Här presenterar vi ett integrerat arbets flöde för att identifiera fenotypiska och molekyl ära egenskaper som karakteriserar cirkulerande tumör celler (CTCs). Vi kombinerar levande immunofärgning och robotliknande mikromanipulation av enstaka och klustrade ctcs med Single cell-baserade tekniker för nedströms analys och bedömning av metastaser-sådd förmåga.
Blodburna metastaser står för de flesta cancerrelaterade dödsfall och involverar cirkulerande tumör celler (CTCs) som är framgångs rika i att etablera nya tumörer på avlägsna platser. CTCs finns i blodet av patienter som enstaka celler (Single CTCs) eller som multicellulära aggregat (CTC-kluster och CTC-vita blod kroppar kluster), med den senare uppvisar en högre metastatisk förmåga. Utöver uppräkning är fenotypisk och molekylär analys utomordentligt viktigt för att dissekera CTC-biologi och för att identifiera sårbarheter som kan åtgärdas. Här ger vi en detaljerad beskrivning av ett arbets flöde som omfattar CTC immunofärgning och micromanipulation, ex vivo kultur för att bedöma proliferativa och överlevnad kapacitet enskilda celler, och in vivo metastasis-formation analyser. Dessutom ger vi ett protokoll för att uppnå dissociation av CTC-kluster i enskilda celler och utredning av heterogenitet inom klustret. Med dessa metoder, till exempel, vi exakt kvantifiera överlevnad och proliferativ potential av enstaka CTCs och enskilda celler inom CTC-kluster, vilket leder oss till observation att celler i kluster visar bättre överlevnad och spridning i ex vivo -kulturer jämfört med enstaka ctcs. sammantaget erbjuder vårt arbets flöde en plattform för att dissekera egenskaperna hos ctcs på en enda cell nivå, som syftar till att identifiera metastaser-relevanta vägar och en bättre förståelse av CTC-biologi.
Den kliniska manifestationen av metastaser i avlägsna organ representerar den sista etappen av cancer progression och står för mer än 90% av cancerrelaterade dödsfall1. Över gången från lokaliserad till metastaserad sjukdom är en process i flera steg, ofta medierad av cirkulerande tumör celler (ctcs)2,3,4. Dessa celler är utgjuta från den primära tumören i blod cirkulationen och transporteras till avlägsna organ, där de kan extravasate och fastställa metastaserande lesioner5,6. Även solida tumörer kan frigöra ett relativt stort antal CTCs, de flesta CTCs är avsedda att dö, på grund av hög skjuvning krafter i omlopp, anoikis-medierad celldöd, immun angrepp eller begränsad förmåga att anpassa sig till en utländsk mikromiljö7. Därför är det avgörande att etablera verktyg som möjliggör dissektion av molekyl ära egenskaper hos de CTCs som är utrustade med metastaser-seedning förmåga. Nyligen genomförda prekliniska och kliniska studier tyder på att förekomst och mängd av enstaka ctcs-och CTC-kluster är förknippat med ett sämre utfall hos patienter med olika typer av solida tumörer8,9,10 , 11 för att , 12 av de , 13 det , 14 (på) . CTC-kluster är grupper av två eller flera ctcs knutna till varandra under cirkulationen och är mer effektiva för att bilda metastaser jämfört med enstaka ctcs3,15,16. Celler i ett kluster upprätthålla stark cell-cell adhesion genom desmosomes och anhängare korsningar, som kan bidra till att övervinna anoikis17,18. Nyligen konstaterade vi att klustring av ctcs är kopplad till hypometylering av bindande platser för stemness-och proliferation-associerade transkriptionsfaktorer, vilket leder till en ökad förmåga att framgångs rikt initiera metastas19. CTC-kluster dissociation resulterar i ombyggnad av viktiga bindnings platser, och därmed dämpning av deras metastaserande potential19. Dessutom till kluster av cancer celler, kan CTCs också associera till vita blod kroppar (oftast neutrofiler) för att bibehålla höga spridnings nivåer i omlopp och öka deras metastaserande förmåga20. Emellertid, biologi CTCs förstås endast delvis och flera frågor förblir öppen, inklusive underliggande molekyl ära egenskaper och sårbarheter i enstaka och klustrade celler.
Under de senaste åren har flera strategier fastställts som utnyttjar cell ytan uttrycks mönster samt fysikaliska egenskaper hos ctcs för isolering21,22,23,24, 25. antigen-beroende isolerings metoder förlitar sig främst på uttrycket av cellytan epitelial cell adhesionsmolekylen (epcam)26. Den mest använda och (i dags läget) den enda FDA-godkända plattform för CTC uppräkning, är CellSearch systemet, som bygger på en två-stegs förfarande för att isolera CTCs21. I det första steget avlägsnas plasma komponenterna genom centrifugering, medan CTCs fångas med magnetiska ferrovätskor kopplade till anti-EpCAM-antikroppar. I det andra steget är den CTC-berikade lösningen fläckig för nukleerade (DAPI-positiva) celler som uttrycker cytokeratin (CK)8,18,19, medan vita blod kroppar (WBCs) identifieras med hjälp av Pan-leukocytmarkör CD45. Slutligen är fångade celler placeras på en integrerad screening plattform och CTCs identifieras genom uttryck av EpCAM, CKs och DAPI samtidigt som negativa för CD45. Även om detta anses vara guldmynt standard för CTC uppräkning, är nedströms molekylär analys utmanande med denna teknik på grund av inneboende begränsningar i CTC-hämtning. Dessutom, med tanke på dess isolerings förfarande, kan cellsearch gynna berikning av ctcs med högre epcam nivåer jämfört med ctcs med lägre epcam uttryck, på grund av till exempel cancer heterogenitet27 eller nedreglering av epitelial markörer 28,29. För att övervinna dessa begränsningar har antigen-oberoende teknik för berikning av CTCs uppstått. Till exempel, CTC-iChip integrerar hydrodynamisk separation av nukleerade celler, inklusive CTCs och WBCs från kvarvarande blod komponenter, följt av en immunomagnetisk utarmning av anti kropp-märkta WBCs, möjliggör rening av otaggade och livskraftiga CTCs i lösning25. Dessutom, det faktum att de flesta ctcs är något större än röda blod kroppar (rbcS) eller WBCs ledde till utvecklingen av storleks-baserade CTC anriknings teknik23,30 (t. ex. parsortix systemet (Angle)) som använder sig av en microfluidic-baserad teknik, bestående av en förträngnings kanal över separations kassetten, ledande celler till ett terminalgap på antingen 10, 8, 6,5 eller 4,5 μm (olika storlekar finns tillgängliga beroende på den förväntade diametern av mål cancer celler). De flesta av blod kropparna passerar genom den smala klyftan, medan CTCs fastna på grund av deras storlek (men också på grund av deras lägre deformability) och är därför kvar i kassetten. Återgår flödes riktningen möjliggör frisläppandet av fångade CTCs, som är i ett livskraftigt tillstånd och lämpar sig för nedströms analys. Oberoende av det valda protokollet för CTC-isolering, ger dock typiska efteranriknings procedurer fortfarande CTCs som blandas med ett relativt litet antal RBCs och WBCs, vilket gör analysen av ren enkel eller bulk CTCs utmanande. För att lösa det här problemet har vi etablerat ett arbets flöde som tillåter CTC manipulation utan potentiell bias infördes av blod celler föroreningar. Tillsats av immunofärgning i förväg, med variabla anti kropps kombinationer, skiljer CTCs från blod kroppar och gör det även möjligt att identifiera CTC-undergrupper med distinkta uttrycks profiler för ytmarkörer. Detta mycket anpassningsbara förfarande kan sedan ytterligare kombineras med specifika nedströms applikationer.
Här beskriver vi ett arbets flöde som utgår från en CTC-berikad produkt (erhålls med valfri CTC-beriknings teknik) och kombinerar flera metoder för att få insikt i CTC-biologi vid encellig upplösning. I korthet möjliggör vårt arbets flöde identifiering av enstaka ctcs, CTC-kluster och CTC-WBC-kluster genom levande immunofärgning, följt av encellig mikromanipulation och nedströms analys med hjälp av ex vivo -odlings protokoll, encellig sekvensering och in vivo metastaser-analyser.
Den molekyl ära karakteriseringen av CTCs har löftet att förbättra vår förståelse av metastatisk process och vägleda utvecklingen av nya anti-metastasis terapier. Här ger vi en detaljerad beskrivning av de protokoll som möjliggör CTC-mikromanipulation och nedströms analys, inklusive både enkelcellsbaserade funktionella analyser, gen uttrycks analys och in vivo -transplantation för metastatisk potential bedömning20.
Bland de mest kritiska stegen i…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla patienter som donerade blod till vår studie, liksom alla involverade kliniker och studie sköterskor. Vi tackar Jens Eberhardt, Uwe Birke och Dr. Katharina Uhlig från ALS Automated Lab Solutions GmbH för kontinuerligt stöd. Vi tackar alla medlemmar i Aceto-labbet för feedback och diskussioner. Forskningen i Aceto-labbet stöds av europeiska forsknings rådet, Europeiska unionen, schweiziska National Science Foundation, schweiziska cancer förbundet, Basel cancer League, de två kantonerna i Basel genom ETH Zürich och universitetet i Basel.
Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
CellD software | ALS | version 3.0 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |