Summary
Beskrivs här är ett protokoll för att undersöka samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora med in vitro-sats fermenterings system.
Abstract
Mänskliga intestinala mikroorganismer har nyligen blivit ett viktigt mål för forskning för att främja människors hälsa och förebygga sjukdomar. Följaktligen har undersökningar av interaktioner mellan endobiotika (t. ex. läkemedel och prebiotika) och tarmbiota blivit ett viktigt forskningsämne. Emellertid, in vivo experiment med frivilliga försökspersoner är inte idealiska för sådana studier på grund av bioetik och ekonomiska begränsningar. Som ett resultat, djurmodeller har använts för att utvärdera dessa interaktioner in vivo. Ändå, djurmodell studier är fortfarande begränsad av bioetiska överväganden, förutom olika kompositioner och mångfaldigheter av bakterieflora hos djur vs. människor. En alternativ forskningsstrategi är användningen av batch jäsning experiment som möjliggör utvärdering av samspelet mellan endobiotika och Gut bakterieflora in vitro-. För att utvärdera denna strategi, bifidobakteriell (BIF) exopolysackarider (EPS) användes som en representativ xenobiotic. Sedan, samspelet mellan BIF EPS och Human Gut bakterieflora undersöktes med hjälp av flera metoder såsom tunnskiktskromatografi (TLC), bakteriell gemenskap sammansättning analys med 16s rRNA gen hög kapacitet sekvensering, och gaskromatografi av kortkedjiga fettsyror (SCFAs). Presenteras här är ett protokoll för att undersöka samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora med in vitro-sats fermenterings system. Viktigt, detta protokoll kan också ändras för att undersöka allmänna interaktioner mellan andra endobiotika och Gut bakterieflora.
Introduction
Gut bakterieflora spela en viktig roll i hur mänskliga tarmarna och i Host Health. Därför har Gut bakterieflora nyligen blivit ett viktigt mål för sjukdomsförebyggande och terapi1. Dessutom, Gut bakterier interagerar med värd tarmceller och reglera grundläggande värdprocesser, inklusive metaboliska aktiviteter, näringsämnes tillgänglighet, immunsystemet modulering, och även hjärnans funktion och beslutsfattande2,3 . Endobiotika har stor potential att påverka bakterie sammansättningen och mångfalden av tarmfloran. Sålunda, interaktioner mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora har väckt ökad forskning uppmärksamhet4,5,6,7,8,9.
Det är svårt att utvärdera interaktioner mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora in vivo på grund av bioetik och ekonomiska begränsningar. Till exempel kan experiment som undersöker samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora inte utföras utan tillstånd från Food and Drug Administration, och rekrytering av volontärer är dyrt. Därför används ofta djurmodeller för sådana utredningar. Emellertid, användningen av djurmodeller är begränsad på grund av olika bakterieflora kompositioner och mångfald i djur-vs. Human-associerade samhällen. En alternativ in vitro-metod för att utforska samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora är genom användning av batch kultur experiment.
Exopolysackarider (EPSs) är prebiotika som avsevärt bidrar till upprätthållandet av människors hälsa10. Distinkta EPSs som består av olika monosackarid kompositioner och strukturer kan uppvisa distinkta funktioner. Tidigare analyser har fastställt sammansättningen av BIF EPSS, som är den representativa xenobiotiska riktad i den aktuella studien11. Emellertid, värd-associerade metaboliska effekter har inte beaktats när det gäller EPS sammansättning och mångfald.
Det protokoll som beskrivs här använder fekal bakterieflora från 12 frivilliga att jäsa BIF EPSS. Tunnskiktskromatografi (TLC), 16S rRNA gen hög kapacitet sekvensering, och gaskromatografi (GC) används sedan i kombination för att undersöka samspelet mellan EPSs och Human Gut Microbiota. Distinkta fördelar med detta protokoll jämfört med in vivo experiment är dess låga kostnader och undvikande av störande effekter från värdens metabolism. Dessutom kan det beskrivna protokollet användas i andra studier som undersöker interaktioner mellan endobiotika och Human Gut Microbiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna från etikkommittén för Hunan University of Science and Engineering (Hunan, Kina) och Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, Kina).
1. beredning av bakterier
- Beredning av Bifidobacterium medium buljong
- Kombinera följande komponenter i 950 mL destillerat vatten: köttextrakt, 5 g/L; jästextrakt, 5 g/L; kasein Peptone, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glukos, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; saltlösning, 40 mL (CaCl2. 2H2O, 0,25 g/L; KH2Po4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); och resazurin, 0,4 mL (2,5 mg/L). Justera pH till 6,8 med 2 M NaOH.
- Autoklav vid 121 ° c i 15 min och låt buljongen svalna till rumstemperatur (RT) under anaeroba förhållanden (10% H2, 10% Co2, 80% N2). Tillsätt filter-steriliserad cystein-HCl (0,5 g/L) och Mupirocin (5 mg/L) till mediet.
- Tillsätt en alikvot (50 μL) fryst Bifidobacterium Longum till en kultur röret med 5 ml av Bifidobacterium medium buljong under anaeroba förhållanden, sedan kultur i en anaerob inkubator för 24 h vid 37 ° c.
2. beredning av bifidobakteriell EPSs
- Beredning av PYG agar medium
- Kombinera följande: Peptone, 20 g/L; jästextrakt, 10 g/L; glukos, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2Po4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Justera pH till 7,2 med 10 M NaOH.
- Autoklav mediet vid 121 ° c i 15 min och svalna till ~ 50 ° c. Därefter, per 1 liter medium, tillsätt 0,5 mL filtersteriliserad vitamin K1 lösning (1 g vitamin k1 upplöst i 99 ml 99% etanol), 5 ml haemin Solution (0,5 g hematin upplöst i 1 ml 1 mol/L NaOH , sedan tas upp till 100 mL med destillerat vatten), och 0,5 g cystein-HCl.
- Innan du häller PYG plattorna, tillsätt filter-steriliserad 5-Bromo-4-klor-3-indolyl β-D-galaktopyranoside (X-gal, 0,06 g/i), LiCl · 3H2O (5,7 g/l) och Mupirocin (5 mg/l) till mediet.
Anmärkning: X-gal och LiCl. 3H2O tillåta identifiering av B. Longum kolonier på plattor via färgförändringar.
- Inokulera 20 μL av B. Longum -stammar (steg 1,2) till pyg-plattor och placera i en anaerob inkubator vid 37 ° c för 72 h.
- Samla in mukoida bakteriekolonier från PYG-plattorna med en vägnings skopa, och sedan helt Omsuspendera i 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en Vortex-oscillator.
Anmärkning: bakterie-och EPS-blandningar bör återsuspenderas helt genom att vortexera eller Pipettera upp och ner upprepade gånger tills fibrerna är helt upplöst i PBS. - Centrifugera suspensionen vid 6 000 x g i 5 min.
- Överför försiktigt supernatanterna till ett nytt centrifugeringsrör och blanda helt med tre volymer kallt 99% etanol genom upprepad inversion och blandning.
- Centrifugera blandningen vid 6 000 x g i 5 min och helt ta bort supernatants.
- Avlägsna fällningarna från centrifugrör genom skrapning och torkning av EPS-utdragen över natten med hjälp av ett hastighets vakuum.
3. beredning av fermenterings medium
- Beredning av grundläggande odlingssubstrat VI
- Kombinera följande: Peptone, 3 g/L; Tryptone, 3 g/L; jästextrakt, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; gallsalter nr 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2· 6H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2. 6H2O, 0,2 g/L; KH2Po4, 0,4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3,0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0,32 g/L; FeSO4· 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CaCl2· 2H2O, 0,1 g/L; ZnSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CuSO4· 5H2O, 0,01 g/L; och NiCl2· 6H2O, 0,092 g/L. Justera pH till 6,5 med 1 M HCl.
- Förbered Haemin och cystein som gjort i avsnitt 2,1 och tillsätt efter autoklav och kyla.
- Förbered kulturmedia som innehåller olika kolkällor med en VI-basmedia. Före autoklavering, tillsätt 8 g/L av BIF EPS fibrer till medium VI, bestående av grupp VI_Bif. Tillsätt dessutom 8 g/L stärkelse till medel VI för att representera grupp VI_Starch. Slutligen används medium VI utan tillsats av en kolkälla som kontroll (grupp VI).
Obs: BIF EPS och stärkelse löses först i varmt vatten med hjälp av en magnetisk omrörare, sedan blandas med förberett VI medium. - Autoklav alla medier vid 121 ° c i 15 min och låt svalna till RT.
- Överför ett delprov (5 mL) av varje medium till odlings rör i en anaerob inkubator och förvara resterande media vid 4 ° c.
4. beredning av Human fekal prov
- Samla färska fekal prover omedelbart efter färsk avföring från friska vuxna frivilliga försökspersoner med avföring behållare, och därefter använda för flytgödsel beredning.
Anmärkning: före provinsamling, alla frivilliga bör screenas för att säkerställa ingen mottagning av antibiotika, probiotika, eller prebiotiska behandlingar för minst 3 månader före donera prover. Dessutom måste alla givare ge informerat, skriftligt medgivande. - Överför ett färskt fekal prov (1 g) till 10 mL 0,1 M anaerob PBS (pH 7,0) i glasbägare och Använd sedan glasstavar för att bereda en 10% (vikt/volym) flytgödsel.
- Använd en sikten på 0,4 mM för att filtrera fekal slam. Använd sedan ett delprov av den filtrerade flytgödsel att Inokulera batch kultur jäsning experiment, och lagra återstoden vid-80 ° c för ytterligare analyser.
Anmärkning: steg 4.2 – 4.3 utförs i en anaerob kammare.
5. in vitro-satsjäsning
- Tillsätt filtrerad fekal flytgödsel (500 μl) till det fermenterings medium som bereds i steg 3,2 i en anaerob kammare och inkubera vid 37 ° c.
- Samla 2 mL fermenterade prover vid 24 h och 48 h i anaerob kammaren och centrifugera sedan utanför kammaren vid 6 000 x g i 3 min.
- Överför försiktigt supernatanterna till ett nytt centrifugeringsrör som kommer att användas för analys av polysackarid nedbrytning och kortkedjiga fettsyror (SCFAs) mätningar.
- Förvara centrifugering pellets vid-80 ° c och därefter användning för bakteriell genomisk DNA-extraktion.
6. EPS nedbrytning av Human fekal bakterieflora
- Ladda 0,2 μl av fermenterade samman supernatanterna på pre-coated kiselgel-60 TLC aluminiumplattor, sedan torka med en hårfön.
- Utveckla plattorna i 20 mL av en myrsyra/n-butanol/vatten (6:4:1, v:v: v) lösning och torka med en hårfön.
- Blötlägg plattorna i orcinol reagens för att färga, sedan torka med en hårfön.
- Förbered orcinol-reagens genom att lösa upp 900 mg Lichenol i 25 mL destillerat vatten och sedan lägga till 375 mL etanol. Därefter bör koncentrerad svavelsyra långsamt tillsättas och lösningen blandas grundligt.
- Värmeplattor vid 120 ° c i 3 min i en bakugn och utvärdera nedbrytning av EPS genom att mäta TLC band.
7. effekter av EPS på human intestinal bakterieflora
- Frys-Tina de ursprungliga fekala proverna som förberetts i steg 4,3 och fermenterade prover som förberetts i steg 5,4.
- Extrahera bakteriell genomisk DNA (gDNA) från alla prover med hjälp av en pall bakteriell genomisk DNA extraktion kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Bestäm DNA-koncentrationer, integriteter och storleks fördelningar med hjälp av en mikrospektrofotometer och agar gel elektrofores.
- Genomför PCR av bakteriella 16S rRNA gener från extraherade gDNA med hjälp av följande tidigare beskrivna framåt och omvänd primers12:
-framåt primer (Barcoded primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-omvänd primer (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Använd följande termiska cyklers tillstånd:- 94 ° c i 5 min.
- 94 ° c i 30 s.
- 55 ° c i 30 s.
- 72 ° c i 1 min.
- Upprepa 2 – 4 för 35 cykler
- 72 ° c i 5 min.
- 4 ° c Håll tills avlägsnande från termisk Cycler.
- Utföra sekvensering av PCR-produkter med hög kapacitet vid ett DNA-sekvenserings företag med mikrobiologisk community-analys med ultrahögt dataflöde.
- Få ren, hög kvalitet sekvenser med hjälp av kvantitativa insikter i mikrobiell ekologi (QIIME) sekvens analys pipeline13.
- Definiera operativa taxonomiska enheter (OTUs) för 16S rRNA gensekvenser med större än 97% nukleotid likhet med hjälp av bioinformatik verktyg såsom Mothur Software Suite14.
- Välj en representativ sekvens från varje OTU och Använd RDP-klassificeraren tillsammans med Silvas taxonomiska databas för att klassificera representativa sekvenser15.
- Beräkna Good ' s täckning, alfa mångfald Metrics (inklusive Simpson och Shannon index), och rikedom (observerade antalet OTUs) med hjälp av bioinformatik verktyg16.
8. effekter av EPS på scfa produktion av Human intestinal bakterieflora
- Tillsätt fermenterade supernatanter (1 mL) som bereds i steg 5,3 till 2 mL centrifugrör.
- Tillsätt 0,2 ml 25% (w/v) metafosforsyra Acid till vart och ett av proverna och grundligt blanda lösningarna genom vortexing.
- Centrifugera blandningarna vid 13 000 x g i 20 min och överför supernatanterna till nya tuber.
- Samtidigt bereda lösningar av 120 mM ättiksyra, propionsyra, smörsyra, isobutyric, Valeriana och isovalerisk syror. Tillsätt sedan 1 ml av varje beredd syra till 1,2 ml 25% (w/v) metafosforsyra Acid och Använd som standard cocktails.
- Filtrera proverna med ett 0,22 μM membran.
- Detektera scfa-koncentrationer med hjälp av gaskromatografi med hög prestanda enligt tidigare beskrivna protokoll11,17.
Anmärkning: en InertCap FFAP-kolonn (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) används för gaskromatografi (GC). SCFA koncentrationer kvantifieras sedan baserat på topp områden med hjälp av Single-Point intern standardmetod i GC lösning mjukvarupaket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produktionen av slemmig EPS kunde observeras i B. Longum kulturer på pyg-plattor efter anaeroba inkubering för 72 h (figur 1a). Centrifugering av kultur skrapor, följt av etanol nederbörd och torkning, resulterade i insamling av cellulosa-liknande EPS (figur 1b). Torkade EPS och löslig stärkelse användes sedan som kolkällor för jäsnings kulturer. TLC användes för oligosackarid separation och renhet analys på grund av dess låga kostnader och snabba resultat vändning18. Även om nedbrytningstakten för stärkelse genom mänsklig fekal bakterieflora var snabbare än för BIF EPS (figur 2), var BIF EPS nedbrytning tydligt observerades för vissa EPS-inokulerade prover.
Gemenskapens sammansättning analys via 16S rRNA Gene High-genomströmning sekvensering och Principal koordinat analys (PCoA) utfördes sedan för att undersöka effekterna av BIF EPS på human Gut Microbiota. Proverna från grupperna VI_Bif och VI_Starch klustrade separat från varandra i PCoA-analysen (figur 3a), vilket indikerar att EPS och stärkelsetillgängligheten Differentiellt formar humana fekala bakteriesamhällen. Linjär diskriminering analys effekt storlek (LEfSe) användes ytterligare för att skilja de specifika bakteriella taxa som skilde mellan VI_Bif och VI_Starch behandlingar. Släktena Collinsella, coprococcus, Parabacteroidesoch Rhodopseudomonas var signifikant vanligare i VI_Bif-proverna än i VI_Starch-proverna (figur 3b). Vidare, GC mätningar gjordes för flera SCFAs att utvärdera sin produktion efter tillsats av olika kolkällor. SCFAs som mättes från jäsning kulturer inkluderade ättiksyra, propionic, isobutyric, smörsyra, isovalerisk, och valerisk syror. Efter jäsning för 24 h och 48 h, fem av de sex ovannämnda SCFA koncentrationer var liknande bland behandlingar och inte statistiskt olika mellan VI_Bif, VI_Starch, och VI grupper. Propionsyra-koncentrationerna var dock signifikant högre i VI_Bif-gruppen än i VI_Starch-gruppen (figur 4).
Figur 1: EPS producerad av B. Longum.
Fryst B. Longum återställdes i Bifidobacterium medium buljong och sedan strimmiga på pyg plattor, följt av Anaerobinkubering vid 37 ° c för 72 h (a). EPS som produceras av bakteriekulturer skrapades från plattkulturer, fälls ut med etanol och torkas över natten med hjälp av en hastighets vakuum (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: TLC analys av in vitro EPS och stärkelse nedbrytning av Human Gut Microbiota.
TLC-analys utfördes på 0,2 μL prover som samlats vid 24 h och 48 h från varje fermenterings kultur som odlas under anaeroba förhållanden. VI, VI_Starch, och VI_Bif anger VI media, VI Media + stärkelse tillägg, och VI Media + EPS-tillägg, respektive. Siffrorna 1 – 12 indikerar fekal bakteriella prover från de 12 frivilliga som användes för att Inokulera jäsnings experiment. Kontrollgruppen representerar behandling utan ytterligare kol tillskott. Denna siffra är modifierad från Yin et al. 11. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekter av BIF EPS tillgänglighet på human Gut bakterieflora samhällen.
(A) PCoA Plot av Gut bakterieflora gemenskapens sammansättning olikheter baserat på oviktade UniFrac metriska. B) vänsteranalys av bakterietaxonomi som var mycket riklig bland behandlingsgrupperna. En cutoff av p < 0,05 användes för att bedöma den statistiska betydelsen av bakteriella taxonomiska skillnader mellan grupper. Ori indikerar Gut bakterieflora av frivilliga fekal prover. VI_Bif och VI_Starch indikerar tarmfloran från jäsnings prov med hjälp av VI-media med EPS och stärkelse som kol substrat, respektive. VI representerar kontrollgruppen med tarmbiota inokulerade fermenteringar i VI-media utan tillskott av andra kolhydrater. Denna siffra är modifierad från Yin et al. elva Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: effekter av EPS tillgänglighet på SCFA produktion efter 24 h och 48 h jäsning.
Ättiksyra, propionsyra, isobutyric, smörsyra, isovalerisk och valerisk syra upptäcktes med gaskromatografi. VI_Bif, VI_Starch, och VI anger de prover som samlades in efter odling med hjälp av VI Media + EPS, VI Media + stärkelse, och VI media, respektive. Alla prover mättes i tre exemplar. Siffrorna har genererats med GraphPad Prism version 5,01. Panelerna representerar organiska syra koncentrationer inom varje fermenterat prov för A, ättiksyra. B, propionsyra; C, mör syra; D, smörsyra; E, isovalerisk syra; och F, valerisk syra. Denna siffra är modifierad från Yin et al.11vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydande framsteg har gjorts mot förståelsen av människans tarmbiota-sammansättning och aktiviteter under det senaste decenniet. Som en konsekvens av dessa studier, holobiont konceptet har dykt upp, som representerar samspelet mellan värdar och associerade mikrobiella samhällen, såsom mellan människor och deras Gut bakterieflora19,20. Dessutom är människor även nu betraktas som superorganismer21, vari bakterieflora har erkänts som en av de funktionella organ i människor22,23. Den mänskliga kroppen är värd för ett komplext mikrobiellt ekosystem, bestående av cirka 1013 mikrobiella celler24. Dessutom betraktas genomerna i tarmfloran som hjälp genom av människor som kodar många metaboliska gener som utökar värdens metaboliska kapacitet4. Emellertid, xenobiotika, inklusive terapeutiska läkemedel och kost-derived bioaktiva föreningar, kan potentiellt förändra Gut mikrobiomet gemenskapsstruktur och tillhörande funktioner5. Ökande antal studier har visat att interaktioner mellan tarmfloran och xenobiotika spelar viktiga roller i att förmedla kemisk toxicitet och orsaka, eller på annat sätt förvärra, mänskliga sjukdomar6,7. Således, undersökningar av samspelet mellan xenobiotika och den mänskliga tarmfloran har nyligen samlat betydande forskning uppmärksamhet.
Musmodeller har varit de mest använda metoderna för att undersöka interaktioner mellan bakterieflora och värdar. Men skillnader i sammansättning och aktiviteter mellan tarmfloran hos människor och möss25 kan resultera i otillräcklig modellering av mänskliga interaktioner genom studier av möss. Bioetiska överväganden kräver dock minimal användning av möss. Ett alternativ till ovanstående in vivo modeller är batch jäsning, som kan användas för att simulera Human Gut bakterieflora in vitro-26. Följaktligen har jäsnings experiment använts för att undersöka samspelet mellan xenobiotika och Human Gut Microbiota. Till exempel, Yin et al. 17 har använt batch jäsning experiment för att undersöka samspelet mellan polysackarider och Human Gut Microbiota. Resultaten från denna studie tyder på att vissa polysackarider kan metaboliseras av den mänskliga tarmfloran, och att polysackarider modulera den mänskliga bakterie samhället och metaboliter som de producerar in vitro, inklusive SCFAs. Vissa metodologiska överväganden är dock avgörande för användningen av detta protokoll. Till exempel, fekal prover bör samlas så snart som möjligt, och en anaerob kammare bör användas för att säkerställa tillväxten av obligate anaerobes. Den senare övervägande är särskilt kritisk, eftersom syre exponering kan leda till döden av vissa Gut bakterie populationer och därmed, förändring av bakterie samhället. Dessutom är xenobiotika metaboliseras i det övre matsmältningssystemet. Följaktligen, modellering av samspelet mellan xenobiotika och den nedre matsmältningssystemet bakterieflora är en viktig faktor för in vivo modellering.
Batch jäsning experiment har tydliga fördelar över in vivo human-och djurstudier eftersom de är mer ekonomiskt genomförbart och bekvämt. Dessutom, de kan användas för att undersöka interindividuell variation av Human Gut bakterieflora svar på xenobiotiska exponering. Dessutom, batch jäsning kan lätt appliceras för att manipulera bakterieflora samhällen och utvärdera deras associerade metaboliska funktioner. Men, satsvis fermenterings system lider av begränsningen av statisk tillståndsdynamik. Framtida utredningar kan genomföra bioreaktor kemostater som möjliggör dynamisk modulering av pH, temperatur och peristaltiken, samtidigt som en stadig tillförsel av näringsämnen och kontinuerlig borttagning av avfall. Sådan verksamhet skulle tillåta experiment för att bättre efterlikna in vivo tarm skrifter och ge nya insikter för att komplettera dem från batch jäsning experiment. En ytterligare begränsning av satsvis jäsning experiment är att de tar bort alla microbiome-värd vävnad interaktioner. Detta kan vara en särskilt viktig faktor, eftersom vissa xenobiotika (t. ex. metamfetamin) kan Co-metaboliseras av mänskliga celler och Gut bakterieflora27. Dessutom har nyligen genomförda studier indikerat att Gut Metagenomanalys (GM) indirekt kan reglera xenobiotisk metabolism via reglering av värd gen uttrycks regel8.
Även om utvecklingen av sats jäsnings system fortfarande behövs, dessa system kan användas i stor utsträckning för hög genomströmning och snabb screening av interaktioner mellan xenobiotika och Human Gut Microbiota. Belysa mekanismerna bakom xenobiotiska resistens och metabolism i aktiva mänskliga Gut mikrobiomes kommer att ge viktiga insikter i oförklarlig patient-till-patient variation i läkemedels effekt och toxicitet8,9. Vidare, en mer detaljerad förståelse för hur dieter och specifika livsmedelskomponenter förändra mikrobiella metabolismer och därmed effekt värd hälsa är det första steget mot att förverkliga målet med personlig medicin via bakterieflora modulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter. Siffrorna nämndes i Yin et al. 11.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av National Nature Science Foundation i Kina (nr 31741109), Hunan Natural Science Foundation (nr 2018JJ3200), och konstruera program för tillämpad karakteristisk disciplin i Hunan University of Science and Engineering. Vi tackar LetPub (www.letpub.com) för dess språkliga hjälp under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
