Kwantitatieve fluorescentie in situ-hybridisatie (vis) en immunofluorescentie (indien) van specifieke genproducten in KSHV-geïnfecteerde cellen

Summary

We beschrijven een protocol met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) om meerdere herpes virale Rna's binnen lytisch geïnfecteerde menselijke cellen te visualiseren, hetzij in suspensie of aanhanger. Dit protocol omvat de kwantificering van fluorescentie die een nucleocytoplasmische verhouding produceert en kan worden uitgebreid voor gelijktijdige visualisatie van gastheer en virale eiwitten met immunofluorescentie (IF).

Abstract

Mechanistisch inzicht komt van zorgvuldige studie en kwantificering van specifieke Rna's en eiwitten. De relatieve locaties van deze biomoleculen in de cel op specifieke tijdstippen kunnen worden opgevangen met fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) en immunofluorescentie (if). Tijdens lytische herpesvirus infectie, het virus kaapt de host cel bij voorkeur Express virale genen, waardoor veranderingen in celmorfologie en gedrag van biomoleules. Lytische activiteiten zijn gecentreerd in nucleaire fabrieken, genaamd virale replicatie compartimenten, die alleen met vis kunnen worden onderscheiden en als. Hier beschrijven we een aanpasbaar Protocol van RNA vis en als technieken voor Kaposi van sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)-geïnfecteerde cellen, zowel aanhandig en in suspensie. De methode omvat stappen voor de ontwikkeling van specifieke anti-Sense oligonucleotiden, dubbel RNA vis, RNA vis met IF, en kwantitatieve berekeningen van fluorescentie intensiteiten. Dit protocol is met succes toegepast op meerdere celtypen, niet-geïnfecteerde cellen, latente cellen, lytische cellen, tijd-cursussen, en cellen behandeld met remmers voor het analyseren van de spatiotemporele activiteiten van specifieke Rna's en eiwitten van zowel de menselijke gastheer en KSHV.

Introduction

In hun lytische (actieve) fase, herpesvirussen kapen de gastheer cel, waardoor veranderingen in celmorfologie en lokalisatie van biologische moleculen, voor de productie van virionen. De basis van operaties is de Nucleus, waar het dubbel gestrande DNA-virale genoom wordt gerepliceerd en verpakt in een eiwit schil, genaamd een capside¹. Om te beginnen, het virus drukt zijn eigen eiwitten, kaping host machines en het voorkomen van expressie van niet-essentiële gastheer genen, een proces genaamd de host uitschakeling effect. De meerderheid van deze activiteit is gelokaliseerd in specifieke 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)-vrije nucleaire gebieden genaamd virale replicatie compartimenten, bestaande uit zowel gastheer en virale eiwitten, Rna's, en virale DNA². De cel wordt gereviseerd om ruimte en middelen te bieden voor de replicatie compartimenten en daarmee het samenstellen van virale capsid's. Zodra de capside de Nucleus verlaat, is het onduidelijk hoe de capside in het cytoplasma is omhuld om een virale deeltje met membraan gebonden te produceren, ook bekend als een virion. Inzicht in de lokalisatie en ruimtelijke verschuivingen van zowel gastheer en virale biomoleules tijdens de lytische fase biedt dieper mechanistisch inzicht in de opstelling van het replicatie compartiment, host-afsluit effect, de virion-egress-route en andere processen in verband met herpes virale infectie en replicatie.

Momenteel is de beste methode om deze veranderingen te detecteren en te bestuderen de visualisatie van eiwitten en Rna's in geïnfecteerde cellen met immunofluorescentie (IF) en fluorescerende in-situ hybridisatie (FISH), respectievelijk. Gebruik van een tijd-cursus met deze technieken onthult de lokalisatie van biomoleules op belangrijke punten van de lytische fase of eenvoudigweg, spatiotemporele gegevens. VIS en als aanvulling op andere biochemische technieken, zoals remming van een cellulair proces (bv. remming van virale DNA-replicatie), RT-qPCR (real-time polymerase kettingreactie), RNA-sequencing, noordelijke blots, massaspectrometrie, Western blotting, en analyse van virale DNA-productie, dat kan een meer globaal beeld van cellulaire activiteiten te bieden.

We ontwikkelden RNA-VISSTRATEGIEËN om de RNA-producten van specifieke genen te onderzoeken en een computationele analyse die de nucleocytoplasmische ratio van een specifiek genproduct kwantitatief berekent. De monstervoorbereiding, aangepast uit eerdere publicaties van Steitz en collega's^3,4, is relatief eenvoudig en kan worden gebruikt voor zowel aanhandige als hangende cellen. Het protocol is ook aanpasbaar voor gelijktijdig gebruik van meerdere RNA visstrategieën (dubbel RNA vis) of RNA vis met IF-strategieën. Ontwikkeling van een specifieke VISSTRATEGIE is uitdagend, maar suggesties om succes te verbeteren worden geschetst. De hier beschreven gegevensanalyse is kwantitatief als fluorescerende kralen en sterke markeringen van compartiment grenzen worden gebruikt en biedt aanvullend inzicht in de micro grafieken, inzicht dat observatie bias verwijdert. Het gedetailleerde protocol is ontworpen voor zowel latent en lytische cellen geïnfecteerd door Kaposi Sarcoma-geassocieerde herpesvirus (KSHV) en kan worden gebruikt met niet-geïnfecteerde cellen of cellen geïnfecteerd door andere herpesvirussen⁵. De methoden van kwantatie zijn van toepassing op studies over nucleocytoplasmische verschuivingen of verplaatsing tussen subcellulaire compartimenten in de meeste cellen.

Protocol

1. ontwerp van fluorescentie in situ (vis) Anti-sense oligonucleotiden om een specifieke herpesvirale transcriptie te detecteren

1. Selecteer 25 tot 40 NT segmenten uit de volgorde van RNA van belang en converteren naar zijn anti-Sense. Een succesvolle VISSTRATEGIE kan bestaan uit één tot tien of meer verschillende anti-Sense oligonucleotiden. Houd bij het selecteren van reeksen rekening met het volgende:
   1. Als het RNA van belang een uniek herhalingsgebied bevat, Profiteer dan van deze functie en ontwerp een anti-Sense oligonucleotide om de herhalings volgorde te targeten.
      Opmerking: Tycowski en collega's⁵ geven een voorbeeld van deze strategie met rhesus rhadinovirus (RRV) polyadenyleerd nucleair (pan) RNA.
   2. Als het RNA van belang bevat een bekende eiwitbinding site of stam-lus structuur, ontwerp oligonucleotiden die deze gebieden te vermijden.
   3. Overweeg, afhankelijk van de doelstellingen van de experimenten, de intronic-sequentie en het al dan niet ontwerpen van een anti-Sense oligonucleotide.
2. Voer eenvoudige rekenkundige analyses uit op de geselecteerde Anti-sense-sequenties om een bindende specificiteit te garanderen en de aggregatie van het Anti-sense oligonucleotide te verminderen.
   1. De sequenties moeten ongeveer 50% GC-rijk zijn (hoge Guanine-en Cytosine-inhoud) en hebben een smelttemperatuur in het bereik van 60 tot 70 °C.
   2. Gebruik een Sequence Analyzer Tool om sequenties te selecteren die niet zelf dimeriseren of haarspelden vormen met smelttemperaturen boven 37 °C, de hybridisatie temperatuur.
   3. Voer een NCBI BLASTn (National Center for Biotechnology Information Basic-zoekhulpmiddel voor lokale uitlijning voor nucleotide-overeenstemmingen) zoek naar de geselecteerde reeksen op basis van de host-en virale transcriptomes met behulp van de ' enigszins vergelijkbare ' instelling. Deze zoekopdracht zal unieke Anti-sense oligonucleotiden identificeren die waarschijnlijk niet zullen binden aan andere host of virale transcripten.
      Opmerking: als transcriptomes niet beschikbaar zijn, voert u de BLAST-zoekopdracht uit met de genomische sequenties. Het is ideaal als de zoekopdrachten worden uitgevoerd op de sequenties van het virus geïsoleerd van de geïnfecteerde cellen gebruikt in het experiment omdat wilde stammen de neiging om te diversifiëren en bevatten een combinatie van sequenties van verschillende Lab stammen.
3. Bestel gezuiverde DNA oligonucleotiden overeenkomend met de Anti-sense sequentie die computationeel is geverifieerd om uniek te zijn en waarschijnlijk te binden aan het doelwit RNA. Er moeten geen speciale aanpassingen worden aangebracht in de oligonucleotiden.
4. Test de ontworpen Anti-sense oligonucleotiden voor bindende specificiteit door vis en Northern Blot.
   1. Het gebruik van een niet-geïnfecteerde cellijn van dezelfde hostsoort (bijv. 293T) en idealiter hetzelfde celtype, voert een transfectie uit met een plasmide die het RNA van belang uitdrukt van een robuuste promotor (CMV, cytomegalovirus) en één met de lege Vector (bijv. pcDNA3). Gebruik een positieve controle voor Transfectie zoals co-transfectie met een GFP (groen fluorescerende proteïne) plasmide (bijv. pmaxGFP) of de vector die GFP bevat.
      Opmerking: het is belangrijk om te voorkomen dat cellijnen die zijn vereeuwigd met behulp van het herpesvirus Epstein-Barr-virus (EBV), omdat er sequentie overeenkomsten zijn tussen herpesvirussen.
   2. Voer vissen uit zoals beschreven in rubriek 3 op beide cellen sets met de Anti-sense oligonucleotiden zoals beschreven in dit protocol. Leid de succesvolle kandidaten af door VISEXPERIMENTEN te vergelijken met individuele, paren of sets van de Anti-sense oligonucleotiden. Gebruik een positieve controle voor het visprotocol zoals U2 snRNA (kleine nucleaire RNA) vissen, aanwezig op 500.000 exemplaren per humane celkern⁶ (tabel 1).
   3. Het fluorescerende signaal moet specifiek en sterk zijn in de cel met het RNA van belang. Ontwerp extra anti-Sense oligonucleotiden om het signaal te versterken en Anti-sense oligonucleotiden te verwijderen die niet specifiek van overweging worden gebonden. De signaalsterkte moet boven de achtergrond en de auto fluorescentie liggen.
   4. Test bindende specificiteit door Northern Blot.

2. Oligonucleotide en celbereiding

1. Gebruik, volgens de instructies van de fabrikant, met terminale transferase de Anti-sense oligonucleotiden met dioxigenin (DIG)-dUTP of, indien sterk bindend, rechtstreeks met een fluorescerende nucleotide zoals Alexa Fluor 594-5-dUTP. Na het labelen is extra zuivering niet nodig. Bewaar gelabelde oligonucleotiden bij-20 °C tot meerdere jaren en in tin folie indien direct gelabeld om fotobleaching te voorkomen.
   Let op: de etiketteringsoplossing bevat een giftig materiaal, kalium cacodylaat. Omgaan met etiketterings reacties met handschoenen.
   Opmerking: om bronnen te sparen, kunnen verschillende anti-Sense oligonucleotiden in één reactie worden gelabeld. Dit protocol maakt gebruik van 3 '-end labeling. Interne labeling is uitdagend omdat de chemische groep (bijv. graven of de fluorophore) wordt gevangen of niet in staat is om de actieve plaats van een DNA-polymerase in te voeren. Een experiment met twee verschillende rna's kan worden uitgevoerd met behulp van direct-gelabelde Anti-sense oligonucleotiden en anti-dig immunofluorescentie met een verschillende de (bijv. FITC (fluorescein) of Alexa Fluor 488 met Alexa Fluor 594).
2. Hecht de cellen aan de dia's met acht kamer.
   Opmerking: met acht kamer dia's zijn verschillende gelijktijdige experimenten mogelijk, terwijl kostbare bronnen zoals antilichamen worden geminimaliseerd. Een alternatief voor 8-kamer slides is een zes-well weefselkweek plaat met standaard dekstroken (22 mm x 22 mm) die beide steriel zijn. Een soortgelijke regeling is mogelijk met circulaire covers Lips en een 24-Well weefselcultuur plaat. Verhoog voor beide de volumes die in dit protocol worden genoemd door 10-15x (bijvoorbeeld 1,75 mL hybridisatieoplossing) en 4x (bijv. 600 μL hybridisatieoplossing).
   1. Gebruik voor aanhandige lytische cellen 1x trypsine/PBS bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 10 min om cellen op te schorten en tot 60% confluency te verdunnen.
      Opmerking: Aanhandige cellijnen gebruikt in vis experimenten opgenomen 293T, iSLK. 219⁷, en islk-BAC36 cellen⁸.
   2. Breng 200 μL celsuspensie aan op elke kamer van de steriel acht-Chambered glaasjes en laat de zaad groei toe voor 12-24 uur bij 37 °C en 5% CO₂. Pas zo nodig aan voor langzaam of snel groeiende cellen en voor cellen die gemakkelijk door trypsine worden beschadigd.
      Let op: het doel is om gelijkmatig verdeelde cellen stevig aan de dia te hebben bevestigd. Overweeg de inducerende lytische fase na hechting als de lytische cellen kwetsbaar zijn. Conclusies getrokken uit experimenten met iSLK-cellen zijn beperkt⁹.
   3. Voor lytische Suspension-cellen, Pre-Treat acht kamer dia's met 1:10 poly L-lysine voor 5 min onder de weefselcultuur kap. Laat de dia's vervolgens 's nachts drogen bij kamertemperatuur of 1 uur bij 65 °C. Incuberen 800 μL lytische cellen met een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml met de met de Chambered glijbanen gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 37 °c en 5% Co₂.
      Let op: suspensie-cellen zullen zich vestigen in een monolayer, vasthouden aan de poly L-lysine en dus overtollige cellen zijn geen zorg in vergelijking met aanhandige cellen. Lytische cellen die, indien mogelijk, druiven clusters vormen, moeten worden gescheiden door zachte grondig of chemische middelen. Toegegeven, de auteurs hebben niet veel succes met dergelijke aanbevelingen in het geval van lytische bjab-RRV-GFP cellen. Als de suspensie-cellen niet goed hechten, overweeg dan de tijd of concentratie van de incubatie van poly L-lysine te verhogen.

3. fixatie, immunofluorescentie (optioneel), hybridisatie en visualisatie van virale Rna's

1. Verwijder media en overtollige cellen. Gebruik in dit protocol vacuüm afzuiging om oplossingen en zachte micropipetting te verwijderen om oplossingen toe te voegen.
   Opmerking: de sterkte van een vacuüm kan worden verminderd door een micro pipetpunt van 200 μL over de glazen Pasteur-pipet te plaatsen. Vervang de micropipet punt tussen de wasstappen om verontreiniging te voorkomen. Elke Wash-stap moet snel worden uitgevoerd, omdat het noodzakelijk is dat de cellen nooit uitdrogen.
2. Repareer onmiddellijk de cellen met voorgekoelde 4% formaldehyde/PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) op ijs gedurende 30 min. was de cellen driemaal met 200 μL 1x PBS gekoeld tot 4 °C en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur of op ijs.
   1. Permeabiliseer de vaste cellen met 200 μL voorgekoelde 0,5% Triton-X/PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) gedurende 10 min op ijs of 750 μL voorgekoelde 70% ethanol bij 4 °C gedurende 1 uur (min) tot 7 d (max.).
      Opmerking: Verzamel eiwitten, totaal RNA en genomische DNA-samples op het punt van fixatie om consistentie tussen beelden en biochemische testen te waarborgen. Alle wassen in dit protocol worden op dezelfde wijze uitgevoerd, tenzij anders aangegeven. 70% ethanol lost de lijm tussen de kamers en de glijbaan, die later scheiden vergemakkelijkt, en biedt ook een belangrijke pauze in het protocol. Niettemin, gebruik van paraffine folie rond de kamer glijbaan om de verdamping te verminderen en controleer het niveau van de ethanol in elke kamer ongeveer elke 8 h. 70% ethanol vlakt ook de cellen af, maakt een scherpere afbeelding, terwijl Triton-X de cellen niet dehydrateert en de afmetingen van de cel.
3. Verwijder de kamers zorgvuldig om te voorkomen dat de glijbaan kraken. Als het experiment immunofluorescentie (IF) van een virale of gastheer eiwit met een primair polyklonale antilichaam omvat, voer dan de IF zoals hieronder beschreven voordat u doorgaat naar RNA vissen. Als de immunofluorescentie een monoklonaal primair antilichaam gebruikt, voer dan immunofluorescentie uit zoals beschreven in stap 3.3.1 na stap 3,11.
   Opmerking: gebruik een nieuw verwijderings apparaat of een met zeer weinig overgebleven lijm van de fabrikant en verlicht de kamers zachtjes om te voorkomen dat de glijbaan scheuren. Het gebruik van 70% ethanol als permeabilizing reagens voor 4 uur vermindert de kans op barsten aanzienlijk. In het geval van een scheur, het protocol op de kamers die niet door de scheur zijn aangetast, verder gaan en rekening worden met de hogere oxidatie graad van onvolkomen verzegelde glijbanen (d.w.z. verminderde bewaarduur).
   1. Spoel cellen met voorgekoelde 1x PBS en blokkeren met voorgekoelde 4% BSA (boviene serumalbumine)/1x PBS gedurende 30 minuten bij 4 °C.
      Opmerking: het gebruik van BSA in dit protocol beperkt niet-specifieke labeling.
   2. Verwijder de blokkerende oplossing en inbroed de cellen met 1:200 of een ander polyklonale primair antilichaam in 0,1% BSA/1x PBS voor 1 uur bij 4 °C. Was dan drie keer met 1x PBS.
      Opmerking: een antilichaam¹⁰ voor de detectie van SSB/ORF6 (virale enkelvoudig gestrande DNA-bindend eiwit) werd gebruikt bij 1:200 verdunning.
   3. Inbroed de cellen met een secundair antilichaam met de dat compatibel is met het Fish-detectie-antilichaam gedurende 1 uur bij 4 °c. Was drie keer met 1x PBS. Bevestig vervolgens met 4% formaldehyde/1x PBS voor 10-15 min en permeabilize met ofwel Triton-X of 70% ethanol zoals eerder beschreven voordat u doorgaat met vissen. Afdekplaat met tinnen folie om fluorescerende signaal te behouden en fotobleaching te voorkomen.
4. Was de cellen één keer met 2x SSC (zoutoplossing Natriumcitraat) en breng vervolgens 45 μL hybridisatie oplossingen aan, bestaande uit 50% formamide, 10% dextran sulfaat, 2x SSC, 0,1% BSA, 500 μg/mL zalm sperma-DNA, 125 μg/mL E. coli tRNA, en 1 mm vanadyl ribonucleoside Complexen. Inincuberen gedurende 1 uur bij 37 °C in een vochtigheids kamer die een 150 mm Petri schaaltje kan zijn met bevochtigde steriele doekjes.
   Opmerking: bereid verse hybridisatieoplossing ten minste een uur voor gebruik. Los de dextran sulfaat eerst in water op, regelmatig vortexeren en inbroed in een waterbad van 37 °C.
5. Bereken een voorgestelde concentratie van 25 μM oligonucleotiden in 35-uL-hybridisatieoplossing per kamer. Pas indien nodig de concentratie van anti-Sense oligonucleotide aan. Voeg gedestilleerd water toe aan de oligonucleotiden om het denaturatievolume tot 10 μL te brengen.
   Opmerking: na de etiketterings reactie worden de oligonucleotiden opgeslagen in de afgebluste oplossing met 0,18 M kalium cacodylaat, 23 mM tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl₂, 18 mm edta, 2,7 mm K-fosfaat, en 6,8 mm kcl, 45 μM 2-mercaptoethanol, 0,02% Triton X-100 en 2% glycerol. De concentraties zijn hoog genoeg dat verdunning met water de denaturatieoplossing zal brengen tot concentraties in de buurt van 1x TE (10 mM tris-HCl en 1 mM EDTA), een standaard oligonucleotide denaturatiebuffer.
6. Denature de DIG-en/of Alexa Fluor 594-gelabelde oligonucleotiden bij 95 °C gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 35 μL verse hybridisatieoplossing per beoogde kamer toe aan de gedenatureerde oligonucleotiden. Bij het uitvoeren van dubbele vissen kunnen beide sets Anti-sense oligonucleotiden samen worden gedenatureerd en hybridiseerd.
7. Verwijder de pre-hybridisatieoplossing en voeg vervolgens hybridisatieoplossing met de gelabelde oligonucleotiden toe aan de cellen. Inbroed 's nachts in de vochtigheids kamer bij 37 °C met tin folie om de fluorophore-gelabelde oligonucleotiden te beschermen.
   Opmerking: incubatie moet ten minste 10 uur en niet meer dan 24 uur zijn.
8. De volgende dag was de cellen tweemaal met 2x SSC gedurende 10 minuten bij 37 °C en vervolgens tweemaal met 1x SSC gedurende 10 minuten bij 25 °C.
9. Repareer de cellen met voorgekoelde 4% formaldehyde/1x PBS voor 10-15 min op ijs. Was de cellen vervolgens driemaal met PBS en permeabilize voor 1 uur met voorgekoelde 70% ethanol of gedurende 10 minuten met voorgekoelde 0,5% Triton-X/1x PBS bij 4 °C.
10. Inincuberen de cellen met 1:200 anti-DIG FITC in voorgekoelde 0,1% BSA/1x PBS voor 1 uur bij 4 °C. Verwijder de antilichaam oplossing en was driemaal met 1x PBS.
11. Repareer met voorgekoeld 4% formaldehyde/1x PBS voor 10-15 min bij 4 °C en spoel vervolgens drie keer met 1x PBS. Als immunofluorescentie wordt uitgevoerd voor een gastheer of virale eiwit met een monoklonaal primair antilichaam, permeabiliseer de cellen en voer vervolgens het IF-protocol dat is beschreven in stap 3.3.1. Ga anders naar de DAPI-kleuring.
12. Inbroed de cellen met 0,4 μg/mL DAPI in voorgekoelde 0,5% Triton-X/1x PBS voor 15 min op ijs en spoel vervolgens drie keer met 1x PBS.
13. Monteer dia's met fluorescerende kralen (optioneel) en een afdekmedium. Sluit vervolgens de Afdeklijst af op de glijbaan met blanke nagellak.
14. Met behulp van een confocale Microscoop, verzamelen beelden van de monsters binnen een uur tot een week van het uitvoeren van het protocol bij 630x vergroting. Breng meerdere lakken nagellak aan om de cover slip te dichten en de levensduur van de te verlengen door de oxidatie snelheid te verlagen.
    Opmerking: gebruik geen DAPI-bevattende bevestigings medium. Bij het verzamelen van de afbeeldingen, opnemen van de schaalbalk op elke afbeelding voor latere kwantificering. Fluorescerende kralen dienen als controle van de intensiteit van de fluorescentie tussen dia's en monster preparaten¹¹. Verzamel afbeeldingen in de middensectie van de cel voor tweedimensionale (2D) kwantificering in stap 4.

4. kwantificering van vis en als beelden om subcellulaire lokalisatie te markeren en om de nucleocytoplasmische verhouding van fluorescentie te bepalen

1. Voer beeldanalyse uit op een geassembleerde stapel van de verschillende TL-gekleurd en samengevoegde afbeeldingen om consistentie te garanderen. Stel de schaal van de analyse software voor afbeeldingen in met de schaalbalk die is meegeleverd bij het verzamelen van de afbeeldingen.
2. Gebruik een lijn gereedschap en een plot profielfunctie om de intensiteit van de fluorescentie over verschillende kanalen te kwantificeren en in verwijzing naar de nucleaire DAPI-vlek. Geef vervolgens de regel permanent op een kopie van de afbeelding aan met behulp van markeringen die het oordeel van de kijker niet belemmeren of beïnvloeden.
   1. Criteria vaststellen om te begeleiden waar de lijn wordt getekend, zoals een spoor dat een verscheidenheid aan topografische kenmerken, pieken en dalen vastlegt, langs een centrale as of een lijn die geen oververzadigde gebieden doorkruist.
      Opmerking: deze lijn sporen tonen ruwe fluorescentie in een cel en zijn dus beperkt tot vergelijkingen van de locaties van een vlek, niet intensiteit. Als u intensiteiten van dezelfde vlek tussen dia's, behandelingen of preparaten wilt vergelijken, voegt u een fluorescerende kraal toe aan de dia als een interne controle tijdens stap 3,13. De fluorescerende kraal moet worden toegevoegd tijdens het montage proces en gedetecteerd met dezelfde instellingen op de excitatie laser en fotomultiplicator buis (confocale).
3. Om een verschuiving in subcellulaire lokalisatie te kwantificeren, bereken je nucleocytoplasmorische verhoudingen van cellen die verschillende behandelingen ondergaan.
   1. Meet het gebied en de ruwe fluorescentie intensiteit van zowel de Nucleus als het cytoplasma met behulp van de nucleaire DAPI-vlek om de binnenste grens in te stellen. Omvatten nucleaire en cytoplasmische controles zoals een nucleair RNA (bijvoorbeeld KSHV PAN RNA) en cytoplasma RNA (bijvoorbeeld gastheer GAPDH mRNA). Bereken bovendien de achtergrond intensiteit voor drie cel-achtige gebieden en gemiddelde de waarden per pixel of μm².
      Opmerking: intensiteitswaarden hebben de neiging om eenheden te missen en dus wordt de term "eenheden" gebruikt.
   2. Normaliseer zowel de waarden voor nucleaire als cellulaire ruwe intensiteit door eerst de gemiddelde achtergrond voor hetzelfde gebied te bepalen en vervolgens die geïndividualiseerde waarde af te trekken van de ruwe intensiteit van het gebied.
      1. Een kern van een lytische B-cel heeft bijvoorbeeld een oppervlakte van 133,4 μm² en een ruwe intensiteit van 75976 eenheden, terwijl de achtergrond intensiteit voor hetzelfde fluorescerende signaal werd vastgesteld op 0,67 eenheden per μm². De genormaliseerde kern intensiteit zou
         
   3. Voer de waarden in de volgende vergelijking in.
      
      Opmerking: deze berekening bepaalt voor wijzigingen in subcellulaire gebied. Lytic inductie-en medicamenteuze behandelingen kunnen de Nucleus vergroten of de grootte van de cel wijzigen.
   4. Maak een boxwhisker-plot om de resultaten te interpreteren. Een gelijke verdeling van het fluorescerende signaal zou bijna nul zijn, terwijl een nucleaire distributie een positieve ratio-waarde zou bevoorrecht en een cytoplasmische verdeling zou gaan naar een negatieve ratio-waarde.

Representative Results

De vissen en als de in dit manuscript beschreven methoden worden weergegeven in Figuur 1 , samen met de kwantificering van de resultaten door lijn sporen van de fluorescentie intensiteit. De hier gepresenteerde resultaten zijn semi-kwantitatief en bieden inzicht in lokalisatie, in plaats van vergelijkingen tussen intensiteiten van verschillende fluorescerende vlekken, omdat experimenten geen fluorescerende kraal bevatten in de voorbereiding van de dia. Figuur 1 onthult ook dat de cytoplasmatische en nucleaire gebieden en hun verhoudingen zijn verschillend voor latente en LYTISCHE KSHV-geïnfecteerde cellen. Zo wordt het gebied bestuurd in de nucleocytoplasmische verhouding, tentoongesteld in Figuur 2. Figuur 2 valideert de in dit manuscript beschreven berekening voor een nucleocytoplasmische verhouding met het gebruik van een nucleaire controle, de virale polyadenylated nucleair (pan) RNA, en een cytoplasmische controle, de gastheer Gapdh mRNA. Figuur 3 onthult dat wanneer KSHV DNA-replicatie wordt geremd in de lytische fase door het gebruik van ofwel fosfonazijnzuur (DOXY + PAA) of cidofovir (Doxy + CIDO), de vroege ORF59-58 transcriptie verschuift naar een overwegend cytoplasmatische lokalisatie. De micro grafieken en de twee kwantificeringsmethoden in Figuur 3 ondersteunen dit resultaat en ONTHULLEN dat pan-RNA op specifieke nucleaire locaties lokaliseert ondanks remming van virale DNA-replicatie en de verandering die werd gezien voor vroege ORF59-58 transcriptie.

Figuur 1: lijnen sporen van fluorescerende intensiteit onthullen subtiliteiten in fluorescentie in situ HYBRIDISATIE (vissen) van kshv transcripten en immunofluorescentie (if) van kshv-replicatie compartimenten. (a-B) Confocale beelden van Trex RTA (tetracycline induceerbare cytochromen virale replicatie en transcriptie Activator proteïne) bcbl-1 cellen¹² die zijn geïnduceerd in de lytische fase voor 24 h met doxycycline (doxy). Schaalbalk geeft 10 μm aan.a)fluorescentie in situ HYBRIDISATIE (vis) voor virale rna's (groen) en immunofluorescentie (if) voor virale enkelvoudig-gestrande DNA bindend eiwit (ORF6/SSB) (rood), een component van KSHV replicaties compartimenten, blijkt dat virale transcripten lokaliseren in het cytoplasma, Nucleus, en in nucleaire Foci buiten ORF6/SSB verrijkte gebieden, ook wel bekend als replicatie compartimenten. De anti-SSB antilichaam¹⁰ werd verdund tot 1:200 in 0,4% BSA/1x PBS en gedetecteerd met 1:500 anti-konijn Alexa Fluor 594 secundair antilichaam in 0,4% BSA/1x PBS. Alle anti-Sense oligonucleotiden die tijdens deze studie worden gebruikt, zijn beschikbaar in tabel 1. De detectie van ORF59-58 mRNA omvat zowel de bicistronic en de monocistronic transcripten. Echter, in KSHV-geïnfecteerde JSC-1 cellen, de monocistronic mRNA is ten minste 18-voudige minder overvloedig dan de bicistronic transcript en waarschijnlijk draagt slechts een klein deel van het totale fluorescerende signaal waargenomen¹³. Bovendien kan een van de PAN-RNA oligonucleotiden (SB88) ook de virale transcriptie voor K7 detecteren. Het signaal van een detectie van k7 zal niet zo significant zijn in vergelijking met het signaal dat KSHV PAN RNA detecteert, dat aanwezig is op bijna 80% van alle polyadenylated RNA in een lytische kshv-geïnfecteerde cel¹⁴. Bovendien is een van de vier Anti-sense oligonucleotiden (tkv13) bij de detectie van de k 8.1 mRNA in staat om te binden aan meerdere isovormen van k 8.1 en andere isovormen van nabijgelegen open Lees kaders (ORF). Het VISSIGNAAL van alleen oligonucleotide tkv13 is onvoldoende (gegevens worden niet weergegeven). De gecombineerde hybridisatie van de vier oligonucleotiden en de binding van hen op dezelfde transcriptie biedt waarschijnlijk het waargenomen sterke signaal. Witte lijnen flankerende cellen in (A) verbeelden het lijnpad van fluorescentie intensiteiten voor de vissen en als signalen, uitgezet in (C). B) digitaal ingezoomde beelden van cellen in (a) geflankeerd door witte lijnen. Voor het gemak wordt het blauwe DAPI-kanaal weggelaten. C) de waarnemingspunten vertonen de relatieve fluorescentie intensiteiten voor elke vlek langs dezelfde lijn: αSSB (rood), virale transcripten (groen; transcript aangegeven op plot) en DAPI (blauw). Gearceerde gebieden geven DAPI-gereduceerde regio's aan die corresponderen met virale replicatie compartimenten of SSB/ORF6-verrijkte gebieden. D) de verhouding tussen de veranderingen in het nucleaire gebied en de cellulaire zone en dus de gehele intensiteit van de fluorescentie die wordt gebruikt, werd genormaliseerd voor het gebied. E) nucleaire en cellulaire gebieden, gemeten voor Trex RTA BCBL-1-cellen met en zonder lytische activering. Statistisch significante veranderingen worden gezien in vergelijking met niet-geïnduceerde cellen. De doos en de whisker plots vertegenwoordigen de 10 en 90 percentielen. Afbeelding herdrukt met kleine wijzigingen van Vallery, Withers en collega's¹⁵ onder een Creative Commons Attribution licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2 : Controle nucleaire en cytoplasmische vis strategieën valideren van de berekeningsmethode van de nucleocytoplasmische verhouding. A) vis voor de gastheer Gapdh mRNA (rood) en voor de virale polyadenylated nucleaire (pan) lncRNA (groen) en DAPI nucleaire kleuring (blauw) zijn positieve viscontroles voor de berekeningsmethode voor het bepalen van de nucleocytoplasmorische verhouding. Host gapdh mRNA is een canonieke doelstelling van het uitschakeling-effect van de kshv en wordt afgebroken op lytische-inductie, zoals hier wordt weergegeven. B) fluorescentie intensiteiten langs een lijn die wordt aangegeven door witte lijnen die flankerende lytische cellen in (a). DAPI (blauw), PAN-RNA (groen) en GAPDH mRNA (rood). Gearceerde gebieden zijn zoals gedefinieerd in Figuur 1. C) kwantificering van de fluorescentie intensiteiten van cellen die worden vertegenwoordigd door (a) (n = 150 voor elk gapdh-monster, n = 75 voor de ORF59-58 of k 8.1-monsters) werden uitgevoerd voor drie biologische replicaten van cellen in Figuur 2 en Figuur 3 . P-waarden: > 0,05 (NS), < 0,05 (*), < 0,005 (* *) en < 0.0005 (* * *). D) representatieve noordelijke vlek van RNA van TREx RTA BCBL-1 cellen 24 h na Doxy. De doos en whisker plots vertegenwoordigen het 10 en 90 percentiel. Afbeelding herdrukt met kleine wijzigingen van Vallery, Withers en collega's¹⁵ onder een Creative Commons Attribution licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: lijn sporen en berekening van nucleocytoplasmatische ratio's onthullen een sterke verschuiving naar het cytoplasma voor de vroege lytische ORF59-58 transcriptie na remming van virale DNA-replicatie. TREx RTA BCBL-1-cellen werden behandeld voor 24 h zonder geneesmiddel (Unind), doxycycline alleen (Doxy), of met doxycycline en één remmer van herpes virale DNA-replicatie, fosfonazijnzuur (Doxy + PAA) of cidofovir (Doxy + CIDO). Panelen (a-C) tonen gegevens van monsters verzameld uit drie biologische replicaten. A) qPCR-waarden voor virale INTRACELLULAIRE DNA tijdens remming van virale DNA-replicatie werden genormaliseerd naar de hoeveelheid van het PROMOTOR-DNA van het hostcel-gapdh-gen. (B) Northern Blot (links) en kwantificering (rechts) vertonen totale RNA-niveaus tijdens remming van virale DNA-replicatie. Niet-geïnduceerde niveaus van alle Rna's waren niet detecteerbaar. C) representatieve visbeelden voor virale ORF59 transcripten (groen) en pan-RNA (rood) bij remming van virale DNA-replicatie. DAPI (blauw) was de nucleaire vlek. D) de kwantificering van de fluorescentie intensiteiten van cellen, vertegenwoordigd door (C) (n = 75 elk), werd gedaan op biologische triplicaten. E) fluorescentie intensiteiten langs door de cellen aangegeven lijnen die worden aangeduid met witte lijnen in (C) worden weergegeven: DAPI (blauw), pan-RNA (rood) en ORF59-58 mRNA (groen). P-waarden: > 0,05 (NS), < 0,05 (*), < 0,005 (* *) en < 0.0005 (* * *). De sequenties van alle oligonucleotiden in deze studie zijn vermeld in tabel 1. De doos en de whisker plots vertegenwoordigen de 10 en 90 percentielen. Figuur herdrukt van Vallery, Withers, en collega's¹⁵ onder een Creative Commons Attribution licentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Noordelijke oligos
Oligo No.	Gen	Volgorde				Positie binnen het gen	Positie met de referentie NC 009333.1 genoom (getallen geven geen richting of streng weer)
KORF50	KSHV RTA/ORF50	Een van de meest GEKKEN in de mond.				1284 tot en met 1309	73936 tot en met 73961
JBW249	KSHV SOX/ORF37	TAACCTGACACCACCAAACACACGGTCCAC				262 tot en met 291	57633 tot en met 57662
tkv379	KSHV ORF59-58	TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT				941 tot 967 (ORF59 ORF)	95879 tot en met 95905
tkv13	KSHV K 8.1	AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT				16 tot 57	76029 tot en met 76070
SB2	KSHV PAN RNA	Een van de meest GEKKEN.				664 tot en met 687	29496 tot en met 29519
RNase P	Menselijke RNase P	TGGGCGGAGGAGAGTAGTCTG				319 tot en met 339	N/a
VISSONDES
Oligo No.	Gen	Volgorde
SB2	KSHV PAN RNA	Een van de meest GEKKEN.				664 tot en met 687	29496 tot en met 29519
SB85	KSHV PAN RNA	CGCTGCTTTCCTTTCACATT				373 tot en met 392	29205 tot en met 29224
SB88	KSHV PAN RNA	GTGAAGCGGCAGCCAAGGTGACTGG				1 tot 22	28830 tot en met 28854
tkv13	KSHV K 8.1	AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT				16 tot 57	76029 tot en met 76070
tkv14	KSHV K 8.1	TGATATTAAGGCATCGGTCAGTTCTGTGGTGGCCTGGA				377 tot en met 414	76390 tot en met 76427
tkv15	KSHV K 8.1	GTAAGGTTACGCTTTATCCCTACACACCGACGGTTTACCC				461 tot en met 500	76474 tot en met 76513
tkv16	KSHV K 8.1	Een van de meest GEKKEN van de kaakje				688 tot en met 725	76701 tot en met 76738
tkv376	KSHV ORF59-58	TAATGTGTTCATTGACCCTCCTGATT				54 tot en met 79	96767 tot en met 96792
tkv377	KSHV ORF59-58	GCCGATCCGTGCACTTGCACTACTCCGGTT				93 tot en met 122	96724 tot en met 96753
tkv378	KSHV ORF59-58	AAGGCTATGCCAGCGTCGAGTACATTCGCA				300 tot en met 329	96517 tot en met 96546
tkv379	KSHV ORF59-58	TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT				941 tot en met 967	95879 tot en met 95905
tkv380	KSHV ORF59-58	Een van de meest GESMOKKELDE schoenen				1289 tot en met 1315	95531 tot en met 95557
tkv381	KSHV ORF59-58	EEN van de meest GEKKEN op de borst				1423 tot en met 1450	95396 tot en met 95423
tkv382	KSHV ORF59-58	TACCTGTGTACTATTGGCGGCGCCTGATACAC				1571 tot en met 1602	95244 tot en met 95275
tkv383	KSHV ORF59-58	GGGTCGAGATTCAGCTAATTAGGCGAAAACTCCACAGG				2136 tot en met 2173	94673 tot en met 94710
Stellaris	GAPDH	Premade door stellaris				N/a	N/a
qPCR-primers
tkv458	GAPDH Promoter	CTGCACCACCAACTGCTTAG				N/a	N/a
tkv459	GAPDH Promoter	GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT				N/a	N/a
tkv319	KSHV ORF39 (gM)	GTGAGGTGCTTCGCTGAGTT				N/a	60075 tot en met 60094
tkv320	KSHV ORF39 (gM)	CCTGGGTCAAGCTGTTGTTT				N/a	60218 tot en met 60237
RT-qPCR-primers
tkv 455	K8/K-bZIP voorwaartse RT qPCR primer	GEAAGDE, Nederland				655 tot en met 673	75603 tot en met 75621
tkv 456	K8/K-bZIP reverse RT qPCR primer voor unspliced	Een van de meest GEKKEN				755 tot en met 774	75703 tot en met 75722
tkv 457	K8/K-bZIP reverse RT qPCR primer voor spliced	GEAGLDE				871 tot en met 888	75819 tot en met 75836
JBW479	Menselijke RNase P voorwaarts	Een van de meest GEKKEN				238 tot en met 257	N/a
JBW480	Menselijke RNase P achteruit	EEN van de meest gege				317 tot en met 336	N/a

