Summary
Hier beschreven is een protocol om de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota met behulp van in vitro batch fermentatiesystemen te onderzoeken.
Abstract
Menselijke intestinale micro-organismen zijn onlangs uitgegroeid tot een belangrijk doelwit van onderzoek bij het bevorderen van de menselijke gezondheid en het voorkomen van ziekten. Bijgevolg zijn onderzoeken naar interacties tussen endobiotica (bijv. drugs en prebiotica) en gut microbiota een belangrijk onderzoeksonderwerp geworden. In vivo experimenten met menselijke vrijwilligers zijn echter niet ideaal voor dergelijke studies als gevolg van bio-ethiek en economische beperkingen. Als gevolg hiervan zijn diermodellen gebruikt om deze interacties in vivo te evalueren. Niettemin, diermodel studies zijn nog steeds beperkt door bio-ethiek overwegingen, naast de verschillende samenstellingen en diversiteit van microbiota bij dieren vs. mensen. Een alternatieve onderzoeksstrategie is het gebruik van batch fermentatie-experimenten die het mogelijk maken de interacties tussen endobiotica en gut microbiota in vitro te evalueren. Om deze strategie te evalueren, werden bifidobacteriële (BIF) exopolysacchariden (EPS) gebruikt als representatief xenobioticum. Vervolgens werden de interacties tussen BIF EPS en humane gut microbiota onderzocht met behulp van verschillende methoden zoals Thin-layer chromatografie (TLC), bacteriële compositorische analyse met 16S rRNA Gene High-throughput sequencing en gaschromatografie van korte-keten vetzuren (SCFAs). Hier gepresenteerd is een protocol om de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota met behulp van in vitro batch fermentatiesystemen te onderzoeken. Belangrijk is dat dit protocol ook kan worden aangepast om de algemene interacties tussen andere endobiotica en gut microbiota te onderzoeken.
Introduction
Gut microbiota spelen een belangrijke rol in de werking van de menselijke darmen en in de gezondheid van de gastheer. Bijgevolg, gut microbiota zijn onlangs uitgegroeid tot een belangrijk doelwit voor ziektepreventie en therapie1. Bovendien, gut bacteriën interactie met gastheer intestinale cellen en reguleren fundamentele gastheer processen, met inbegrip van metabole activiteiten, voedingsstoffen availabiliteiten, immuun systeem modulatie, en zelfs hersenfunctie en besluitvorming van2,3 . Endobiotica hebben aanzienlijke potentie om invloed op de bacteriële samenstelling en de diversiteit van gut microbiota. Zo, interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota hebben aangetrokken toegenomen onderzoek aandacht4,5,6,7,8,9.
Het is moeilijk om de interacties tussen endobiotica en humane gut microbiota in vivo te evalueren als gevolg van bio-ethiek en economische beperkingen. Bijvoorbeeld, experimenten onderzoeken de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota kan niet worden uitgevoerd zonder toestemming van de Food and Drug Administration, en werving van vrijwilligers is duur. Daarom worden voor dergelijke onderzoeken vaak diermodellen gebruikt. Het gebruik van diermodellen is echter beperkt als gevolg van verschillende microbiota-composities en diversiteit in dier-vs. mensen-geassocieerde Gemeenschappen. Een alternatieve in vitro methode om de interacties tussen endobiotica en humane gut microbiota te onderzoeken is door het gebruik van batch cultuur experimenten.
Exopolysacchariden (EPSs) zijn prebiotica die significant bijdragen aan het behoud van de gezondheid van de mens10. Afzonderlijke EPSS die bestaan uit verschillende Monosacharide composities en structuren kunnen verschillende functies vertonen. Eerdere analyses hebben de samenstelling van BIF EPSs bepaald, de representatieve xenobiotische die in de huidige studie11is getarget. Echter, gastheer-geassocieerde metabole effecten zijn niet overwogen met betrekking tot EPS samenstelling en diversiteit.
Het hier beschreven protocol gebruikt de fecale microbiota van 12 vrijwilligers tot gisten BIF EPSS. Thin-layer chromatografie (TLC), 16S rRNA Gene High-throughput sequencing en gaschromatografie (GC) worden vervolgens gebruikt in combinatie om de interacties tussen EPSs en humane gut microbiota te onderzoeken. Duidelijke voordelen van dit protocol in vergelijking met in vivo experimenten zijn de lage kosten en het vermijden van storende effecten van de stofwisseling van de gastheer. Bovendien kan het beschreven protocol worden gebruikt in andere onderzoeken die interacties tussen endobiotica en humane gut microbiota onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie van Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) en de Zhejiang Gongshang-Universiteit (Zhejiang, China).
