Summary
यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए मस्तिष्क चोट, गतिकीय घाटे और neuroinflammation के बाद zebrafish लार्वा में मस्तिष्क में खून बह रहा है, मानव इंट्रा नकसीर के संदर्भ में (ICH) ।
Abstract
उच्च वैश्विक मृत्यु दर के साथ स्ट्रोक के सबसे गंभीर उपप्रकार होने के बावजूद, इंट्रा नकसीर (ICH) के साथ रोगियों के लिए कोई विशिष्ट उपचार है । मॉडलिंग ICH पूर्व चिकित्सकीय मुश्किल साबित किया है, और वर्तमान कृंतक मॉडल खराब मानव ICH के सहज प्रकृति संक्षेप । अत इस रोग तंत्र के अध्ययन के लिए और संभावित औषध खोज के लिए वैकल्पिक पूर्व नैदानिक पद्धतियों की तत्काल आवश्यकता है ।
Zebrafish का उपयोग ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक तेजी से लोकप्रिय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, मुख्य रूप से लाभ की एक संख्या के कारण वे रोग के स्तनधारी मॉडल पर अधिकारी, विपुल प्रजनन दर और लार्वा पारदर्शिता सहित जीने के लिए अनुमति इमेजिंग. अंय समूहों की स्थापना की है कि zebrafish लार्वे आनुवंशिक या मस्तिष्कवाहिकीय विकास के रासायनिक विघटन के बाद सहज च प्रदर्शन कर सकते हैं । इस पद्धति का उद्देश्य प्री-क्लीनिकल आईसीएच अनुसंधान के संदर्भ में ब्रेन हेमरेज के रोग परिणामों का अध्ययन करने के लिए इस तरह के मॉडलों का उपयोग करना है । जी इमेजिंग और गतिशीलता का उपयोग करके assays हैं, मस्तिष्क क्षति, तंत्रिका सूजन और गतिकारक समारोह के बाद आईसीएच का आकलन किया जा सकता है और मात्रा ।
इस अध्ययन से पता चलता है कि मनुष्यों में ब्रेन हेमरेज के प्रमुख रोग परिणामों को zebrafish लार्वा में संरक्षित किया जाता है जो मॉडल जीव को हाइलाइट करता है, जो कि वीवो प्रणाली में एक मूल्यवान है । इस पद्धति का उद्देश्य प्री-क्लीनिकल स्ट्रोक समुदाय को कृंतकों के लिए एक वैकल्पिक पूरक मॉडल प्रणाली के रूप में जेब्राफिश लार्वा मॉडल को नियोजित करने में सक्षम बनाना है ।
Introduction
Intracerebral नकसीर (आईसीएच) के सबसे गंभीर उप प्रकार के स्ट्रोक के सहज मस्तिष्क पोत टूटना और मस्तिष्क क्षति, शारीरिक विकलांगता और अक्सर1मौत के लिए अग्रणी पैरेंकाइमा में खून बह रहा है के साथ जुड़े । आईसीएच2के साथ उच्च मृत्यु दर और रुग्णता दरों से जुड़े होने के बावजूद अंडरपिनिंग एटियलजी और पोस्ट-हेमरेज पैथोलॉजी की समझ अभी भी कमी है । जैसे, वहां कोई विशेष उपचार के लिए आईसीएच को रोकने या रोगी परिणामों में सुधार कर रहे हैं । रोग जीवविज्ञान की हमारी समझ के अधिकांश पूर्व से आया है,3के नैदानिक कृंतक मॉडल, लेकिन अध्ययन करने के लिए इन मॉडलों में तिथि करने के लिए क्लिनिक4,5के लिए किसी भी सफल चिकित्सकीय अनुवाद करने में विफल रहा है । इस असफलता के भाग में कारण हो सकता है, इन पूर्व नैदानिक मॉडल की कुछ सीमाओं को आसानी से मानव रोग की सहज प्रकृति और इनवेसिव सर्जरी के लिए आवश्यकता के लिए स्तनधारियों6में मॉडल उत्पंन करने के लिए संक्षेप अक्षमता सहित, । इसके अतिरिक्त, कृंतकों के साथ व्यावहारिक समस्याओं मुद्रा को बरकरार ऊतक में आईसीएच के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की तेजी से शुरुआत देख के संबंध है । कृंतक मॉडलों से अनुवाद की कमी को देखते हुए, सहज ICH के वैकल्पिक मॉडल का विकास जरूरी है अगर हम इन व्यावहारिक समस्याओं को दूर करने और मदद उपंयास दवा लक्ष्य की पहचान कर रहे हैं ।
संवहनी विकास के आणविक तंत्र अच्छी तरह से zebrafish सहित कशेरुकी के बीच संरक्षित कर रहे है (danio rerio)7। इस प्रकार, इस आदर्श जीव को अपनाना मस्तिष्कवाहिकीय रोग8के अध्ययन के लिए एक और अधिक उपयोगी यंत्रवादी कार्यनीति बन रहा है । Zebrafish मॉडल की एक संख्या उत्पंन किया गया है जो स्ट्रोक से संबंधित फीनोटाइप9,10,11,12से जुड़े संक्षेप । रोग रोगजनन की जांच करने के लिए zebrafish लार्वा का उपयोग स्तनधारी मॉडल8से अधिक व्यावहारिक और वैज्ञानिक लाभ प्रदान करता है । यह उच्च प्रजनन दर, तेजी से विकास और लार्वा पारदर्शिता कि इनवेसिव कृंतकों के साथ जुड़े बाधाओं के बिना intravital इमेजिंग के लिए अनुमति देता है शामिल हैं। युग्मन zebrafish अनुसंधान समुदाय के भीतर उपलब्ध ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों की विस्तृत श्रृंखला के साथ ये लाभ रोग जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए vivo दृष्टिकोण में एक शक्तिशाली करने के लिए मात्रा, रोग का अध्ययन करने के लिए अभी तक उपयोग नहीं आईसीएच के परिणाम ।
मस्तिष्क में रक्त के लिए चोट प्रतिक्रिया13बिफेसिक है; प्राथमिक अपमान न्यूरोनल मौत और कोशिका परिगलन, जो तब नुकसान की एक माध्यमिक लहर है कि जंमजात प्रतिरक्षा सक्रियण द्वारा प्रेरित है शुरू होता है । मस्तिष्क की चोट का दूसरा चरण, विशेष रूप से neuroप्रदाहक घटक, भविष्य में दवा उपचार के लिए एक यथार्थवादी लक्ष्य माना जाता है13. Zebrafish लार्वा पहले14,15,16,17,18,19में वर्णित किया गया है सहज और मस्तिष्क विशिष्ट हेमोरेज । इस तरह के दो मॉडलों में अटोरवस्टैन (एटीवी) का उपयोग कर रहे है 24 एच पोस्ट निषेचन (hpf) को बाधित hmgcr मार्ग और कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण14, और एक bubblehead (bbh) उत्परिवर्ती जो arhgef7 जीन में एक hypomorphic उत्परिवर्तन व्यक्त, βpix, और बाद में तंग अंतर्वाहिकी जंक्शनों18के लिए actin remodeling रोकता है । इन मॉडलों संचलन की शुरुआत में सहज मस्तिष्क विशिष्ट रक्त वाहिका टूटना प्रदर्शन (~ ३३ hpf) । हाल ही में, हम इन मॉडलों की विशेषता है और पता चलता है कि मस्तिष्क चोट प्रतिक्रिया के प्रमुख पहलुओं मनुष्यों और zebrafish लार्वा20के बीच संरक्षित है । इस अध्ययन को प्राप्त करने के लिए और zebrafish लार्वा में सहज मस्तिष्क हेमोरेज कल्पना और कैसे मस्तिष्क की चोट, और चलन और neuroinflammatory फीनोटाइप कि मानव की स्थिति से संबंधित मात्रा करने के लिए आवश्यक कार्यप्रणाली को दर्शाता है । ये डेटा और तकनीक पूर्व नैदानिक आईसीएच अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान पूरक प्रणाली के रूप में इस मॉडल प्रजातियों के उपयोग का समर्थन ।
Protocol
Zebrafish उठाया और मैनचेस्टर के रूप में मानक शर्तों के तहत जैविक सेवा इकाई विश्वविद्यालय में बनाए रखा गया पहले से21वर्णित है । वयस्क zebrafish पशुपालन विश्वविद्यालय मैनचेस्टर पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी प्रयोग यूके होम ऑफिस रेगुलेशंस (पीपीएल P132EB6D7) के अनुसार किया गया ।
नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त ट्रांसजेनिक लाइनों macrophage-विशिष्ट वंशावली mpeg1शामिल हैं: mcherry (निर्मित में घर के रूप में पहले से वर्णित22), neutrophil-विशिष्ट mcherry:gfp23,erythroid-विशिष्ट gata1: dsred24 और ubiq:secannexinv-mvenus, सेल मौत के लिए एक रिपोर्टर (फिर से घर मेंव्युत्पंन25)पर वंय-प्रकार, (mitfaw2/ चित्रा 1 प्रयोगात्मक समयरेखा दिखाता है ।
चित्रा 1 : मस्तिष्क चोट, चलन और neuroinflammatory परिणामों की विशेषता के लिए प्रयोगात्मक समयरेखा के ग्राफिक । एच. ए., इंट्रा नकसीर; bbh, bubblehead । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
1. दिन 0: अंडा उत्पादन और संग्रह
- 1 पुरुष और 1-2 महिला वयस्क zebrafish से उत्पादित प्रजनन बक्से में प्राकृतिक स्पोनिंग से निषेचित भ्रूण ले लीजिए ।
नोट: अटोरवस्टेटिन प्रोटोकॉल के लिए किसी भी wildtype/ट्रांसजेनिक जानवरों का इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन नकसीर दरों में उपभेदों के बीच थोड़ा अलग है । - मानक E3 भ्रूण में 28 डिग्री सेल्सियस पर १०० भ्रूण के रूप में मानक के अनुसार पेट्री पकवान और चरण26।
- पर ~ 6 घंटे के बाद निषेचन (hpf) एक पाश्र पिपेट का उपयोग कर डिश से मृत और अनिषेचित भ्रूण को हटा दें ।
2. दिन 1:24 एचपीएफ पर अटोरवस्टैन उपचार
- 27संदंश तीव्र अल्ट्रा पतली विच्छेदन का उपयोग कर अटोरवस्टाइन उपचार के लिए भ्रूण dechorionate । प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या तदनुसार समायोजित किया जा सकता है ।
- दो स्वच्छ पेट्री व्यंजन के लिए 30 मिलीलीटर E3 भ्रूण मध्यम जोड़ें । १०० भ्रूणों के लिए एक डिश का प्रयोग करें ।
नोट: यदि प्लेटें सेल संस्कृति के लिए डिजाइन किए हैं, इस प्रारंभिक चरण में dechorionated zebrafish अक्सर नीचे से चिपके रहते हैं । इससे बचने के लिए इस्तेमाल से पहले साफ पानी में अच्छी तरह से प्लेटों को खंगाल लें । - उपचार प्लेट से भ्रूण के पानी की ६० μL निकालें और ०.५ mM atorvastatin (एटीवी) के ६० μL जोड़ें । एक ०.५ mM स्टॉक एकाग्रता में, उपरोक्त तनुकरण 1 माइक्रोमीटर की अंतिम सांद्रता में परिणाम देगा, जो लार्वा के 20% नॉन-हेमोरेज (ICH-) और ~ ८०% लार्वा रक्तस्रावी (आईसीएच) में परिणाम देगा । अनुपचारित नियंत्रण के लिए अंय थाली का प्रयोग करें
नोट: अटोर्वस्टैन आसुत जल (10 मिलीलीटर में 3 मिलीग्राम) के लिए एक ०.५ मिमी स्टॉक समाधान बनाने के लिए solubilized है । विलेनीकरण के रूप में आंदोलन के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर सेते कुछ समय लगता है । पूर्ण घुलनशीकरण में 1 सप्ताह तक का समय लग सकता है । DMSO का उपयोग न करें । हल को 20 ° ब् पर आधृत और भंडारित किया जाता है । पिघलना नहीं है । - एक पाश्र पिपेट का उपयोग करना, उपचार प्लेटों के लिए संभव के रूप में छोटे पानी के रूप में १०० भ्रूण हस्तांतरण ।
- 28 ° ब् पर प्लेटों को सेते हैं ।
नोट: ICH ३३ और ४८ hpf के बीच हो जाएगा । अटोरवस्टेटू को निकालने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि 24 घंटे से अधिक ऊष्मायन से आगे विकासात्मक समस्याएँ उत्पन्न नहीं होती हैं ।
3. दिन 2: अलग ich-और ich + ५० एचपीएफ पर आबादी
- आईसीएच से अलग ICH + मछली-आबादी और आसानी के लिए नए व्यंजनों को हस्तांतरण ।
- यदि 1 μM की एकाग्रता पर एटीवी मॉडल का उपयोग, लार्वा का 75-100% इस समय बिंदु पर नकसीर (ICH +) प्रदर्शन करेंगे ।
ध्यान दें: लार्वा की प्रतिक्रिया उपभेदों के बीच अलग होती है, यदि लार्वा वांछित आवृत्तियों पर रक्तस्रावी नहीं होते हैं, तो अटोरवेरिन या उच्च एकाग्रता के एक नए बैच का उपयोग करें । यदि लार्वा ४८ एचपीएफ द्वारा नकसीर का प्रदर्शन नहीं किया है, तो उन पर विचार करें । - यदि bbh मॉडल का उपयोग कर रहे हैं, सभी समयुग्मजी म्यूटेंट ४८ hpf द्वारा नकसीर प्रदर्शित करेगा । यदि एक विषमयुग्मज incross का उपयोग कर, ICH-विषम युग्मज और wildtype भाई बहनों के प्रयोग के लिए नियंत्रण जानवरों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- यदि 1 μM की एकाग्रता पर एटीवी मॉडल का उपयोग, लार्वा का 75-100% इस समय बिंदु पर नकसीर (ICH +) प्रदर्शन करेंगे ।
- यदि आवश्यक हो, ०.०२% MS222 को जोड़ने के द्वारा लार्वा बेहोश कर देना E3 मीडिया । एक पाश्र पिपेट का उपयोग करना, सिर में रक्त की उपस्थिति के लिए लार्वा को ताजा E3 मीडिया में सॉर्ट करें । चित्रा 2देखें ।
नोट: सिर में रक्त सामने, मध्य या हिनब्रेन या संयोजन में प्रकट हो सकता है, और खून की मात्रा जानवरों के बीच भिन्न हो सकते हैं । Bbh म्यूटेंट में, आईसीएच अक्सर बड़ा सिर, आंखों के बीच व्यापक अंतरिक्ष और एक अधिक फैलाना खून बह रहा द्वारा गंभीर edema पहचानने के साथ जुड़ा हुआ है । लेकिन नहीं सभी ICH + bbh लार्वा edema प्रदर्शन ।
चित्रा 2 : आईसीएच + ब्रेन हेमरेज phenotypes । एक ट्रांसजेनिक gata1 पर बनाए रखे गए लार्वा के प्रकार के फीनोटाइप के उदाहरण: dsred रिपोर्टर नेकर पृष्ठभूमि एक उपकरण stereomसूक्ष्मदर्शी (शीर्ष पैनलों) और प्रतिदीप्ति के साथ मनाया (नीचे पैनल) ~ ४८ एच के बाद निषेचन । कोई हेमोरेज च-लार्वा (बाएं पैनलों) में नहीं देखा गया । अग्रमस्तिष्क और हिब्रेन (तीर) में लाल रक्त कोशिकाओं का एक अलग संचय आईसीएच + लार्वा (सही पैनलों) में देखा गया । स्केल पट्टियां २५० μm का प्रतिनिधित्व करती हैं । चित्रा Crilly एट अल.20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
4. दिन 3: सेल मौत और ७२ एचपीएफ पर ल्युकोसैट विश्लेषण
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लार्वा को स्क्रीन करें ।
नोट: इस अध्ययन में, ट्रांसजेनिक ubiq: secannexinv-mvenus लार्वा मस्तिष्क कोशिका मौत की रिपोर्ट और डबल ट्रांसजेनिक mvenus: gfp के लिए इस्तेमाल किया गया; mpeg1: mcherry या ubiq: secannexinv-mcherry; mpeg1: mcherry ल्यूकोसाइट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया । - ०.०२% MS222 युक्त E3 मीडिया के साथ lightsheet बढ़ते चैंबर भरें ।
- ०.०२% MS222 का उपयोग करते हुए लार्वा को एनेस्थेटाइज़ करना । एक छोटी बूंद में एक सूखी पेट्री डिश सतह के लिए (n = 1-6) बढ़ते के लिए लार्वा स्थानांतरण । जितना संभव हो उतना लिक्विड निकालें ।
नोट: १.५% कम पिघल agarose कम पिघल agarose के ०.१५ जी का उपयोग कर तैयार किया जाता है एक माइक्रोवेव में methylene नीले बिना E3 मध्यम के 10 मिलीलीटर में भंग और ४५ डिग्री सेल्सियस पर रखा जब तक उपयोग । - लार्वा के लिए १.५% कम-पिघल agarose (एक ४५ ° c हीट ब्लॉक में तरल के रूप में बनाए रखा) की एक बूंद जोड़ें और एक ८०० μm बढ़ते केशिका का उपयोग कर, और लार्वा पहले सिर को आकर्षित । स्थिति सही नहीं है, तो लार्वा agarose से निष्कासित कर दिया और फिर से घुड़सवार किया जा सकता है । केशिका को लाइटशीट चैंबर में डालने से पहले ठंडा होने के लिए छोड़ दें ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, एक संनाभि माइक्रोस्कोप इस प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस के लिए, लार्वा एक गिलास नीचे पकवान पर agarose में laterally घुड़सवार होना चाहिए । - आँख लेंस (~ ३०० μm) और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि के लिए प्रक्रिया के बीच सिर के जेड स्टैक छवियों को प्राप्त.
- फ्लोरोसेंट कोशिकाओं और कुल तीव्रता प्रतिदीप्ति20की कुल संख्या के लिए एकत्र छवियों से मस्तिष्क क्षेत्र का विश्लेषण ।
- ल्युकोसैट गतिशीलता और मर कोशिकाओं के साथ बातचीत को ट्रैक करने के लिए 18-24 घंटे से अधिक कई प्रक्षेपण कंपोजिट के एक समय चूक वीडियो बनाएँ ।
नोट: यदि लंबी अवधि के लाइव इमेजिंग किया जाता है, केवल एक लार्वा केशिका में घुड़सवार है । - जब इमेजिंग पूरा हो गया है एक घातक ओवरडोज में बढ़ते केशिका से लार्वा को निष्कासित 4% MS222 euthanize करने के लिए ।
5.3 दिन: ७२ एचपीएफ में गतिशीलता परख के लिए लार्वा का चयन
- ०.०२% MS222 के साथ पेट्री व्यंजन में लार्वा को एनेस्थेटाइज़ करना ।
- बेतरतीब ढंग से का चयन करें = 24 गतिशीलता परख और नए E3 मीडिया में स्थानांतरण के लिए लार्वा और पशुओं चतनाशूंय करनेवाली औषधि से उबरने के लिए अनुमति देते हैं ।
नोट: इस बिंदु पर चतनाशूंय करनेवाली औषधि धीमी गति से तैराकों कि पकड़ने के लिए आसान कर रहे है के लिए चयन पूर्वाग्रह को हटा ।
6. दिन 3-5:७२, ९६ और १२० एचपीएफ पर assaying चलन
- स्थानांतरण लार्वा methylene नीले बिना E3 माध्यम में ७२ एचपीएफ में चयनित ।
नोट: 3 dpf पर एसेइंग के लिए लार्वा संवेदनाहारी (> 1 एच) से उबरने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति । - प्लेट एक लार्वा एक पिपेट के उपयोग से एक 24-कूप प्लेट के प्रति कूप 1 मिलीलीटर में ।
नोट: लार्वा को नुकसान से बचाने के लिए पिपेट टिप का अंत काटें । प्लेट का आकार प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार बदला जा सकता है । - कैमरा चैंबर में लोड प्लेट्स और 10 मिनट के लिए परख गति एक सफेद प्रकाश का उपयोग कर सहज तैराकी बढ़ाने के लिए नियमित डराना ।
नोट: तैराकी व्यवहार एक कैमरा चैंबर और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ट्रैक किया गया था ( सामग्री की मेजदेखें) । - ९६ और १२० hpf पर एक ही लार्वा के साथ प्रयोग दोहराएं । Assays हैं, के बीच में 28 डिग्री सेल्सियस पर एक पेट्री डिश और इनक्यूबेट को परख थाली में व्यक्तिगत आवास से लार्वा हटो ।
- परख पूरा होने पर, 4% MS222 के घातक अधिक मात्रा में लार्वा euthanize ।
Representative Results
मस्तिष्क कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन ट्रांसजेनिक यूबीक्यू का उपयोग करना :secannexinv-mvenus सभी ich-लार्वा में अनुपस्थित रहे हैं कि दोनों एटीवी और bbh मॉडल में, आईसीएच + लार्वा में मर कोशिकाओं के स्पष्ट निश्चित समूहों में परिणाम (चित्रा 3). क्लस्टर ९६ hpf से पहले हो जाता है । छवि विश्लेषण के माध्यम से, रक्तस्राव मस्तिष्क में प्रतिदीप्ति संकेत की कुल तीव्रता में एक महत्वपूर्ण दो गुना वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, जो चिह्नित कोशिका मृत्यु का संकेत है ।
एक neuroinflammatory प्रतिक्रिया आईसीएच में पहचाना + लार्वा मस्तिष्क में mpeg1 सकारात्मक महाविभोजी कोशिकाओं की काफी वृद्धि की संख्या से है । कुल mpo सकारात्मक न्युट्रोफिल कोशिकाओं की संख्या भी वृद्धि हुई लेकिन यह सांख्यिकीय महत्व तक पहुंच नहीं था (चित्रा 4) । Mpeg1 सकारात्मक मैक्रोफेज के आकारिकी भी एक सक्रिय, गोल, अमीबीय आकार को अपनाने के रूप में आईसीई + लार्वा में बदलने के लिए देखा जा सकता है । इन सक्रिय गोल कोशिकाओं को भी समय के साथ मॉनिटर किया जा सकता है कि यूबिक़ की बढ़ी हुई फैगोसाइटिक प्रतिक्रिया दिखाएं: secannexinv-शुक्र ,ICH + लार्वा में मर कोशिकाओं को व्यक्त (चित्रा 5) । (क) क्या यह सही है कि इस पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा है;
ब्रेन हेमरेज, दोनों bbh और एटीवी मॉडल में ICH-सहोदर नियंत्रण की तुलना में ७२ और ९६ एचपीएफ में गतिशीलता में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ जुड़ा हुआ है (चित्रा 6) । गतिशीलता १२० एचपीएफ पर आधार रेखा के स्तर के पास करने के लिए ठीक हो । वहां अक्सर अंडे चंगुल और उपभेदों के बीच आधारभूत गतिशीलता में मतभेद है और इसलिए तुलना आईसीएच को बनाया जाना चाहिए हर बार नियंत्रित करता है ।
चित्रा 3 : Intracerebral नकसीर (ICH) zebrafish लार्वा में एक quantifiable मस्तिष्क चोट में परिणाम । (क) आईसीएच-सहोदर (बाएं पैनलों) की तुलना में, ७२ एचपीएफ में मस्तिष्क की चोट के फेनोटाइप, ich + लार्वा (दाहिने पैनलों) की प्रतिनिधि छवियां । ब्राइटफील्ड छवियां (बॉटम पैनल्स, स्केल बार = २५० μm) आईसीएच + लार्वा में मस्तिष्क bleeds (तीर) की उपस्थिति का प्रदर्शन । प्रतिदीप्त माइक्रोस्कोपी में सेल मौत कल्पना करने के लिए किया गया था ubiq:secannexinv-mvenus रिपोर्टर लाइन (शीर्ष पैनलों, स्केल बार = १०० μm). मर कोशिकाओं के समूहों peri-रक्तगुगल क्षेत्रों में मनाया गया । छवियाँ केवल मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए फसली थे और पूरक फ़ाइल 1में मैक्रो का उपयोग कर व्यास (सफेद रेखा) में 30 पिक्सल से बड़ा दौर कणों में कुल हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए विश्लेषण किया. (ख) अनुपचारित, आईसीएच और आईसीएच + के दिमाग में फ्लोरेसेंस सिगनल का परिमाणीकरण, एटीवी मॉडल (एन = 12 प्रति समूह; 3 स्वतंत्र प्रतिकृति) के माध्यम से ७२ एचपीएफ पर प्राप्त होता है । काफी अंतर पाया गया जब आईसीएच की तुलना इलाज के साथ (* * p = ०.००४) और आईसीएच के साथ-(* p = ०.०३) भाई बहन । (ग) ७२ एचपीएफ पर bubblehead (बीबीएच) मॉडल (एन = 12 प्रति समूह; 2 स्वतंत्र प्रतिकृति) के माध्यम से प्राप्त किए गए आईआईसीईसीवी के दिमाग में बाध्यकारी के रूप में प्रतिदीप्ति सिगनल का परिमाणन । रेखांकन मतलब से एसडी दिखाओ । MVenus प्रतिदीप्ति में एक महत्वपूर्ण अंतर आईसीएच के बीच मनाया गया + और ICH-आयु-मिलान भाई बहन (* * p = ०.००२) । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : Intracerebral नकसीर (आईसीएच) zebrafish लार्वा मस्तिष्क में एक सहज सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू होता है । पहले mpo के लिए वर्णित मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर मात्रा निर्धारित ल्यूकोसाइट्स की संख्या: gfp; mpeg1: dsred डबल ट्रांसजेनिक लार्वा (n = 8 प्रति समूह; 2 स्वतंत्र replicates) पर ७२ एचपीएफ मैक्रोफेज में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चलता है (* p = ०.०१), लेकिन नहीं न्यूट्रोफिल (p = ०.५), आईसीएच के जवाब में । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : सक्रियित मैक्रोफेज कोशिकाएं मस्तिष्क के घावों के लिए एक फैगोसाइटिक प्रतिक्रिया दिखाती हैं । (क) प्रतिनिधिक समय-चूक पोस्टरों20 में एक शारिष्ट पैट्रोलिंग मैक्रोफेज को दर्शाया गया है जो एनेसिफाइड पॉजिटिव सेल (आई-6) की ओर पलायन कर रहा है । Stills एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर पूरे मस्तिष्क की लिया छवियों की एक श्रृंखला से प्राप्त कर रहे हैं । स्केल बार ५० μm का प्रतिनिधित्व करता है । बृहत्विभोजी ने एनेन्सवी-पॉजिटिव सेल (vi, vii) को फैगोसाइटोज करने से पहले एक अमीबाइड आकारिकी (v) का अधिग्रहण किया । फागोसाइटोसिस के बाद मैक्रोफेज एक शारिकृत आकारिकी को फिर से शुरू करता है और दूर ले जाता है और annexinV-positive सेल अब नहीं देखा जा सकता है (viii) । शाखाकृत मैक्रोफेज (#), एनेइनव पॉजिटिव सेल (तीर), अमीबाभ मैक्रोफेज (*) संकेत दिए गए हैं । (ख) इच- और च + लार्वा मस्तिष्क में ए. एच. आई-पॉजिटिव कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां जो अमीबोइड और शाखित मॉर्पोलोजी का प्रदर्शन कर रही हैं । स्केल पट्टियां ५० μm का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ग) इच-सहोदर की तुलना में अमीबोइड (फैगोसाइटिक) का एक बढ़ा हुआ अनुपात और शाखित (निष्क्रिय) मैक्रोफेज का अनुपात कम पाया गया । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6 : आईसीएच प्रेरित मस्तिष्क चोट zebrafish लार्वा में एक quantifiable चलन में कमी का परिणाम है । (क) आईसीएच-और आईसीए + बी के लार्वा में तैराकी पटरियों के ७२, ९६ और १२० एचपीएफ के प्रतिनिधि उदाहरण । (ख) आईसीएच + लार्वा ने 10 मिनट की रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान ७२ और ९६ दोनों एचपीएफ पर संचित समय में काफी कमी दर्शाई है । महत्व १२० एचपीएफ समय बिंदु पर खो गया था संभावित मस्तिष्क चोट से वसूली के लिए alluding (n = 24 लार्वा प्रति समूह; 3 स्वतंत्र प्रतिकृति; * * * * p = ०.००००६; * * p = ०.००३; ns: p = ०.०८) । (ग) अशोधित और एटीवी-उपचारित आईसीएच और आईसीएच + १२० एचपीएफ पर लार्वा में चलने वाले संचयी समय का परिमाणीकरण । ICH + लार्वा 10 मिनट रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान खर्च मोबाइल संचई समय में एक महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित । तीन तकनीकी प्रतिकृति (n = 24 लार्वा प्रति समूह) मतलब से एसडी की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया (* * * p = ०.००००४, * * p = ०.०००३) । चित्रा Crilly एट अल20 से एक क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के तहत अनुमति के साथ reproduced किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस अध्ययन से पता चलता है कि zebrafish लार्वा में आईसीएच मस्तिष्क चोट प्रतिक्रिया लाती है कि मानव की स्थिति है कि व्यवस्थित रूप से assayed और मात्रा की जा सकती है के प्रमुख पहलुओं recapitulates । Zebrafish सहज, जो भविष्य में दवा हस्तक्षेप अध्ययन रक्त प्रेरित मस्तिष्क चोट को लक्षित करने पर ध्यान केंद्रित के बजाय पोत टूटना रोकने के17,28के साथ सहायता करेगा की एक सुसंगत और reproducible मॉडल प्रदान करते हैं । वास्तव में, रोग शुरुआत नैदानिक स्थिति के समान की तेजी से प्रकृति को देखते हुए, इस तरह के एक दृष्टिकोण भविष्य में सफल अनुवाद के लिए रोमांचक संभावनाएं प्रदान करता है ।
कुछ सीमाएं zebrafish लार्वा के उपयोग के साथ जुड़े रहे हैं, जैसे एक विकासशील प्रणाली और वर्गीकरण रैंक के उपयोग के रूप में, लेकिन इस मॉडल के व्यावहारिक और वैज्ञानिक लाभ आईसीएच में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विचार किया जाना चाहिए । नकसीर शुरू करने के लिए या चोट के बाद समय की विस्तारित अवधि में सेलुलर प्रक्रियाओं की निगरानी करने के लिए कोई सर्जरी की आवश्यकता है । Zebrafish pairings के उच्च उर्वरता आसानी से सुलभ और बड़े नमूना आकार उत्पंन करते हैं, और लार्वा के तेजी से विकास के कारण प्रयोगात्मक समयरेखा रोहताश अध्ययन29,30की तुलना में काफी कम है ।
वर्तमान में इन मॉडलों के लिए तत्काल रोग और जीवित बरकरार जानवरों के मस्तिष्क में सहज आईसीइयूलॉजिकल प्रतिक्रिया elucidating के लिए उपयोग करने के लिए फिट हैं । संभवतः, इस मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है मध्यम उच्च throughput दवा स्क्रीन के लिए ICH चिकित्सा, चाहे preventative या वसूली को बढ़ावा देने । इस प्रकार, इस अध्ययन में प्रस्तुत की पोस्ट-च विकृतियों पूर्व नैदानिक आईसीएच अनुसंधान के लिए एक वैकल्पिक, पूरक मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम डॉ डेविड स्पेलर और उपकरण के उपयोग के लिए मैनचेस्टर सिस्टम्स Microscopy कोर सुविधा के विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, प्रो रिचर्ड Baines के उपयोग के लिए DanioVision और डॉ जैक नदियों-सांख्यिकी परामर्श के लिए Auty. Bbh लाइन कृपया डॉ सारा बच्चे की प्रयोगशाला से निकोल Munsie द्वारा कैलगरी विश्वविद्यालय में साझा किया गया । हम प्रो स्टीफन रेनशॉ, डॉ एडम हुल्स्टोन, डॉ एंड्रयू बडरॉक और डॉ हेलेन यंग को फिश लाइंस और इक्विपमेंट के लिए भी धन्यवाद देते हैं ।
इस अध्ययन NC3Rs द्वारा समर्थित किया गया था (नेकां/N002598/1), स्ट्रोक एसोसिएशन (TSA LECT 2017/02), युग नेट ंयूरॉन (श्री/M501803/ हम भी विशेष रूप से नेटली केट मॉस ट्रस्ट और उनके जारी वित्तीय सहायता के लिए जीव विज्ञान, चिकित्सा और स्वास्थ्य के मैनचेस्टर संकाय के विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
| 28 °C incubator | LMS | 210 | |
| Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
| Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
| Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
| E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
| EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
| Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
| Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
| Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
| Low melt agarose | Promega | V2111 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
| Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
| Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
| MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
| P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
| P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
| Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
| Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
| Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
| Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
| Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
| Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
| Zen software | Zeiss | version 2.3 |
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