Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Мониторинг в режиме реального времени миграции клеток глиомы человека на dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

Здесь мы представляем экс-виво смешанной монослойной системы культуры для изучения миграции клеток глиомы человека (hGC) в режиме реального времени. Эта модель обеспечивает возможность наблюдать взаимодействия между hGCs и как миелинированных, так и немиелинированных аксонов в разрозненных камерах.

Abstract

Глиобластома является одним из самых агрессивных видов рака человека из-за обширной клеточной неоднородности и миграционных свойств ГГК. Для того, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе миграции клеток глиомы, способность изучать взаимодействие между HGCs и аксонами в микроокружении опухоли имеет важное значение. Для того, чтобы смоделировать это клеточное взаимодействие, мы разработали смешанную систему культуры, состоящую из hGCs и дорсальных корней ганглиев (DRG) аксон-олигодендроцитов кокультур. Культуры DRG были выбраны потому что они могут быть изолированы эффективно и могут сформировать длинние, обширные прогнозы которые идеально для изучений переселения такого характера. Очищенные крысиные олигодендроциты затем добавлялись на очищенные крысиные аксоны DRG и индуцировали в миелинат. После подтверждения образования компактного миелина, HGCs были, наконец, добавлены к совместной культуре и их взаимодействия с аксонами DRG и олигодендроцитов был проверен в режиме реального времени с помощью замедленной микроскопии. В этих условиях, hGCs образуют опухолевые агрегатные структуры, которые выражают GFAP и Ki67, мигрируют по миелинизированным и немиелинированным аксональным следам и взаимодействуют с этими аксонами через образование псевдоподии. Наша система совместной культуры ex vivo может быть использована для выявления новых клеточных и молекулярных механизмов миграции hGC и потенциально может быть использована для тестирования эффективности препарата in vitro.

Introduction

Глиобластома является одной из самых агрессивных и смертельных опухолей человеческого мозга. Текущий стандарт ухода включает в себя хирургическую резекцию опухоли с последующим излучением1 плюс сопутствующим и адъювантным введением темозоломида2. Даже при таком мультитерапевтическом подходе, рецидив опухоли неизбежен3. Отчасти это связано с обширным миграционным характером опухолевых клеток, которые вторгаются в мозг паренхимы, создавая несколько пальцев, как прогнозы в головном мозге4, которые делают полную резекцию маловероятно.

В последние годы стало очевидно, что агрессивность глиобластомы обусловлена, в частности, наличием популяции раковых стволовых клеток в пределах опухолевой массы5,6, которые обладают высоким миграционным потенциалом7,8,устойчивостью к химиотерапии и радиации9,10 и способности формировать вторичные опухоли11. ГСК способны подвешивать оригинальные поликлональные опухоли при ксенотрансплантации обнаженным мышам5.

Несмотря на богатство знаний о генетическом фоне глиобластом, исследования миграции клеток глиомы (GC) в настоящее время сдерживаются отсутствием эффективных моделей миграции in vitro или in vivo. Примечательно, что в то время как глиома клеточных аксональных взаимодействий модулируется клеточных и экологических факторов являются основным компонентом вторжения глиомы, насколько нам известно, в настоящее время нет экспериментальной системы с возможностью моделирования этих взаимодействий12,13,14. Для устранения этого дефицита, мы разработали систему культуры ex vivo первичных hGCs совместно с очищенными DRG аксон-олигодендроциты, что приводит к повышенному выражению дифференцированных маркеров опухоли, а также обширной миграции и взаимодействия ГГК с миелинированными и немиелинированными волокнами. Эта платформа ex vivo, благодаря своей разобщенной планировке, подходит для тестирования влияния новых терапевтических препаратов на модели миграции hGC.,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протоколы сбора, изоляции и распространения клеток глиомы человека, полученных от пациента, были одобрены комитетом IRB больницы Род-Айленда. Все животные содержались в соответствии с руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Все протоколы использования животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию больницы Род-Айленда.

1. Подготовка средств массовой информации и буфера

  1. Подготовка 50 мл нейросферы СМИ: 1x Нейрональных базальных средних ж / о витамина А, 1x сыворотки бесплатно дополнение w/o витамина А, 2 мМ L-глютамин, 20 нг /мл эпидермального фактора роста (EGF), 20 нг/мл базового фибробластного фактора роста (FGF), 2 мкг /мЛ гепарина, и 1 антибиотик-антиантианти-анти-анти-антико).
  2. Подготовка 50 мл дополненной нейрональной базальной среды: 1x Нейрональной базальной среды, 1x безсыворотки, 4 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамина, и 50 нг/мл фактор роста нерва (NGF).
  3. Подготовка 500 мл N2B2 Средний: 1:1 Dulbecco в модифицированных Eagle Medium-Ham's F12 питательные смеси (DMEM-F12), 1x Инсулин-Трансферин-Селений (ITS-G), 66 мг/мл бычьей сыворотки альбумина (BSA), 0,1 мг/млин, 0,01 мг/мл биотин, 6,29 мг/мл прогестерона, 5 мкг/мЛ N-ацетил-L-цистин (NAC), и 1 мМ putriscine. Aliquot и заморозить при -20 градусах по Цельсию.
  4. Подготовка 500 мл C-Medium: 1x Минимальная основная среда (MEM), D-глюкоза (окончательный 4 г/л), 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), и 2 мм L-глутамин. Aliquot и заморозить при -20 градусах по Цельсию. Добавить фактор роста нерва (NGF) свежие перед использованием (50 нг/мл).
  5. Подготовка 200 мл Papain Буфер: 1x Эрл сбалансированное решение соли (EBSS), 100 мМ Mg2SO4, 30% Глюкоза, 0,25 M EGTA, и 1 M NaHCO3.
  6. Подготовьте 10 мл DMEM-ITS-G Medium: 1x DMEM, 0.5% BSA и 1x ITS-G.
  7. Подготовка 200 мл PB буфера: 1x Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS) без Ca2 "и Mg2" и 0,5% BSA. Дега буфер перед использованием и держать на льду.

2. Изоляция и культура нейросфер стволовых клеток глиомы

  1. Изоляция нейросфер
    1. Соберите IRB утвержденных и пациент согласился свежей человеческой глиобластомы (GBM) ткани из операционной. Передача образцов GBM на льду в DPBS, содержащий 2x анти-анти в BL2 сертифицированный шкаф биологической безопасности.
    2. Перенесите один 1 см3 ГБМ образца с минимальным некрозом или загрязнением красных кровяных телец на 60 мм пластины и нарезать 1 мм3 фрагмента; удалить излишки DPBS.
    3. Переварить ткань с 5 мл коллагеназа / диспази (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию и осторожно закружить блюдо каждые 5-10 минут.
    4. Перенесите переваренные фрагменты в трубку 50 мл и тритурируйте путем трубопроката с 10 мл пипетки несколько раз, чтобы разъединить ткани.
    5. Добавить равный объем нейросферы СМИ и тритурировать ткани снова; позволяет большие фрагменты, чтобы осесть.
    6. Удалите носители без фрагментов ткани и медленно пройдите через 70-мкм-ситечко, помещенное на свежую трубку 50 мл.
    7. Повторите шаги 2.1.5-2.1.6 до тех пор, пока вся ткань не будет разобщена, изменив при необходимости клеточный ситечко.
    8. Спин клеточной подвески на 110 х г в течение 10 мин.
    9. Удалите супернатант и resuspend гранулы в 10 мл ACK lysing буфера для удаления загрязнения красных кровяных клеток. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    10. Спин клеточной подвески на 110 х г в течение 5 мин.
    11. Удалите супернатант и resuspend клеток в 10 мл нейросферы СМИ. Возьмите 10 зл и севена клетки и разбавьте с 10 зл и синего трипана. Подсчитайте 10 кЛ клеточной подвески с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоситометра и пластины в 10 мл нейросферных носителей при плотности 3 х 106 ячеек в 100 мм подвесной культуре пластин.
    12. Добавьте 2 мл свежего нейросферного медиа в культуру 2-3 раза в неделю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейросферы будут формироваться в подвеске в течение 3-4 недель. После субкультирования в 2-4 раза, подтвердить стебель через ограничение разбавления анализ и перепросмотра опухоли через ксенографическую трансплантацию у мышей с ослабленным иммунитетом, как ранее описано 22.
  2. Субкультивирование нейросфер
    1. Когда сферы образуются и достигают диаметра от 200-500 мкм, перенесите нейросферы в трубку 15 мл и вращайтесь при 110 х г в течение 5 мин.
    2. Приостановить нейросферы в 1 мл предварительно подогретого раствора отслоения клеток.
    3. Переложить на трубку 1,5 мл и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
    4. Установите пипетку P200 до 150 л и тритурируйте, прокладывая вверх и вниз, чтобы разъединить нейросферы.
    5. Перенос разъединенных ячеек в трубку 15 мл. Добавьте 4 мл нейросферных медиа и вращайтесь при 300 х г в течение 5 мин.
    6. Удалите супернатант и resuspend клеток в 5 мл нейросферы СМИ. Возьмите 10 зл и севена клетки и разбавьте с 10 зл и синего трипана. Подсчитайте 10 л клеточной подвески с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоситометра и пластины при плотности 1 х 106 ячеек/60 мм в окончательном объеме 4 мл.
    7. Освежать медиа 2 раза в неделю и клетки субкультуры по мере необходимости. Заморозить целые нейросферы при желании в нейронных базальных средств массовой информации ж / о витамина А дополнил 10% DMSO. Нейросферы могут быть использованы для экспериментов после P4.

3. Сравнителая культура Крысиных Корневых Ганглий (DRGs), олигодендроцитов (ОПК) и hGCs

  1. Приготовление разрозненных культурных блюд
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги за несколько дней до запланированного урожая DRGs.
    1. Соберите разрозненные блюда культуры.
    2. Разбавить раствор коллагена до 500 мкг/мл в стерильной дистиллированной H2O; тщательно перемешать.
    3. С помощью стерильной трансферной пипетки заполните 35-мм культовое блюдо 2 мл коллагенового раствора; удалить раствор, оставив тонкую пленку коллагена позади и поместите его в следующий 35 мм блюдо. Повторите этот процесс, добавляя больше раствора коллагена по мере необходимости, пока все блюда не будут покрыты.
    4. После того, как все пластины покрыты, поместите пластины в 245 мм х 245 мм культуры лоток и лежали три 1 мм х 1 мм марлевые колодки в центре лотка.
    5. Для полимеризации коллагена, мокрые марлевые колодки с 1 мл концентрированного гидроксида аммония и накройте лотки в течение 15 минут.
    6. Удалите марлевые прокладки и дайте 35-миллиметровой посуде высохнуть в ламинарном капоте.
    7. Пока посуда сушат, загрузите бочку смазки шприцев с высоким вакуумным жиром. Поместите разрозненные камеры в большую бутылку рот сми заполнены дистиллированной водой. Стерилизовать как путем автоклавирования и дать остыть.
    8. Файл от точки 18-G иглы, чтобы сделать тупой отзыв. Стерилизовать в 70% этанола. Прикрепите иглу к смазке шприца.
    9. Стерилизовать булавку грабли, замачивая в 70% этанола; дайте ему высушить воздух в ламинарном капоте.
    10. Снимите крышку с сухой коллагеновой тарелки с покрытием 35 мм. Держите блюдо между большим и указательным пальцем. Держите булавку грабли с другой стороны. Применяйте твердое давление, чтобы создать даже 200 мкм широкие царапины по центру блюда.
    11. Используя пастбище пипетка, поместите две капли дополненного нейронального базального среднего в центре царапин.
    12. Повторите шаги 3.1.10-3.1.11 до тех пор, пока все блюда не будут поцарапаны.
    13. Высушите разрозненные камеры в ламинарном капоте.
    14. С стерильных гемостатических щипц, схватить одну разделенную камеру центральным разделителем. Переверните гемостатические щипцы, чтобы нижняя часть камеры оказалась вверх.
    15. Нанесите силиконовую смазку на разрозненные камеры, начиная с верхней части. Убедитесь, что смазка помещается аккуратно и перекрывается на всех углах.
    16. Снимите крышку с 35-мм тарелки. Перевернуть блюдо и поместить царапины над камерой. Нажмите вниз на нижней части пластины осторожно с парой щипкетов.
    17. Аккуратно переверните тарелку с помощью гемостатических щиптов. Отпустите щипки.
    18. Поместите насыпь смазки у основания центрального отсека. Заполните каждую камеру с дополненной нейрональной базальной среды (NB) и проверить на наличие утечек. Уплотнение протекает с силиконовой смазкой по мере необходимости.
    19. Продолжить сборку всех культурных блюд и хранить на ночь на 37 ", 5% CO2.
  2. Изоляция rat DRG Нейронов и культуры в сравнительной камере
    1. Пожертвуйте приурочен беременных E16 Sprague-Dawley крысы CO2 удушья или химической передозировки.
    2. Поместите животное в положение на спине на чистую поверхность; дезинфекции брюшной полости с 70% этанола.
    3. Возьмитесь за кожу нижней части живота с помощью щипков и осторожно поднимите.
    4. Используя ножницы, сделайте разрез «Я» вдоль средней линии животного, заботясь о том, чтобы не проколоть мышцы брюшной стенки.
    5. С чистой парой щипцы, схватить мышечную стенку и сделать поперечный разрез с чистой парой ножниц, используя осторожность, чтобы не проколоть матку или кишечник.
    6. С парой тупых щипц, схватить матку и осторожно поднять прямо из перитонеальной полости.
    7. Используя свежие, стерильные ножницы, обкрепите соединительную ткань у основания каждого рога матки.
    8. Поместите всю матку в стерильное блюдо культуры тканей объемом 100 мм.
    9. Носите матку к ламинарной капоте потока для вскрытия.
    10. Удалить эмбрионы из матки, по одному, путем отсечения через амниотический мешок и осторожно дразнить эмбриона и в 60 мм блюдо, содержащее 5 мл L-15 с 1x перо-стрепы.
    11. С тонкими щипками, поместите 3-4 эмбриона в 60 мм блюдо, содержащее 5 мл L-15 с 1x перо-стрептококк.
    12. Работая под рассекающимся микроскопом и с одним эмбрионом за один раз, эвтаназии путем обезглавливания.
    13. Лягте на вентральную сторону эмбриона вверх и удалите конечности и хвост.
    14. С тонкими щипками, сделать разрез средней линии в животном.
    15. Удалить внутренние органы и ткани, чтобы разоблачить спинной структуры, особенно спинного мозга, которые должны быть видны по завершении.
    16. Поместите одно лезвие микро-расчленяющих ножниц между позвоночником и позвоночным каналом и тщательно прорежьте позвоночный столб, чтобы разоблачить спинной мозг. Позаботьтесь, чтобы не клип через спинной мозг.
    17. С помощью тонких щипц, слегка схватить ростальный конец спинного мозга и медленно поднять из эмбриона. DRGs будут прикреплены к спинному мозгу.
    18. Передача спинного мозга и прилагается DRGs на 35 мм блюдо, содержащее 2 мл L-15 с 1x перо-стрептококк. Место на льду.
    19. После того, как все спинные мозги были изолированы, используйте тонкие щипцы, чтобы индивидуально сорвать DRGs из спинного мозга. Поместите DRGs в свежее 35-мм блюдо.
    20. Если нервные корни присутствуют на DRGs, клип их прочь.
    21. Удалить готовые 35 мм блюда из 37 кв,C, 5% CO2 инкубатора. Удалите носители с предыдущего дня. Поместите 80 зл и содержание дополненных нейрональных базальных носителей (NBF), содержащих 10 мкм 5-флуоро-2'-deoxyuridine (FUDR) в центральном отсеке и 250 л носителей в каждом внешнем отсеке.
    22. Поместите 2 ганглии в каждом центральном отсеке. Вернуть блюда в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
    23. На следующий день добавить 2,5 мл NBF.
    24. Кормите культуры, следующие по расписанию в таблице 1,изменяя график на основе дня, выбранного для начала подготовки DRG.
    25. На 21 день (или когда аксоны достигают конца дистальных отсеков), либо семенные культуры с нейросферой GBM (Продолжить шаг 3.2.26) и живой образ или миелинат культур с культурами олигодендроцитов (Приступить к шагу 3.3), а затем семена с GBM нейросферы после миелинации.
    26. Замените дополненный NB Medium в каждой дистальной разрозненных камерах, которая будет посеяна с нейросферой GBM с дополненной NB Medium, содержащей 10% FBS.
    27. С пипеткой P20, установленной на 10 зл,удалите одну нейросферу ГБМ из блюда культуры. Нейросфера ГБМ должна измерять размер около 200 микрон.
    28. Поместите кончик пипетки в дистальную камеру и медленно изгоните нейросферу ГБМ, чтобы она мягко упала на аксоны в той части дистальной камеры, которая находится ближе всего к центральной камере, над аксонами возле центральной камеры. Будьте осторожны, чтобы не позволить пипетке наконечник нарушить аксоны.
    29. Оставьте культуру в шкафу биобезопасности на 1 ч при комнатной температуре, чтобы позволить нейросфере GBM прикрепить.
