Summary
בשנת מבחנה הפלישה תא מתורבת משמש כדי למדוד את הפוטנציאל של גרורות סרטן על ידי כימות הפוטנציאל התאי עבור פלישה והגירה באמצעות התרבות תאים מוסיף חלבון מטריצה. התאים מאותגרים לעבור דרך מטריצת החלבונים וממברנה נקבובי, לכיוון מיקרוסטנט, ולאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ אור.
Abstract
שיטת הפלישה מחוץ למבחנה משתמשת במטריצה עשירה בחלבון בחדר Boyden כדי למדוד את היכולת של תאים מתורבתים לעבור דרך מטריקס וקרום נקבובי בתהליך הדומה לשלבים הראשוניים של גרורות בתאי סרטן. התאים נבדק ניתן לשנות עבור ביטוי הגנים או מטופלים עם מעכבי כדי לבדוק שינויים בפוטנציאל הפלישה. ניסוי זה בוחן את הפנוטיפ האגרסיבי של תאים סרטניים בפטמות העכבר כדי לגלות ולאפיין את אונגנים פוטנציאליים המעודדים הפלישה התא. טכניקה זו, לעומת זאת, יכולה להיות מגוונת ומותאמת ליישומים רבים ושונים. הניסוי עצמו יכול להיעשות ביום אחד והתוצאות נרכשים על ידי מיקרוסקופ קל בפחות מיום. התוצאות כוללות ספירות של מספר תאים פולשים להשוואה וניתוח. הבדיקה של הפלישה מחוץ לעולם היא שיטה מהירה, זולה, וברורה לחתוך לקביעת התנהגות התא בתרבות שניתן להשתמש בה כהערכה ראשונית לפני מעורב יותר vivo assays.
Introduction
שיטת הפלישה מחוץ למבחנה יכולה להיות כלי שימושי כאשר מדידת היכולת של התא לעבור דרך ממברנה מצופה חלבון, מקבילה לצעדים הראשונים גרורות. תכונה מפתח של תאים סרטניים ממאירים היא היכולת שלהם להגר דרך לפלוש רקמות סמוכות. סרטן שהתפשט או גרורות מהווה אתגרים טיפול יותר ויש לו שיעורי נמוך יותר של הישרדות ארוכת טווח, בעוד גידולים מקומיים קל יותר לטפל ויש להם שיעור גבוה יותר של הישרדות לטווח ארוך. על מנת גרורות, תאים סרטניים חייבים לעזוב את הגידול העיקרי להגר לתוך הדם או מערכת הלימפה, תהליך אשר דורש לעבור דרך מטריצה החילוץ וממברנה מרתף1. בתהליך שנקרא מעבר האפיתל mesenchymal (פרמדיק), את התאים הסרטניים חייבים לשבור את הקשר תא התא, להעביר מבחינה מבצעית, ולפלוש דם הסמוך או כלי הלימפה. הצעדים הראשוניים של המפל גרורות זה הם בעלי עניין רב מאז שלבים אלה הם מה שיכול להפוך סרטן קטלני. הגורמים הגנטיים והאפיגנטיים המעורבים בשלבים המוקדמים של גרורות הם המוקד של כמות גדולה של מחקר, אך כלים ניסיוניים מדויקים ואמינים נחוצים כדי לבדוק את הצעדים המוקדמים הללו הן בvivo והן בתחום החוץ.
כלים למדוד שינויים בהעברת תאים כגון ריפוי בפצע (שריטה) בחני או צמיחה בסביבות תלת-ממד כגון מראה רך אגר יכול באופן חלקי לענות על הצורך בשיטות ניסיוני של מדידת צעדים מוקדמים של גרורות, אבל הטיפול כדי למדוד הפלישה הוא מאתגרת יותר מאז התהליך מתרחשת בגוף בתוך מיקרוסביבה מורכבת הגידול. לצורך הקרנת תרופות או שינויים גנים כדי לקבוע גורמים חשובים בפלישה גרורות, מערכת שניתן להשתמש בתוך מבחנה עם תאים מתורבתים ולחקות את האתגרים הניצבים על ידי תאים גרורתי ב vivo היא האפשרות הפלישה2, 3. שלוש. סרטן השד הוא סוג הנפוץ ביותר של סרטן בנשים והגורם המוביל השני של מוות סרטן אצל נשים, כך הבנה הגנים האחראים לפלישה לסרטן השד וגרורות הוא חשוב באופן ביקורתי לבריאות הציבור. יתר על כן, תאי העכבר הם מערכת מודל שימושי ללמוד סרטן השד ההתקדמות שלה.
שיטת הפלישה החוץ גופית מבוססת על האסיפה קאמרית Boyden שבו שני התאים של התקשורת הצמיחה מופרדים על ידי קרום נקבובי3. כדי לחקות את מיקרוסביבה הגידול, ג'ל עשיר בחלבון נכלל גם בתאים נפרדים בחדר אחד מתוך כימוסטנט בשני ולשמש מחסום קרום המרתף. על מנת לעבור לכיוון הדרך, התאים חייבים תחילה לעבור דרך המכשול עשיר בחלבון ולאחר מכן לעבור דרך קרום נקבובי-תהליך הדומה כיצד תאים גרורתי להגר דרך משתית. ג'ל עשיר חלבון ניתן לשנות בהתבסס על הצרכים של הניסוי, אבל בדרך כלל מורכב קולגן, או תמצית קרום המרתף (למשל, מטריצות)4. זהו תערובת מורכבת של חלבונים, פרוטאוגליקנים וגורמי גדילה, אבל בעיקר מורכב של למינציה ו קולגן הרביעי 4,5. תאים לאחר מכן לעבור דרך קרום נקבובי בדרך כלל עשוי פוליקרבונט, פוליאסטר, או polyטטרפלואורואתילן (מצופה). ניתן לרכוש ממברנות מסחרית עם או בלי ג'ל חלבון (בדרך כלל collagens), או ג'ל ניתן לרכוש בנפרד והוסיף. גודל הנקבוביות ניתן לכוונן על בסיס גודל התא. בעוד גדלי נקבוביות זמינים מ 0.4-8.0 יקרומטר, רק נקבוביות מ 3.0-8.0 יקרומטר הם גדולים מספיק עבור הגירה תא. שיטת הפלישה שימש כדי לקבוע את האפקטיביות של מעכבי על היכולת של תאים להגר ולפלוש. בעוד המחסור המדויק הגידול מיקרוסביבה כי הוא קיים בvivo, שיטת הפלישה מחוץ למבחנה היא מועילה בסינון תנאים רבים תוך זמן קצר תוך מזעור הצורך מודלים בעלי חיים. המטרה של ניסויים אלה היא להשוות את הביטוי הגנטי של החשוד אונגנים ולקבוע את ההשפעות על התנהגות תא סרטן תוקפנות מחלה באמצעות שיטת הפלישה מחוץ למבחנה ובדיקות אחרות. באופן כללי, שיטת הפלישה מספקת תוצאות עקביות, כמותיים ומהירות לקביעת פוטנציאל גרורתי תוך היותו גם שיטה זולה, פשוטה וישימה באופן יחסי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים והשיטות בוצעו כפי שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת וילאנובה (IACUC).
1. ביטוי גנים בתוך מתורבת העכבר תאים סרטניים הגידול
- ראשית, הכן את קווי התא לבדיקה.
-
השתמש במושבה רבייה של עכברים BALB/cV. עכברים אלה לשאת את המתח balb/קורות חיים של וירוס גידול של חלב של העכבר, מועבר לגורים חלב6,7. 50 אחוזים של נקבות רבייה לפתח גידולים בחלב בגיל 10 חודשים.
- כדי ליצור קו תאי גידול, להקריב סכר שנושא גידול באמצעות פרוטוקול IACUC מאושר. משרים את עור הבטן ב-70% אטוח ומסירים את הגידול בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינארי. גידולים הם תת עורית, אז לדאוג כדי למנוע את הצפק.
- מקום שברי הגידול מאזורים שאינם נקרופטיים בצלחת פטרי עם כמות קטנה של תמיסת מלוחים הנקס סטרילי מאוזן (HBSS) והבשר מאוד דק עם סכין גילוח סטרילי.
- להעביר את הגושים תאים מפוזרים T25 התרבות התא בקבוקון המכיל 5 mL בינונית הנשר השתנה או DMEM (4.5 g/L גלוקוז, פנול אדום, ו-L-גלוטמין) שיושלם עם 50% העוברי שור סרום או FBS ו 1% אנטיביוטי/antimycotic פתרון. לגדול תאים בתוך מבחנות תרבות התא מטופלים בחממה עם 5% CO2 ו 100% לחות ב 37 ° c.
