Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kvantifiera hjärn skada, rörelse rubbningar och neuroinflammation efter blödning i hjärnan i zebra fiskar larver, i samband med mänsklig Intracerebral blödning (ICH).
Abstract
Trots att den allvarligaste subtypen av stroke med hög global mortalitet, det finns ingen specifik behandling för patienter med Intracerebral blödning (ICH). Modellering ICH pre-kliniskt har visat sig svårt, och nuvarande gnagare modeller dåligt upprepa den spontana karaktären av mänskliga ICH. Det finns därför ett brådskande krav på alternativa prekliniska metoder för studier av sjukdomsmekanismer i ICH och för potentiell läkemedels upptäckt.
Användningen av zebra fiskar är en alltmer populär metod för translationell forskning, främst på grund av ett antal fördelar som de besitter över däggdjurs modeller av sjukdomar, inklusive produktiva reproduktions frekvenser och larv transparens som möjliggör levande Imaging. Andra grupper har fastställt att zebra fiskar larver kan uppvisa spontan ICH efter genetisk eller kemisk störning av cerebrovaskulär utveckling. Syftet med denna metod är att använda sådana modeller för att studera de patologiska följderna av hjärn blödning, i samband med preklinisk ICH-forskning. Genom att använda Live Imaging och motilitet analyser, hjärn skador, neuroinflammation och rörelse apparaten funktion efter ICH kan bedömas och kvantifieras.
Denna studie visar att viktiga patologiska konsekvenser av hjärn blödning hos människor bevaras i zebra fiskar larver belyser modellorganismen som ett värdefullt in vivo-system för pre-klinisk undersökning av ICH. Syftet med denna metod är att göra det möjligt för pre-kliniska stroke samfundet att anställa zebra fiskar larv modell som en alternativ kompletterande modell system för gnagare.
Introduction
Intracerebral blödning (ICH) är den allvarligaste under typen av stroke i samband med spontan cerebral kärl bristning och blödning i lungparenkym leder till hjärn skador, fysiska funktions hinder och ofta död1. Trots den höga dödligheten och sjuklighet i samband med ICH2, förståelse av underliggande etiologi och post-hemorragi patologi saknas fortfarande. Som sådan, det finns inga specifika behandlingar för att förhindra ICH eller förbättra patientens resultat. De flesta av våra kunskaper om sjukdoms bio Logi har kommit från prekliniska gnagare modeller av ICH3, men studier hittills i dessa modeller har misslyckats med att översätta någon framgångs rik terapeutisk till kliniken4,5. Detta misslyckande kan delvis bero på vissa begränsningar av dessa prekliniska modeller, inklusive oförmågan att enkelt upprepa den spontana karaktären av mänskliga sjukdomar och kravet på invasiv kirurgi för att generera modeller i däggdjur6. Dessutom, gnagare utgör praktiska problem när det gäller att observera den snabba uppkomsten av cellulära svar på ICH i intakt vävnad. Med tanke på avsaknaden av översättning från gnagare modeller, utveckla alternativa modeller av spontan ICH är absolut nödvändigt om vi ska övervinna dessa praktiska problem och hjälpa till att identifiera nya läkemedel mål.
De molekyl ära mekanismerna för vaskulär utveckling är väl bevarade bland ryggradsdjur inklusive zebra fiskar (Danio rerio)7. Som sådan, antagandet av denna modell organism blir en allt mer användbar mekanistisk strategi för att studera cerebrovaskulär sjukdom8. Ett antal zebra fiskar modeller har genererats som upprepa fenotyper i samband med stroke-relaterade villkor9,10,11,12. Användningen av zebra fisk larver för att undersöka sjukdomens patogenes erbjuder både praktiska och vetenskapliga fördelar jämfört med däggdjurs modeller8. Detta inkluderar hög reproduktions frekvens, snabb utveckling och larv transparens som möjliggör intravital avbildning utan de invasiva begränsningarna i samband med gnagare. Koppling dessa fördelar med det breda spektrum av transgena reporter linjer som finns inom zebra fiskar forsknings samfundet uppgår till en kraftfull in vivo -strategi för att studera sjukdoms bio logi, ännu inte utnyttjas för att studera den patologiska konsekvenserna av ICH.
Skadan svar på blod i hjärnan är biphasic13; den primära förolämpningen orsakar neuronala död och cellnekros, som sedan initierar en sekundär våg av skador som induceras av medinnate immun aktivering. Den andra fasen av hjärn skada, i synnerhet den neuroinflammatoriska komponenten, anses vara ett realistiskt mål för framtida läkemedels behandling13. Spontana och cerebral-specifika blödningar har beskrivits i zebra fiskar larver tidigare14,15,16,17,18,19. Två sådana modeller är användningen av atorvastatin (ATV) vid 24 h post-fertilisering (hpf) att hämma HMGCR väg och kolesterol bio syntes14, och en bubblehead (BBH) Mutant som uttrycker en hypomorphic mutation i arhgef7 genen, βpix, och därefter hämmar aktin remodeling för snäva endovaskulära korsningar18. Dessa modeller uppvisar spontan cerebral-specifika blod kärl bristning vid uppkomsten av cirkulationen (~ 33 hpf). Nyligen har vi karakteriserat dessa modeller ytterligare för att avslöja att viktiga aspekter av hjärn skada svar bevaras mellan människor och zebra fiskar larver20. Denna studie visar den metod som krävs för att få och visualisera spontana hjärn blödningar i zebra fiskar larver och hur man kan kvantifiera hjärn skada, och rörelse apparaten och neuroinflammatoriska fenotyper som relaterar till människans tillstånd. Dessa data och tekniker stöder användningen av denna modell arter som ett värdefullt komplement system för prekliniska ICH forskning.
Protocol
Zebrafish togs upp och underhålls vid University of Manchester biologisk tjänst enhet under standard förhållanden som tidigare beskrivits21. Vuxen zebra fiskar hållning godkändes av University of Manchester djur välfärd och etik prövnings nämnden. Alla experiment utfördes i enlighet med UK Home Office Regulations (PPL: P132EB6D7).
Obs: transgena linjer som används i denna studie inkluderar makrofagspecifik härstamning MPEG1:mcherry (konstruerad internt som tidigare beskrivits22), neutrofila-specifika MPO:GFP23,erytroid-specifika gata1: dsred24 och Ubiq:secannexinv-mvenus, en reporter för celldöd (återutvunnits i hus25)på Wild-typ, Nacre (mitfaW2/W2) och Mutant (BBHm292) bakgrunder. Figur 1 visar den experimentella tids linjen.
Figur 1 : Grafisk av experimentell tids linje för att karakterisera hjärn skada, rörelse och neuroinflammatoriska utfall. ICH, Intracerebral blödning; BBH, bubblehead. Figuren har reproducerats från Crilly et al.20 med tillstånd under en Creative Commons-licens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. dag 0: produktion och insamling av ägg
- Samla in befruktade embryon från naturlig lek i avels lådor producerade från 1 manlig och 1-2 kvinnlig vuxen Zebrafish.
Anmärkning: för atorvastatin protokoll alla wildtype/transgena djur kan användas men blödning priser skiljer sig något mellan stammar. - Inkubera 100 embryon vid 28 ° c i standard E3 embryo medium per petriskål och steg enligt standard rikt linjer26.
- Vid ~ 6 timmar efter befruktning (hpf) ta bort döda och obefruktade embryon från skålen med en Pasteur pipett.
2. dag 1: behandling med atorvastatin vid 24 hpf
- Dekorionat embryon för atorvastatin behandling med vassa ultratunna dissektion pincett27. Nummer som krävs för experimentering kan justeras i enlighet med detta.
- Tillsätt 30 mL E3 embryo medium till två rena Petriskålarna. Använd en mat rätt för 100 embryon.
Obs: om plattorna är konstruerade för cell odling, håller dekorionated zebra fiskar i detta tidiga skede ofta till botten. För att undvika detta, skölj plattorna grundligt i rent vatten före användning. - Avlägsna 60 μL embryo-vatten från behandlings plattan och tillsätt 60 μL 0,5 mM atorvastatin (ATV). Vid en lager koncentration på 0,5 mM kommer ovanstående spädning att resultera i en koncentration på 1 μM, vilket kommer att resultera i ~ 20% av larverna som inte blöder (ICH-) och ~ 80% av de hemorragade larverna (ICH +). Använd den andra plattan för obehandlade kontroller
Anmärkning: Atorvastatin är lösligt i destillerat vatten (3 mg till 10 mL) för att göra en 0,5 mM stam lösning. Inkubera över natten vid rums temperatur i mörker med agitation som inlösning tar lite tid. Fullständig inlösning kan ta upp till 1 vecka. Använd inte DMSO. Lösningen är aliciterad och förvaras vid-20 ° c. Frys inte Tina. - Överför 100 embryon i så lite vatten som möjligt till behandlings plattorna med hjälp av en Pastejpipett.
- Inkubera plattorna vid 28 ° c.
Obs: ICH kommer att inträffa mellan 33 och 48 hpf. Atorvastatin behöver inte avlägsnas eftersom inkubation längre än 24 timmar inte orsakar några ytterligare utvecklings problem.
3. dag 2: separera ICH-och ICH +-populationerna vid 50 hpf
- Separera ICH +-fisken från ICH-populationerna och överför till nya rätter för enkelheten.
- Om man använder ATV-modellen med en koncentration på 1 μM, kommer 75-100% av larverna att uppvisa blödning (ICH +) vid denna tidpunkt.
Anmärkning: larverna reagerar på olika stammar, om larverna inte blöder vid de önskade frekvenserna, Använd ett nytt parti atorvastatin eller en högre koncentration. Om larverna inte har ställt ut blödning av 48 hpf sedan överväga dem ICH-. - Om du använder BBH-modellen, kommer alla homozygot mutanter uppvisar blödning av 48 hpf. Om du använder en heterozygot incross, ICH-heterozymer och vildtyp syskon kan användas som kontroll djur för experiment.
- Om man använder ATV-modellen med en koncentration på 1 μM, kommer 75-100% av larverna att uppvisa blödning (ICH +) vid denna tidpunkt.
- Vid behov bedövar larverna genom att lägga till 0,02% MS222 till E3-mediet. Med hjälp av en Pasteur pipett, sortera larverna efter förekomst av blod i huvudet i färskt E3 media. Se figur 2.
Obs: blod i huvudet kan visas i förgrunden, mitten eller hindbrain eller i kombination, och blöda volymen kan variera mellan djur. I BBH mutanter, ICH är ofta förknippad med svår ödem igenkännbar av större huvuden, bredare utrymme mellan ögonen och en mer diffus blödning. Men inte alla ICH + BBH larver uppvisar ödem.
Figur 2 : ICH + hjärn blödning fenotyper. Exempel på larv ICH fenotyper som upprätthålls på en transgena gata1: dsred reporter Nacre bakgrund observerats med en brightfield stereo mikroskopet (övre paneler) och fluorescens (botten panel) på ~ 48 h post-fertilisering. Inga blödningar observerades i ICH-larver (vänster paneler). En distinkt ansamling av röda blod kroppar i framhjärnan och hindbrain (pilar) observerades i ICH + larver (höger paneler). Skal streck representerar 250 μm. figuren har reproducerats från Crilly et al.20 med tillstånd under en Creative Commons-licens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. dag 3: celldöd och leukocytanalys vid 72 hpf
- Avskärma larverna med ett fluorescensmikroskop för att säkerställa uttrycket av fluorescerande protein.
Anmärkning: i denna studie användes transgena Ubiq: secannexinv-mvenus-larver för att rapportera hjärn celldöd och dubbel transgen MPO: GFP; MPEG1: mcherry eller Ubiq: secannexinv-mvenus; MPEG1: mcherry används för leukocytanalys. - Fyll ljus blads monterings kammaren med E3-media som innehåller 0,02% MS222.
- Bedöva larverna med 0,02% MS222. Transfer larver för montering (n = 1-6) till en torr petriskål i en enda droppe. Ta bort så mycket vätska som möjligt.
Anmärkning: 1,5% låg smälta AGA ros bereds med 0,15 g av låg smält AGA ros upplöst i 10 ml E3 medium utan metylenblått i en mikrovågsugn och hålls vid 45 ° c tills användning. - Tillsätt en droppe 1,5% låg smält AGA Ros (bibehålls som vätska i en 45 ° c värme block) till larverna och med hjälp av en 800 μm montering kapillär, och dra larverna upp huvudet först. Om positionering inte är korrekt kan larverna utvisas från Aga ros och monteras igen. Låt kapillär svalna innan du sätter in i lightsheet kammaren.
Anmärkning: Alternativt kan ett konfokal Mikroskop användas för denna procedur. För detta bör larver monteras lateralt i AGA ros på en glas botten skålen. - Förvärva z-stack bilder av huvudet mellan ögat linser (~ 300 μm) och process till maximal intensitet projektion bild.
- Analysera hjärn regionen från bilder som samlats in för totalt antal fluorescerande celler och total intensitet fluorescens20.
- Skapa en tids fördröjning video av flera projektion kompositer över 18-24 h att spåra leukocyt rörlighet och interaktion med döende celler.
Obs: om lång sikt levande avbildning utförs, är endast en larv monterad i kapillär. - När Imaging är klar utvisa larverna från montering kapillär till en dödlig överdos av 4% MS222 till euthanize.
5. dag 3: Val av larver för motilitetsanalys vid 72 hpf
- Anestetize larver i Petriskålarna med 0,02% MS222.
- Slumpmässigt välja n = 24 larver för motilitet assay och överföring till nya E3 media och låta djuren återhämta sig från bedövnings medel.
Anmärkning: bedövnings medel vid denna punkt tar bort markeringen bias för långsamma simmare som är lätta att fånga.
6. dag 3-5: Assaying förflyttning vid 72, 96 och 120 hpf
- Transfer larver som valts ut på 72 hpf till E3 medium utan metylenblått.
Anmärkning: för test metoder på 3 DPF tillåta larverna riklig tid att återhämta sig från bedövnings medel (> 1 h). - Platta en larv i 1 mL per brunn av en 24-vältplåt med hjälp av en pipett.
Obs: klipp av pipettspetsen för att undvika att larverna skadas. Plåt storleken kan ändras enligt experimentell design. - Ladda plattorna i kamera kammaren och assay rörelse för 10 min med hjälp av en vit ljus skrämma rutin för att öka spontan simning.
Obs: simning beteende spårades med hjälp av en kamera kammare och spårnings program (se material tabell). - Upprepa experimentet med samma larver på 96 och 120 hpf. Flytta larver från enskilda bostäder i analys plattan till en petriskål och inkubera vid 28 ° c mellan analyserna.
- Vid analysen, euthanize larver i en dödlig överdos av 4% MS222.
Representative Results
Bedömning av hjärnans celldöd med transgena Ubiq:secannexinv-mvenus resulterar i tydliga definitiva kluster av döende celler i ICH +-larver i både ATV-och BBH-modeller som saknas i alla ICH-larver (figur 3). Kluster avtar före 96 hpf. Genom bild analys är blödning förknippad med en signifikant tvåfaldig ökning av den totala intensiteten av fluorescenssignalen i hjärnan, vilket indikerar markerad celldöd.
Ett neuroinflammatoriskt svar identifieras i ICH +-larver av signifikant ökat antal MPEG1 positiva makro Fager celler i hjärnan. Antalet totala MPO -positiva neutrofila celler ökade dock också men detta nådde inte statistisk signifikans (figur 4). Morfologin av MPEG1 positiva makro Fager kan också ses förändras i ICH + larver som cellerna anta en aktiv, rundade, amöbiska form. Dessa aktiverade rundade celler kan också övervakas över tid för att visa en ökad fagocytisk respons av Ubiq:secannexinv-mvenus som uttrycker döende celler i ICH +-larver (figur 5). MPEG1 positiva makro Fager uppvisar förgrenade processer kategoriserades som inaktiva.
Hjärn blödning är förknippad med en signifikant minskning av motiliteten vid 72 och 96 hpf jämfört med ICH-syskon kontroller i både BBH och ATV modeller (figur 6). Motilitet på 120 hpf återhämtar sig till nära bas linje nivåer. Det finns ofta skillnader i utgångs läget motilitet mellan ägg kopplingar och stammar och så jämförelse bör göras till ICH-kontroller varje gång.
Figur 3 : Intracerebral blödning (ICH) i zebra fiskar larver resulterar i en kvantifierbar hjärn skada. Arepresentativa bilder av hjärn skada FENOTYP i ICH +-larver (höger paneler), jämfört med ICH-syskon (vänster panel), vid 72 hpf. Brightfield bilder (botten paneler, skala bar = 250 μm) visar förekomst av hjärn blödningar (pilar) i ICH + larver. Fluorescerande mikroskopi utfördes för att visualisera celldöd i den Ubiq:secannexinv-mvenus reporter linje (topp paneler, Scale bar = 100 μm). Kluster av döende celler observerades i Peri-hematomal regioner. Bilderna beskärdes till endast hjärn regioner och analyserades för total grön fluorescensintensitet i runda partiklar som var större än 30 pixlar i diameter (vit linje) med hjälp av makrot i tilläggs fil 1. B) kvantifiering av fluorescenssignal i hjärnan hos oobehandlade, ICH-och ICH +-larver som erhållits genom ATV-modellen (n = 12 per grupp, 3 oberoende replikat) vid 72 hpf. Signifikanta skillnader observerades vid jämförelse av ICH + med obehandlade (* * p = 0,004) och med ICH-(* p = 0,03) syskon. Ckvantifiering av fluorescenssignalen som en avläsning av annexinV-bindningen i hjärnorna på ICH-och ICH +-larverna erhållna genom bubblehead-modellen (n = 12 per grupp, 2 oberoende replikat) vid 72 hpf. Diagrammen visar SD från medelvärdet. En signifikant skillnad i mVenus-fluorescens observerades mellan ICH + och ICH-åldersmatchade syskon (* * p = 0,002). Figuren har reproducerats från Crilly et al.20 med tillstånd under en Creative Commons-licens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Intracerebral blödning (ICH) initierar en medfödd cellulär immun svar i zebra fiskar larv hjärnan. Antal leukocyter kvantifierade inom de hjärn regioner som tidigare beskrivits för MPO: GFP; MPEG1: dsRed dubbel transgena larver (n = 8 per grupp; 2 oberoende replikat) vid 72 hpf visar en signifikant ökning av makro Fager (* p = 0,01), men inte neutrofiler (p = 0,5), som svar på ICH. Figuren har reproducerats från Crilly et al.20 med tillstånd under en Creative Commons-licens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Aktiverade makro Fager celler visar en fagocytisk respons på hjärn skadan. A) representativa tids fördröjnings stillbilder20 som visar en förgrenat patrullering av makro Fager som migrerar mot en annexinv-positiv cell (i-vi). Stillbilder erhålls från en serie bilder tagna av hela hjärnan med hjälp av en 20x mål. Skalstapeln representerar 50 μm. Den makrofag förvärvat en amöbiska morfologi (v) innan fagocytosing den annexinv-positiva cellen (vi, VII). Efter fagocytos återupptar macrophagen en förgrenade morfologi och migrerar bort och annexinV-positiva cellen kan inte längre ses (VIII). Ramified makrofag (#), annexinv positiv cell (pil), amöbiska makrofag (*) indikeras. Brepresentativa bilder av MPEG1-positiva celler i den ICH-och ICH + larv-hjärna som uppvisar amöbiska och förgrenade morfologier. Skal streck representerar 50 μm. (C) en ökad andel av amöbiska (fagocytos) och minskad andel förgrenade (inaktiva) makro Fager observerades i ICH + hjärnor i jämförelse med ICH-syskon. Figuren har reproducerats från Crilly et al.20 med tillstånd under en Creative Commons-licens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : ICH-inducerad hjärn skada resulterar i en kvantifierbar rörelse resultat underskott i zebra fiskar larver. Arepresentativa exempel på simspår i ICH-och ICH + BBH-larverna vid 72, 96 och 120 hpf. (B) ICH + larverna uppvisade en betydande minskning av den kumulativa tid som tillbringades i mobilen under registrerings perioden på 10 min, både 72 och 96 hpf. Signifikans gick förlorad vid 120 hpf-tidpunkt som potentiellt syftade på återhämtning från hjärn skada (n = 24 larver per grupp; 3 oberoende replikat; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08). Ckvantifiering av ackumulerad tid som tillbringats i obehandlad och ATV-behandlad ICH-och ICH +-larver vid 120 hpf. ICH +-larverna uppvisade en signifikant minskning av den kumulativa tid som tillbringats i mobilen under inspelnings perioden på 10 minuter. Tre tekniska replikat (n = 24 larver per grupp) användes för att beräkna SD från medelvärdet (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). Figuren har reproducerats från Crilly et al.20 med tillstånd under en Creative Commons-licens. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Denna studie visar att ICH i zebra fiskar larver inducerar en hjärna skada svar som recapitulates viktiga aspekter av människans tillstånd som systematiskt kan analyseras och kvantifieras. Zebrafish erbjuder en konsekvent och reproducerbar modell av spontan ICH som kommer att hjälpa till med framtida läkemedels intervention studier fokuserat på att inrikta sig på blodinducerad hjärn skada, snarare än att förhindra att fartyget bristning17,28. Med tanke på den snabba sjukdoms debuten som liknar den kliniska situationen, erbjuder ett sådant tillvägagångs sätt spännande utsikter till framgångs rik översättning i framtiden.
Vissa begränsningar är förknippade med användning av zebra fiskar larver, såsom användning av ett utvecklings system och taxonomisk rang, men de praktiska och vetenskapliga fördelarna med denna modell måste anses erbjuda nya insikter i ICH. Ingen kirurgi krävs för att initiera en blödning eller för att övervaka cellulära processer under längre tids perioder efter skada. Hög fruktsamhet av zebra fiskar lottning generera lättillgängliga och stora urvals storlekar, och på grund av den snabba utvecklingen av larverna den experimentella tids linjen är signifikant reducerad jämfört med gnagare studier29,30.
För närvarande dessa modeller är lämpliga att använda för att belysa den omedelbara patologiskt och immunologiskt svar på spontan ICH i hjärnan hos levande intakt djur. Potentiellt kan denna modell anpassas för medel stora hög genom strömning drog skärmar för ICH terapier, oavsett om förebyggande eller återhämtning främja. Som sådan, den post-ICH patologier som presenteras i denna studie utgör en alternativ, kompletterande plattform för pre-klinisk ICH forskning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr David spiller och University of Manchester Systems Microskopi Core Facility för användning av utrustningen, prof. Richard Baines för användning av DanioVision och Dr Jack Rivers-Auty för statistisk konsultation. Den BBH linjen var vänligt delas av Nicole Munsie från Dr Sarah Child ' s Lab vid University of Calgary. Vi tackar också prof. Stephen Renshaw, Dr Adam Hurlstone, Dr Andrew badrock och Dr Helen Young för fisk linjer och utrustning.
Denna studie stöddes av NC3Rs (NC/N002598/1), stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) och British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Vi är också särskilt tacksamma för The Natalie Kate Moss Trust och University of Manchester fakulteten för biologi, medicin och hälsa för deras fortsatta ekonomiska stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
| 28 °C incubator | LMS | 210 | |
| Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
| Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
| Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
| E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
| EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
| Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
| Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
| Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
| Low melt agarose | Promega | V2111 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
| Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
| Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
| MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
| P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
| P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
| Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
| Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
| Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
| Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
| Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
| Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
| Zen software | Zeiss | version 2.3 |
References
- An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3 (2017).
- WHO. The top 10 causes of death. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
- Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
- Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
- Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
- ASPA. 1986 amendments. , (2012).
- Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. Methods in cell biology. 105, Elsevier. 137-161 (2011).
- Walcott, B. P., Peterson, R. T.
- Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
- Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
- Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
- Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
- Mracsko, E., Veltkamp, R.
- Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
- Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
- Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
- Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051 (2017).
- Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
- ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
- Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238 (2003).
- Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Liang, J. O. Zebrafish in the Classroom. , http://www.zfic.org (2011).
- Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
- Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
- Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M.
