Summary
Beskrevet her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora bruker in vitro batch gjæring systemer.
Abstract
Menneskelige tarm mikroorganismer har nylig blitt et viktig mål for forskning for å fremme menneskers helse og forebygge sykdommer. Følgelig er undersøkelser av interaksjoner mellom endobiotics (f.eks. narkotika og Prebiotics) og tarm bakterieflora blitt et viktig forsknings emne. Men in vivo eksperimenter med frivillige mennesker er ikke ideelt for slike studier på grunn av bioetikk og økonomiske begrensninger. Som et resultat, har dyremodeller blitt brukt til å evaluere disse interaksjoner i vivo. Likevel, dyr modell studier er fortsatt begrenset av bioetikk betraktninger, i tillegg til ulike komposisjoner og forskjeller av bakterieflora i dyr kontra mennesker. En alternativ forskningsstrategi er bruken av batch gjæring eksperimenter som tillater evaluering av samspillet mellom endobiotics og gut bakterieflora in vitro. For å evaluere denne strategien ble bifidobacterial (Bif) exopolysaccharides (EPS) brukt som en representativ xenobiotic oval. Deretter ble samspillet mellom Bif EPS og menneskelige gut bakterieflora undersøkt ved hjelp av flere metoder som tynne-lags kromatografi (TLC), bakteriell samfunnet analyse med 16S rRNA genet høy gjennomstrømming sekvensering, og gass kromatografi av kort-kjeden fettsyrer (SCFAs). Presentert her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora bruker in vitro batch gjæring systemer. Viktigere, kan denne protokollen også endres for å undersøke generelle interaksjoner mellom andre endobiotics og gut bakterieflora.
Introduction
Gut bakterieflora spiller en viktig rolle i funksjon av menneskelig tarmen og i verts helse. Derfor har gut bakterieflora nylig blitt et viktig mål for sykdomsforebygging og terapi1. Videre, gut bakterier samhandle med vert intestinal celler og regulere grunnleggende verts prosesser, inkludert metabolske aktiviteter, næringsstoffer tilgjengelighet, immunsystem modulering, og til og med hjernefunksjon og beslutningstaking2,3 . Endobiotics har betydelig potensial til å påvirke bakteriell sammensetning og mangfoldet av gut bakterieflora. Dermed interaksjoner mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora har tiltrukket økende forskning oppmerksomhet4,5,6,7,8,9.
Det er vanskelig å evaluere samspillet mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora in vivo på grunn av bioetikk og økonomiske begrensninger. For eksempel, eksperimenter gransker samspillet mellom endobiotics og menneskelige gut bakterieflora kan ikke utføres uten tillatelse fra Food and Drug Administration, og rekruttering av frivillige er dyrt. Derfor er dyremodeller ofte brukt til slike undersøkelser. Imidlertid er bruken av dyremodeller begrenset på grunn av ulike bakterieflora komposisjoner og mangfold i dyr-vs. menneske-tilknyttede samfunn. En alternativ in vitro metode for å utforske samspillet mellom endobiotics og menneskelige gut bakterieflora er gjennom bruk av batch kultur eksperimenter.
Exopolysaccharides (EPSs) er Prebiotics som betydelig bidrar til opprettholdelse av menneskers helse10. Distinkte EPSs som består av ulike monosakkarid komposisjoner og strukturer kan vise distinkte funksjoner. Tidligere analyser har bestemt sammensetningen av Bif EPSs, som er representative xenobiotic oval som er målrettet i den aktuelle studien11. Men verts tilknyttede metabolske effekter har ikke blitt vurdert med hensyn til EPS sammensetning og mangfold.
Protokollen som er beskrevet her bruker avføring bakterieflora fra 12 frivillige til å gjære Bif EPSs. Tynne-lags kromatografi (TLC), 16S rRNA genet høy gjennomstrømming sekvensering, og gass kromatografi (GC) blir deretter brukt i kombinasjon for å undersøke samspillet mellom EPSs og menneskelige gut bakterieflora. Distinkte fordeler med denne protokollen i forhold til in vivo eksperimenter er dens lave kostnader og unngåelse av forstyrrende effekter fra vertens metabolisme. Videre kan den beskrevne protokollen brukes i andre studier som undersøker interaksjoner mellom endobiotics og menneskelige gut bakterieflora.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene for etikk komiteen av Hunan University of Science and Engineering (Hunan, Kina), og Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, Kina).
1. utarbeidelse av bakterier
- Utarbeidelse av Bifidobacterium medium buljong
- Kombiner følgende komponenter i 950 mL destillert vann: kjøtt ekstrakt, 5 g/L; gjærekstrakt, 5 g/L; kasein peptone, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glukose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4· 7H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Mellom 80, 1 mL; saltløsning, 40 mL (CaCl2. 2h2O, 0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCOg/L; NaCl, 2 g/L); og resazurin, 0,4 mL (2,5 mg/L). Juster pH til 6,8 med 2 M NaOH.
- Autoklav ved 121 ° c i 15 min og la suppen avkjøles til romtemperatur (RT) under anaerobe forhold (10% H2, 10% co2, 80% N2). Legg til filter-sterilisert cystein-HCl (0,5 g/L) og Mupirocin (5 mg/L) til mediet.
- Tilsett en alikvot (50 μL) av frosne Bifidobacterium-Longum i et kultur rør med 5 ml Bifidobacterium medium buljong under anaerobe forhold, deretter kulturen i en anaerob inkubator i 24 timer ved 37 ° c.
2. utarbeidelse av bifidobacterial EPSs
- Utarbeidelse av PYG agar medium
- Kombiner følgende: peptone, 20 g/L; gjærekstrakt, 10 g/L; glukose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO4· 7H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Juster pH til 7,2 med 10 M NaOH.
- Autoklav mediene ved 121 ° c i 15 min og avkjøles til ~ 50 ° c. Deretter, per 1 L medium, tilsett 0,5 mL filter-sterilisert vitamin K1 løsning (1 g vitamin k1 oppløst i 99 ml 99% etanol), 5 mL haemin oppløsning (0,5 g Haemin oppløst i 1 ml 1 mol/L NaOH , deretter brakt opp til 100 mL med destillert vann), og 0,5 g av cystein-HCl.
- Før helle PYG platene, tilsett filter-sterilisert 5-bromo-4-klor-3-indolyl β-D-galaktopyranosid (X-gal, 0,06 g/L), LiCl · 3H2O (5,7 g/l) og Mupirocin (5 mg/l) til mediet.
Merk: X-gal og LiCl. 3H2O tillate identifisering av B. Longum koloniene på platene via fargeendringer.
- Vaksinere 20 μL av B. Longum stammer (trinn 1,2) til PYG plater og plasser i en anaerob inkubator ved 37 ° c for 72 h.
- Samle mucoid bakterie kolonier fra PYG platene ved hjelp av en veie scoop, deretter helt resuspend i 10 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) ved hjelp av en Vortex oscillator.
Merk: bakteriell og EPS blandinger skal resuspendert helt av virvlingen eller pipettering opp og ned gjentatte ganger til fibrene er helt oppløst i PBS. - Sentrifuger suspensjonen ved 6 000 x g i 5 min.
- Forsiktig overføre supernatanter til et nytt sentrifugerør og bland helt med tre volumer med kaldt 99% etanol ved gjentatt inversjon og blending.
- Sentrifuger blandingen ved 6 000 x g i 5 min og fjern supernatanter fullstendig.
- Fjern precipitates fra sentrifuge rørene ved skraping og tørking av EPS ekstrakter over natten ved hjelp av en hastighet vakuum.
3. utarbeidelse av gjæring medium
- Utarbeidelse av grunnleggende kultur medium VI
- Kombiner følgende: peptone, 3 g/L; tryptone, 3 g/L; gjærekstrakt, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; galle alter nr. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4,5 g/L; 1 mL mellom 80; CaCl2. 6h2O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO4· 7H2O, 3,0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0,32 g/L; FeSO4· 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4· 7H2O, 0,18 g/L; CaCl2· 2h2O, 0,1 g/L; ZnSO4· 7H2O, 0,18 g/L; CuSO4· 5h2O, 0,01 g/L; og NiCl2· 6h2O, 0,092 g/L. Juster pH-verdien til 6,5 med 1 M HCL.
- Forbered haemin og cystein som gjort i Seksjon 2,1 og Legg etter autoklavering og kjøling.
- Forbered kultur medier som inneholder forskjellige karbon kilder med en VI-Base media. Før autoklavering, tilsett 8 g/L av Bif EPS fibre til medium VI, bestående av gruppe VI_Bif. I tillegg legger du til 8 g/L stivelse til medium VI for å representere gruppe VI_Starch. Til slutt, medium VI uten tilsetning av en karbon kilde brukes som kontroll (gruppe VI).
Merk: Bif EPS og stivelse er først oppløst i varmt vann ved hjelp av en magnetisk agitator, deretter blandes med forberedt VI medium. - Autoklav alle medier ved 121 ° c i 15 min og la avkjøles til RT.
- Overfør en subsample (5 mL) av hvert medium til kultur rør i en anaerob inkubator, og oppbevar de resterende mediene ved 4 ° c.
4. Human avføring prøveforberedelse
- Samle ferske avføringsprøver umiddelbart etter fersk avføring fra friske voksne menneskelige frivillige ved hjelp av avføring beholdere, og deretter bruke for slurry forberedelse.
Merk: før prøvetaking samling, alle de frivillige bør undersøkes for å sikre ingen mottak av antibiotika, probiotika, eller prebiotiske behandlinger i minst 3 måneder før donerer prøver. I tillegg må alle givere gi informert, skriftlig samtykke. - Overfør en fersk avføringsprøve (1 g) til 10 mL 0,1 M anaerob PBS (pH 7,0) i glass kanner, deretter bruke glass stenger for å forberede en 10% (w/v) slurry.
- Bruk en 0,4 mM sil til å filtrere avføring. Deretter bruker en subsample av filtrert slurry til vaksinere batch kultur gjæring eksperimenter, og lagre resten ved-80 ° c for videre analyser.
Merk: trinn 4.2 – 4.3 utføres i et anaerob kammer.
5. in vitro batch gjæring
- Legg filtrert avføring (500 μL) til gjæring medium fremstilt i trinn 3,2 i et anaerob kammer, deretter ruge ved 37 ° c.
- Samle 2 mL av gjæret prøver ved 24 h og 48 h i anaerob kammeret og deretter sentrifuger utenfor kammeret ved 6 000 x g i 3 min.
- Overfør supernatanter forsiktig til et nytt sentrifugerør som skal brukes til polysakkarid ned brytnings analyse og målinger av korte kjede fettsyrer (SCFAs).
- Oppbevar sentrifugering pellets ved-80 ° c og bruk deretter for bakteriell genomisk DNA-ekstraksjon.
6. EPS degradering av menneskelig avføring bakterieflora
- Load 0,2 μL av gjæret supernatanter på pre-belagt silica gel-60 TLC aluminium plater, deretter tørr ved hjelp av en hårføner.
- Utvikle platene i 20 mL av en maursyre syre/n-butanol/vann (6:4:1, v:v: v) løsning og tørk ved hjelp av en hårføner.
- Sug platene i orcinol reagens til farge, tørk deretter med en hårføner.
- Klargjør orcinol reagenser ved å oppløse 900 mg Lichenol i 25 mL destillert vann og deretter tilsette 375 mL etanol. Deretter bør konsentrert svovelsyre tilsettes langsomt og løsningen grundig blandet.
- Varmeplater ved 120 ° c i 3 minutter i en bakervarer ovn og evaluere nedbrytning av LOO ved å måle TLC-båndene.
7. virkninger av LOO på Human intestinal bakterieflora
- Frys-tine den opprinnelige avføringsprøver utarbeidet i trinn 4,3 og gjæret prøver utarbeidet i trinn 5,4.
- Pakk bakteriell genomisk DNA (gDNA) fra alle prøvene ved hjelp av en krakk bakteriell genomisk DNA Extraction Kit følge produsentens instruksjoner.
- Bestem DNA konsentrasjoner, integrities, og størrelse distribusjoner ved hjelp av en mikro-spektrofotometer og agar gel elektroforese.
- Gjennomføre PCR av bakteriell 16S rRNA gener fra utdraget gDNA bruke følgende tidligere beskrevet fremover og omvendt grunning12:
-Forward primer (Barcoded primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-omvendt primer (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Bruk følgende termiske cycler forhold:- 94 ° c i 5 min.
- 94 ° c i 30 s.
- 55 ° c i 30 s.
- 72 ° c i 1 min.
- Gjenta 2 – 4 for 35 sykluser
- 72 ° c i 5 min.
- 4 ° c hold til fjerning fra termisk cycler.
- Gjennomføre høy gjennomstrømming sekvensering av PCR-produkter på en DNA-sekvensering selskap ved hjelp av ultra-høy gjennomstrømming mikrobiell samfunnet analyse.
- Få rene, høy kvalitet sekvenser ved hjelp av kvantitativ innsikt i mikrobiell økologi (QIIME) sekvens analyse rørledning13.
- Definer operative taksonomisk enheter (OTUs) for 16S rRNA gen sekvenser med større enn 97% nukleotid likhet ved hjelp av Bioinformatikk verktøy som Mothur programvarepakke14.
- Velg en representativ sekvens fra hver OTU og bruk RDP-klassifiserer sammen med SILVA taksonomisk-databasen for å klassifisere representative sekvenser15.
- Beregn god dekning, Alpha mangfold beregninger (inkludert Simpson og Shannon Index), og rikdom (observert antall OTUs) ved hjelp Bioinformatikk verktøy16.
8. effekter av EPS på SCFA produksjon av menneskelige intestinal bakterieflora
- Tilsett gjæret supernatanter (1 mL) fremstilt i trinn 5,3 til 2 mL sentrifugerør.
- Tilsett 0,2 mL 25% (w/v) metaphosphoric syre til hver av prøvene og bland løsningene grundig ved virvlingen.
- Sentrifuger blandingen på 13 000 x g i 20 min og Overfør supernatanter til friske rør.
- Samtidig forberede løsninger på 120 mM eddiksyre, propionsyre, smørsyre, isosmørsyre, valeriansyre og isovaleric syrer. Deretter legger du til 1 mL av hver forberedt syre til 1,2 mL av 25% (w/v) metaphosphoric syre og bruk som standard cocktails.
- Filtrer prøvene med en 0,22 μM-membran.
- Oppdage SCFA konsentrasjoner ved bruk av høyytelses gass kromatografi i henhold til tidligere beskrevne protokoller11,17.
Merk: en InertCap FFAP-kolonne (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) brukes til Gas kromatografi (GC). SCFA-konsentrasjoner blir deretter kvantifisert basert på topp områder ved hjelp av den interne standardmetoden med én punkt i programvarepakken GC Solution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produksjonen av mucoid EPS kan observeres i B. Longum kulturer på PYG plater etter anaerob inkubasjons for 72 h (figur 1a). Sentrifugering av kultur skraper, etterfulgt av etanol nedbør og tørking, resulterte i innsamling av cellulose-lignende EPS (figur 1B). Tørket EPS og løselig stivelse ble deretter brukt som karbon kilder for gjæring kulturer. TLC ble brukt for Oligosaccharide separasjon og renhet analyse på grunn av sin lave kostnader og raske resultater behandlingstid18. Selv om nedbrytning av stivelse av menneskelig avføring bakterieflora var raskere enn for Bif EPS (figur 2), Bif EPS degradering var tydelig observert for noen EPS-inokulert prøver.
Community analyse via 16S rRNA genet høy gjennomstrømming sekvensering og rektor koordinere analyse (PCoA) ble deretter utført for å undersøke virkningene av Bif EPS på menneskelige gut bakterieflora. Prøver fra VI_Bif og VI_Starch grupper gruppert separat fra hverandre i PCoA-analysen (figur 3a), noe som indikerer at EPS og stivelse tilgjengelighet differensielt forme menneskelige avføring bakterielle lokalsamfunn. Lineær discriminant analyse effekt størrelse (LEfSe) ble videre brukt til å skille mellom de spesifikke bakterielle dyr som skilte mellom VI_Bif og VI_Starch behandlinger. Den slekter Collinsella, Coprococcus, Parabacteroides, og Rhodopseudomonas var betydelig mer rikelig i VI_Bif prøvene enn i VI_Starch prøvene (figur 3b). Videre ble GC målinger gjort for flere SCFAs å evaluere sin produksjon etter tilsetning av ulike karbon kilder. SCFAs som ble målt fra gjærings kulturer omfattet eddiksyre, propionsyre, isosmørsyre, smørsyre, isovaleric og valeriansyre syrer. Etter gjæring for 24 h og 48 h, fem av de seks nevnte SCFA konsentrasjoner var lik blant behandlinger og ikke statistisk forskjellig mellom VI_Bif, VI_Starch, og VI grupper. Propionsyre yre konsentrasjoner var imidlertid signifikant høyere i VI_Bif-gruppen enn i VI_Starch-gruppen (Figur 4).
Figur 1: EPS produsert av B. Longum.
Frozen B. Longum ble restaurert i Bifidobacterium medium buljong og deretter STRIPETE på PYG plater, etterfulgt av anaerob inkubasjons ved 37 ° c for 72 h (A). EPS produsert av bakterielle kulturer ble skrapet fra plate kulturer, utløst ved hjelp av etanol, og tørket over natten ved hjelp av en hastighet vakuum (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: TLC analyse av in vitro EPS og stivelse degradering av menneskelige gut bakterieflora.
TLC-analysen ble utført på 0,2 μL prøver samlet på 24 h og 48 h fra hver gjærings kultur dyrket under anaerobe forhold. VI, VI_Starch, og VI_Bif indikerer VI Media, VI Media + stivelse supplement, og VI Media + EPS supplement, henholdsvis. Tallene 1 – 12 viser avførings bakterie prøver fra de 12 frivillige som ble brukt til å vaksinere gjærings forsøkene. Kontrollgruppen representerer behandling uten ekstra karbon tilskudd. Dette tallet er modifisert fra Yin et al. 11. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: effekter av Bif EPS tilgjengelighet på menneskelige gut bakterieflora lokalsamfunn.
(A) PCoA plot av gut bakterieflora samfunnet dissimilarities basert på unweighted UniFrac beregning. (B) LEfSE analyse av bakteriearter som ble differensielt rikelig blant behandlingsgruppene. En cut-off på p < 0,05 ble brukt til å vurdere den statistiske betydningen av bakterielle taksonomisk forskjeller mellom grupper. Ori indikerer tarm bakterieflora av frivillige avføringsprøver. VI_Bif og VI_Starch indikerer tarmen bakterieflora fra gjæring prøver bruker VI medier med EPS og stivelse som karbon underlag, henholdsvis. VI representerer kontrollgruppen med gut bakterieflora inokulert fermentations i VI media uten tilskudd av andre karbohydrater. Dette tallet er modifisert fra Yin et al. 11 flere Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: effekter av EPS tilgjengelighet på SCFA produksjon etter 24 h og 48 h av gjæring.
Eddiksyre, propionsyre, isosmørsyre, smørsyre, isovaleric og valeriansyre syrer ble påvist ved hjelp av gass kromatografi. VI_Bif, VI_Starch, og VI indikerer prøvene som ble samlet inn etter dyrking bruker VI Media + EPS, VI Media + stivelse, og VI Media, henholdsvis. Alle prøvene ble målt i tre eksemplarer. Tallene ble generert ved hjelp GraphPad Prism Version 5,01. Paneler representerer organiske syre konsentrasjoner innenfor hver gjæret prøve for A, eddiksyre; B, propionsyre syre; C, isosmørsyre syre; D, smørsyre syre; E, isovaleric syre; og F, valeriansyre syre. Dette tallet er modifisert fra Yin et al.11Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelig fremgang har blitt gjort mot å forstå menneskelige gut bakterieflora sammensetning og aktiviteter i løpet av det siste tiåret. Som en konsekvens av disse studiene, har holobiont konseptet dukket opp, som representerer samspillet mellom verter og tilhørende mikrobielle samfunn, for eksempel i mellom mennesker og deres gut bakterieflora19,20. Videre mennesker er selv nå betraktet som superorganisms21, karakterisert ved at tarmen bakterieflora har blitt anerkjent som en av de funksjonelle organene hos mennesker22,23. Menneskekroppen er vert for et komplekst mikrobiell økosystem, bestående av ca 1013 mikrobielle celler24. Videre er genomer av gut bakterieflora anses hjelpe genomer fra mennesker som kodes mange metabolske-relaterte gener som utvider vertens metabolske evner4. Men xenobiotics, inkludert terapeutiske stoffer og diett-avledet bioaktive forbindelser, kan potensielt endre tarmen mikrobiomet samfunnet struktur og tilhørende funksjoner5. Økende antall studier har indikert at samspillet mellom gut bakterieflora og xenobiotics spille viktige roller i formidling kjemisk toksisitet og forårsaker, eller på annen måte forverre, menneskelige sykdommer6,7. Dermed undersøkelser av samspillet mellom xenobiotics og den menneskelige tarmen bakterieflora har nylig fått betydelig forskning oppmerksomhet.