Tabel 1: alle oligonucleotiden die bij de analyses van deze publicatie worden gebruikt. Tabel 1 werd gereproduceerd met toestemming van de American Society for Microbiology onder een Creative Commons attributie licentie van Vallery et al.¹⁵.

Discussion

Het protocol dat in dit rapport wordt beschreven, kan worden aangepast aan verschillende celtypen en bevat stappen voor dubbele RNA-vissen en RNA-vissen met als gebruik wordt gemaakt van zowel monoklonaal als polyklonale primaire antilichamen. Hoewel geprepareerde dia's meestal worden afgebeeld met een confocale Microscoop, kan Imaging worden uitgevoerd met een gested (gestimuleerde emissie depletie) Microscoop na wijzigingen van verhoogde antilichaam concentratie en een ander afdekmedium. Voor een betere analyse van afzonderlijke cellen kunnen monsters die met dit protocol zijn bereid ook worden gesorteerd, gefotografeerd en geanalyseerd door een celsorteerder of flow-cytometer met bescheiden veranderingen, zoals Borah en collega's¹⁶laten zien. Dit protocol kan echter niet worden goedgekeurd voor Live-celbeeldvorming.

De kwantificeringsmethoden gedetailleerd elimineren observatie bias en dienen voor het valideren van een potentiële nucleocytoplasmorische verschuiving. De nucleocytoplasmische verhouding bepaalt ook wanneer een biomolecule zich aanpast van gelijkmatig gedispergeerd tot lokaliseren in een specifiek subcellulair compartiment. De hier gepresenteerde resultaten zijn semi-kwantitatief, terwijl het protocol manieren schetst om de kwantificering te versterken. De sterkte van de nucleocytoplasmische verhouding en lijn sporen (stap 4) is afhankelijk van het gebruik van fluorescerende kralen als intensiteits controles (stap 3,13) en het gebruik van duidelijke subcellulaire markers, zoals een voor nucleaire Lamin A/C. Op dit moment bestaat er geen duidelijke grens markering voor KSHV-virale replicatie compartimenten. Ongeacht, deze berekening kan worden uitgebreid naar andere subcellulaire compartimenten met het gebruik van de juiste markeringen.

De belangrijkste hindernis voor het protocol dat in dit verslag wordt beschreven, is de ontwikkeling van VISSTRATEGIEËN voor specifieke transcripten (stap 1). Succes is afhankelijk van de overvloed en bindende kracht van anti-Sense oligonucleotiden. Specificiteit voor bepaalde transcripten wordt nog moeilijker gemaakt door de aanwezigheid van overlappende open Lees kaders (Orf's) in virale Genomes. Virale transcripten hebben dus vaak sequentie gelijkenis¹⁷ met andere virale transcripten uit dezelfde genomische regio, vooral in het geval van herpesvirussen. Vaak moet de ontwikkeling van een VISSTRATEGIE profiteren van meer overvloedige transcripten. Om een gebrek aan een vissignaal op te lossen, moeten gebruikers het visprotocol uitvoeren met de snRNA-visstrategie van U2 om te bevestigen dat technieken in menselijke cellen en voorbereiding van reagentia toereikend zijn. Evenzo kan de KSHV PAN RNA VISSTRATEGIE lytische activatie bevestigen in KSHV-geïnfecteerde cellen. Om het oplossen van bindende door de Anti-sense oligonucleotiden, de auteurs adviseren het ontwikkelen van verschillende anti-Sense oligonucleotiden. Als alles faalt, is een commerciële optie beschikbaar zoals blijkt uit het gebruik van de GAPDH-VISSTRATEGIE in Figuur 2 en door Vallery, Withers en collega's¹⁵.

Sterkere algoritmen om de cellulaire en subcellulaire grenzen te definiëren zou de kwantificerings bias verder elimineren. Sommige analytische beeldverwerkingssoftware kan grenzen instellen voor de cel, Nucleus en meer, maar vereist definitieve markeringen. Ongewone celmorfologieën zoals virale replicatie compartimenten zijn moeilijk voor dergelijke software-een uitdaging voor toekomstige ontwikkeling. Bovendien zijn de hier beschreven kwantificeringsmethoden beperkt tot één optisch segment van een cel (2D-beeldanalyse). Hoewel 3D-beeld verwerving mogelijk is¹⁸, kan toekomstige ontwikkeling van een kwantitatieve 3D-beeldanalyse meer inzicht geven in spatiotemporele regulering van virale replicatie compartimenten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor594-5-dUTP	Life Technologies	C1100
anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody	Invitrogen	A-11037	Goat
Anti-SSB Antibody	N/A	N/A	Ref. Chiou et al. 2002
BLASTn	NIH NCBI	N/A	Free Sequence Alignment Software
Dextran Sulfate	Sigma Aldrich	D8906	Molecular Biology Grade
DIG-Oligonucleotide Tailing Kit	Sigma Roche	#03353583910	2nd Gen
Eight-Chamber Slides	Nunc Lab Tek II	#154453	Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available.
Formamide	Sigma Aldrich	F9037	Molecular Biology Grade
GAPDH Probes	Stellaris	SMF-2019-1	Compatible with protocol, Quasar 670
ImageJ	NIH, Bethesda, MD	N/A	Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer	IDT	N/A	Free Oligonucleotide Analyzer
pcDNA3	Invitrogen	A-150228
pmaxGFP	Amaxa	VDF-1012
Poly L-Lysine	Sigma Aldrich	P8920
Terminal Transferase	Sigma Roche	#003333574001
Vanadyl Ribonucleoside Complexes	NEB	S1402S
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast.