Summary
Her præsenterer vi en protokol til kvantificering af hjerneskade, underskud i bevægeapparatet og neuroinflammation efter blødning i hjernen i zebrafisklarver, i forbindelse med humant intracerebralt blødning (ICH).
Abstract
Trods den mest alvorlige under type af slagtilfælde med høj global dødelighed, er der ingen specifik behandling for patienter med intracerebralt blødning (ICH). Modellering ICH præ-klinisk har vist sig vanskeligt, og nuværende gnaver modeller dårligt rekapitulere den spontane karakter af menneskelige ICH. Der er derfor et presserende behov for alternative prækliniske metoder til undersøgelse af sygdomsmekanismer i ICH og for potentiel lægemiddel opdagelse.
Brugen af zebrafisk er en stadig mere populær tilgang til Translationel forskning, primært på grund af en række fordele, som de besidder over pattedyr modeller af sygdom, herunder produktive reproduktions rater og larve gennemsigtighed, der giver mulighed for levende Imaging. Andre grupper har fastslået, at zebrafisklarver kan udvise spontan ICH efter genetisk eller kemisk afbrydelse af cerebrovaskulær udvikling. Formålet med denne metode er at udnytte sådanne modeller til at studere de patologiske konsekvenser af hjerneblødning, i forbindelse med præklinisk ICH forskning. Ved hjælp af levende billeddannelse og motilitet assays, hjerneskade, neuroinflammation og lokomotor funktion efter ICH kan vurderes og kvantificeres.
Denne undersøgelse viser, at de vigtigste patologiske konsekvenser af hjerneblødning hos mennesker bevares i zebrafisklarver, der fremhæver model organismen som et værdifuldt in vivo-system til præklinisk undersøgelse af ICH. Formålet med denne metode er at gøre det muligt for det prækliniske slag samfund at anvende zebrafisklarve modellen som et alternativt modelsystem til gnavere.
Introduction
Intracerebral blødning (ICH) er den mest alvorlige sub-type af slagtilfælde forbundet med spontan cerebral kar ruptur og blødning i parenkym fører til hjerneskade, fysisk handicap og ofte død1. På trods af den høje dødelighed og sygelighed, der er forbundet med ICH2, mangler der stadig forståelse for den understøttende ætiologi og patologi efter hæmoragi. Som sådan, der er ingen specifikke behandlinger for at forhindre ICH eller forbedre patientens resultater. De fleste af vores forståelse af sygdom biologi er kommet fra prækliniske gnaver modeller af ICH3, men undersøgelser til dato i disse modeller har undladt at oversætte nogen vellykket terapeutisk til klinikken4,5. Denne fiasko kan skyldes delvis, at nogle begrænsninger af disse prækliniske modeller, herunder manglende evne til nemt at rekapitulere den spontane karakter af menneskelig sygdom og kravet om invasiv kirurgi til at generere modellerne i pattedyr6. Derudover, gnavere udgør praktiske problemer med hensyn til at observere den hurtige indtræden af cellulære reaktioner på ICH i intakt væv. I betragtning af manglen på oversættelse fra gnaver modeller er det bydende nødvendigt at udvikle alternative modeller af spontan ICH, hvis vi skal overvinde disse praktiske problemer og hjælpe med at identificere nye narkotika målsætninger.
De molekylære mekanismer for vaskulær udvikling er velbevaret blandt hvirveldyr, herunder zebrafisk (Danio rerio)7. Som sådan, vedtagelsen af denne model organisme er ved at blive en stadig mere nyttig mekanistisk strategi for at studere cerebrovaskulær sygdom8. Der er genereret en række zebrafiske modeller, som rekapitulere fænotyper forbundet med slagtilfælde-relaterede betingelser9,10,11,12. Brugen af zebrafiske larver til at undersøge sygdoms patogenesen giver både praktiske og videnskabelige fordele i forhold til pattedyrs modeller8. Dette omfatter høje reproduktions rater, hurtig udvikling og larve gennemsigtighed, der giver mulighed for intravital billeddannelse uden de invasive begrænsninger forbundet med gnavere. Kobling af disse fordele med den brede vifte af transgene reporter linjer til rådighed inden for: zebrafisk forskning samfund udgør en kraftfuld in vivo tilgang til at studere sygdoms biologi, endnu ikke udnyttet til at studere den patologiske konsekvenser af ICH.
Skaden respons på blod i hjernen er bifasisk13; den primære fornærmelse forårsager neuronal død og celle nekrose, som derefter indleder en sekundær bølge af skader, der er induceret af medfødte immun aktivering. Den anden fase af hjerneskade, især den Neuro inflammatoriske komponent, betragtes som et realistisk mål for fremtidig narkotikabehandling13. Spontane og cerebral-specifikke blødninger er blevet beskrevet i: zebrafisk larver tidligere14,15,16,17,18,19. To sådanne modeller er brugen af atorvastatin (ATV) ved 24 h post-befrugtning (HPF) at hæmme HMGCR pathway og kolesterol biosyntese14, og en bubblehead (BBH) mutant, som udtrykker en hypomorphic mutation i arhgef7 genet, βpix, hæmmer efterfølgende aktiv remodellering for stramme endovaskulære vejkryds18. Disse modeller udviser spontan cerebral-specifikke blodkar ruptur i begyndelsen af cirkulation (~ 33 HPF). For nylig har vi karakteriseret disse modeller yderligere at afsløre, at centrale aspekter af hjernen skaden respons er bevaret mellem mennesker og: zebrafisk larver20. Denne undersøgelse viser den metodologi, der kræves for at opnå og visualisere spontane hjerneblødninger i: zebrafisk larver, og hvordan man kan kvantificere hjerneskade, og lokomotor og Neuro inflammatoriske fænotyper, der relaterer til den menneskelige tilstand. Disse data og teknikker understøtter brugen af denne model art som et værdifuldt supplerende system til præklinisk ICH-forskning.
Protocol
Zebrafish blev opdraget og vedligeholdt på University of Manchester Biological service Unit under standardbetingelser som tidligere beskrevet21. Adult: zebrafisk opdræt blev godkendt af University of Manchester Animal Welfare og etisk Review Board. Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med britiske Home Office Regulations (PPL: P132EB6D7).
Bemærk: transgene linjer, der anvendes i dette studie, omfatter makrofag-specifik Lineage MPEG1:mcherry (konstrueret in-House som tidligere beskrevet22), neutrofilspecifikke MPO:gfp23,erythroid-specifikke gata1: dsred24 og Ubiq:secannexinv-mvenus, en journalist for celledød (genafledt i hus25)på Wild-type, Nacre (mitfaW2/W2) og mutant (BBHm292) baggrunde. Figur 1 viser den eksperimentelle tidslinje.
Figur 1 : Grafisk af eksperimentel tidslinje til at karakterisere hjerneskade, lokomotor og Neuro inflammatoriske resultater. ICH, intracerebralt blødning; BBH, bubblehead. Figuren er blevet gengivet fra Crilly et al.20 med tilladelse i henhold til en Creative Commons licens. Klik her for at se en større version af dette tal.
1. dag 0: produktion og opsamling af æg
- Indsaml befrugtede embryoner fra naturlig gydning i avls æsker fremstillet af 1 mandlig og 1-2 kvindelig voksen zebrafisk.
Bemærk: for atorvastatin protokol kan enhver wildtype/transgene dyr anvendes dog blødning satser varierer lidt mellem stammer. - Der inkurueres 100 embryoner ved 28 °C i standard E3 embryo medium pr. Petri skål og trin i henhold til standard retningslinjer26.
- På ~ 6 timer efter befrugtning (HPF) fjerne døde og ubefrugtede embryoner fra skålen ved hjælp af en Pasteur pipette.
2. dag 1: behandling med atorvastatin ved 24 HPF
- Dechorionatembryoner til atorvastatinbehandling med skarp ultra tynd dissekat pincet27. Tal, der kræves til eksperimenter, kan justeres i overensstemmelse hermed.
- Der tilsættes 30 mL E3 embryo medium til to rene Petri skåle. Brug en skål til 100 embryoner.
Bemærk: hvis pladerne er designet til cellekultur, skal dechorionerede zebrafisk på dette tidlige stadie ofte holde sig til bunden. For at undgå dette skal pladerne skylles grundigt i rent vand før brug. - Fjern 60 μL embryo vand fra behandlings pladen, og tilsæt 60 μL af 0,5 mM atorvastatin (ATV). Ved en koncentration på 0,5 mM vil ovennævnte fortynding resultere i en slutkoncentration på 1 μM, hvilket vil resultere i ~ 20% af larverne ikke-hæmoraged (ICH-) og ~ 80% af larverne hæmoraged (ICH +). Brug den anden plade til ubehandlet kontrol
Bemærk: atorvastatin er solubiliseret i destilleret vand (3 mg i 10 mL) for at lave en 0,5 mM stamopløsning. Inkuperer natten over ved stuetemperatur i mørket med agitation som solubilisering tager nogen tid. Komplet solubilisering kan tage op til 1 uge. Brug ikke DMSO. Opløsningen er aliciteres og opbevares ved-20 °C. Lad være med at fryse tø. - Brug en Pasteur-pipette til at overføre 100 embryoner i så lidt vand som muligt til behandlings pladerne.
- Pladerne inkueres ved 28 °C.
Bemærk: ICH vil forekomme mellem 33 og 48 HPF. Atorvastatin behøver ikke at blive fjernet, da inkubation længere end 24 timer ikke forårsager yderligere udviklingsmæssige problemer.
3. dag 2: adskillelse af ICH-og ICH + populationer på 50 HPF
- Adskil ICH + fisk fra ICH-populationer og Overfør til nye retter for nemheds skyld.
- Hvis ATV-modellen anvendes i en koncentration på 1 μM, vil 75-100% af larverne udvise blødning (ICH +) på dette tidspunkt.
Bemærk: larvernes respons varierer mellem stammerne, hvis larverne ikke hæmoragere ved de ønskede frekvenser, skal du bruge en ny batch af atorvastatin eller en højere koncentration. Hvis larver ikke har udvist blødning af 48 HPF så overvej dem ICH-. - Hvis du bruger BBH-modellen, vil alle homozygot mutanter udvise blødning ved 48 HPF. Hvis du bruger en heterozygot incross, kan den ICH-heterozygot og dværg søskende bruges som kontrol dyr til eksperimenter.
- Hvis ATV-modellen anvendes i en koncentration på 1 μM, vil 75-100% af larverne udvise blødning (ICH +) på dette tidspunkt.
- Hvis det er nødvendigt, anæstetiserer larverne ved at tilføje 0,02% MS222 til E3-mediet. Brug en Pasteur-pipette til at sortere larverne, så der er blod i hovedet, til de friske E3-medier. Se figur 2.
Bemærk: blod i hovedet kan forekomme i forgrunden, Mid eller baghjernen eller i kombination, og blødning volumen kan variere mellem dyr. I BBH mutanter, ICH er ofte forbundet med svær ødem genkendelige af større hoveder, bredere rum mellem øjnene og en mere diffus blødning. Men ikke alle ICH + BBH larver udviser ødem.
Figur 2 : ICH + hjerneblødning fænotyper. Eksempler på larve ICH fænotyper vedligeholdes på en transgene gata1: dsred reporter Nacre baggrund observeret med en lysfelt stereo mikroskopi (øverste paneler) og fluorescens (nederste panel) på ~ 48 h efter befrugtning. Der blev ikke observeret nogen blødninger i ICH-larver (venstre paneler). Der blev observeret en tydelig ophobning af røde blodlegemer i forhjernen og baghjernen (pile) i ICH + larver (højre paneler). Skala stænger repræsenterer 250 μm. figuren er blevet gengivet fra Crilly et al.20 med tilladelse i henhold til en Creative Commons licens. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. dag 3: celledød og leukocytanalyse ved 72 HPF
- Skærm larverne ved hjælp af et fluorescens mikroskop for at sikre udtryk for fluorescerende protein.
Bemærk: i dette studie blev transgene Ubiq: secannexinv-mvenus larver brugt til at indberette hjernens celledød og dobbelt transgene MPO: gfp; MPEG1: mcherry eller Ubiq: secannexinv-mvenus; MPEG1: mcherry anvendt til leukocytanalyse. - Fyld monterings kammeret til lightsheet med E3-medier, der indeholder 0,02% MS222.
- Anaesthetize larverne ved hjælp af 0,02% MS222. Overfør larver til montering (n = 1-6) til en tør Petri skål overflade i en enkelt dråbe. Fjern så meget væske som muligt.
Bemærk: 1,5% lav smelte agopstået er fremstillet ved hjælp af 0,15 g lavsmelteagopstået opløst i 10 mL E3-medium uden methylenblåt i en mikrobølgeovn og opbevares ved 45 °C indtil brug. - Tilsæt en dråbe 1,5% lavsmelteagopstået (opretholdt som væske i en 45 °C varmeblok) til larverne og brug en 800 μm monterings kapillar, og træk larverne op i hovedet først. Hvis placeringen ikke er nøjagtig, kan larverne udvises fra den agopstået og monteres igen. Lad kapillaren køle af, før den sættes i lightsheet-kammeret.
Bemærk: Alternativt kan der anvendes et confokal mikroskop til denne procedure. Til dette skal larverne monteres sideværts i agopstået på en glasbund skål. - Erhverve z-stack billeder af hovedet mellem øjet linser (~ 300 μm) og proces til maksimal intensitet projektion billede.
- Analyser hjernen region fra billeder indsamlet for det samlede antal af fluorescerende celler og total intensitet fluorescens20.
- Opret en tidsforskudt video af flere projektions kompositter over 18-24 h at spore leukocyt mobilitet og interaktion med døende celler.
Bemærk: Hvis der udføres langtids levende billeddannelse, er der kun monteret én larve i kapillar. - Når billeddannelse er afsluttet, udstøder larverne fra monterings kapillar til en dødelig overdosis på 4% MS222 til euthanize.
5. dag 3: valg af larver til motilitet assay ved 72 HPF
- Anaesthetize larver i petriskåle med 0,02% MS222.
- Tilfældigt vælge n = 24 larver til motilitet assay og overførsel til friske E3 medier og tillade dyr at komme sig efter bedøvelsesmiddel.
Bemærk: bedøvelse på dette tidspunkt fjerner valg bias for langsomme svømmere, der er nemme at fange.
6. dag 3-5: Udlægnings Lokomotion ved 72, 96 og 120 HPF
- Overfør larver, der er valgt på 72 HPF, til E3-mediet uden methylenblåt.
Bemærk: til metaloid ved 3 DPF kan larverne få rigelig tid til at restituere sig fra anæstesi (> 1 h). - Der udtages en larve i 1 mL pr. brønd af en 24-brønd plade ved hjælp af en pipette.
Bemærk: skær enden af pipettespidsen for at undgå at beskadige larverne. Plade størrelse kan ændres i henhold til eksperimentel design. - Læg pladerne i kamera kammeret og analysens bevægelse i 10 minutter ved hjælp af en hvid lys stjerne rutine for at øge den spontane svømning.
Bemærk: svømning adfærd blev sporet ved hjælp af et kamera kammer og tracking software (Se tabellen over materialer). - Gentag forsøget med de samme larver ved 96 og 120 HPF. Der flyttes larver fra det enkelte hus i analyse pladen til en Petri skål, og der inkueres ved 28 °C mellem assays.
- Ved assay færdiggørelse, aflive larver i en dødelig overdosis af 4% MS222.
Representative Results
Vurdering af hjernens celledød ved hjælp af transgene Ubiq:secannexinv-mvenus resulterer i klare, definitive klynger af døende celler i ICH + larver i både ATV-og BBH-modeller, der ikke findes i alle ICH-larver (figur 3). Klynger aftage før 96 HPF. Gennem billedanalyse, blødning er forbundet med en signifikant dobbelt stigning i den samlede intensitet af fluorescens signal i hjernen, hvilket indikerer markeret celledød.
En Neuro inflammatorisk respons er identificeret i ICH + larver ved signifikant øget antal MPEG1 positive makrofag celler i hjernen. Antallet af totale MPO positive neutrofilceller steg også, men dette nåede ikke Statistisk signifikans (figur 4). Den morfologi af MPEG1 positive makrofager kan også ses at ændre i ICH + larver som cellerne vedtage en aktiv, afrundet, amøboid form. Disse aktiverede afrundede celler kan også overvåges med tiden for at vise en øget Fagocytisk respons af Ubiq:secannexinv-mvenus, der udtrykker døende celler i ICH + larver (figur 5). MPEG1 positive makrofager udstiller forgrenede processer blev kategoriseret som inaktive.
Hjerneblødning er forbundet med et signifikant fald i motilitet ved 72 og 96 HPF i forhold til ICH-søskende kontrol i både BBH-og ATV-modeller (figur 6). Motilitet ved 120 HPF genindvinder til nær baseline niveauer. Der er ofte forskelle i den oprindelige motilitet mellem ægkoblinger og-stammer, og der bør derfor foretages en sammenligning af ICH-kontrollerne hver gang.
Figur 3 : Intracerebral blødning (ICH) i: zebrafisk larver resulterer i en kvantificerbar hjerneskade. A) repræsentative billeder af Fænotypen af hjerneskade i ICH + larver (højre paneler) i forhold til ICH-søskende (venstre paneler) ved 72 HPF. Brightfield-billeder (bund paneler, skala linje = 250 μm) viser tilstedeværelsen af hjerneblødninger (pile) i ICH + larver. Fluorescerende mikroskopi blev udført for at visualisere celledød i Ubiq:secannexinv-mvenus reporter line (top paneler, skala bar = 100 μm). Klynger af døende celler blev observeret i Peri-hematomale regioner. Billeder blev beskåret til kun hjerneregioner og analyseret for total grøn fluorescens intensitet i runde partikler større end 30 pixels i diameter (hvid linje) ved hjælp af makroen i supplerende fil 1. B) kvantificering af fluorescens signal i hjernen på ubehandlede, Ich-og ICH + larver opnået gennem ATV-modellen (n = 12 pr. gruppe, 3 uafhængige replikater) ved 72 HPF. Der blev observeret signifikante forskelle, når ICH + blev sammenlignet med ubehandlet (* * p = 0,004) og med ICH-(* p = 0,03) søskende. C) kvantificering af fluorescens signal som en oplæsning for annexinV bindende i HJERNEN af ICH-og ICH + larver opnået gennem bubblehead (BBH)-modellen (n = 12 pr. gruppe, 2 uafhængige replikater) ved 72 HPF. Grafer viser SD fra middelværdien. Der blev observeret en signifikant forskel i mVenus-fluorescens mellem ICH + og ICH-alders matchede søskende (* * p = 0,002). Figuren er blevet gengivet fra Crilly et al.20 med tilladelse i henhold til en Creative Commons licens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Intracerebral blødning (ICH) initierer en medfødt cellulær immunrespons i zebrafisklarve hjernen. Antal leukocytter kvantificeret inden for de områder af hjernen, der tidligere er beskrevet for MPO: GFP; MPEG1: dsRed dobbelt transgene larver (n = 8 pr. gruppe; 2 uafhængige replikater) ved 72 HPF afslører en signifikant stigning i makrofager (* p = 0,01), men ikke neutrofiler (p = 0,5) som svar på ICH. Figuren er blevet gengivet fra Crilly et al.20 med tilladelse i henhold til en Creative Commons licens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Aktiverede makrofag celler viser et Fagocytisk respons på hjerne læsionen. A) repræsentative tidsforskydnings Stills20 , der viser et forgrenet patruljerings-makrofag, der migrerer mod en annexinv-positiv celle (i-vi). Stills er opnået fra en række billeder taget af hele hjernen ved hjælp af en 20x mål. Skala bjælken repræsenterer 50 μm. Makrofag erhvervet en amøboid morfologi (v) før fagocytosing den annexinV-positive celle (vi, VII). Efter fagocytose genoptager makrofag en forgrenet morfologi og migrerer væk, og annexinV-positiv cellen kan ikke længere ses (VIII). Forgrenet makrofag (#), annexinv positiv celle (pil), amøboid makrofag (*) er indiceret. (B) repræsentative billeder af MPEG1-positive celler i ICH-og ICH + larve hjernen, der udviser amøboid og forgrenede morfologier. Skala stænger repræsenterer 50 μm. (C) en øget andel af amøboid (Fagocytisk) og nedsat andel af forgrenede (inaktive) makrofager blev observeret i ICH + hjerner i forhold til ICH-søskende. Figuren er blevet gengivet fra Crilly et al.20 med tilladelse i henhold til en Creative Commons licens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : ICH-induceret hjerneskade resulterer i et kvantificerbart lokomotor underskud i zebrafisklarver. A) repræsentative eksempler på svømmebanerne i ICH-og ICH + BBH larver på 72, 96 og 120 HPF. B) ICH + larver udviste et betydeligt fald i den samlede tid, der blev brugt på mobilen i løbet af 10 minutters optagelsesperioden, både 72 og 96 HPF. Signifikansen gik tabt ved 120 HPF-tidspunktet, der potentielt kunne hentyde til helbredelse efter hjerneskade (n = 24 larver pr. gruppe; 3 uafhængige replikater; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; ns: p = 0,08). C) kvantificering af kumulativ tid, der er brugt på at bevæge sig i ubehandlet og ATV-behandlet ICH-og ICH + larver ved 120 HPF. ICH + larver udviste et betydeligt fald i den samlede tid, der blev brugt på mobilen i løbet af 10 minutters optagelsesperioden. Tre tekniske replikater (n = 24 larver pr. gruppe) blev anvendt til at beregne SD fra middelværdien (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). Figuren er blevet gengivet fra Crilly et al.20 med tilladelse i henhold til en Creative Commons licens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne undersøgelse viser, at ICH i: zebrafisk larver inducerer en hjerneskade respons, der genberegner centrale aspekter af den menneskelige tilstand, der kan systematisk analyseres og kvantificeres. Zebrafish tilbyder en konsistent og reproducerbar model af spontan ICH, som vil hjælpe med fremtidige Drug intervention undersøgelser fokuseret på at målrette blod-induceret hjerneskade, snarere end at forhindre fartøjet ruptur17,28. I betragtning af den hurtige karakter af sygdommens opståen beslægtet med den kliniske situation, en sådan tilgang giver spændende udsigter til vellykket oversættelse i fremtiden.
Nogle begrænsninger er forbundet med brugen af: zebrafisk larver, såsom brugen af et udviklingssystem og taksonomisk rang, men de praktiske og videnskabelige fordele ved denne model skal anses for at give ny indsigt i ICH. Der kræves ingen operation for at initiere en blødning eller for at overvåge cellulære processer over længere perioder efter skaden. Høj frugtbarhed af: zebrafisk bindinger generere let tilgængelige og store stikprøvestørrelser, og på grund af den hurtige udvikling af larverne den eksperimentelle tidslinje er væsentligt reduceret i forhold til gnaver undersøgelser29,30.
I øjeblikket disse modeller er egnet til brug for belysning af den umiddelbare patologiske og immunologiske reaktion på spontan ICH i hjernen af levende intakte dyr. Potentielt kan denne model tilpasses til medium-høj gennemløb stof skærme til ICH behandlinger, uanset om forebyggende eller nyttiggørelse fremme. Som sådan udgør de post-ICH-sygdomme, der præsenteres i denne undersøgelse, en alternativ, komplementær platform for præklinisk ICH-forskning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. David spiller og University of Manchester Systems Microscopy Core facilitet for brug af udstyret, Prof. Richard Baines for brugen af DanioVision og Dr. Jack Rivers-auty til statistisk konsultation. BBH linjen blev venligt delt af Nicole Munsie fra Dr. Sarah Child 's Lab på University of Calgary. Vi takker også Prof. Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock og Dr. Helen Young for fiske linjer og udstyr.
Dette studie blev støttet af NC3Rs (NC/N002598/1), slagtilfælde Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) og British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Vi er også særligt taknemmelige for Natalie Kate Moss Trust og University of Manchester fakultetet for biologi, medicin og sundhed for deres fortsatte økonomiske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
| 28 °C incubator | LMS | 210 | |
| Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
| Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
| Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
| E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
| EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
| Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
| Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
| Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
| Low melt agarose | Promega | V2111 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
| Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
| Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
| MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
| P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
| P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
| Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
| Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
| Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
| Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
| Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
| Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
| Zen software | Zeiss | version 2.3 |
References
- An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).
- WHO. The top 10 causes of death. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
- Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
- Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
- ASPA. 1986 amendments. , (2012).
- Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. Methods in cell biology. 105, Elsevier. 137-161 (2011).
- Walcott, B. P., Peterson, R. T.
- Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
- Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
- Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
- Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
- Mracsko, E., Veltkamp, R.
- Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
- Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
- Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
- Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051 (2017).
- Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
- ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
- Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238 (2003).
- Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Liang, J. O. Zebrafish in the Classroom. , http://www.zfic.org (2011).
- Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
- Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
- Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M.
