Summary
Burada açıklanan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.
Abstract
İnsan bağırsak mikroorganizmaları son zamanlarda insan sağlığını teşvik ve hastalıkları önlemede araştırma önemli bir hedef haline gelmiştir. Sonuç olarak, endobiyotikler (örneğin, ilaçlar ve prebiyotikler) ve bağırsak mikrobiyotaları arasındaki etkileşimlerin araştırılması önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Ancak, insan gönüllüleri ile in vivo deneyler biyoetik ve ekonomik kısıtlamalar nedeniyle bu tür çalışmalar için ideal değildir. Sonuç olarak, hayvan modelleri in vivo bu etkileşimleri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, hayvan modeli çalışmaları hala biyoetik hususlar ile sınırlıdır, hayvanlarda farklı kompozisyonlar ve hayvanlarda mikrobiyota çeşitlemeleri ek olarak insanlara karşı. Alternatif bir araştırma stratejisi endobiyotikler ve in vitro bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesi sağlayan toplu fermantasyon deneyleri kullanımıdır. Bu stratejiyi değerlendirmek için bifidobakteriyel (Bif) eksopolisakkaritler (EPS) temsili ksenobiyotik olarak kullanıldı. Daha sonra, Bif EPS ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimler ince tabaka kromatografisi (TLC), 16S rRNA geni yüksek iş yapma lı analiz ve gaz kromatografisi gibi çeşitli yöntemlerle incelenmiştir. kısa zincirli yağ asitleri (SCFAs). Burada sunulan in vitro toplu fermantasyon sistemleri kullanarak endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotları arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür. Daha da önemlisi, bu protokol aynı zamanda diğer endobiyotikler ve bağırsak mikrobiyotaarasındaki genel etkileşimleri araştırmak için değiştirilebilir.
Introduction
Gut mikrobiyota insan bağırsaklarının işleyişinde ve konak sağlığında önemli bir rol oynamaktadır. Sonuç olarak, bağırsak mikrobiyota son zamanlarda hastalık önlemeve tedavi için önemli bir hedef haline gelmiştir 1. Ayrıca, bağırsak bakterileri konak bağırsak hücreleri ile etkileşim ve metabolik faaliyetler, besin kullanılabilirlik, bağışıklık sistemi modülasyonu ve hatta beyin fonksiyonu ve karar verme dahil olmak üzere temel konak süreçlerini düzenleyen2,3 . Endobiyotikler bakteri bileşimi ve bağırsak mikrobiyota çeşitliliği etkilemek için önemli bir potansiyele sahip. Böylece, endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimler artan araştırma dikkat çekti4,5,6,7,8,9.
Biyoetik ve ekonomik kısıtlamalar nedeniyle endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası in vivo arasındaki etkileşimleri değerlendirmek zordur. Örneğin, endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri araştıran deneyler Gıda ve İlaç İdaresi izni olmadan yapılamaz, ve gönüllü alımı pahalıdır. Sonuç olarak, hayvan modelleri genellikle bu tür araştırmalar için kullanılır. Ancak, hayvan modellerinin kullanımı farklı mikrobiyota kompozisyonları ve hayvan-vs insan ilişkili topluluklarda çeşitlilik nedeniyle sınırlıdır. Alternatif in vitro yöntemi endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimleri keşfetmek için toplu kültür deneyleri kullanımı ile.
Eksopolisakkaritler (EPSs) önemli ölçüde insan sağlığının bakımına katkıda prebiyotikler10. Farklı monosakkarit bileşimlerinden ve yapılarından oluşan farklı EPS'ler farklı işlevler sergileyebilir. Daha önceki analizler, mevcut çalışmada hedeflenen temsili ksenobiyotik olan Bif EPSs'nin bileşimini belirlemiştir11. Ancak, konakilişkili metabolik etkileri EPS bileşimi ve çeşitliliği açısından dikkate alınmamıştır.
Burada açıklanan protokol bif EPSs fermantasyon için 12 gönüllü gelen dışkı mikrobiyota kullanır. İnce tabaka kromatografisi (TLC), 16S rRNA geni yüksek iş yapma alanı sıralaması ve gaz kromatografisi (GC) eps ve insan bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri araştırmak için birlikte kullanılır. Bu protokolün in vivo deneylere göre belirgin avantajları düşük maliyetli ve konak metabolizmasından kaynaklanan etkilerden kaçınmadır. Ayrıca, açıklanan protokol endobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyotaarasındaki etkileşimleri araştırmak diğer çalışmalarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi (Hunan, Çin) ve Zhejiang Gongshang Üniversitesi (Zhejiang, Çin) etik komitesinin yönergelerini izler.
1. Bakterilerin hazırlanması
- Bifidobacterium orta et suyu hazırlanması
- Aşağıdaki bileşenleri 950 mL distile suda birleştirin: et özü, 5 g/L; maya özü, 5 g/L; kazein peptone, 10 g/L; soya tonulu, 5 g/L; glikoz, 10 g/L; K2HPO4, 2.04 g/L; MgSO4·7H2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; tuz çözeltisi, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); ve resazurin, 0.4 mL (2.5 mg/L). 2 M NaOH ile pH'ı 6,8'e ayarlayın.
- 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklav ve suyu anaerobik koşullarda oda sıcaklığına (RT) soğumasını bekleyin (%10 H2, %10 CO2,%80 N2). Ortama filtre ile sterilize edilmiş sistein-HCl (0.5 g/L) ve mupirosin (5 mg/L) ekleyin.
- Anaerobik koşullarda 5 mL bifidobacterium orta et suyu ile bir kültür tüpüne dondurulmuş Bifidobacterium longum bir aliquot (50 μL) ekleyin, sonra 37 °C'de 24 saat için bir anaerobik kuluçka kültürü.
2. Bifidobakteriyel EPS hazırlanması
- PYG agar orta hazırlanması
- Aşağıdakileri birleştirin: peptone, 20 g/L; maya özü, 10 g/L; glikoz, 5 g/L; NaCl, 0.08 g/L; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4·7H2O, 0.008 g/L; K2HPO4, 0.04 g/L; KH2PO4, 0.04 g/L; NaHCO3, 0.4 g/L; agar, 12 g/L. 10 M NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
- 15 dakika boyunca 121 °C'de otoklav ve ~50 °C'ye kadar soğutun. Daha sonra, orta 1 L başına, filtre sterilize K1 çözeltisi 0.5 mL ekleyin (1 gK 1 vitamini 99% etanol 99 mL çözünmüş), haemin çözeltisi 5 mL (haemin 0.5 g 1 mol /L NaOH 1 mL çözünmüş , daha sonra distile su ile 100 mL kadar getirdi), ve sistein-HCl 0.5 g.
- PYG plakalarını dökmeden önce, ortama filtre sterilize edilmiş 5-bromo-4-kloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal, 0.06 g/L), LiCl·3H2O (5.7 g/L) ve mupirocin (5 mg/L) ekleyin.
NOT: X-Gal ve LiCl.3H2O renklendirme değişiklikleri ile plakalar üzerinde B. longum kolonilerinin tanımlanmasına izin verir.
- 20 μL B. longum suşlarını (adım 1.2) PYG plakalarına aşıla ve 37 °C'de 72 saat boyunca anaerobik bir kuluçka makinesine yerleştirin.
- Bir tartım kepçesi kullanarak PYG plakalarından mukoid bakteri kolonileri toplayın, sonra bir girdap osilatör kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mL tamamen askıya.
NOT: Bakteriyel ve EPS karışımları, lifler PBS'de tamamen eriyene kadar tekrar tekrar yukarı veya aşağı borular girdap veya borulama ile tamamen askıya alınmalıdır. - Süspansiyonu 5 dk için 6.000 x g olarak santrifüj edin.
- Supernatants'ı yeni bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın ve tekrarlanan ters çevirme ve harmanlama ile üç cilt soğuk %99 etanol ile tamamen karıştırın.
- Karışımı 5 dk için 6000 x g'da santrifüj edin ve süpernatantları tamamen çıkarın.
- Hız vakum kullanarak bir gecede EPS ekstreleri kazıyarak ve kurutarak santrifüj tüpleri çökeltileri çıkarın.
3. Fermantasyon ortamının hazırlanması
- Temel kültür ortamının hazırlanması VI
- Aşağıdakileri birleştirin: peptone, 3 g/L; tripton, 3 g/L; maya özü, 4.5 g/L; müsin, 0.5 g/L; safra tuzları No. 3, 0.4 g/L; NaCl, 4.5 g/L; KCl, 2.5 g/L; MgCl2·6H2O, 4.5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0.4 g/L; MgSO4·7H2O, 3.0 g/L; MnCl2·4H2O, 0.32 g/L; FeSO4·7H2O, 0.1 g/L; CoSO4·7H2O, 0.18 g/L; CaCl2·2H2O, 0.1 g/L; ZnSO4·7H2O, 0.18 g/L; CuSO4·5H2O, 0.01 g/L; ve NiCl2·6H2O, 0.092 g/L. PH'ı 1 M HCl ile 6,5'e ayarlayın.
- Bölüm 2.1'de yapıldığı gibi haemin ve sistein hazırlayın ve otoklavlama ve soğutmadan sonra ekleyin.
- VI temel ortamile farklı karbon kaynakları içeren kültür ortamı hazırlayın. Otoklavlamadan önce, grup VI_Bif'i içeren orta VI'ye 8 g/L Bif EPS lifleri ekleyin. Buna ek olarak, grup VI_Starch temsil etmek için orta VI 8 g / L nişasta ekleyin. Son olarak, bir karbon kaynağı eklenmeden orta VI kontrol (grup VI) olarak kullanılır.
NOT: Bif EPS ve nişasta önce manyetik bir karıştırıcı kullanılarak sıcak suda çözülür, daha sonra hazır VI ortamı ile karıştırılır. - 15 dakika boyunca 121 °C'deki tüm ortamları otoklavla ve RT'ye soğumaya bırakın.
- Her ortamdan bir alt numuneyi (5 mL) anaerobik kuluçka makinesinde kültür tüplerine aktarın ve kalan ortamı 4 °C'de saklayın.
4. İnsan dışkı örnek hazırlama
- Sağlıklı yetişkin insan gönüllülerdışkı kapları kullanarak taze dışkılama hemen sonra taze dışkı örnekleri toplamak ve daha sonra bulamaç hazırlanması için kullanın.
NOT: Örnek toplama öncesinde, tüm gönüllüler antibiyotik, probiyotik veya prebiyotik tedavilerin en az 3 ay boyunca örnek bağışı ndan önce alınmaması için taranmalıdır. Buna ek olarak, tüm bağışçılar bilgilendirilmiş, yazılı onay vermelidir. - Taze dışkı örneğini (1 g) ila 0,1 M anaerobik PBS (pH 7,0) cam gagalara aktarın, ardından %10 (w/v) bulamaç hazırlamak için cam çubuklar kullanın.
- Dışkı bulamacını filtrelemek için 0,4 mM elek kullanın. Daha sonra, toplu kültür fermantasyon deneylerini aşılamak için filtrelenmiş bulamaç alt örneğini kullanın ve geri kalanını daha fazla analiz için -80 °C'de saklayın.
NOT: 4.2-4.3 basamakları anaerobik bir odada gerçekleştirilir.
5. In vitro toplu fermantasyon
- Bir anaerobik oda içinde adım 3.2 hazırlanan fermantasyon ortamına filtrelenmiş dışkı bulamacı (500 μL) ekleyin, ardından 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 24 h ve 48 h'de mayalanmış numunelerden 2 mL'yi anaerobik odada toplayın ve 3 dk için 6.000 x g'da odanın dışında santrifüj edin.
- Süpernatanları polisakkarit bozunma analizi ve kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) ölçümleri için kullanılacak yeni bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.
- Santrifüj peletlerini -80 °C'de saklayın ve daha sonra bakteriyel genomik DNA ekstraksiyonu için kullanın.
6. İnsan dışkı mikrobiyotası tarafından EPS bozulması
- Önceden kaplanmış silika jel-60 TLC alüminyum plakalara fermente edilmiş süpernatantların 0,2 μL'sini yükleyin, ardından saç kurutma makinesi kullanarak kurulayın.
- Plakaları formik asit/n-butanol/su (6:4:1, v:v:v) çözeltisi içinde 20 mL'lik bir çözeltide geliştirin ve saç kurutma makinesi kullanarak kurulayın.
- Boya için orsinol reaktif plakaları ıslatın, sonra bir saç kurutucu kullanarak kuru.
- Distile su 25 mL içinde Likenol 900 mg eriterek orsinol reaktifleri hazırlayın sonra etanol 375 mL ekleyerek. Daha sonra, konsantre sülfürik asit yavaş yavaş eklenmelidir ve çözelti iyice karıştırılmalıdır.
- 120 °C'de bir fırında 3 dk ısı tonuyla pişirilir ve TLC bantlarını ölçerek EPS'nin bozulmasını değerlendirir.
7. EPS'nin insan bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkileri
- Adım 4.3'te hazırlanan orijinal dışkı örneklerini ve 5.4 adımda hazırlanan fermente numuneleri dondurun-eritin.
- Üreticinin talimatları doğrultusunda bir dışkı bakteriyel genomik DNA çıkarma kiti kullanarak tüm örneklerden bakteriyel genomik DNA (gDNA) ayıklayın.
- Mikro spektrofotometre ve agar jel elektroforezi kullanarak DNA konsantrasyonlarını, bütünlüklerini ve boyut dağılımlarını belirleyin.
- Daha önce açıklanan ileri ve ters astarlar12aşağıdakileri kullanarak çıkarılan gDNA'dan bakteriyel 16S rRNA genlerinin PCR'sini gerçekleştirin:
-ileri astar (barkodlu astar 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-ters astar (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanın:- 5 dk için 94 °C.
- 30 s için 94 °C.
- 30 s için 55 °C.
- 1 dk için 72 °C.
- 35 döngü için 2-4'u tekrarlayın
- 5 dk için 72 °C.
- 4 °C, termal döngüden çıkarılana kadar bekletin.
- PCR ürünlerinin yüksek iş yapma elde sini, ultra yüksek üretim mikrobiyal topluluk analizini kullanarak BIR DNA sıralama şirketinde gerçekleştirin.
- Mikrobiyal Ekoloji (QIIME) dizi analizi boru hattı13içine Nicel Insights kullanarak temiz, yüksek kaliteli diziler elde edin.
- Mothur yazılım paketi14gibi biyoinformatik araçları kullanarak %97'den fazla nükleotit benzerliği ile 16S rRNA gen dizileri için operasyonel taksonomik birimleri (Otus) tanımlayın.
- Her OTU'dan bir temsilci sıra seçin ve temsili dizileri15sınıflandırmak için SILVA taksonomik veritabanı ile birlikte RDP sınıflandırıcısını kullanın.
- Biyoinformatik araçları 16 kullanarak Good'un kapsamını, alfa çeşitliliği ölçümlerini (Simpson ve Shannon indeksidahil) ve zenginliği (gözlenen OTÜs sayısı) hesaplayın.
8. EPS'nin insan bağırsak mikrobiyotası ile SCFA üretimiüzerine etkileri
- Adım 5,3 ila 2 mL santrifüj tüpler hazırlanan fermente supernatants (1 mL) ekleyin.
- Numunelerin her birine %0,2 mL (w/v) metafosforik asit ekleyin ve girdap yaparak çözeltileri iyice karıştırın.
- Karışımları 13.000 x g'de 20 dk için santrifüj edin ve süpernatantları taze tüplere aktarın.
- Buna eşlik etmek üzere, 120 mM asetik, propiyonik, bütirik, izobütirik, valerik ve izovalerik asitlerin çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra, her bir hazırlanan asit 1 mL ekleyin 1.2 mL 25% (w / v) metafosforik asit ve standart kokteyller olarak kullanın.
- Örnekleri 0,22 μM membran kullanarak filtreleyin.
- Daha önce açıklanan protokollere göre yüksek performanslı gaz kromatografisi kullanarak SCFA konsantrasyonlarını saptamak11,17.
NOT: Gaz kromatografisi (GC) için InertCap FFAP kolonu (0.25 mM x 30 m x 0.25 μM) kullanılır. SCFA konsantrasyonları daha sonra GC Solution yazılım paketinde tek noktalı dahili standart yöntemi kullanılarak en yüksek alanlara göre ölçülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mukoid EPS üretimi 72 saat anaerobik kuluçka dan sonra PYG plakaları üzerinde B. longum kültürlerde görülebilir (Şekil1A). Kültür kazımalarının santrifüjü, ardından etanol çökeltme ve kuruma, selüloz benzeri EPS toplanması ile sonuçlanır (Şekil 1B). Kurutulmuş EPS ve çözünür nişasta daha sonra fermantasyon kültürleri için karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. TLC oligosakkarit ayırma ve saflık analizi nedeniyle düşük maliyet ve hızlı sonuç dönüş18kullanılmıştır. İnsan dışkı mikrobiyotası ile nişastanın bozulma oranı Bif EPS'den(Şekil 2)daha hızlı olmasına rağmen, bazı EPS aşılanmış örneklerde Bif EPS yıkımı açıkça gözlenmiştir.
Bif EPS'nin insan bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkilerini araştırmak için 16S rRNA geni yüksek iş parçacığı sekesi ve temel koordinat analizi (PCoA) ile topluluk kompozisyon analizi yapıldı. VI_Bif ve VI_Nişasta gruplarından alınan örnekler PCoA analizinde (Şekil3A)birbirinden ayrı kümelenmiştir ve EPS ve nişasta kullanılabilirliğinin insan dışkı bakteri topluluklarını farklı biçimde şekillendirdiğini gösterir. Lineer ayrımcı analiz etki boyutu (LEfSe) vi_bif ve VI_Nişasta tedavileri arasında farklılık gösteren spesifik bakteriyel taksaları ayırt etmek için daha fazla kullanıldı. Collinsella, Coprococcus, Parabacteroidesve Rhodopseudomonas cinsi VI_Bif örneklerinde VI_Nişasta örneklerine göre anlamlı olarak daha boldur (Şekil3B). Ayrıca, farklı karbon kaynaklarının eklenmesinden sonra üretimlerini değerlendirmek için çeşitli SCFA'lar için GC ölçümleri yapılmıştır. Fermantasyon kültürlerinden ölçülen SCFA'lar asetik, propiyonik, izobütirik, bütirik, izovalerik ve valerik asitleri içerir. 24 saat ve 48 saat fermantasyondan sonra, söz konusu altı SCFA konsantrasyonundan beşi tedaviler arasında benzerdi ve VI_Bif, VI_Nişasta ve VI grupları arasında istatistiksel olarak farklı değildi. Ancak VI_Bif grubunda propiyonik asit konsantrasyonları VI_Nişasta grubuna göreanlamlı olarak yüksekti (Şekil 4).
Şekil 1: B. longum tarafından üretilen EPS.
Dondurulmuş B. longum Bifidobacterium orta et suyunda restore edildi ve daha sonra PYG plakaları üzerine çizgili, 72saat (A) için 37 °C'de anaerobik kuluçka izledi. Bakteri kültürleri tarafından üretilen EPS plaka kültürlerinden kazınmış, etanol kullanılarak çökelmişve bir hız vakum kullanılarak bir gecede kurutulmuş (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: In vitro EPS ve insan bağırsak mikrobiyotası tarafından nişasta bozulması nın TLC analizi.
TLC analizi, anaerobik koşullarda yetiştirilen her fermantasyon kültüründen 24 saat ve 48 saat olarak toplanan 0,2 μL numuneler üzerinde yapılmıştır. VI, VI_Starch ve VI_Bif, sırasıyla VI medya, VI media + nişasta eki ve VI media + EPS eki gösterir. 1-12 rakamları fermantasyon deneylerini aşılamak için kullanılan 12 gönüllüden alınan dışkı bakteri örneklerini göstermektedir. Kontrol grubu ek karbon takviyesi olmadan tedavi temsil eder. Bu şekil Yin ve ark.'dan değiştirilmiştir. 11. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bif EPS kullanılabilirliğinin insan bağırsak mikrobiyota toplulukları üzerindeki etkileri.
(A) ağırlıksız UniFrac metrik dayalı bağırsak mikrobiyota topluluk kompozisyon farklılıklarPCoA arsa. (B) Tedavi grupları arasında farklı olarak bol olan bakteriyel taksinlerin LEfSE analizi. Gruplar arasındaki bakteriyel taksonomik farklılıkların istatistiksel önemini değerlendirmek için p < 0.05'in kesilmesi kullanıldı. Ori gönüllü dışkı örneklerinin bağırsak mikrobiyotasını gösterir. VI_Bif ve VI_Starch, fermantasyon örneklerinden alınan bağırsak mikrobiyotasını sırasıyla Karbon substratları olarak EPS ve nişasta ile VI media kullanarak gösterir. VI diğer karbonhidrat takviyesi olmadan VI ortamda bağırsak mikrobiyota inoculated fermantasyon ile kontrol grubunu temsil eder. Bu şekil Yin ve ark.'dan değiştirilmiştir. 11.11.20 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 24 saat ve 48 saat fermantasyon sonrası EPS kullanılabilirliğinin SCFA üretimi üzerindeki etkileri.
Asetik, propiyonik, izobütirik, bütirik, izovalerik ve valerik asitler gaz kromatografisi kullanılarak saptandı. VI_Bif, VI_Nişasta ve VI sırasıyla VI media + EPS, VI media + nişasta ve VI media kullanılarak ekimden sonra toplanan örnekleri gösterir. Tüm örnekler trilikcate ölçüldü. Rakamlar GraphPad Prizma Sürüm 5.01 kullanılarak oluşturuldu. Paneller A için her fermente örnek içinde organik asit konsantrasyonları temsil, asetik asit; B, propiyonik asit; C, izobütirik asit; D, büyrik asit; E, isovalerik asit; ve F, valerik asit. Bu şekil Yin ve ark. 11'den değiştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son on yılda insan bağırsak mikrobiyota bileşimi ve faaliyetleri anlama yolunda önemli ilerleme yapılmıştır. Bu çalışmaların bir sonucu olarak, holobiont kavramı ortaya çıkmıştır, hangi konaklar ve ilişkili mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimleri temsil eden, insanlar ve bağırsak mikrobiyota arasında olduğu gibi19,20. Ayrıca, insanlar bile şimdi süperorganizmalar21olarak kabul edilir , bağırsak mikrobiyota insanlarda fonksiyonel organlardan biri olarak kabul edilmiştir22,23. İnsan vücudu yaklaşık 1013 mikrobiyal hücreden oluşan karmaşık birmikrobiyal ekosisteme ev sahipliği yapmaktadır. Ayrıca, bağırsak mikrobiyota genomları konağın metabolik yeteneklerini genişletmek çok sayıda metabolik ilişkili genleri kodlamak insanlardan yardımcı genomlar olarak kabul edilir4. Ancak, terapötik ilaçlar ve diyet kaynaklı biyoaktif bileşikler de dahil olmak üzere ksenobiyotikler, potansiyel bağırsak mikrobiyom topluluk yapısı ve ilişkili fonksiyonları değiştirebilir5. Çalışmaların artan sayıda bağırsak mikrobiyota ve ksenobiyotikler arasındaki etkileşimler kimyasal toksisite aracılık ve neden önemli roller oynadığını göstermiştir, ya da başka bir şekilde şiddetlendiren, insan hastalıkları6,7. Böylece, ksenobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin araştırmalar son zamanlarda önemli araştırma dikkat topladık.
Fare modelleri mikrobiyota ve konaklar arasındaki etkileşimleri araştırmak için en yaygın olarak kullanılan yöntemler olmuştur. Ancak, insanlar ve farelerin bağırsak mikrobiyotası arasındaki kompozisyon ve aktivitelerdeki farklılıklar25 farelerin çalışmaları yoluyla insan etkileşimlerinin yetersiz modelilmesine neden olabilir. Yine de, biyoetik hususlar farelerin en az kullanımını gerektirir. Vivo modelleri yukarıda bir alternatif toplu fermantasyon, hangi in vitro 26insan bağırsak mikrobiyota simüle etmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, fermantasyon deneyleri ksenobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılmıştır. Örneğin, Yin ve ark. 17 polisakkaritler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimleri araştırmak için toplu fermantasyon deneyleri kullandık. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, bazı polisakkaritlerin insan bağırsak mikrobiyotları tarafından metabolize edilebilen ve polisakkaritlerin insan bakteri topluluğunu modüle ettiğini ve scfa'lar da dahil olmak üzere in vitro ürettikleri metabolitleri gösterdiğini göstermektedir. Ancak, bazı metodolojik hususlar bu protokolün kullanımı için önemlidir. Örneğin, dışkı örnekleri mümkün olan en kısa sürede toplanmalı ve zorunlu anerobların büyümesini sağlamak için anaerobik bir oda kullanılmalıdır. Oksijene maruz kalma bazı bağırsak bakteri popülasyonlarının ölümüne ve böylece, bakteri toplumunun değiştirilmesine yol açabilir, çünkü ikinci göz özellikle önemlidir. Buna ek olarak, ksenobiyotikler üst sindirim sisteminde metabolize edilir. Sonuç olarak, ksenobiyotikler ve alt sindirim sistemi mikrobiyota arasındaki etkileşimleri modelleme in vivo modelleme için önemli bir husustur.
Toplu fermantasyon deneyleri, ekonomik açıdan daha uygun ve kullanışlı oldukları için in vivo insan ve hayvan çalışmalarında açık avantajlara sahiptir. Ayrıca, onlar kznobiyotik maruziyete insan bağırsak mikrobiyota yanıtlarının bireysel varyasyon araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, toplu fermantasyon kolayca mikrobiyota toplulukları işlemek ve ilişkili metabolik fonksiyonlarını değerlendirmek için uygulanabilir. Ancak, toplu fermantasyon sistemleri statik durum dinamiklerinin sınırlama muzdarip. Gelecekteki araştırmalar, pH, sıcaklık ve peristalsisin dinamik modülasyonuna olanak sağlayan biyoreaktör chemostatlarını uygularken, sürekli besin kaynağı ve atıkların sürekli olarak uzaklaştırılmasını sağlayabilir. Bu tür faaliyetler deneylerin in vivo intestinal yollardan daha iyi taklit edilmesine ve toplu fermantasyon deneylerinden elde edilenleri tamamlamak için yeni içgörüler sağlamasına olanak sağlayacaktır. Toplu fermantasyon deneyleri ek bir sınırlama tüm mikrobiyom-konak doku etkileşimleri kaldırmak olduğunu. Bazı ksentobiyotikler (örneğin, metamfetamin) insan hücreleri ve bağırsak mikrobiyotası27tarafından birlikte metabolize edilebilir gibi bu, özellikle önemli bir göz olabilir. Ayrıca, son çalışmalar bağırsak metagenomu (GM) dolaylı olarak konak gen ekspresyonu düzenleme 8ile kksiz otobiyotik metabolizmayı düzenleyebilir göstermiştir .
Toplu fermantasyon sistemlerinin gelişmeler hala gerekli olmasına rağmen, bu sistemler yaygın ksenobiyotikler ve insan bağırsak mikrobiyota arasındaki etkileşimlerin yüksek iş ve hızlı tarama için kullanılabilir. Aktif insan bağırsak mikrobiyomlarında ksenobiyotik direnç ve metabolizmanın altında yatan mekanizmaların aydınlatılması, ilaç etkinliği ve toksisitede açıklanamayan hastadan hastaya varyasyonuna ilişkin önemli bilgiler sağlayacaktır8,9. Ayrıca, diyetler ve belirli gıda bileşenleri mikrobiyal metabolizmaları değiştirmek ve dolayısıyla etkisi konak sağlığı nasıl daha ayrıntılı bir anlayış mikrobiyota modülasyonu ile kişiselleştirilmiş tıp hedefini gerçekleştirmeyolunda ilk adımdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler. Rakamlar Yin ve ark belirtilmiştir. 11. Yıl.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31741109), Hunan Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2018JJ3200) ve Hunan Bilim ve Mühendislik Üniversitesi'nde uygulamalı karakteristik disiplinin yapı programı tarafından finanse edilmiştir. LetPub'a (www.letpub.com) bu makalenin hazırlanmasısırasındaki dilsel yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
