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Bioengineering

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/59678
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 4, 5, 2, 1
1Department of Internal Medicine (Nephrology) and the Einthoven Laboratory for Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 2Division of Systems Biomedicine and Pharmacology, Department of Analytical BioSciences and Metabolomics, Leiden University, 3Ncardia, 4Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 5Mimetas

ERRATUM NOTICE

Summary

Este método describe el cultivo de células endoteliales derivadas de iPSC como 40 microvas 3D perfundidas en una plataforma microfluídica estandarizada. Esta plataforma permite el estudio de la brotación angiogénica impulsada por gradientes en 3D, incluyendo anastomosis y estabilización de los brotes angiogénicos de una manera escalable y de alto rendimiento.

Abstract

La investigación preclínica de enfermedades vasculares requiere modelos in vitro de vasculatura que sean modificables para el cribado de alto rendimiento. Sin embargo, los modelos de cribado in vitro actuales que tienen un rendimiento suficiente sólo tienen una relevancia fisiológica limitada, lo que dificulta la traducción de los hallazgos de in vitro a in vivo. Por otro lado, las plataformas de cultivo celular microfluídico han demostrado una relevancia fisiológica sin precedentes in vitro, pero a menudo carecen del rendimiento, escalabilidad y estandarización requeridos. Demostramos una plataforma robusta para estudiar la angiogénesis de células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-EF) en un microambiente celular fisiológico relevante, incluyendo perfusión y gradientes. Los iPSC-EC se cultivan como 40 microvasos 3D perfundidos contra un andamio de colágeno 1 estampado. Tras la aplicación de un gradiente de factores angiogénicos, se pueden estudiar importantes características distintivas de la angiogénesis, incluida la diferenciación en células de punta y tallo y la formación de lumen perfundible. La perfusión con colorantes de trazador fluorescentes permite el estudio de la permeabilidad durante y después de la anastomosis de los brotes angiogénicos. En conclusión, este método muestra la viabilidad de las CP derivadas de iPSC en un ensayo angiogénico 3D estandarizado y escalable que combina las condiciones de cultivo fisiológicarelevantes relevantes en una plataforma que tiene la robustez y escalabilidad necesarias para integrarse la infraestructura de detección de drogas.

Introduction

Los modelos in vitro desempeñan un papel fundamental en el descubrimiento y validación de nuevas dianas farmacológicas de enfermedades vasculares. Sin embargo, los modelos de cribado in vitro actuales que tienen un rendimiento suficiente sólo tienen una relevancia fisiológica limitada1, lo que dificulta la traducción de los hallazgos de in vitro a in vivo. Por lo tanto, para avanzar en la investigación preclínica de fármacos vasculares, se utilizan modelos in vitro mejorados de vasculatura que combinan el cribado de alto rendimiento con un microambiente celular 3D fisiológicamente relevante.

En la última década, se han realizado progresos significativos para aumentar la relevancia fisiológica de los modelos in vitro de vasculatura. En lugar de cultivar células endoteliales en superficies planas como plásticos de cultivo de tejido, las células endoteliales se pueden incrustar en andamios 3D, como geles de fibrina y colágeno2. Dentro de estas matrices, las células endoteliales muestran un fenotipo más relevante fisiológicamente asociado con la degradación de la matriz y la formación de lúmenes. Sin embargo, estos modelos sólo demuestran un subconjunto de los muchos procesos que se producen durante la brotación angiogénica, ya que todavía faltan señales importantes del microambiente celular.

Las plataformas de cultivo celular microfluídico son especialmente adecuadas para aumentar aún más la relevancia fisiológica de los modelos in vitro de vasculatura. Por ejemplo, las células endoteliales pueden estar expuestas al estrés por cizallamiento, que es un importante estímulo biomecánico para la vasculatura. Además, la posibilidad de controlar espacialmente los fluidos dentro de los microfluídicos permite la formación de gradientes biomoleculares3,4,5,6. Estos gradientes juegan un papel importante in vivo durante la formación y el patrón durante la angiogénesis. Sin embargo, si bien las plataformas de cultivo celular microfluídico han demostrado una relevancia fisiológica sin precedentes sobre los métodos tradicionales de cultivo de células 2D y 3D, a menudo carecen del rendimiento, escalabilidad y estandarización necesarios para la detección de drogas 7. Además, muchas de estas plataformas no están disponibles comercialmente y requieren que los usuarios finales microfabricadan sus dispositivos antes de usar8. Esto no sólo requiere aparatos de fabricación y conocimientos técnicos, sino que también limita el nivel de control de calidad y afecta negativamente a la reproducibilidad9.

Hasta la fecha, las células endoteliales humanas primarias siguen siendo la fuente celular más utilizada para modelar la angiogénesis in vitro10. Sin embargo, las células humanas primarias tienen una serie de limitaciones que dificultan su aplicación rutinaria en los enfoques de detección. En primer lugar, existe una posibilidad limitada de escalar y ampliar las culturas primarias derivadas de células. Por lo tanto, para el experimento a gran escala, es necesario utilizar lotes de diferentes donantes, lo que resulta en diferencias genómicas y variaciones de lote a lote. En segundo lugar, después de algunos pasajes, las células endoteliales primarias generalmente pierden propiedades relevantes cuando se cultivan in vitro11,12.

Las células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC) son una alternativa prometedora: se asemejan a las células primarias, pero con un genotipo más estable que también es susceptible a la edición precisa del genoma. Además, los iPSC son capaces de autorenovarse y, por lo tanto, pueden ampliarse en cantidades casi ilimitadas, lo que hace que las células derivadas de iPSC sean una alternativa atractiva a las células primarias para su uso dentro de los modelos de cribado in vitro13.

Aquí, describimos un método para cultivar células endoteliales como microvas 3D perfundibles en una plataforma de cultivo de células microfluídicas estandarizada de alto rendimiento. La perfusión se aplica colocando el dispositivo en una plataforma basculante, lo que garantiza un funcionamiento robusto y aumenta la escalabilidad del ensayo. Como los microvasos se perfunden continuamente y se exponen a un gradiente de factores angiogénicos, la brotación angiogénica se estudia en un microambiente celular más relevante fisiológicamente. Si bien el protocolo es compatible con muchas fuentes diferentes de células endoteliales (primarias)14,15, nos centramos en el uso de LOS CI humanos derivados de iPSC con el fin de aumentar la estandarización de este ensayo y facilitar su integración dentro de la investigación de fármacos vasculares.

Protocol

1. Preparación del dispositivo

  1. Transfiera la placa microfluídica de 384 pocillos a una campana de flujo laminar estéril.
  2. Retire la tapa y añada 50 ml de agua o solución salina con fosfato (PBS) a cada uno de los 40 pozos de observación(Figura 1b,bien B2) utilizando una pipeta multicanal o repetitiva.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Deje la placa con la tapa puesta en el armario de cultivo estéril a temperatura ambiente (RT).

2. Preparar gel y recubrimiento

  1. Preparar 2,5 ml de solución de recubrimiento de fibronectina (FN) de 10 g/ml. Diluir 25 ml de 1 mg/ml de solución en stock de fibronectina en 2,5 ml de PBS de Dulbecco (dPBS, calcio y magnesio sin magnesio). Colocar la solución en el baño de agua a 37oC hasta su uso.
  2. Preparar 100 l de solución de colágeno-1. Añadir 10 l de HEPES (1 M) a 10 l de NaHCO3 (37 g/L) y mezclar mediante pipeteo. Colocar el tubo sobre hielo y añadir 80 ml de colágeno-1 (5 mg/ml) para producir una concentración neutralizada de colágeno-1 de 4 mg/ml. Utilice una pipeta para mezclar cuidadosamente y evitar la formación de burbujas.
  3. Añadir 1,5 l de solución de colágeno-1 (4 mg/ml) a la entrada de gel de cada unidad microfluídica(Figura 1b,bien B1). Asegúrese de que la gota de gel se coloca en el centro de cada poca para que el gel entre en el canal (ver Figura 2a).
    NOTA: Las guías de fase evitan el llenado de los canales adyacentes y permiten el patrón de gel. La correcta carga de gel se puede confirmar bajo un microscopio de campo brillante observando la formación de menisco a través de la 'ventana de observación' (bien B2) o volteando la placa al revés. Si el gel no llenó completamente el canal, se puede añadir una gota adicional de 1 l.
  4. Colocar la placa microfluídica en una incubadora (37oC, 5% CO2) durante 10 min para polimerizar colágeno-1.
    NOTA: El tiempo de la polimerización es crucial; debido a los bajos volúmenes utilizados en los microfluidos, la evaporación ya se puede observar después de 15 minutos de incubación, lo que resulta en colapso o contracción del gel.
  5. Saque la placa de la incubadora y transfiera a una campana de flujo laminar estéril.
  6. Añadir 50 l de solución de recubrimiento FN de 10 g/ml a la salida del canal de perfusión superior de cada unidad microfluídica(Figura 1b,bien A3). Presione la punta de la pipeta contra el lado del pozo para el llenado correcto del pozo sin atrapar burbujas de aire (consulte la figura 2b). El canal debe llenarse, y el líquido debe fijar en la salida (bien C1) sin llenar bien la salida.
  7. Colocar la placa en la incubadora (37oC, 5% CO2)durante al menos 2 días.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, ya que el gel de colágeno-1 junto con la mezcla de recubrimiento es estable durante al menos 5 días en la incubadora. Si la mezcla de recubrimiento se refresca, podrían ser posibles períodos más largos, pero esto no ha sido probado. Es crucial el nivel de recubrimiento FN, ya que esto evita la deshidratación del gel de colágeno-1.

3. Sembrado celular /Cultivo de microbuques

  1. Añadir 5 ml de suero de ternera fetal y 2,5 ml de pluma/estreptococo a 500 ml de medio de cultivo de células endoteliales basales y filtrar el esterilizado utilizando un filtro superior de botella con tamaño de poro de 0,22 m. Este medio se conoce ahora como medio basal.
  2. Preparar el medio de crecimiento vascular: Añadir 3 sL de factor de crecimiento endotelial vascular de 50 g/ml (VEGF) y 2 oL de factores básicos de crecimiento de fibroblastos de 20 g/ml (bFGF) a 5 ml de medio basal.
  3. Descongelar los iPSC-EC congelados rápidamente (<1 min) en un baño de agua de 37 oC y transferir a un tubo de 15 ml y diluir en 10 ml de medio basal.
  4. Cuente las celdas.
    NOTA: Un solo vial contiene 1 millón de células en 0,5 ml con >90% de viabilidad.
  5. Centrifugar el tubo a 100 x g durante 5 min. Aspiratear sobrenadante sin perturbar el pellet celular y resuspender en medio basal para producir una concentración de 2 x 107 células/ml.
  6. Transfiera la placa microfluídica de 384 pocillos de la incubadora a una campana estéril de flujo laminar.
  7. Aspirar solución de recubrimiento FN de la entrada de perfusión (pozo A1). Añadir 25 l de medio basal en los pozos de entrada (bien A1).
  8. Añadir una gota de 1 L de suspensión celular a cada pozo de entrada de perfusión superior(Figura 1b,bien A1). La gota debe aplanarse en unos segundos (consulte la figura 3a, b para obtener una ilustración de este método de "bombeo pasivo").
    NOTA: Compruebe bajo un microscopio si la semilla es homogénea. Si no es así, añada otro 1 l en la salida y espere hasta que la gota se aplane.
  9. Incubar la placa de pozo microfluídica durante 1 h a 37oC, 5%CO2. Después de esto, las células deben haberse adherido. Si no, espere otros 30 minutos.
  10. Retire el medio basal de los pozos de salida de perfusión superior(Figura 1b,bien A3). Añadir medio de cultivo de recipiente caliente en la entrada y salida de perfusión superior(Figura 1b,pozos A1 y A3). Coloque la placa en la plataforma basculante (ajuste en ángulo de 7o, intervalo de balanceo de 8 min) en la incubadora (37 oC, 5% CO2).
  11. Imagen de la placa utilizando un microscopio de campo brillante con etapa automatizada en los días 1 y 2 post-sembrado para confirmar la viabilidad celular. Después de 2 días, una monocapa confluente debe haberse formado contra el andamio de colágeno-1.
    NOTA: Si los canales no parecen ser igualmente confluentes, los microvasculares se pueden cultivar durante 24 horas adicionales.

4. Estudiar la brotación angiogénica incluyendo la formación de células de punta y acecho

  1. Preparar 4,5 ml de medio de brotación angiogénico complementando el medio basal con 4,5 l de VEGF (50 g/ml), 4,5 ml de phorbol 12-miristate-13-acetate (PMA) (2 g/ml) y 2,25 l de esfingosina-1-fosfato (S1P) (1 mM).
  2. Preparar 8,5 ml de medio de crecimiento del vaso (medio basal complementado con 30 ng/ml VEGF y 20 ng/mL bFGF).
  3. Aspirar el medio de los pozos y añadir 50 l de medio de cultivo de recipiente fresco en los pozos superiores de entrada y salida de perfusión y pozos de entrada y salida de gel(Figura 1b,pozos A1, A3, B1 y B3).
  4. Añadir 50 l de mezcla de brotes angiogénicos a cada uno de los pozos de entrada y salida del canal de perfusión inferior(Figura 1b,pozos C1 y C3).
  5. Vuelva a colocar el dispositivo en la incubadora (37 oC, 5% CO2)en la plataforma del balancín para formar un gradiente de factores de crecimiento angiogénicos.
  6. Imagen 1 día y 2 días después de la adición de los factores de crecimiento angiogénicos utilizando un microscopio de campo brillante con etapa automatizada.
    NOTA: Continúe el cultivo de los microvasculares para estudiar la anastomosis (ir a la sección 5) o fijar y manchar los microvasculares para cuantificar la longitud y morfología de la brotación en el día 2 y el día 6 (ir a la sección 6).

5. Estudiar anastomosis y estabilización de brotes

  1. Imagen utilizando un microscopio de campo brillante con etapa automatizada.
  2. Añadir 1 l de albúmina etiquetada fluorescentemente (0,5 mg/ml) a la entrada de perfusión superior(Figura 1b,bien A1) y mezclar con una pipeta de 50 ml.
  3. Transfiera la placa a un microscopio fluorescente con etapa automatizada e incubadora a 37 oC. Ajuste el microscopio a 10 ajustes de exposición objetivo y correctos (por ejemplo, canal de tetrametilrhodamina [TRITC], 20 ms de exposición). Adquiera imágenes de lapso de tiempo cada minuto durante 10 minutos.
  4. Retire la placa del microscopio y transfiera la placa a una campana de flujo laminar estéril.
  5. Retire todo el medio de los pozos y sustituya tanto el medio de cultivo del recipiente como el medio de brotación angiogénico en los pozos correspondientes (véanse los pasos 4.3 y 4.4).
  6. Vuelva a colocar el dispositivo en la incubadora (37 oC, 5% CO2)para continuar con la brotación angiogénica.
  7. Repita los pasos 5.1 a 5.6 para estudiar la permeabilidad en el día 6.

6. Fijación, tinción e imágenes

  1. Aspirar todos los medios de cultura de todos los pozos.
    NOTA: El medio residual o los líquidos en los canales microfluídicos no influyen en la fijación debido a su bajo volumen de 1 x 2 s.
  2. Añadir 25 l de paraformaldehído (PFA) del 4% en PBS a toda la entrada de perfusión(Figura 1b,A1 y C1) y pozos de salida(Figura 1b,A3 y C3). Incubar durante 10 minutos en RT. Coloque el dispositivo bajo un ligero ángulo (-5o) para inducir el flujo (por ejemplo, colocando un lado de la placa en una tapa).
  3. Aspirar PFA de los pozos. Lave todas las entradas y salidas de perfusión dos veces con 50 ml de la solución salina equilibrada (HBSS) de Hank. Aspirar HBSS de pozos.
  4. Permeabilizar a RT durante 10 min añadiendo 50 sl de tensioactivo no iónico al 0,2% de tensioactivo no iónico a todas las entradas y salidas de perfusión.
  5. Aspirar el tensioactivo no iónico de los pozos. Lave los canales de perfusión dos veces añadiendo 50 ml de HBSS a todos los pozos de entrada y salida de perfusión. Aspirar HBSS de pozos.
  6. Mancha los núcleos usando Hoechst (1:2,000) y F-actin usando faloideiidin (1:200) en HBSS. Prepare 2,2 ml para 40 unidades y añada 25 ml a cada pozo de entrada y salida de perfusión. Coloque la placa bajo un ligero ángulo e incubar en RT durante al menos 30 minutos.
  7. Lavar dos veces con 50 ml de HBSS en todas las entradas y salidas de perfusión.
  8. Imagen directa utilizando un microscopio fluorescente con etapa automatizada o almacene la placa protegida de la luz a 4 oC para su uso posterior.

Representative Results

La plataforma de cultivo celular 3D microfluídico consta de 40 unidades microfluídicas perfundidas(Figura 1a,b),que se utiliza para estudiar la brotación angiogénica de microvasos perfundidos contra un gel de colágeno 1 estampado(Figura 1c). Estos microvasos se perfunden continuamente y se exponen a un gradiente de factores de crecimiento angiogénicos(Figura 3a-d). Los brotes angiogénicos pueden estudiarse 2 días después de la exposición a gradiente o cultivarse durante más de 5 días después de la exposición por gradiente a la anastomosis del estudio y la estabilización de los brotes (ver cronología, Figura 1d).

La sembración de los iPSC-EC utilizando el método de bombeo pasivo debe dar lugar a densidades de semillas homogéneas(Figura 4a,b). El cultivo bajo perfusión continua dio lugar a microvas confluentes en 2 días, con las células que recubren completamente la circunferencia del canal microfluídico y la formación de una monocapa confluente contra el gel de colágeno 1 estampado.

La exposición a un gradiente de factores angiogénicos dio lugar a la brotación angiogénica direccional de los microvasos dentro del gel de colágeno-1 estampado(Figura 5a-g). La formación de células de punta clara y la invasión en el gel de colágeno-1 fueron visibles 24 h después de la adición del gradiente angiogénico, mientras que las células de tallo incluyendo la formación de lumen fueron visibles después de 48 h(Figura 5a).

Después de la fijación y la tinción, la red capilar se puede visualizar utilizando faloideicina para manchar F-actin y utilizando Hoechst 33342 para manchar el núcleo(Figura 5b,c). Estos brotes se pueden cuantificar (por ejemplo, forma y longitud14). Sin adición de factores de crecimiento, no se debe observar ninguna invasión en el gel de colágeno-1 (Figura 5d). Se utilizaron imágenes confocales para determinar el diámetro del brote y para confirmar la formación de lúmenes(Figura 5e-g).

Los brotes continúan creciendo hacia la dirección del gradiente y alcanzan el canal de perfusión opuesto dentro de 3 a 4 días después de la adición de factores de crecimiento angiogénicos. Esto se traduce en la remodelación de la red vascular, con una clara reducción en el número de brotes angiogénicos(Figura 6a). La formación de lúmenes se evaluó mediante perfusión de la red vascular con macromoléculas etiquetadas fluorescentesmente (por ejemplo, albúmina o dextrans). La perfumar los microvasculares con 0,5 mg/ml de albúmina etiquetada antes y después de la anastomosis reveló una clara diferencia en la permeabilidad del brote después de 10 min(Figura 6b-e),lo que sugiere que los capilares se estabilizan y maduran después de la anastomosis.

Figure 1
Figura 1: Protocolo de cultivo celular microfluídico para microvasos derivados de iPSC. (a) Se muestra la parte inferior del dispositivo de cultivo celular microfluídico que muestra las 40 unidades microfluídicas que se integran debajo de la placa de 384 pocillos. La vista más grande muestra una de las 40 unidades microfluídicas. (b) Cada unidad microfluídica se coloca debajo de 9 pozos con 3 pozos de entrada y 3 pozos de salida. Los canales microfluidos están separados por crestas («guías de fase»), que permiten el patrón de hidrogeles en el canal central («canal de gel») mientras todavía hay contacto con los canales adyacentes («canales de perfusión»). (c) Método para el cultivo de un microrecipiente perfundido dentro del dispositivo microfluídico, que se utiliza para estudiar la brotación angiogénica impulsada por gradientes a través de una matriz de colágeno-1 estampada. (d) Cronología para el estudio de la brotación angiogénica y/o anastomosis. Esta cifra ha sido modificada de van Duinen et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Procedimientos de carga para gel y medio. (a ) Ejemplos de deposición correcta e incorrecta del gel. La presentación correcta da como resultado un gel de colágeno-1 estampado en el canal medio, que posteriormente se polimeriza. (b) Ejemplos de llenado correcto e incorrecto de los pozos. Los pozos se llenan en el orden de 1-4 para evitar la captura de burbujas de aire dentro de los canales microfluídicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Flujo continuo impulsado por presión hidrostática y estabilización de gradiente. (a) Las diferencias de presión hidrostática entre los pozos dan como resultado la nivelación pasiva y el flujo dentro de los canales microfluídicos. ( b) Colocar el dispositivo en una plataforma basculante establecida en un tiempo de ciclo de 7o y 8 min da como resultado una perfusión bidireccional continua dentro de los canales microfluídicos. (c) Los degradados se forman introduciendo dos concentraciones diferentes dentro de los pozos, que se actualizan continuamente mediante la nivelación pasiva. (d) Visualización de degradado utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran. El flujo bidireccional estabiliza el gradiente hasta 3 días. Barra de escala a 200 m. Esta cifra ha sido modificada de van Duinen et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Método de bombeo pasivo para la sembración de células. (a ) El bombeo pasivo es impulsado por diferencias de presión causadas por diferencias en la tensión superficial. Esto resulta en un flujo desde la gota (alta presión interna) hacia el depósito (baja presión interna). (b) Lapso de tiempo de una gota (contorno gris) que se coloca en la parte superior de la entrada (esquema blanco) del canal microfluídico (contorno azul). Justo después de la adición(Figura 4b, i), la gota en la parte superior de la entrada se encoge(Figura 4b, ii: 1 s después de la adición; iv: 2 s después de la adición), lo que resulta en un flujo hacia la salida. Esto continúa hasta que la entrada fija el menisco de gotas(Figura 4b, iv). Barra de escala a 400 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Brote 3D robusto de microvasos iPSC-EC. (a ) Brote de iPSC-EC a lo largo del tiempo. Los microvessels fueron cultivados durante 48 h (derecha) y luego estimulados con un cóctel angiogénico que contiene 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P y 2 ng/mL PMA. Las primeras células de punta que invaden el andamio de colágeno-1 (medio) son visibles 24 h después de la exposición. Los primeros lúmenes son visibles (flechas) 48 h después de la exposición (derecha) mientras que las células de la punta han migrado aún más en la dirección del degradado. (b) Matriz de 15 microvas que fueron estimulados con VEGF, S1P y PMA durante 2 días y teñidos para F-actina (amarillo) y núcleos (azul). Barra de escala a 200 m. (c) Microrecipiente estimulado (control positivo). (d) Microvaso sin estimular (control negativo). (e) La proyección máxima de un solo capilar dentro del gel. (f) Igual que (g) pero se centró en el medio. La línea de puntos indica la posición de la vista ortogonal en el panel g. Barras de escala (a-d: 200 m; e-g: 20 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Visualización de la permeabilidad del brote angiogénico antes y después de la anastomosis. (a) La anastomosis con canal basal desencadena la poda y maduración de los brotes angiogénicos. Primer plano del lecho capilar a los 2, 4, 6 y 7 días después de la estimulación con factores de crecimiento angiogénicos. (b) Brotes angiogénicos después de 2 días después de la adición de factores de crecimiento angiogénicos. Los brotes angiogénicos se forman dentro del gel, pero aún no están conectados al canal de perfusión inferior. (c) Perfusión del microbuque con solución de albúmina-Alexa 555 de 0,5 mg/ml. Imágenes fluorescentes obtenidas a 0 y 10 min. (d,e) Igual que en los paneles b y c, pero después de 7 días de estimulación. Los brotes están conectados al otro lado y forman un microrecipiente confluente en el canal de perfusión basal. Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Problema Causa Solución
El colágeno-1 no entra ni llena el canal por completo La gota de colágeno-1 no se coloca encima de la entrada Coloque cuidadosamente la gota en la parte superior de la entrada desde el canal de gel
El volumen de colágeno-1 es demasiado bajo Utilice 1,5 l del gel para llenar el canal por completo
El colágeno-1 es demasiado viscoso Use otro lote de colágeno-1
El colágeno-1 fluye hacia los canales de perfusión El colágeno-1 se entuba directamente en la entrada del canal de gel Coloque cuidadosamente la gota en la parte superior de la entrada desde el canal de gel
El colágeno-1 no es transparente/formación de fibra El colágeno-1 no se almacena correctamente Conservar el colágeno-1 a 4oC, no congelar
NaHCO3 y HEPES no se mezclan bien antes de añadir colágeno-1 Mezcle cuidadosamente el NaHCO3 y hePES pipeteando antes de agregar el colágeno-1
Droplet no se encoge con el método de bombeo pasivo Droplet se adhiere al lado del pozo Aspirar gota y añadir una nueva gota en la parte superior de la entrada
Asegúrese de que el pozo de salida esté lleno de al menos 20 s de medio
No se observa nado la brotación No se añaden factores de crecimiento o las alícuotas no se almacenan correctamente Preparar un nuevo medio de brotación angiogénico
Bloques de burbujas de aire de perfusión/formación de gradiente Retire las burbujas de aire con una pipeta P20 o P200
Diferencias de volumen entre pozos Los volúmenes en todos los pozos deben ser iguales para formar un gradiente lineal
Células no viables Placa no colocada en la plataforma rocker/plataforma rocker apagada Asegúrese de que la plataforma basculante esté encendida y tenga el tiempo/ángulo de ciclo correcto (8 min/7o)
No es posible perfusión debido a la presencia de burbujas de aire Retire las burbujas de aire con una pipeta P20 o P200
No se forman lúmenes, las células se migran como células individuales Se añadió una mezcla de brotación angiogénica antes de que se formara una monocapa Espere 24 horas adicionales antes de añadir los factores de crecimiento angiogénicos
Variación importante en la densidad de brotación Diferencias en las densidades celulares después de la sembración Compruebe si la densidad celular es homogénea y comparable entre unidades microfluídicas. Agregue otra gota de suspensión celular si es necesario

Tabla 1: Solución de problemas de errores comunes.

Discussion

Este método describe el cultivo de 40 microvasculares endoteliales perfundibles dentro de una plataforma de cultivo celular microfluídica robusta y escalable. En comparación con los métodos tradicionales de cultivo celular 2D y 3D, este método muestra cómo un microambiente celular fisiológico relevante que incluye gradientes y perfusión continua se puede combinar con el cultivo celular 3D con un rendimiento adecuado para el cribado Propósitos.

Una de las principales ventajas sobre los ensayos microfluídicos comparables es que este método no depende de bombas para perfusión, sino que utiliza una plataforma basculante para inducir la perfusión continua en todas las unidades microfluídicas simultáneamente. Esto garantiza que el ensayo sea robusto y escalable: las placas se pueden apilar en una plataforma basculante. Es importante destacar que todas las unidades microfluídicas siguen siendo direccionables individualmente, lo que permite que este método se implemente dentro del cribado de fármacos, incluida la generación de una curva dosis-respuesta. Además, sin una bomba, la imagen y el reemplazo medio es mucho más simple con menos riesgo de contaminación (cruzada).

Otra ventaja de este método es el uso de una plataforma estandarizada y prefabricada, mientras que las plataformas de cultivo celular microfluídicas comparables deben ser fabricadas por los usuarios finales. Esta disponibilidad facilita la adopción de este ensayo entre otros grupos de investigación académica y farmacéutica, lo que conduce a la estandarización. Además, a diferencia de los prototipos microfluídicos, la interfaz de placa de 384 pocillos garantiza la compatibilidad con el equipo de laboratorio actual (por ejemplo, aspiradores, manipuladores de placas y pipetas multicanal), facilitando la integración dentro de la infraestructura de cribado actual .

Hay varios pasos críticos para realizar este ensayo. El gel de colágeno-1 debe llenar completamente el canal de gel. Durante la carga en gel, este relleno se puede observar inspeccionando los canales microfluídicos a través de la ventana de observación(Figura 2a)o volteando la placa al revés (como se muestra en la Figura 1a). Durante el llenado, el gel de colágeno debe permanecer en el canal central, sin fluir en los canales de perfusión adyacentes. Hemos notado que la calidad del gel de colágeno-1 es crucial para el rendimiento adecuado del ensayo. Los lotes de colágeno-1 con viscosidad demasiado alta conducirán al llenado incompleto del canal de gel. Después de 10 min de polimerización a 37oC, el gel debe ser homogéneo y transparente. Si el colágeno-1 no se almacena correctamente (por ejemplo, debido a las temperaturas fluctuantes en el refrigerador), el colágeno se polimerizará dentro de los canales con una formación de fibra claramente visible. Esto puede resultar en la invasión de las CE en el gel sin adición de factores angiogénicos, pero sin el desarrollo adecuado del lumen.

Cuando las células se sembran, la solución de recubrimiento de fibronectina se retira de los pozos, dejando sólo los canales microfluídicos llenos de solución de recubrimiento. La aspiración de la solución de recubrimiento de canales microfluídicos podría causar interrupción del gel o aspiración de gel. La suspensión celular necesita reemplazar/desplazar esta solución de recubrimiento. Esto funciona mejor cuando la suspensión celular se sintea utilizando el método de bombeo pasivo, ya que directamente pipetear la suspensión celular en los canales muestran densidades de semilla menos reproducibles.

A medida que los microvasos forman una monocapa estable contra el gel, estas pequeñas diferencias sólo resultan en diferentes tiempos necesarios para alcanzar la confluencia. Por lo tanto, el punto de inicio del ensayo está determinado por la confluencia en lugar del tiempo de cultivo. Si es necesario, el tiempo de cultivo se puede extender hasta que se haya formado una monocapa transparente contra el gel.

Dentro de los pozos, las burbujas de aire pueden quedar atrapadas por el llenado incorrecto de los pozos (ver Figura 2b). Estas burbujas de aire restringirán el flujo de medio, incluso cuando el dispositivo se coloca en una plataforma basculante, y resultará en el colapso del microrecipiente y la formación de gradiente incorrecto. Presionar la punta de la pipeta contra la pared lateral de los pozos aumentará el éxito de llenar completamente el pozo. Si una burbuja de aire está atrapada dentro de los pozos, se puede quitar insertando suavemente una punta de pipeta estéril en el fondo de vidrio. Las burbujas de aire también pueden ocurrir dentro de los canales microfluídicos. Cuando el medio se ha eliminado de los pozos, la evaporación del medio es notable de los canales microfluídicos después de 30 min (debido a los volúmenes de microlitros dentro de los canales). Por lo tanto, los cambios medios se realizan preferiblemente lo más rápido posible. Cuando se añade un medio en un canal con medio evaporado, las burbujas de aire quedarán atrapadas dentro de los canales microfluídicos. Estas burbujas de aire dentro de los canales microfluídicos se pueden eliminar manualmente colocando una pipeta P20 directamente en la entrada o salida y forzando el medio a través de los microfluidos desde el pozo opuesto. Eliminación exitosa de las burbujas de aire resulta en una pequeña pero notable disminución de volumen en el otro pozo. La Tabla 1 enumera los errores comunes y cómo solucionarlos.

La falta de una bomba es una limitación cuando se requiere imágenes continuas, ya que la plataforma rocker limita al usuario a la imagen en intervalos de tiempo secuenciales. Además, la perfusión de medio en esta plataforma consiste en un flujo bidireccional con bajos niveles de tensión de cizallamiento, mientras que la vasculatura in vivo está expuesta a un flujo unidireccional con mayores niveles de tensión de cizallamiento. Si bien no observamos los efectos negativos del flujo bidireccional con respecto a la brotación angiogénica, el flujo es un estímulo biomecánico importante y preferiblemente controlado. Sin embargo, mientras que hay configuraciones de bomba disponibles comercialmente, la interfaz con la placa de 384 pocillos sigue siendo un reto y las configuraciones de la bomba obstaculizan gravemente la escalabilidad de este ensayo.

La posibilidad de utilizar iPSC-ECs para estudiar la brotación angiogénica abre nuevas oportunidades en el modelado de enfermedades y la investigación de drogas. A diferencia de las CE primarias, estas células se pueden generar en cantidades casi ilimitadas con un genotipo estable y mediante el uso de técnicas de edición del genoma, se pueden generar células que incluyen nocauts genéticos y knock-ins. Sin embargo, como los protocolos para diferenciar los CP de iPSC son relativamente nuevos, todavía no está claro qué conduce a los IPSC-CP que mejor reflejan los CE primarios y qué subtipos de CE son o se pueden generar. Además, aún quedan preguntas sobre su pertinencia. Por ejemplo, ¿los iPSC-EF siguen exhibiendo la plasticidad típica de las células endoteliales? ¿Y hasta qué punto las células derivadas de iPSC responden e interactúan con su microambiente celular? La plataforma estandarizada presentada aquí podría utilizarse para responder a algunas de estas preguntas con el fin de validar aún más el uso de los CIC derivados de iPSC in vitro.

La dirección futura más directa para este ensayo será la integración de otros tipos de células que desempeñan un papel importante durante la angiogénesis, como los pericitas y los macrófagos. Esto facilitará la capacidad de estudiar el papel de los macrófagos durante la anastomosis entre los brotes o la adherencia de los periitas después de la formación capilar. Además, es posible cultivar varios otros tipos de células dentro o contra una matriz extracelular (por ejemplo, hemos demostrado el cultivo de neuronas y varias estructuras epiteliales como túbulos proximales e intestinos delgados), que se pueden combinar con el vascular camas generadas utilizando este método. Por último, será interesante estudiar la brotación angiogénica en hidrogeles sintéticos, ya que su composición definida aumenta aún más la estandarización del ensayo y permite ajustar la rigidez y los motivos de unión que afectan las interacciones entre la matriz celular.

En conclusión, este método muestra la viabilidad de las CP derivadas de iPSC en un ensayo angiogénico 3D estandarizado y escalable que combina las condiciones de cultivo fisiológicarelevantes relevantes en una plataforma que tiene la robustez y escalabilidad necesarias para integrarse la infraestructura de detección de drogas.

Disclosures

P. Vulto y T. Hankemeier son accionistas de Mimetas BV. V. Borgdorff y A. Reijerkerk son empleados de Ncardia BV. V. van Duinen, W. Stam, V. V. Orlova y A.J. van Zonneveld no tienen ninguna divulgación.

Acknowledgments

Este trabajo está en parte respaldado por una beca de investigación del programa 'Meer Kennis met Minder Dieren' (número de proyecto 114022501) de la Organización Neerlandesa para la Investigación y el Desarrollo sanitario (ZonMw) y la subvención del consorcio CVON de la Fundación Neerlandesa Heart Reconectar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-10 μL Electronic repeater pipette Sigma Z654566-1EA
1 M HEPES Gibco 15630-056
3-lane OrganoPlate Mimetas 4003-400B
4% PFA in PBS Alfa Aesar J61899
Basal culture medium NCardia
Collagen-1 Cultrex 3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL VWR 613-2071
dPBS Gibco 14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte VWR 613-2890
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759-1MG 1 mg/mL in milliQ water
HBSS Gibco 14025-050
Hoechst Molecular Probes H3569 10 mg/mL solution in water
iPSC-derived endothelial cells NCardia
NaHCO3 Sigma S5761 37 g/L in milliQ water
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini Mimetas Rocker platform used to provide flow
Pen/Strep Sigma P4333
Phalloidin Sigma P1951 1 mg/mL in DMSO
PMA Focus-Biomolecules 10-2165 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO
S1P Ecehelon Biosciences S-2000 1 mM in methanol containing 1% acetic acid
TRITC-albumin Invitrogen A34786
VEGF Peprotech 450-32-10 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA

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References

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Tags

Bioingeniería Número 153 cultivo de células 3D microfluidos in vitro células madre pluripotentes inducidas por humanos células endoteliales angiogénesis gradientes cribado de alto rendimiento desarrollo de ensayos

Erratum

Formal Correction: Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro
Posted by JoVE Editors on 01/25/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. The Protocol section was updated.

Step 2.6 of the Protocol was updated from:

Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.

to:

Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.

Step 3.7 of the Protocol was updated from:

Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 µL of basal medium in the inlet wells (well A1).

to:

Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 µL of basal medium in the outlet well (well A3).

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro
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van Duinen, V., Stam, W., Borgdorff, V., Reijerkerk, A., Orlova, V., Vulto, P., Hankemeier, T., van Zonneveld, A. J. Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (153), e59678, doi:10.3791/59678 (2019).

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