- לשטוף את התאים הלא מחסיד לאחר 24-48 h ולהחליף את DMEM עם 50% FBS ו 1% אנטיביוטיקה/פתרון antimycotic. . החזר את התאים לחממה
- החליפו מדיית תרבות נוזלית כל 3 ימים.
- פצל או מעבר את התאים כאשר הם 90% שוטפת. הסר מדיית תרבות ושטוף תאים מחסיד עם HBSS (ללא סידן או מגנזיום). מודדת תאים עם 0.25% טריפסין-EDTA פתרון עבור 1-5 דקות ב 37 ° צ' עד התאים מעוגלים ומנותקים. לדלל תאים 1:10 בתקשורת תרבות טרייה ולהוסיף בקבוקון חדש. בקבוקון תרבות תא T-25 מחייב 5-8 מ ל התרבות, 5 מ ל של HBSS לשטוף, ו 1 מ ל טריפסין-EDTA למעבר. . החזר את הבקבוקון לחממה
- הפחת את ריכוז ה-FBS ל 40% לאחר המעבר הראשון, ואז 30% אחרי המעבר השני, ואז 20% אחרי המעבר השלישי, ולבסוף 10% עבור כל המעברים הבאים. תהליך הקמת הצמיחה במדיום DMEM דיום סטנדרטי עם 10% FBS דורש ארבעה מעברים ו 2-8 חודשים.
-
לאחר שקווי התא (s) מבוססים, לשנות את הביטוי של החשוד אונגנים על ידי העברה של שרין מיקוד mRNA או CRISPR עבור גנים שאינם חיוניים.
- ליצור עמידות לאנטיביוטיקה עמידים בפני תאים עם שיבוטים בודדים אשר מאומתים על ידי כתם מערבי ו/או RT-qPCR לתוצאות עקביות, עם זאת, הטרנספנויות ארעי יכול לעבוד גם מאז הצורך רק דורש 22 h. בקרת קווי תא עם יש צורך גם ברצפי יעד שאינם ספציפיים.
2. שיטת הפלישה לחוץ-גופית
- לגדול חסיד בתאי הגידול הפטמות של העכבר בבקבוקון T25 עד 70-90% confluent עבור יום 1 של הניסוי.
הערה: קווי תאים אחרים או תנאים ניסיוניים עשויים לדרוש מדיית תרבות תא שונה. לדוגמה, אם הורמון מגיב בתאי סרטן השד נבדקים, הפחם מסוננים סרום עשוי להיות צורך להסיר תרכובות המפעילות אסטרוגן או קולטני הורמונים אחרים. - הכן את מוסיף קאמרית Boyden על ידי התחממות אותם לטמפרטורת החדר (מ-20 ° c אחסון) עבור כ 20 דקות במכסה של תרבות התא. מנע הפשרת מחזורי הקפאה עבור שימוש בתוספות. השתמש בשלוש הוספות (משכפל) כדי ליצור נתונים חוקיים מבחינה סטטיסטית עבור כל קו תא עבור כל ניסוי.
- הוסף טרום מחמם 37 ° c סרום בחינם מדיית DMEM הבאר ולאחר מכן את ההכנסה. עבור הוספות שתוכננו עבור 24-היטב מנות, להוסיף 500 μL של הסרום ללא הנסיוב dmem לבאר ולאחר מכן 500 μL של הסרום ללא הצורך להכניס את הקרום והג הנקבובי משני הצדדים.
הערה: עבור מוסיף גדול המיועדים עבור מאכל 6-היטב, השתמש 2 מ ל של DMEM ללא סרום משני הצדדים.
- הוסף טרום מחמם 37 ° c סרום בחינם מדיית DMEM הבאר ולאחר מכן את ההכנסה. עבור הוספות שתוכננו עבור 24-היטב מנות, להוסיף 500 μL של הסרום ללא הנסיוב dmem לבאר ולאחר מכן 500 μL של הסרום ללא הצורך להכניס את הקרום והג הנקבובי משני הצדדים.
- מניחים את הצלחת עם מוסיף לתוך החממה 37 התרבות של התאים ° c עם 5% CO2 ו 100% לחות עבור לפחות 2 h כדי מימה ביסודיות ו acclimate.
