Summary

Analyse af interaktioner mellem Endobiotika og humant tarm mikrobiota ved hjælp af in vitro-bade fermenterings systemer

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Beskrevet her er en protokol til at undersøge samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota ved hjælp in vitro-batch fermenterings systemer.

Abstract

Humane tarm mikroorganismer er for nylig blevet et vigtigt mål for forskning i at fremme menneskers sundhed og forebygge sygdomme. Derfor er undersøgelser af interaktioner mellem endobiotika (f. eks. lægemidler og Prebiotika) og Gut mikrobiota blevet et vigtigt forskningsemne. Men in vivo eksperimenter med humane frivillige er ikke ideelle til sådanne undersøgelser på grund af bioetik og økonomiske begrænsninger. Som følge heraf er der blevet anvendt dyremodeller til at evaluere disse interaktioner in vivo. Ikke desto mindre er dyremodel undersøgelser stadig begrænset af bioetiske overvejelser, foruden forskellige sammensætninger og forskelle i mikrobiota hos dyr vs. mennesker. En alternativ forskningsstrategi er brugen af batch fermenterings eksperimenter, der muliggør evaluering af samspillet mellem endobiotika og Gut mikrobiota in vitro. For at evaluere denne strategi, bifidobacterial (BIF) Exopolysaccharider (EPS) blev brugt som en repræsentativ xenobiotic. Derefter, samspillet mellem BIF EPS og human Gut mikrobiota blev undersøgt ved hjælp af flere metoder såsom tyndtlagkromatografi (TLC), bakteriel samfund kompositoriske analyse med 16S rRNA gen High-gennemløb Sequencing, og gaskromatografi af kortkædede fedtsyrer (SCFAs). Præsenteret her er en protokol til at undersøge samspillet mellem endobiotika og human Gut mikrobiota ved hjælp in vitro batch fermenterings systemer. Vigtigere, denne protokol kan også ændres til at undersøge generelle interaktioner mellem andre endobiotika og Gut microbiota.

Introduction

Gut mikrobiota spiller en vigtig rolle i driften af humane tarme og i værts sundhed. Derfor er Gut mikrobiota for nylig blevet et vigtigt mål for sygdomsforebyggelse og terapi1. Desuden, Gut bakterier interagere med vært tarmceller og regulere grundlæggende vært processer, herunder metaboliske aktiviteter, næringsstof tilgængeliggørelse, immunsystem modulation, og endda hjernefunktion og beslutningstagning2,3 . Endobiotika har et betydeligt potentiale til at påvirke den bakterielle sammensætning og mangfoldighed af Gut microbiota. Således, interaktioner mellem endobiotika og human Gut mikrobiota har tiltrukket stigende forskning opmærksomhed4,5,6,7,8,9.

Det er vanskeligt at evaluere samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota in vivo på grund af bioetik og økonomiske begrænsninger. For eksempel kan eksperimenter, der undersøger samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota, ikke udføres uden tilladelse fra Food and Drug Administration, og rekruttering af frivillige er dyrt. Derfor anvendes dyremodeller ofte til sådanne undersøgelser. Brugen af dyremodeller er dog begrænset på grund af forskellige mikrobiota kompositioner og diversitet i dyr-vs. menneske-associerede samfund. En alternativ in vitro-metode til at udforske samspillet mellem endobiotika og human Gut mikrobiota er gennem brug af batch kultur eksperimenter.

Exopolysaccharider (Eps’er) er prebiotics, der bidrager væsentligt til opretholdelsen af menneskers sundhed10. Særskilte Eps’er, der består af forskellige monosaccharid kompositioner og strukturer kan udvise forskellige funktioner. Tidligere analyser har fastlagt sammensætningen af BIF Eps’er, som er det repræsentative xenobiotiske mål i den nuværende undersøgelse11. Men, Host-associerede metaboliske effekter er ikke blevet overvejet med hensyn til EPS sammensætning og mangfoldighed.

Den protokol, der er beskrevet her, bruger fækal mikrobiota fra 12 frivillige til gære BIF EPSS. Tyndtlags kromatografi (TLC), 16S rRNA-gensekvensering med høj gennemløb og gaskromatografi (GC) anvendes derefter i kombination til at undersøge samspillet mellem EPSs og humant tarm mikrobiota. Særskilte fordele ved denne protokol sammenlignet med in vivo eksperimenter er dens lave omkostninger og undgåelse af interfererende virkninger fra værtens metabolisme. Desuden kan den beskrevne protokol anvendes i andre undersøgelser, der undersøger interaktioner mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne fra den etiske komité for Hunan University of Science and Engineering (Hunan, Kina), og Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, Kina). 1. fremstilling af bakterier Fremstilling af bifidobacterium medium bouillon Bland følgende komponenter i 950 mL destilleret vand: kødekstrakt, 5 g/L; gærekstrakt, 5 g/L; kasein peptone, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4· 7h2</sub…

Representative Results

Produktionen af mucoid EPS kunne observeres i B. longum kulturer på PYG plader efter anaerob inkubation for 72 h (figur 1a). Centrifugering af kultur skraber, efterfulgt af ethanol nedbør og tørring, resulterede i indsamling af cellulose-lignende EPS (figur 1b). Tørrede EPS og opløselige stivelse blev derefter brugt som kulstofkilder til fermenterings kulturer. TLC blev brugt til oligosaccharid separation og renhed analyse på grund af sin lave omk…

Discussion

Der er gjort betydelige fremskridt i retning af at forstå Human Gut mikrobiota sammensætning og aktiviteter i løbet af de sidste ti år. Som en konsekvens af disse undersøgelser, holobiont koncept er dukket op, som repræsenterer samspillet mellem værter og associerede mikrobielle samfund, såsom i mellem mennesker og deres Gut mikrobiota19,20. Desuden er mennesker selv nu betragtes som Super organismer21, hvor tarmen mikrobiota er bl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev finansieret af national Nature Science Foundation i Kina (no. 31741109), Hunan Natural Science Foundation (nr. 2018JJ3200), og konstruktions programmet for anvendt karakteristisk disciplin i Hunan University of Science and Engineering. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for sin sproglige bistand under forberedelsen af dette manuskript.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

References

  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

View Video