1. bereiding van bacteriën
- Voorbereiding van Bifidobacterium medium Bouillon
- Combineer de volgende componenten in 950 mL gedistilleerd water: vleesextract, 5 g/L; Gistextract, 5 g/L; caseïne peptone, 10 g/L; soja Toon, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; zoutoplossing, 40 mL (CaCl2. 2H2O, 0,25 g/L; KH2po4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); en resazurin, 0,4 mL (2,5 mg/L). Stel de pH in op 6,8 met 2 M NaOH.
- Autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten en laat de Bouillon afkoelen tot kamertemperatuur (RT) onder anaerobe condities (10% H2, 10% Co2, 80% N2). Voeg filter-gesteriliseerd cysteïne-HCl (0,5 g/L) en Mupirocin (5 mg/L) toe aan het medium.
- Voeg een aliquot (50 μL) van bevroren Bifidobacterium longum toe aan een cultuur buis met 5 ml Bifidobacterium medium Bouillon onder anaerobe condities, dan cultuur in een anaerobe incubator voor 24 uur bij 37 °c.
2. bereiding van bifidobacteriële EPSs
- Bereiding van de PYG agar medium
- Combineer het volgende: peptone, 20 g/L; Gistextract, 10 g/L; glucose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2po4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Stel de pH in op 7,2 met 10 M NaOH.
- Autoclaaf de media bij 121 °C gedurende 15 minuten en koel tot ~ 50 °C. Voeg vervolgens per 1 liter medium 0,5 mL filter-gesteriliseerde vitamine K1 -oplossing (1 g vitamine k1 opgelost in 99 ml 99% ethanol), 5 ml haemin oplossing (0,5 g Haemin opgelost in 1 ml van 1 mol/L NaOH , vervolgens gebracht tot 100 mL met gedestilleerd water), en 0,5 g van cysteïne-HCl.
- Voor het gieten van de PYG platen, Voeg filter-gesteriliseerd 5-broom-4-Chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal, 0,06 g/L), LiCl · 3H2O (5,7 g/l) en Mupirocin (5 mg/l) op het medium.
Opmerking: X-gal en LiCl. 3H2O toestaan de identificatie van B. longum kolonies op platen via kleurveranderingen.
- Inoculeren 20 μL van B. longum stammen (stap 1,2) op pyg platen en plaats in een anaerobe incubator bij 37 °c voor 72 h.
- Verzamel mucoïde bacteriële kolonies van de PYG platen met behulp van een weeg Scoop, en vervolgens volledig respenderen in 10 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een Vortex-oscillator.
Opmerking: de bacteriële en EPS-mengsels moeten volledig worden geresuspendeerd door grondig of pipetteren herhaaldelijk omhoog en omlaag totdat de vezels volledig zijn opgelost in PBS. - Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 6.000 x g .
- Breng de supernatanten voorzichtig over naar een nieuwe centrifugebuis en meng volledig met drie volumes koude 99% ethanol door herhaalde inversie en menging.
- Centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 6.000 x g en verwijder de supernatants volledig.
- Verwijder de precipitaten van de centrifugebuizen door de EPS-extracten 's nachts te schrapen en te drogen met behulp van een snelheids vacuüm.
3. bereiding van het fermentatie medium
- Bereiding van basis kweekmedium VI
- Combineer het volgende: peptone, 3 g/L; Tryptone, 3 g/L; Gistextract, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; galzouten No. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4,5 g/L; 1 mL-Tween 80; CaCl2. 6h2O, 0,2 g/L; KH2po4, 0,4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3,0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0,32 g/L; FeSO4· 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CaCl2· 2H2O, 0,1 g/L; ZnSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CuSO4· 5H2O, 0,01 g/L; en NiCl2· 6h2O, 0,092 g/L. Stel de pH in op 6,5 met 1 M HCl.
- Bereid haemin en cysteïne zoals gedaan in paragraaf 2,1 en voeg toe na Autoclaveren en koeling.
- Bereid cultuur media voor die verschillende koolstofbronnen bevatten met een VI-basismedia. Voeg vóór autoclaven 8 g/L BIF EPS-vezels toe aan medium VI, bestaande uit groep VI_Bif. Voeg bovendien 8 g/L zetmeel toe aan medium VI om groep VI_Starch te vertegenwoordigen. Ten slotte wordt medium VI zonder toevoeging van een koolstofbron gebruikt als controle (groep VI).
Opmerking: BIF EPS en zetmeel worden voor het eerst opgelost in heet water met behulp van een magnetische agitator, vervolgens vermengd met bereid VI-medium. - Autoclaaf alle media bij 121 °C gedurende 15 minuten en laat afkoelen tot RT.
- Breng een submonster (5 mL) van elk medium over naar kweek buizen in een anaerobe incubator en bewaar de overblijvende media op 4 °C.
4. menselijke fecale monstervoorbereiding
- Verzamel verse fecale monsters onmiddellijk na verse ontlasting van gezonde volwassen menselijke vrijwilligers met behulp van ontlasting containers, en vervolgens gebruiken voor slurry voorbereiding.
Opmerking: voorafgaand aan de monsterverzameling, moeten alle vrijwilligers worden gescreend om te zorgen voor geen ontvangst van antibiotica, probiotica of prebiotische behandelingen gedurende ten minste 3 maanden voorafgaand aan het doneren van monsters. Bovendien moeten alle donoren geïnformeerde, schriftelijke toestemming geven. - Breng een vers fecaal monster (1 g) naar 10 mL van 0,1 M anaerobe PBS (pH 7,0) in glazen bekers en gebruik vervolgens glazen staven om een 10% (w/v) slurry te bereiden.
- Gebruik een zeef van 0,4 mM om de fecale slurry te filteren. Gebruik vervolgens een submonster van de gefilterde slurry om batch cultuur fermentatie-experimenten te beënten en bewaar de rest bij-80 °C voor verdere analyses.
Opmerking: stappen 4.2 – 4.3 worden uitgevoerd in een anaerobe kamer.
5. in vitro batch gisting
- Voeg gefilterde fecale slurry (500 μL) toe aan het fermentatie medium dat in stap 3,2 is bereid in een anaerobe kamer, en inbroed bij 37 °C.
- Verzamel 2 mL gefermenteerde monsters bij 24 uur en 48 uur in de anaerobe kamer en centrifugeer vervolgens buiten de kamer bij 6.000 x g gedurende 3 minuten.
- Breng de supernatanten voorzichtig over naar een nieuwe centrifugebuis die zal worden gebruikt voor de analyse van polysaccharide afbraak en korte-keten vetzuren (scfas) metingen.
- Bewaar de centrifugeren pellets bij-80 °C en gebruik vervolgens voor bacteriële genomische DNA-extractie.
6. EPS afbraak door menselijke fecale microbiota
- Laad 0,2 μL gefermenteerde supernatanten op voorgecoate silica gel-60 TLC aluminium platen en droog ze vervolgens met een haardroger.
- Ontwikkel de platen in 20 mL van een mierenzuur/n-butanol/water (6:4:1, v:v: v) oplossing en droog met een haardroger.
- Week de platen in het orcinol-reagens om te verven en droog ze vervolgens met een haardroger.
- Bereid orcinol reagentia door het oplossen van 900 mg Lichenol in 25 mL gedestilleerd water en vervolgens 375 mL ethanol toe te voegen. Vervolgens moet geconcentreerd zwavelzuur langzaam worden toegevoegd en de oplossing grondig gemengd.
- Warmte platen bij 120 °C gedurende 3 minuten in een bakoven en evalueren de afbraak van EPS door het meten van TLC-bands.
7. effecten van EPS op humane intestinale microbiota
- Freeze-ontdooien de oorspronkelijke fecale monsters bereid in stap 4,3 en gefermenteerde monsters bereid in stap 5,4.
- Extract bacteriële genomische DNA (gDNA) uit alle monsters met behulp van een ontlasting bacteriële genomische DNA-extractie Kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Bepaal DNA concentraties, integrities en grootte verdelingen met behulp van een micro-spectrofotometer en agar gel elektroforese.
- PCR van bacteriële 16S rRNA genen uit de geëxtraheerde gDNA met behulp van de volgende eerder beschreven voorwaartse en omgekeerde primers12:
-voorwaartse primer (Barcoded primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-omgekeerde primer (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Gebruik de volgende thermische cycler-condities:- 94 °C gedurende 5 min.
- 94 °C gedurende 30 sec.
- 55 °C gedurende 30 sec.
- 72 °C gedurende 1 minuut.
- Herhaal 2 – 4 voor 35 cycli
- 72 °C gedurende 5 min.
- 4 °C vasthouden tot verwijdering uit thermische cycler.
- Gebruik een high-throughput sequencing van PCR-producten bij een DNA-sequencing bedrijf met behulp van ultra-hoge doorvoer van microbiële communityanalyse.
- Verkrijg schone, hoge kwaliteit sequenties met behulp van de kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie (QIIME) sequentieanalyse pipeline13.
- Definieer operationele taxonomische eenheden (Otu's) voor 16S rRNA gensequenties met meer dan 97% nucleotide-gelijkenis met behulp van bio-informatica tools zoals de Mothur software suite14.
- Kies een representatieve reeks van elke OTU en gebruik de RDP-classificatie samen met de SILVA taxonomische database om representatieve reeksen15te classificeren.
- Bereken de dekking van goede, Alfa-diversiteits statistieken (inclusief Simpson en Shannon-index) en rijkdom (waargenomen aantal Otu's) met behulp van bioinformatica-tools16.
8. effecten van EPS op SCFA-productie door humane intestinale microbiota
- Voeg gefermenteerde supernatanten (1 ml) bereid in stap 5,3 tot 2 ml centrifugebuizen.
- Voeg aan elk van de monsters 0,2 mL van 25% (g/v) metafosforzuur toe en meng de oplossingen grondig door vortexing.
- Centrifugeer de mengsels gedurende 20 minuten bij 13.000 x g en breng de supernatanten over naar verse buizen.
- Bereid tegelijkertijd oplossingen van 120 mm azijn, propionzuur, Butyric, Isobutyric, Valeriaan en isovalerische zuren. Voeg vervolgens 1 mL van elk bereid zuur toe aan 1,2 mL van 25% (g/v) metafosforzuur en gebruik dit als de standaard cocktails.
- Filtreer de monsters met een 0,22 μM-membraan.
- Detecteer scfa concentraties met behulp van krachtige gaschromatografie volgens eerder beschreven protocollen11,17.
Opmerking: een InertCap FFAP-kolom (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) wordt gebruikt voor gaschromatografie (GC). De SCFA concentraties worden vervolgens gekwantificeerd op basis van piek gebieden met behulp van de single-point interne standaardmethode in het GC Solution softwarepakket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De productie van mucoïde EPS kan worden waargenomen in B. longum culturen op pyg platen na anaerobe incubatie voor 72 h (Figuur 1a). Centrifugeren van cultuur resten, gevolgd door ethanol precipitatie en drogen, resulteerde in de inzameling van cellulose-achtige EPS (Figuur 1b). Gedroogde EPS en oplosbare zetmeel werden vervolgens gebruikt als koolstofbronnen voor fermentatie culturen. TLC werd gebruikt voor oligosaccharide scheiding en zuiverheid analyse als gevolg van de lage kosten en snelle resultaten turnaround18. Hoewel de afbraaksnelheid van zetmeel door menselijke fecale microbiota sneller was dan die van BIF EPS (Figuur 2), werd de afbraak van BIF EPS duidelijk waargenomen bij sommige EPS-inocculeerde monsters.
Communautaire compositorische analyse via 16S rRNA Gene High-throughput sequencing en Principal coordinatieanalyse (PCoA) werd vervolgens uitgevoerd om de effecten van BIF EPS op humane gut microbiota te onderzoeken. Monsters van de VI_Bif en VI_Starch groepen die afzonderlijk van elkaar zijn geclusterd in de PCoA-analyse (Figuur 3a), wat aangeeft dat de beschikbaarheid van EPS en zetmeel differentieel is voor menselijke fecale bacteriële Gemeenschappen. Lineaire Discriminant Analyse effect grootte (LEfSe) werd verder gebruikt om de specifieke bacteriële taxa die verschafden tussen de VI_Bif en VI_Starch behandelingen te onderscheiden. De geslachten Collinsella, coprococcus, parabacteroidesen Rhodopseudomonas waren significant meer overvloedig in de VI_Bif monsters dan in de VI_Starch monsters (Figuur 3b). Bovendien werden GC-metingen gedaan voor verschillende Scfi's om hun productie te evalueren na de toevoeging van verschillende koolstofbronnen. SCFAs die werden gemeten uit fermentatie culturen waren onder meer azijnzuur, propion, Isobutyric, boterzuur, isovalerische en valerische zuren. Na de fermentatie voor 24 uur en 48 uur waren vijf van de zes bovengenoemde SCFA concentraties vergelijkbaar bij behandelingen en niet statistisch verschillend tussen de groepen VI_Bif, VI_Starch en VI. Echter, propionzuur concentraties waren significant hoger in de VI_Bif groep dan in de VI_Starch groep (Figuur 4).
Figuur 1: EPS geproduceerd door B. longum.
Bevroren B. longum werd hersteld in Bifidobacterium medium Bouillon en vervolgens gestreept op pyg platen, gevolgd door anaerobe incubatie bij 37 ° c voor 72 h (A). De EPS geproduceerd door bacteriële culturen werden geschuurd uit plaat culturen, neergeprecipiteerd met behulp van ethanol, en 's nachts gedroogd met behulp van een toerental vacuüm (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: TLC analyse van in vitro EPS en zetmeel afbraak door menselijke gut microbiota.
TLC analyse werd uitgevoerd op 0,2 μL monsters verzameld bij 24 h en 48 h van elke fermentatie cultuur geteeld onder anaerobe omstandigheden. VI, VI_Starch, en VI_Bif geven VI media, VI media + zetmeel supplement, en VI media + EPS supplement, respectievelijk. De getallen 1 – 12 duiden op fecale bacteriële monsters van de 12 vrijwilligers die werden gebruikt om de fermentatie-experimenten te beënten. De controlegroep vertegenwoordigt de behandeling zonder extra koolstof supplementen. Dit cijfer is gewijzigd van Yin et al. 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: effecten van BIF EPS beschikbaarheid op menselijke gut microbiota Gemeenschappen.
A) pcoa-plot van gut microbiota-communautaire compositorische disgelijkenissen op basis van de ongewogen UniFrac-metriek. B) een lefse analyse van bacteriële taxa die in de behandelingsgroepen differentieel overvloedig waren. Een cutoff van p < 0,05 werd gebruikt om de statistische significantie van bacteriële taxonomische verschillen tussen groepen te beoordelen. Ori geeft de darm microbiota van de vrijwillige fecale monsters. VI_Bif en VI_Starch geven de darm microbiota aan van fermentatie monsters met behulp van VI-media met EPS en zetmeel als koolstof substraten, respectievelijk. VI vertegenwoordigt de controlegroep met gut microbiota inocculeerde fermentaties in VI media zonder suppletie van andere koolhydraten. Dit cijfer is gewijzigd van Yin et al. 11 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: effecten van EPS beschikbaarheid op SCFA productie na 24 h en 48 h van fermentatie.
Met behulp van gaschromatografie werden azijnzuur, propion, Isobutyric, Butyric, isovalerische en valerische zuren gedetecteerd. VI_Bif, VI_Starch en VI geven de monsters aan die na de teelt werden verzameld met respectievelijk VI media + EPS, VI media + zetmeel en VI media. Alle monsters werden gemeten in drievat. De cijfers werden gegenereerd met behulp van GraphPad Prism versie 5,01. Deelvensters vertegenwoordigen organische zuur concentraties binnen elk gefermenteerde monster voor een azijnzuur; B, propionzuur; C, waaronder zuur; D, boterzuur; E, isovalerische zuur; en F, Valeriaan Acid. Dit cijfer is gewijzigd van Yin et al.11Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van de samenstelling en activiteiten van menselijke gut microbiota in het afgelopen decennium. Als gevolg van deze studies is het concept van holobiont ontstaan, dat de interacties tussen hosts en geassocieerde microbiële gemeenschappen vertegenwoordigt, zoals tussen mensen en hun gut microbiota19,20. Bovendien, mensen worden nu zelfs beschouwd als Super organismen21, waarbij de darm microbiota zijn erkend als een van de functionele organen bij de mens22,23. Het menselijk lichaam herbergt een complex microbieel ecosysteem, bestaande uit ongeveer 1013 Microbiële cellen24. Bovendien worden de genomen van gut microbiota beschouwd als Auxiliary genomen van mensen die talrijke metabolische gerelateerde genen coderen die de metabole capaciteiten van de gastheer uitbreiden4. Echter, xenobiotics, met inbegrip van therapeutische drugs en dieet-afgeleide bioactieve stoffen, kan potentieel veranderen de darm microbiome Gemeenschap structuur en bijbehorende functies5. Toenemende aantallen studies hebben aangegeven dat interacties tussen gut microbiota en xenobiotica belangrijke rollen spelen bij het bemiddelen van chemische toxiciteit en het veroorzaken, of anderszins verergeren, van menselijke ziekten6,7. Zo, onderzoek van de interacties tussen xenobiotica en de menselijke gut microbiota hebben onlangs vergaard belangrijke onderzoek aandacht.
Muismodellen zijn de meest gebruikte methoden om interacties tussen microbiota en hosts te onderzoeken. Echter, verschillen in samenstelling en activiteiten tussen de darm microbiota van mensen en muizen25 kan resulteren in inadequate modellering van menselijke interacties door middel van studies van muizen. Desalniettemin vereisen bioethische overwegingen een minimaal gebruik van muizen. Een alternatief voor de hierboven in vivo modellen is batch fermentatie, die kan worden gebruikt om menselijke gut microbiota in vitro26te simuleren. Daarom zijn fermentatie-experimenten gebruikt om de interacties tussen xenobiotica en humane gut microbiota te onderzoeken. Bijvoorbeeld Yin et al. 17 hebben batch fermentatie experimenten gebruikt om de interacties tussen polysacchariden en humane gut microbiota te onderzoeken. De resultaten van deze studie blijkt dat sommige polysacchariden kunnen worden gemetaboliseerd door de menselijke gut microbiota, en dat polysacchariden moduleren de menselijke bacteriële Gemeenschap en metabolieten die zij in vitro produceren, met inbegrip van SCFAs. Sommige methodologische overwegingen zijn echter van cruciaal belang voor het gebruik van dit protocol. Zo moeten fecale monsters zo snel mogelijk worden verzameld, en moet een anaerobe kamer worden gebruikt om de groei van verplicht anaërobe te waarborgen. Deze laatste overweging is bijzonder kritisch, omdat de blootstelling aan zuurstof kan leiden tot de dood van sommige darmbacteriële populaties en dus een verandering van de bacteriële Gemeenschap. Bovendien worden xenobiotica gemetaboliseerd in het bovenste spijsverteringsstelsel. Bijgevolg is het modelleren van de interacties tussen xenobiotica en het lagere spijsverteringsstelsel microbiota een belangrijke overweging voor in vivo modellering.
Batch fermentatie experimenten hebben duidelijke voordelen ten opzichte van in vivo studies van mens en dier, omdat ze economisch haalbaar en handiger zijn. Bovendien kunnen ze worden gebruikt om interindividuele variatie van menselijke gut microbiota reacties op xenobiotische blootstelling te onderzoeken. Bovendien kan batch fermentatie eenvoudig worden toegepast om microbiota-gemeenschappen te manipuleren en hun bijbehorende metabole functies te evalueren. Echter, batch fermentatiesystemen lijden onder de beperking van statische toestand dynamiek. Toekomstige onderzoeken kunnen biooreactor chemostatica implementeren die de dynamische modulatie van pH, temperatuur en peristaltiek mogelijk maken, met behoud van een constante toevoer van voedingsstoffen en de continue verwijdering van afval. Dergelijke activiteiten zouden experimenten mogelijk maken om in vivo intestinale tracten beter na te bootsen en nieuwe inzichten te bieden om die van batch fermentatie-experimenten aan te vullen. Een extra beperking van batch fermentatie-experimenten is dat ze alle microbiome-host weefsel interacties verwijderen. Dit zou een bijzonder belangrijke overweging kunnen zijn, aangezien sommige xenobiotica (bijv. methamfetamine) kunnen worden gemetaboliseerd door menselijke cellen en gut microbiota27. Bovendien hebben recente studies aangegeven dat gut meta (GM) het xenobiotische metabolisme indirect kan reguleren via regulering van gastheer-genexpressie verordening8.
Hoewel de ontwikkelingen van batch fermentatiesystemen nog steeds nodig zijn, kunnen deze systemen op grote schaal worden gebruikt voor hoge doorvoer en snelle screening van interacties tussen xenobiotica en humane gut microbiota. Het verhelderend maken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan xenobiotische resistentie en metabolisme in actieve humane gut microbiomen zal belangrijke inzichten geven in onverklaarbare variatie van patiënt tot patiënt in de werkzaamheid en toxiciteit van de drug8,9. Bovendien is een gedetailleerder begrip van de manier waarop diëten en specifieke voedsel componenten de microbiële metabolische veranderingen veranderen en bijgevolg de gezondheid van gastheer de eerste stap naar het realiseren van het doel van gepersonaliseerde geneeskunde via microbiota modulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben. De cijfers werden aangehaald in Yin et al. 11.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door de National Nature Science Foundation of China (nr. 31741109), de Hunan Natural Science Foundation (nr. 2018JJ3200), en het construct programma van toegepaste karakteristieke discipline in de Hunan University of Science and Engineering. Wij danken LetPub (www.letpub.com) voor haar taalkundige hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