- הכן תאים על-ידי הסרת מדיית הצמיחה ושטיפה את התאים באמצעות 5 מ"ל HBSS.
- הסר את HBSS והוסף 1 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA פתרון עבור 1-5 דקות ב-37 ° צ' או עד שתאים מופיעים מעוגלים או מראים סימנים של ניתוק מהבקבוקון.
- הקש בעדינות על הבקבוקון כדי לנתק את כל התאים. השהה מחדש את התאים ב-5 מ ל של Dמאמ + 10% FBS והעבר לשפופרת צנטריפוגה סטרילית בעלת 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את התאים ב 1,000 x g עבור 5 דקות כדי לסדר את התאים בעדינות. הסר את המדיה והחלף עם DMEM של 5 mL כדי להשעות מחדש את התאים.
- חזור על הצנטריפוגה וההשעיה במדיה ללא סרום פעמיים יותר עבור סך של 3 שוטף.
- השהה מחדש ביסודיות את התאים ב -5 מ ל האחרון של DMEM ללא סרום וודא שאין גושים של תאים.
- לקבוע את ריכוז התא באמצעות הומוציטומטר. . תספור רק תאים שניתן לעשות לדלל את השעיית התא כדי 5 x 104 תאים/ml ב 5 מ ל של הסרום-dmem חינם.
הערה: ריכוז זה מניב 2,500 תאים לכל הוספה בצלחת של 24 שעות ביממה. מספר זה של תאים מספיק עבור תאים סרטניים אגרסיבי עם שיעור גבוה של הגירה ופלישה. שורות תא פחות אגרסיביות עשויות לדרוש תאים נוספים, עד 10,000 תאים לכל הוספה עבור התאים הנצפה. אם הפלישה התא מופחת צפוי, לשקול למקסם את התאים הפולשים על ידי הגדלת מספר התא. אם הפלישה לתא מוגברת צפוי, התחל עם פחות תאים. - הסר את הצלחת תרבות התא מהאינקובטור ומכניס בעדינות את המדיה מתוך ההוספה. הרם את התותב ושף את המדיה מבאר. לעבוד במהירות, להוסיף את כימוסטנט לתא התחתון. עבור מאכל 24-היטב, הוסף 750 μL של DMEM זיכרון עם 5% FBS.
- הצב את ההכנסה בבאר והוסף את התאים להוספה. עבור צלחת 24-היטב, השתמש 500 μL של השעיית תא. עבור הוספת הצלחת 6-היטב, השתמש 2.5 mL של כימוכ 2 מ ל של תאים. ודא כי לא קיימים בועות אוויר משני צדי הקרום.
- החזר את המנה לחממה לתרבות התאים במשך 22 שעות.
- לאחר 22 שעות, לתקן ולהכתים את התאים. הכינו פתרון של 1% פאראמפורמלדהיד בתמיסת מלח באגירה בגודל 1x (PBS) עבור קיבעון.
- בצלחת נקייה 24 היטב של תרבות התא, להוסיף 1 mL של קבע בארות בודדות כך יש אחד טוב עבור כל הוספה.
- להכין את הפתרון מכתים (טרי עשוי) של 0.1% קריסטל סגול (w/v) בתמיסה של PBS עם 10% אתנול (v/v). באופן דומה, להוסיף 1 מ ל של פתרון הצביעת לבאר נקי בצלחת התרבות 24 היטב עבור כל הוספה.
- הסר כל אחד הוספת אחת בכל פעם עם מלקחיים ולמקם משטח כותנה סטרילי בתוך הכנס לנקות את הצד העליון של הקרום כדי להסיר תאים שהועברו.
- . אני חוזר עם דגימה מכותנה נוספת הקרום חזק למדי, כל כך עדין לחץ בזמן שווינג אינו מסכן את שלמות הקרום.
- הסר את כל המדיה הנותרת מתוך החלק הפנימי של ההוספה והוסף 750 μL של PBS כדי לשטוף את התאים המנותקים.
- . הסירו את הערוץ וחזרו על הכביסה מניחים את התותב לתוך היטב המכיל תיקון כדי לתקן את התאים שהועברו בצד התחתון של הקרום. חזור על הפעולה עבור כל התוספות.
- תקן את התוספות עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הקיבעון הבא מסיר את ההוספה. שטוף שוב את ההוספה עם 750 μL PBS.
- מניחים את התותב לתוך הבאר עם פתרון הכתמים כדי להכתים את כל התאים הועברו וקבוע. הכתם את התאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: עבור 6-היטב מוסיף, השתמש 2 מ ל של פתרון קבע, 2 ml כתמים פתרון, ו 2 מ ל כביסה PBS.
- השתמש בגביע עם מים מזוקקים כדי להכתים את התוספות. הסר את התוספות וטבול לתוך המים המזוקקת עד שהמים הזורמים מההוספה ברורים.
- הסירו את טיפות המים העודפות והניחו את התוספות על נייר סינון צדדי לאוויר יבש (בדרך כלל בן לילה).
- הכן את קרום להדמיה על ידי תיוג מיקרוסקופ זכוכית נקייה שקופית עבור כל הוספת ומקום טיפה קטנה של שמן טבילה מיקרוסקופ במרכז השקופית.
- ניתוק הקרום מתוך התותב באמצעות אזמל לחתוך סביב היקף הקרום על החלק הפנימי של הוספת פלסטיק.
- להסיר את הקרום באמצעות מלקחיים ומקום על החלק העליון של טיפת השמן על השקופית כדי להחזיק אותו במקום.
הערה: הקרומים דקים מאוד ומאוד קלים, כך שניתן לאבד אותם בקלות באמצעות זרימת אוויר עדינה.
3. דימות וניתוח
- כיוון שהממברנות הנקבוביות ברורות ומכתימה תאים עם גביש סגול מעניקים להן ניגוד, השתמשו במיקרוסקופ אור מורכב כדי לראות את התאים. השתמש מצלמה ו/או תוכנה לכמת עבור דגימות רבות, אך אינו הכרחי. הצגת תאים בהגדלה של 5x, 10x או 20x. לקוונפיקציה, השתמשו במספר תמונות שאינן חופפות בהגדלה של 10x. לחלופין, ספור את כל התאים שהועברו על הקרום בהגדלה של 10 x.
- לקבוע את המספר הכולל של תאים הפולש או תאים לכל אזור עבור כל הדגימות. עבור כל ניסוי, בצע כל תנאי בתוך הבחינה עם שלושה מוסיף שכפול וחזור על מספר פעמים על תוצאות מועילות מבחינה סטטיסטית.
- בעת השוואת קווי תאים שונים עם קצבי צמיחה וקצבי הגירה שונים, בצע ניסוי מקביל להשוואת תאים הפולשים דרך מטריצת חלבון ומשווים להרכבה קאמרית של Boyden ללא מטריצת חלבונים (תאים שהועברו בלבד). חישוב אחוז הפלישה עבור כל קו תא (מספר התאים פלשו/מספר תאים שהועברו x 100%).
הערה: גישה זו יכולה לסייע בהשוואת שיעור הפלישה לתעריפי ההגירה. אם השוואת תנאים שונים המוחלים על אותו קו תא, חישוב הפלישה בלבד הוא חישובים רלוונטיים יותר. הקצה החיצוני של הקרום לפעמים יש מספר גבוה יותר של תאים מאשר האזורים המרכזיים, ולכן, פחות מדויק. אם זה קורה, להוציא את התאים האלה מן הכמת ולוודא שכל התאים יוסרו על ידי מסיר כותנה בניסוי חוזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו של הפלישה מבחנה באמצעות מטריצת חלבון שימש כדי להעריך את פנוטיפים אגרסיבי והתנהגויות תא אונגניים של העכבר בתאי גידול בחלב עם ביטוי שונה של חלבון האצבע אבץ ZC3H88. בשילוב עם גישות אחרות אשר גם לבחון את הגירה התא ואת הצמיחה בסביבות תלת-ממד, זה נמצא כי רמות גבוהות יותר של ביטוי של Zc3h8 בקווי הגידול תאים, או על ידי ביטוי היזם-מתווך מפלביניים, הביא שיעורי תא מהיר התפשטות, הגירה מהירה, צמיחה בסביבות תלת-ממד, ומוגברת הפלישה בשנת הפלישה מחוץ למבחנה8. לעומת זאת, ירידה בביטוי על-ידי מבנה מרין הביא להפצה אגרסיבית פחות, הגירה ופלישה8. תוצאות אלה אושרו בvivo שבו ביטוי גבוה יותר של Zc3h8 המיוצר גידולים גדולים שהופיעו במהירות, בעוד ירד ביטוי הפיק פחות גידולים שהיו קטנים יותר ותכופים פחות8.
כדי להרחיב את העבודה הזאת, ביטוי פלמידים שיכולים להציל את שרין מתווכת מZc3h8 ביטוי באופן מאוד מנוכר בתאי הפטמות של העכבר כדי להעריך אם צמיחת תאים אגרסיביים התנהגות יכול להיות מתחדשת בתאים אלה. כל הנוק-אין והצלה של ביטויים אומתו על ידי הכתם המערבי או RT-qPCR8. שיטת הפלישה שימש עם 5,000 תאים לכל חדר בצלחת 24-טוב ומתועד עם תצלומים כפי שמוצג באיור 1 ואיור 2. איור 3 מראה את התוצאות של שיטת הפלישה המדגימה כיצד הפלישה התאים ירדו על משאת מZc3h8 ביטוי של הביטוי, אבל הפלישה היא הצילה כאשר הביטוי הוא חולץ. נתונים אלה מראים כי שיטת הפלישה יכולה לספק שיטה מהירה לבדיקת קווי התאים בחוץ לפני היציאה לגישות יקרות יותר וארוכות יותר.
איור 1: שיטת הפלישה רכיבים. (א) בוידן בחדר הכנסת לצלחת תרבות של 24 רקמה. (ב) מאכל ששימש לקיבוע רקמות ברקמה 24 שעות ביממה, המשמש לקיבעון, כתמים וכביסה לאחר הדגירה של 22 התאים. מספרים 1, 2 ו-3 הם שכפול של קו תא יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
דמות 2: שיטת הפלישה תרשים זרימה עם סרגל הזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדגם הפלישה לדוגמה תוצאות של תאים סרטניים בפטמות של העכבר שונה עבור ביטוי של Zc3h8, אשר משנה את הפנוטיפים אונגניים. (א, ב) תאים בודדים מתוך גידולים בחלב העכבר היו מנוכר באופן מתון עם מיקוד של שליטה ברצף של mRNA או מיקוד Zc3h8 mRNA. (ג) קו התא המאוחר חולץ לאחר מכן על ידי ביטוי רקומביננטי Zc3h8 תוכנן להיות מושפע על ידי שרין. התאים מוכתמים בגביש סגול ונלכדים בהגדלה של 10x בעזרת מיקרוסקופ קל. סרגל קנה מידה = 500 μm. (ד) קוונפיקציה מראה כי ביטוי מופחת של Zc3h8 ירד מספר התאים הפולשים ואת הפוטנציאל גרורות. הצלה של ביטוי גנים מצילה שיעור גבוה יותר של הפלישה התא. הערכים מייצגים את המספר הכולל של תאים פולשים מתוך הוספת שיטת הפלישה היטב 24. עבור כל שכפול בניסוי, חישוב המספר הממוצע של תאים פולשים. זה חזר על עצמו לשלושה ניסויים. קווי שגיאה מציינים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת הפלישה לחוץ-גופית היא שיטה זולה, מהירה, כמותית וישירה לחקר הגורמים המקדמים את הפלישה לתא הסרטן. סרטן השד הוא הסרטן השכיח ביותר בקרב נשים. של שלושת סוגי המשנה העיקריים של סרטן השד, משולש שלילי, (או ER-,PR-, HER2/או-), הוא אגרסיבי ביותר, קרוב לוודאי גרורות, ואת הקטלנית ביותר9. לכן, הבנת הגנים והביטוי הנובעים גרורות יכול לעזור למצוא מטרות טיפוליות חדשות סמנים גנטיים עבור המחלה. בעוד רבים של גנים החשובים עבור הפלישה לתא סרטן גרורות זוהו מאופיין, ביטוי רמות הפעילות של הנהגים גרורות נגד גרורות דכאי עשוי להיות היבט קריטי של התקדמות המחלה9, . בסדר, עשר
מעבר לביטוי הגנים, שיטת הפלישה לחוץ-גופית הייתה גם בשימוש כדי ללמוד את תפקידה של מיקרואורנה ומחוקקים אחרים בקידום או מניעת הפלישה לתאי סרטן11,12. בשיטת הגדרת הפלישה למבחנה ניתן להשתמש למחקר של מעכבי, מרובת תאים בסביבות גידול סוג, CRISPR בעריכה תאים, או לטווח קצר שינויים בסביבות צמיחה תאית. צדדיות והסתגלות להפוך את היכולת הזאת יתרון מאוד.
שיטת הפלישה ניתן להשתמש בשלב הראשון בניתוח של גנים וגורמים שתורמים או למנוע התקדמות הגידול. למשל, יאן ואח ' (2010) השתמשו בפלישה מחוץ לתחום מבחנה כדי להגדיר את התפקיד של טה-3 בדיכוי את החובש על ידי הסרטן האגרסיבי ביותר התאים הסרטניים מד א-בתים 23113. לאחר מכן הם הצליחו להראות כי בקורלציה זו הדיכוי עם יכולת ירידה ליצור גרורות ב vivo בתוך שיטת13. אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות יכול להיות מאופיין בתחילה על ידי היכולת של מעכבי מסלול כדי להגביל את הפלישה דרך מטריצות, גם הקשורות עם ההשפעה של מעכבי אלה על היווצרות הגידול במודלים בעלי חיים. ניתן להשתמש בשיטת הפלישה לחוץ-גופית לניתוח מעמיק יותר של אונגנים מוכרים ופוטנציאלים ושותפים לאינטראקציה. לדוגמה, ניתוח מולקולרי של מוטיבים פונקציונליים מוכרים של אונקופרוטאין או ניתוח מהיר של מוטציות ניתן לעשות עם שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמסך הראשונית או הערכה של משמעות. זה יכול לספק תובנה רבת ערך לתחומים קריטיים, כמו גם הבנה תפקודית של פנוטיפים התא ברמה המולקולרית.
בעוד שלאולם הפלישה של בוידן יש יתרונות רבים, יש הגבלות. למשל, שיטת הפלישה רק מסתכל על חוסר התקדמות, אחד השלבים הראשוניים של גרורות, אבל לא את השלבים המאוחרים כאשר תאים סרטניים ליישב מיקומים משניים. לכן, ניתן להסיק רק תצוגה חלקית של פוטנציאל גרורות. אורך 22 h של השינוי, בעוד גמיש, לא יכול לכלול חלק מחלוקת התא שיכול להטות שינויים עדינים במדידת הפלישה של אוכלוסיות של תאים אסינכרוניים. מעכבי כגון מיטומיצין C ניתן להשתמש כדי למנוע את חלוקת התא במקרה של תאים צלילה במהירות. לבסוף, השימוש 5% FBS פתרון עבור כימוטקוניות יהיה באיטיות לפזר לאורך זמן ומשקל בין העליון והתחתון. צפיפות ג'ל החלבון מאיטה את הדיפוזיה ומציגה את התאים באמצעות האפשרות של הגירה לרוחב הג והקרום (הפלומטוניות) או דרך מטריצת החלבון ודרך הנקבוביות לעבר ריכוזים גבוהים יותר של FBS (כימוטקסיס). כימוטרמוניות חלופיים יכולים להיות החליף או קצבאות זמן קצר יותר עבור הפלישה יכול לשמש כדי למדוד רק את התאים שפלשו לפני השפה. זה הגמישות, לא קשיחות, של שיטת הפלישה מחוץ למבחנה המאפשרת התאמה אישית שהופכת את הצורך הזה לשימושי כל כך. עיבודים עתידיים של שיטת זה כוללים הקרנת בקנה מידה גדול של תרכובות, ביטוי גנים שינויים, והערכה של אפקטיביות תרופה ספציפית allele. יתר על כן, מערכת קאמרית כפולה עם מדיה במחזור יכול לאתגר את התאים כדי לפלוש דרך מטריצת חלבון, לחצות את הסביבה הנוזלית, וליצור מחדש על מטריצת חלבון שנייה במיקום משני. לבסוף, ממברנה מאתגרת יותר ניתן להשתמש עם מערכת הפלישה מחוץ למערכת כגון מונאולייר של תאים פולשני כי יהיה קשה יותר תאים סרטניים לחצות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי גרנט R15CA169978 מן המכונים הלאומיים לבריאות. מימון נוסף הגיע מאוניברסיטת וילאנובה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y.
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. Cancer Research. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), pii: BSR20180571 (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