Musemodeller har vært de mest brukte metodene for å undersøke interaksjoner mellom bakterieflora og verter. Forskjeller i sammensetning og aktiviteter mellom tarm bakterieflora til mennesker og mus25 kan imidlertid føre til utilstrekkelig modellering av menneskelig samhandling gjennom studier av mus. Likevel, bioetikk hensyn krever minimal bruk av mus. Et alternativ til de ovennevnte in vivo-modeller er batch gjæring, som kan brukes til å simulere menneskelige gut bakterieflora in vitro26. Følgelig har gjæring eksperimenter blitt brukt til å undersøke samspillet mellom xenobiotics og menneskelige gut bakterieflora. For eksempel, Yin et al. 17 har brukt batch gjæring eksperimenter for å undersøke samspillet mellom polysakkarider og menneskelige gut bakterieflora. Resultatene fra denne studien tyder på at noen polysakkarider kan være metaboliseres av den menneskelige tarmen bakterieflora, og at polysakkarider modulere den menneskelige bakterielle samfunnet og metabolitter at de produserer in vitro, inkludert SCFAs. Men noen metodisk betraktninger er avgjørende for bruk av denne protokollen. For eksempel bør avføringsprøver samles så snart som mulig, og en anaerob kammer bør brukes for å sikre vekst av forplikte anaerobe. Sistnevnte hensynet er spesielt kritisk, fordi oksygen eksponering kan føre til døden av noen gut bakterielle populasjoner og dermed endring av bakteriell samfunnet. I tillegg er xenobiotics metaboliseres i det øvre fordøyelsessystemet. Følgelig er modellering av samspillet mellom xenobiotics og det nedre fordøyelsessystemet bakterieflora en viktig faktor for in vivo modellering.
Batch gjæring eksperimenter har klare fordeler over in vivo menneskelige og dyrestudier fordi de er mer økonomisk gjennomførbart og praktisk. Videre kan de brukes til å undersøke interindividuelle variasjon av menneskelig gut bakterieflora svar på xenobiotic oval eksponering. Videre batch gjæring kan enkelt brukes til å manipulere bakterieflora samfunn og evaluere deres tilknyttede metabolske funksjoner. Men batch gjæring systemer lider av begrensningen av statisk tilstand dynamikk. Fremtidige undersøkelser kan iverksette bioreactor chemostats som tillater dynamisk modulering av pH, temperatur og peristaltikk, og samtidig opprettholde en jevn tilførsel av næringsstoffer og kontinuerlig fjerning av avfall. Slike aktiviteter vil tillate eksperimenter for å bedre etterligne in vivo tarm trakter og gi ny innsikt for å supplere dem fra batch gjæring eksperimenter. En ekstra begrensning av batch gjæring eksperimenter er at de fjerner alle mikrobiomet-vert vev interaksjoner. Dette kan være en spesielt viktig faktor, som noen xenobiotics (for eksempel metamfetamin) kan være co-metaboliseres av menneskelige celler og gut bakterieflora27. Videre har nyere studier indikert at gut metagenome (GM) kan indirekte regulere xenobiotic oval metabolisme via regulering vert genuttrykk regulering8.
Selv om utviklingen av batch gjærings systemer er fortsatt nødvendig, kan disse systemene bli mye brukt for høy gjennomstrømming og rask screening av interaksjoner mellom xenobiotics og menneskelig gut bakterieflora. Elucidating mekanismene underliggende xenobiotic oval motstand og metabolisme i aktiv menneskelig gut microbiomes vil gi viktig innsikt i uforklarlige pasient-til-pasient variasjon i stoffet effekt og toksisitet8,9. Videre, en mer detaljert forståelse av hvordan dietter og bestemte mat komponenter endre mikrobiell metabolisms og følgelig effekt vert helse er første skritt mot å realisere målet om personlig medisin via bakterieflora moduleringshjul.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter. Tallene ble sitert i Yin et al. 11i.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av National Nature Science Foundation i Kina (nr. 31741109), Hunan Natural Science Foundation (no. 2018JJ3200), og konstruere program av anvendt karakteristisk disiplin i Hunan University of Science and Engineering. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for sin språklige assistanse under utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
