Beskrevet her er en protokol til at undersøge samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota ved hjælp in vitro-batch fermenterings systemer.
Humane tarm mikroorganismer er for nylig blevet et vigtigt mål for forskning i at fremme menneskers sundhed og forebygge sygdomme. Derfor er undersøgelser af interaktioner mellem endobiotika (f. eks. lægemidler og Prebiotika) og Gut mikrobiota blevet et vigtigt forskningsemne. Men in vivo eksperimenter med humane frivillige er ikke ideelle til sådanne undersøgelser på grund af bioetik og økonomiske begrænsninger. Som følge heraf er der blevet anvendt dyremodeller til at evaluere disse interaktioner in vivo. Ikke desto mindre er dyremodel undersøgelser stadig begrænset af bioetiske overvejelser, foruden forskellige sammensætninger og forskelle i mikrobiota hos dyr vs. mennesker. En alternativ forskningsstrategi er brugen af batch fermenterings eksperimenter, der muliggør evaluering af samspillet mellem endobiotika og Gut mikrobiota in vitro. For at evaluere denne strategi, bifidobacterial (BIF) Exopolysaccharider (EPS) blev brugt som en repræsentativ xenobiotic. Derefter, samspillet mellem BIF EPS og human Gut mikrobiota blev undersøgt ved hjælp af flere metoder såsom tyndtlagkromatografi (TLC), bakteriel samfund kompositoriske analyse med 16S rRNA gen High-gennemløb Sequencing, og gaskromatografi af kortkædede fedtsyrer (SCFAs). Præsenteret her er en protokol til at undersøge samspillet mellem endobiotika og human Gut mikrobiota ved hjælp in vitro batch fermenterings systemer. Vigtigere, denne protokol kan også ændres til at undersøge generelle interaktioner mellem andre endobiotika og Gut microbiota.
Gut mikrobiota spiller en vigtig rolle i driften af humane tarme og i værts sundhed. Derfor er Gut mikrobiota for nylig blevet et vigtigt mål for sygdomsforebyggelse og terapi1. Desuden, Gut bakterier interagere med vært tarmceller og regulere grundlæggende vært processer, herunder metaboliske aktiviteter, næringsstof tilgængeliggørelse, immunsystem modulation, og endda hjernefunktion og beslutningstagning2,3 . Endobiotika har et betydeligt potentiale til at påvirke den bakterielle sammensætning og mangfoldighed af Gut microbiota. Således, interaktioner mellem endobiotika og human Gut mikrobiota har tiltrukket stigende forskning opmærksomhed4,5,6,7,8,9.
Det er vanskeligt at evaluere samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota in vivo på grund af bioetik og økonomiske begrænsninger. For eksempel kan eksperimenter, der undersøger samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota, ikke udføres uden tilladelse fra Food and Drug Administration, og rekruttering af frivillige er dyrt. Derfor anvendes dyremodeller ofte til sådanne undersøgelser. Brugen af dyremodeller er dog begrænset på grund af forskellige mikrobiota kompositioner og diversitet i dyr-vs. menneske-associerede samfund. En alternativ in vitro-metode til at udforske samspillet mellem endobiotika og human Gut mikrobiota er gennem brug af batch kultur eksperimenter.
Exopolysaccharider (Eps’er) er prebiotics, der bidrager væsentligt til opretholdelsen af menneskers sundhed10. Særskilte Eps’er, der består af forskellige monosaccharid kompositioner og strukturer kan udvise forskellige funktioner. Tidligere analyser har fastlagt sammensætningen af BIF Eps’er, som er det repræsentative xenobiotiske mål i den nuværende undersøgelse11. Men, Host-associerede metaboliske effekter er ikke blevet overvejet med hensyn til EPS sammensætning og mangfoldighed.
Den protokol, der er beskrevet her, bruger fækal mikrobiota fra 12 frivillige til gære BIF EPSS. Tyndtlags kromatografi (TLC), 16S rRNA-gensekvensering med høj gennemløb og gaskromatografi (GC) anvendes derefter i kombination til at undersøge samspillet mellem EPSs og humant tarm mikrobiota. Særskilte fordele ved denne protokol sammenlignet med in vivo eksperimenter er dens lave omkostninger og undgåelse af interfererende virkninger fra værtens metabolisme. Desuden kan den beskrevne protokol anvendes i andre undersøgelser, der undersøger interaktioner mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota.
Der er gjort betydelige fremskridt i retning af at forstå Human Gut mikrobiota sammensætning og aktiviteter i løbet af de sidste ti år. Som en konsekvens af disse undersøgelser, holobiont koncept er dukket op, som repræsenterer samspillet mellem værter og associerede mikrobielle samfund, såsom i mellem mennesker og deres Gut mikrobiota19,20. Desuden er mennesker selv nu betragtes som Super organismer21, hvor tarmen mikrobiota er bl…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af national Nature Science Foundation i Kina (no. 31741109), Hunan Natural Science Foundation (nr. 2018JJ3200), og konstruktions programmet for anvendt karakteristisk disciplin i Hunan University of Science and Engineering. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for sin sproglige bistand under forberedelsen af dette manuskript.
0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |