Summary
Beskrevet her er en protokol til at undersøge samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota ved hjælp in vitro-batch fermenterings systemer.
Abstract
Humane tarm mikroorganismer er for nylig blevet et vigtigt mål for forskning i at fremme menneskers sundhed og forebygge sygdomme. Derfor er undersøgelser af interaktioner mellem endobiotika (f. eks. lægemidler og Prebiotika) og Gut mikrobiota blevet et vigtigt forskningsemne. Men in vivo eksperimenter med humane frivillige er ikke ideelle til sådanne undersøgelser på grund af bioetik og økonomiske begrænsninger. Som følge heraf er der blevet anvendt dyremodeller til at evaluere disse interaktioner in vivo. Ikke desto mindre er dyremodel undersøgelser stadig begrænset af bioetiske overvejelser, foruden forskellige sammensætninger og forskelle i mikrobiota hos dyr vs. mennesker. En alternativ forskningsstrategi er brugen af batch fermenterings eksperimenter, der muliggør evaluering af samspillet mellem endobiotika og Gut mikrobiota in vitro. For at evaluere denne strategi, bifidobacterial (BIF) Exopolysaccharider (EPS) blev brugt som en repræsentativ xenobiotic. Derefter, samspillet mellem BIF EPS og human Gut mikrobiota blev undersøgt ved hjælp af flere metoder såsom tyndtlagkromatografi (TLC), bakteriel samfund kompositoriske analyse med 16S rRNA gen High-gennemløb Sequencing, og gaskromatografi af kortkædede fedtsyrer (SCFAs). Præsenteret her er en protokol til at undersøge samspillet mellem endobiotika og human Gut mikrobiota ved hjælp in vitro batch fermenterings systemer. Vigtigere, denne protokol kan også ændres til at undersøge generelle interaktioner mellem andre endobiotika og Gut microbiota.
Introduction
Gut mikrobiota spiller en vigtig rolle i driften af humane tarme og i værts sundhed. Derfor er Gut mikrobiota for nylig blevet et vigtigt mål for sygdomsforebyggelse og terapi1. Desuden, Gut bakterier interagere med vært tarmceller og regulere grundlæggende vært processer, herunder metaboliske aktiviteter, næringsstof tilgængeliggørelse, immunsystem modulation, og endda hjernefunktion og beslutningstagning2,3 . Endobiotika har et betydeligt potentiale til at påvirke den bakterielle sammensætning og mangfoldighed af Gut microbiota. Således, interaktioner mellem endobiotika og human Gut mikrobiota har tiltrukket stigende forskning opmærksomhed4,5,6,7,8,9.
Det er vanskeligt at evaluere samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota in vivo på grund af bioetik og økonomiske begrænsninger. For eksempel kan eksperimenter, der undersøger samspillet mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota, ikke udføres uden tilladelse fra Food and Drug Administration, og rekruttering af frivillige er dyrt. Derfor anvendes dyremodeller ofte til sådanne undersøgelser. Brugen af dyremodeller er dog begrænset på grund af forskellige mikrobiota kompositioner og diversitet i dyr-vs. menneske-associerede samfund. En alternativ in vitro-metode til at udforske samspillet mellem endobiotika og human Gut mikrobiota er gennem brug af batch kultur eksperimenter.
Exopolysaccharider (Eps'er) er prebiotics, der bidrager væsentligt til opretholdelsen af menneskers sundhed10. Særskilte Eps'er, der består af forskellige monosaccharid kompositioner og strukturer kan udvise forskellige funktioner. Tidligere analyser har fastlagt sammensætningen af BIF Eps'er, som er det repræsentative xenobiotiske mål i den nuværende undersøgelse11. Men, Host-associerede metaboliske effekter er ikke blevet overvejet med hensyn til EPS sammensætning og mangfoldighed.
Den protokol, der er beskrevet her, bruger fækal mikrobiota fra 12 frivillige til gære BIF EPSS. Tyndtlags kromatografi (TLC), 16S rRNA-gensekvensering med høj gennemløb og gaskromatografi (GC) anvendes derefter i kombination til at undersøge samspillet mellem EPSs og humant tarm mikrobiota. Særskilte fordele ved denne protokol sammenlignet med in vivo eksperimenter er dens lave omkostninger og undgåelse af interfererende virkninger fra værtens metabolisme. Desuden kan den beskrevne protokol anvendes i andre undersøgelser, der undersøger interaktioner mellem endobiotika og humant tarm mikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra den etiske komité for Hunan University of Science and Engineering (Hunan, Kina), og Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, Kina).
1. fremstilling af bakterier
- Fremstilling af bifidobacterium medium bouillon
- Bland følgende komponenter i 950 mL destilleret vand: kødekstrakt, 5 g/L; gærekstrakt, 5 g/L; kasein peptone, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Mellem 80 og 1 mL saltopløsning, 40 mL (CaCl2. 2H2O, 0,25 g/L; KH2po4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); og resazurin, 0,4 mL (2,5 mg/L). Justér pH-værdien til 6,8 med 2 M NaOH.
- Autoklave ved 121 °C i 15 minutter og lad bouillon afkøles til stuetemperatur (RT) under anaerobe forhold (10% H2, 10% Co2, 80% N2). Tilsæt filter-steriliseret cystein-HCl (0,5 g/L) og mupirocin (5 mg/L) til mediet.
- Tilsæt en alikvot (50 μL) frossen Bifidobacterium longum til et kulturrør med 5 ml Bifidobacterium medium bouillon under anaerobe forhold, og derefter kulturen i en anaerob inkubator i 24 timer ved 37 °c.
2. forberedelse af bifidobacterial EPSs
- Fremstilling af PYG agar medium
- Kombiner følgende: peptone, 20 g/L; gærekstrakt, 10 g/L; glucose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2po4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Justér pH til 7,2 med 10 M NaOH.
- Autoklave mediet ved 121 °C i 15 min. og afkøles til ~ 50 °C. Derefter, pr 1 L medium, tilsættes 0,5 mL filter-steriliseret vitamin K1 opløsning (1 g vitamin k1 opløst i 99 ml af 99% ethanol), 5 ml haemin opløsning (0,5 g af Haemin opløst i 1 ml af 1 mol/L NaOH , og derefter bragt op til 100 mL med destilleret vand), og 0,5 g cystein-HCl.
- Før hælde PYG pladerne tilsættes filter-steriliseret 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranosid (X-gal, 0,06 g/L), LiCl · 3H2O (5,7 g/l) og mupirocin (5 mg/l) til mediet.
Bemærk: X-gal og LiCl. 3H2O tillader identifikation af B. longum kolonier på plader via farveændringer.
- 20 μL B. longum -stammer (trin 1,2) til PYG plader og placeres i en anaerob inkubator ved 37 °c i 72 h.
- Saml mucoid bakterielle kolonier fra PYG pladerne ved hjælp af en veje måleske, og gensuspender derefter fuldstændigt i 10 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved hjælp af en vortex oscillator.
Bemærk: bakterie-og EPS-blandingerne skal resuspenderes helt ved vortexning eller pipettering op og ned gentagne gange, indtil fibrene er helt opløst i PBS. - Centrifuger suspensionen ved 6.000 x g i 5 min.
- Supernatanterne overføres forsigtigt til et nyt centrifugeglas og blandes helt med tre mængder kold 99% ethanol ved gentagen inversion og blanding.
- Blandingen centrifugeres ved 6.000 x g i 5 minutter, og Supernatanterne fjernes helt.
- Udfældning fjernes fra centrifuge rørene ved at skraber og tørre EPS-ekstrakterne om natten ved hjælp af en hastigheds vakuum.
3. tilberedning af fermenterings medium
- Forberedelse af grundlæggende kulturmedium VI
- Kombiner følgende: peptone, 3 g/L; tryptone, 3 g/L; gærekstrakt, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; galdesalte No. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2. 6h2O, 0,2 g/L; KH2po4, 0,4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3,0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0,32 g/L; FeSO4· 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CaCl2· 2H2O, 0,1 g/L; ZnSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CuSO4· 5H2O, 0,01 g/L; og NiCl2· 6h2O, 0,092 g/L. Juster pH til 6,5 med 1 M HCL.
- Forbered haemin og cystein som udført i afsnit 2,1 og tilsæt efter autoklave og køling.
- Forbered kultur medier, der indeholder forskellige kulstofkilder med et VI-basis medie. Før autoclaving tilsættes 8 g/L BIF EPS-fibre til medium VI, bestående af gruppe VI_Bif. Derudover tilsættes 8 g/L stivelse til medium VI til at repræsentere gruppe VI_Starch. Endelig anvendes medium VI uden tilsætning af en kulstofkilde som kontrol (gruppe VI).
Bemærk: BIF EPS og stivelse opløses først i varmt vand ved hjælp af en magnetisk agitator, derefter blandet med forberedt VI medium. - Autoclave alle medier ved 121 °C i 15 min og lad det køle af til RT.
- Der overføres en delprøve (5 mL) af hvert medium til kulturrør i en anaerob inkubator, og de resterende medier opbevares ved 4 °C.
4. humant fækal prøveforberedelse
- Saml friske fækale prøver umiddelbart efter frisk afføring fra raske voksne humane frivillige ved hjælp af afføring beholdere, og efterfølgende brug til gylle forberedelse.
Bemærk: forud for prøvetagning bør alle de frivillige screenes for at sikre, at der ikke modtages antibiotika, probiotika eller prebiotiske behandlinger i mindst 3 måneder forud for donering af prøver. Desuden skal alle donorer give informeret, skriftligt samtykke. - En frisk fækal prøve (1 g) overføres til 10 mL 0,1 M anaerob PBS (pH 7,0) til glas bægre, og derefter anvendes glas stænger til at tilberede en 10% (w/v) gylle.
- Brug en 0,4 mM sigte til at filtrere fækal gylle. Brug derefter en delprøve af den filtrerede gylle til at inokulere batch kultur gærings eksperimenter, og opbevar resten ved-80 °C for yderligere analyser.
Bemærk: trin 4.2 – 4.3 udføres i et anaerob kammer.
5. in vitro-batch gæring
- Tilsæt filtreret fækal gylle (500 μL) til fermenterings mediet fremstillet i trin 3,2 i et anaerob kammer, og Inkuber derefter ved 37 °C.
- 2 mL fermenterede prøver opsamles ved 24 timer og 48 h i det anaerobe kammer, hvorefter de centrifugeres uden for kammeret ved 6.000 x g i 3 min.
- Supernatanterne overføres forsigtigt til et nyt centrifugeglas, der skal anvendes til analyse af polysaccharid nedbrydning og kortkædede fedtsyrer (SCFAs).
- Centrifugerings pellets opbevares ved-80 °C og anvendes efterfølgende til bakteriel genomisk DNA-ekstraktion.
6. EPS nedbrydning af human fækal mikrobiota
- Indlæs 0,2 μL fermenterede supernatanter på præ-belagt silica gel-60 TLC aluminiumsplader, og tør derefter ved hjælp af en hårtørrere.
- Der udvikles plader i 20 mL af en myresyre/n-butanol/vand (6:4:1, v:v: v) opløsning og tørres med en hårtørrere.
- Soak pladerne i orcinol reagens til farvning, derefter tørre ved hjælp af en hårtørrere.
- Forbered orcinol reagenser ved at opløse 900 mg Lichenol i 25 mL destilleret vand og derefter tilføje 375 mL ethanol. Efterfølgende bør koncentreret svovlsyre tilsættes langsomt, og opløsningen blandes grundigt.
- Varmeplader ved 120 °C i 3 minutter i en bageovn og evaluere nedbrydning af EPS ved at måle TLC-bånd.
7. virkninger af EPS på humant intestinal mikrobiota
- Frys-tø de oprindelige fækale prøver tilberedt i trin 4,3 og fermenterede prøver tilberedt i trin 5,4.
- Ekstrakt bakteriel genomisk DNA (gDNA) fra alle prøverne ved hjælp af en afføring bakteriel genomisk DNA ekstraktions kit efter producentens anvisninger.
- Fastlæg DNA-koncentrationer, integriteter og størrelsesfordelinger ved hjælp af et mikro-Spektrofotometer og Agar gel elektroforese.
- Udføre PCR af bakterielle 16S rRNA-gener fra den ekstraherede gDNA ved hjælp af følgende tidligere beskrevne fremad og omvendte primere12:
-Forward primer (barkodet primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-reverse primer (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Brug følgende termiske variator betingelser:- 94 °C i 5 min.
- 94 °C i 30 s.
- 55 °C i 30 s.
- 72 °C i 1 min.
- Gentag 2 – 4 for 35 cyklusser
- 72 °C i 5 min.
- 4 °C hold indtil fjernelse fra termisk cycler.
- Udfør sekvensering med høj gennemløb af PCR-produkter hos et DNA-sekventering-firma ved hjælp af mikrobiel Fællesskabs analyse med ultrahøj gennemløb.
- Opnå rene, højkvalitets sekvenser ved hjælp af den kvantitative indsigt i mikrobiel økologi (QIIME) Sekvensanalyse pipeline13.
- Definer operationelle taksonomiske enheder (Otu'er) for 16S rRNA-gensekvenser med større end 97% nucleotid-lighed ved hjælp af bioinformatik værktøjer som Mothur software suite14.
- Vælg en repræsentativ sekvens fra hver OTU, og brug RDP-klassifikatoren sammen med SILVA-taksonomisk database til at klassificere repræsentative sekvenser15.
- Beregn god dækning, alpha Diversity Metrics (herunder Simpson og Shannon index), og rigdom (observeret antal OTUs) ved hjælp af Bioinformatik Tools16.
8. virkninger af EPS på SCFA-produktion af humant tarm mikrobiota
- Tilsæt fermenterede supernatanter (1 mL) tilberedt i trin 5,3 til 2 mL centrifugeglas.
- Tilsæt 0,2 mL af 25% (w/v) metaphosphorsyre til hver af prøverne og bland grundigt løsningerne ved vortexing.
- Blandingerne centrifugeres ved 13.000 x g i 20 minutter, og Supernatanterne overføres til friske rør.
- Samtidig forberedes opløsninger af 120 mM eddikesyre, propionsyre, butyric, isobutyric, valeric og isovaleriske syrer. Tilsæt derefter 1 mL af hver tilberedt syre til 1,2 mL af 25% (w/v) metaphosphorsyre og brug som standard cocktails.
- Prøverne filtreres ved hjælp af en 0,22 μM membran.
- Detektér SCFA-koncentrationer ved hjælp af gaskromatografi med høj ydeevne i henhold til tidligere beskrevne protokoller11,17.
Bemærk: en InertCap FFAP-kolonne (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) anvendes til gaskromatografi (GC). SCFA-koncentrationerne kvantificeres derefter på basis af spidsbelastnings områder ved hjælp af den interne standardmetode i GC-løsningens softwarepakke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produktionen af mucoid EPS kunne observeres i B. longum kulturer på PYG plader efter anaerob inkubation for 72 h (figur 1a). Centrifugering af kultur skraber, efterfulgt af ethanol nedbør og tørring, resulterede i indsamling af cellulose-lignende EPS (figur 1b). Tørrede EPS og opløselige stivelse blev derefter brugt som kulstofkilder til fermenterings kulturer. TLC blev brugt til oligosaccharid separation og renhed analyse på grund af sin lave omkostninger og hurtige resultater turnaround18. Selv om nedbrydningshastigheden af stivelse med human fækal mikrobiota var hurtigere end BIF EPS (figur 2), blev BIF EPS-nedbrydning tydeligt observeret for nogle EPS-inokulerede prøver.
Fællesskabets kompositoriske analyse via 16S rRNA gene High-gennemløb sekventering og Principal koordinat analyse (pcoa) blev derefter udført for at undersøge virkningerne af BIF EPS på human Gut mikrobiota. Prøver fra VI_Bif og VI_Starch grupper grupperet adskilt fra hinanden i PCoA-analyse (figur 3a), hvilket indikerer, at EPS og stivelse tilgængelighed differentielt forme menneskelige fækale bakterielle samfund. Lineær diskriminant analyse effekt størrelse (LEfSe) blev yderligere brugt til at skelne de specifikke bakterielle taxa, der varierede mellem VI_Bif og VI_Starch behandlinger. Den generelle Collinsella, coprococcus, parabacteroidesog rhodopseudomonas var signifikant mere rigelige i de VI_Bif prøver end i VI_Starch prøverne (figur 3b). Desuden blev der foretaget GC-målinger for flere SCFAs for at evaluere deres produktion efter tilsætning af forskellige kulstofkilder. SCFAs, der blev målt fra gærings kulturer, inkluderede eddikesyre, propionsyre, isobutyric, butyric, isovaleric og valeric syrer. Efter fermentering i 24 timer og 48 h var fem af de seks førnævnte SCFA-koncentrationer ens blandt behandlingerne og ikke statistisk forskellige fra grupperne VI_Bif, VI_Starch og VI. Propionsyrekoncentrationerne var imidlertid signifikant højere i gruppen VI_Bif end i VI_Starch gruppen (figur 4).
Figur 1: EPS produceret af B. longum.
Frosset B. longum blev restaureret i Bifidobacterium medium bouillon og derefter strippet på PYG plader, efterfulgt af anaerob inkubation ved 37 °c for 72 h (A). EPS produceret af bakterielle kulturer blev skrabet fra plade kulturer, udfældede ved hjælp af ethanol, og tørret natten ved hjælp af en hastighed vakuum (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: TLC-analyse af in vitro -EPS og stivelses nedbrydning ved humant tarm mikrobiota.
TLC-analyse blev udført på 0,2 μL prøver indsamlet ved 24 timer og 48 h fra hver fermenterings kultur dyrket under anaerobe forhold. VI, VI_Starch og VI_Bif angiver henholdsvis VI Media, VI Media + stivelse supplement, og VI Media + EPS supplement, hhv. Tallene 1 – 12 indikerer fækale bakterie prøver fra de 12 frivillige, der blev brugt til at inokulere fermenterings forsøgene. Kontrolgruppen repræsenterer behandling uden yderligere kulstof tilskud. Dette tal er ændret fra Yin et al. 11. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: virkninger af BIF EPS tilgængelighed på human Gut mikrobiota samfund.
A) pcoa-plot af Gut mikrobiota Fællesskabets sammensætning af forskelligheder baseret på den uvægtede unifrac-måling. (B) lefse analyse af bakterielle taxa, der var differentieret rigelige blandt behandlingsgrupper. En cutoff af p < 0,05 blev brugt til at vurdere den statistiske signifikans af bakterielle taksonomiske forskelle mellem grupperne. Ori indikerer tarm mikrobiota af frivillige fækale prøver. VI_Bif og VI_Starch indikerer Gut mikrobiota fra fermenterings prøver ved hjælp af VI medier med EPS og stivelse som kulstof substrater, hhv. Vi repræsenterer kontrolgruppen med Gut mikrobiota inokulerede fermentationer i vi medier uden tilskud af andre kulhydrater. Dette tal er ændret fra Yin et al. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: virkninger af EPS-tilgængelighed på SCFA-produktion efter 24 h og 48 h fermentering.
Der blev detekteret eddikesyre, propionsyre, isobutyrisk, butyric, isovalerisk og valerisk syrer ved hjælp af gaskromatografi. VI_Bif, VI_Starch og VI angiver de prøver, der blev indsamlet efter dyrkning med henholdsvis VI Media + EPS, VI Media + stivelse og VI Media. Alle prøver blev målt i tre eksemplarer. Tallene blev genereret ved hjælp af GraphPad Prism version 5,01. Paneler repræsenterer organiske syre koncentrationer i hver gæret prøve for en eddikesyre B, propionsyre; C, isobutyrisk syre; D, smørsyre; E, isovalerisk syre; og F, valeric Acid. Dette tal er ændret fra Yin et al.11venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er gjort betydelige fremskridt i retning af at forstå Human Gut mikrobiota sammensætning og aktiviteter i løbet af de sidste ti år. Som en konsekvens af disse undersøgelser, holobiont koncept er dukket op, som repræsenterer samspillet mellem værter og associerede mikrobielle samfund, såsom i mellem mennesker og deres Gut mikrobiota19,20. Desuden er mennesker selv nu betragtes som Super organismer21, hvor tarmen mikrobiota er blevet anerkendt som en af de funktionelle organer i mennesker22,23. Den menneskelige krop er vært for et komplekst mikrobielt økosystem, der består af ca. 1013 mikrobielle celler24. Desuden, genomer af Gut mikrobiota betragtes som hjælpe genomer fra mennesker, at indkode talrige metaboliske-relaterede gener, der udvider værtens metaboliske kapaciteter4. Xenobiotika, herunder terapeutiske lægemidler og diæt afledte bioaktive forbindelser, kan dog potentielt ændre tarm mikrobielle fællesskabsstruktur og dermed forbundne funktioner5. Et stigende antal undersøgelser har vist, at interaktioner mellem Gut mikrobiota og fremmedstoffer spiller en vigtig rolle i mediering af kemisk toksicitet og forårsager, eller på anden måde, forværrer, menneskelige sygdomme6,7. Således, undersøgelser af samspillet mellem fremmedstoffer og human Gut mikrobiota har for nylig høstet betydelig forskning opmærksomhed.
Musemodeller har været de mest udbredte metoder til at undersøge interaktioner mellem mikrobiota og værter. Men forskelle i sammensætning og aktiviteter mellem tarm mikrobiota af mennesker og mus25 kan resultere i utilstrækkelig modellering af menneskelig interaktion gennem undersøgelser af mus. Ikke desto mindre kræver bioetiske overvejelser minimal brug af mus. Et alternativ til ovenstående in vivo modeller er batch gæring, som kan bruges til at simulere Human Gut mikrobiota in vitro26. Derfor er der anvendt gærings eksperimenter til at undersøge samspillet mellem xenobiotika og humant tarm mikrobiota. For eksempel, Yin et al. 17 har brugt batch fermenterings eksperimenter til at undersøge samspillet mellem polysaccharider og humant tarm mikrobiota. Resultaterne fra denne undersøgelse indikerer, at nogle polysaccharider kan metaboliseres af human Gut mikrobiota, og at polysaccharider modulerer det humane bakterielle samfund og metabolitter, som de producerer in vitro, herunder SCFAs. Nogle metodologiske overvejelser er imidlertid afgørende for anvendelsen af denne protokol. For eksempel, fækale prøver bør indsamles så hurtigt som muligt, og en anaerob kammer bør anvendes til at sikre væksten af obligat anaerobes. Sidstnævnte overvejelse er særlig kritisk, fordi oxygen eksponering kan føre til døden af nogle tarm bakterielle populationer og dermed ændring af bakteriel samfund. Derudover metaboliseres xenobiotika i det øvre fordøjelsessystem. Derfor modellering samspillet mellem fremmedstoffer og den nedre fordøjelsessystemet mikrobiota er en vigtig overvejelse for in vivo modelle ringen.
Batch gæring eksperimenter har klare fordele i forhold til in vivo humane og animalske undersøgelser, fordi de er mere økonomisk gennemførlige og bekvemme. Desuden kan de anvendes til at undersøge den interindividuelle variation af humant tarm mikrobiota respons på xenobiotisk eksponering. Desuden kan batch gæring let anvendes til at manipulere mikrobiota samfund og evaluere deres tilknyttede metaboliske funktioner. Dog, batch fermenterings systemer lider under begrænsningen af statisk tilstand dynamik. Fremtidige undersøgelser kunne gennemføre bioreaktor kemo, der giver mulighed for dynamisk graduering af ph, temperatur og peristaltik, samtidig med at en stabil forsyning af næringsstoffer og kontinuerlig fjernelse af affald. Sådanne aktiviteter ville gøre det muligt for eksperimenter at bedre efterligne in vivo tarm skrifter og give ny indsigt til at supplere dem fra batch gæring eksperimenter. En yderligere begrænsning af batch gæring eksperimenter er, at de fjerner alle mikrobiome-Host væv interaktioner. Dette kan være en særlig vigtig overvejelse, da nogle xenobiotika (f. eks. metamfetamin) kan blive Co-metaboliseret af humane celler og Gut mikrobiota27. Desuden har nylige undersøgelser indikeret, at Gut metagenome (GM) indirekte kan regulere xenobiotisk metabolisme via regulering af Host genekspression regulation8.
Selv om der stadig er behov for udvikling af batch fermenterings systemer, kan disse systemer i vid udstrækning anvendes til højt gennemløb og hurtig screening af interaktioner mellem xenobiotika og humant tarm mikrobiota. Belyse de mekanismer, der underliggende xenobiotisk resistens og metabolisme i aktive humane tarm mikrobiomer vil give vigtig indsigt i uforklarlige patient-til-patient variation i Drug effekt og toksicitet8,9. Desuden er en mere detaljeret forståelse af, hvordan kost og specifikke fødevarer komponenter ændre mikrobielle metabolimer og dermed virkning vært sundhed er det første skridt i retning af at realisere målet om personlig medicin via mikrobiota modulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter. Tallene blev citeret i Yin et al. 11.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af national Nature Science Foundation i Kina (no. 31741109), Hunan Natural Science Foundation (nr. 2018JJ3200), og konstruktions programmet for anvendt karakteristisk disciplin i Hunan University of Science and Engineering. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for sin sproglige bistand under forberedelsen af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