    30. После того, как нейросфера прикрепляется, очень тщательно заменить средства массовой информации в дистальном отсеке с дополненной NB Medium.
    31. Live культур изображения в течение 3-7 дней, добавив средства массовой информации по мере необходимости. В этом случае контролируемый корпус живых клеток CO2, прикрепленный к микроскопу (например, «Зейсс Аксиоверт»), использовался для непрерывного мониторинга миграции клеток в течение 7 дней с помощью яркого поля. Изображения были приобретены каждые 10 минут с помощью связанного с ним программного обеспечения. Повторите тот же протокол с помощью hGCs, которые были застыл, чтобы выразить GFP и изображения были захвачены с помощью комбинации яркого поля и 488 нм лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейросферы могут быть транс-инфицированы с лентивирусом или трансфицированы плазмидов или siRNAs. Сравнения также могут рассматриваться с желаемыми мелкими ингибиторами молекулы для изучения миграции.
  3. Миелинация DRG Аксонс с олигодендроцитами
    1. Накануне изоляции олигодендроцитов, заменить NB Medium в DRGs с C-Medium.
    2. Перед вскрытием поместите 10 мл папейнского буфера в 60-мм блюдо в инкубаторе, чтобы уравновесить.
    3. В ламинаре поток капот, заполнить один 100 мм блюдо и один 60 мм блюдо с ледяной HBSS. Место на льду.
    4. Пожертвуйте p2 крысиный щенка обезглавливанием. Удалите кожу ножницами. После того, как кожа удаляется, вырезать череп вдоль средней линии с парой тонких ножниц.
    5. Аккуратно удалите череп мелкими щипками. С помощью шпателя, аккуратно зачерпнуть мозг из нижней части черепа и передать перевернутой ткани культуры пластины крышкой.
    6. Удалить мозжечок и разделить головной мозг на два полушария головного мозга. Удалите обонятельные луковицы, гиппокамп и базальные ганглии ниже коры головного мозга каждого полушария. Поместите кору головного мозга в 100-мм тарелку, содержащую HBSS. Повторите шаги 3.3.4-3.3.6 для остальных животных.
    7. Работая с одной коры в то время, удалить олени с тонкой щипцы Дюмон. Поместите все кортики без оленя в свежие 60-мм блюда с HBSS.
    8. Нарезать корковой тканью на 1 мм3 кусочками. Место на льду.
    9. Поместите уравновешённый Папейн Буфер в трубку 15 мл. Добавьте 200 единиц папаина и 2 мг L-цистеина. Фильтр стерилизовать и добавить 200 л стерильных DNase I.
    10. Удалить HBSS из кубиками ткани мозга и заменить Папаин буфер от 3.3.2. Поместите блюдо в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор в течение 80 минут, осторожно встряхивая каждые 15 минут.
    11. Перенесите переваренные ткани в трубку 50 мл и добавьте 2 мл C-среднего.
    12. Тритурет с серологической пипеткой 5 мл для разъединить ткани; позволяют более крупным частям ткани оседать. Удалить супернатант и поместить в стерильную трубку 15 мл.
    13. Добавьте 2 мл C-Medium и повторите тритурацию с серологическим пипеткой 5 мл еще раз. Переключитесь на наконечник пипетки 1 мл и стриметитесь до полного разобщены ткани. Перенесите на трубку 15 мл.
    14. Закрутите трехугольную ткань при 300 х г в течение 15 мин. Тщательно удалите супернатант и отдохните гранулы в 8 мл DMEM-ITS-G Medium.
    15. Предварительно промокните стерильную 30 мкм-ситечко с 2 мл PB Buffer. Поместите ситечко на трубку 50 мл и отфильтруйте суспензию ячейки 1 мл за один раз. Промыть фильтр с 5 мл PB буфера.
    16. Перенесите суспензию клетки на бактериологическую пластину калибра 100 мм; инкубировать в течение 15 минут в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор, чтобы микроглии прикрепить.
    17. Удалите носители и поместите в трубку 15 мл. Аккуратно промыть тарелку 2 мл среды DMEM-ITS-G и переложить на трубку 15 мл.
    18. Аккуратно приостановите суспензию клеток. Возьмите 10 л клеточной суспензии и разбавьте 10 л трипан синего цвета. Подсчитайте 10 л клеточной подвески с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоситометра.
    19. Спин клеточной подвески на 300 х г в течение 10 мин.
    20. Аспир супернатант полностью и resuspend клеток в 70 Л PB буфера для каждых 1 х 107 клеток. Хорошо перемешайте и инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
    21. Добавьте 20 йл микрошариков против A2B5 на каждые 1 х 107 клеток. Хорошо перемешайте и инкубировать при 4 градусах Цельсия.
    22. Добавьте 1-2 мл PB Buffer на каждые 1 х 107 ячеек и центрифугу при 300 х г в течение 10 минут в центрифуге 4 градусов По Цельсию.
    23. Аспир супернатант полностью. Повторное действие до 108 ячеек в 500 Л Pb Buffer. Продолжайте на льду.
    24. Поместите столбик магнитного биса в магнитное поле сепаратора.
    25. Подготовьте колонку путем промывки с 500 Зл ПБ Буфер. Нанесите подвеску ячейки на столбец. Отбросьте поток через в контейнер есот (он содержит не маркированные ячейки).
    26. Вымойте колонку с 500 л PB буфера 3 раза. Отбросьте поток через.
    27. Снимите столбец с магнитного сепаратора и поместите в трубку для сбора.
    28. Пипетка 1 мл PB Буфер на колонку. Промыть магнитно помеченные клетки, твердо нажав поршень в колонке.
    29. Добавьте 4 мл C-Medium к фракции клетки и вращайтесь при 300 х г в течение 10 мин.
    30. Удалить супернатант и повторно в 5 мл N2B2 Medium. Возьмите 10 зл и севена клетки и разбавьте с 10 зл и синего трипана. Подсчитайте 10 зл клеточной подвески с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоситометра.
    31. Плита олигодендроцитов в концентрации 150000 клеток на разрозненные камеры, содержащие DRG с полностью расширенными аксонами.
    32. На следующий день изменить средства массовой информации в разобщенной камере n2B2, чтобы для миелинации. Заменяйте носители каждые 2-3 дня. Миелинизм будет завершен через 14 дней.
    33. На 14-й день культура семян с нейросферой ГБМ в 3.2.26-3.2.32. Поддержание миелинированных культур в N2B2 Medium в течение всех экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол представлен как схема диаграммы потока на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для изучения взаимодействия ГГК с аксономмы мы создали очищенные аксоны DRG, как уже говорилосьранее, 15,17,18. Эти очищенные аксоны DRG были затем посеяны с hGCs, которые сформировали GFAP/Ki67 "опухолевые структуры, интегрированные в аксональной сети, в то время как отдельные hGCs мигрировали либо в связи или между аксонами (Рисунок 2). Чтобы определить, как hGCs взаимодействуют с миелинированными аксонами, мы посеяли культуры аксона DRG с очищенными крысиными олигодендроцитами и индуцированной миелинизмом, как ранее описано19,20,21. Добавление hGCs на миелинированных DRG-oligodendrocyte кокультуры показали, что hGCs мигрировать в связи с миелинированных аксонов и от опухолевой массы через образование псевдоподии, как показано в нашей недавней работе (Рисунок 3)22. Олигодендроцитная миелиника может быть определена с помощью myelin Basic Protein (MBP) окрашивания культур. Для количественной оценки миграции hGCs в этих культурах мы измерили общую площадь культуры, занимаемой мигрирующими hGCs с помощью программного обеспечения Image J22.

ПОНЕДЕЛЬНИК СРЕДА ПЯТНИЦА
День 1 Nbf
НЕДЕЛЯ 1 Nb Nbf Nb
НЕДЕЛЯ 2 Nbf Nb Nb
НЕДЕЛЯ 3 Nb Nb

Таблица 1: Расписание кормления культур DRG.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая сводка протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: HGCs образуют опухолеобразные структуры в совместной культуре с аксоном DRG. Культура была зафиксирована и окрашена для маркеров опухоли GFAP (красный) и Ki67 (зеленый), в то время как аксоны были окрашены нейрофиламентом (синим). Шкала бар: 200 мкм. Эта цифра была изменена из нашей недавно опубликованной статьи22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: hGCs мигрируют вдоль миелинированных аксональных дорожек. hGCs, выражающий зеленый флуоресцентный белок (GFP), мигрируют по миелинированным аксональным следам, окрашенным красным цветом для MBP в системе культуры hGC-DRG-oligodendrocyte. Шкала бар: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Миграционные исследования для HGCs могут быть выполнены с помощью камерных систем Boyden или царапинных анализов. Однако, в то время как эти эксперименты не дают никакой информации о взаимодействии опухолевых клеток с другими окружающими тканями, нынешняя система может резюмировать взаимодействия GC с миелинированными и немиелинированными волокнами. Кроме того, для изучения формирования опухоли и конечной точки миграции, органотипические срез культуры мозга грызунов или виво имплантации клеток глиомы в мозг грызунов или фланг ранее были использованы23,24,25. Более поздние усилия по трехмерному моделированию клеток глиомы использовали такие системы, как коллагеновые слои26,27,28,астроцитов на основе эшафот29,30, внеклеточные слои матрицы31, электроструны нановолокна32, и гидрогели33. Хотя эти эксперименты дают удовлетворительные конечные результаты в отношении миграции, они не имеют возможности изучаться в режиме реального времени с помощью микроскопии высокого разрешения.

Здесь мы продемонстрировали новый подход к изучению миграции ГГК, подготовив сокультуру DRG в разрозненных камерах. Если доступ к свежей ткани ГБМ имеется, HGCs могут быть изолированы и культурно йога. Хотя hGCs занять много времени, чтобы сформировать нейросферы на начальном этапе, культуры легко поддерживать и субкультуры, как только сферы форме. Чтобы обеспечить успех культуры hGC, ткани должны быть обработаны как можно быстрее. Время между резекцией и обработкой должно быть максимально сведено к минимуму, а образцы всегда следует транспортировать на льду.

DRG также легко изолировать, расширяет свои аксоны дольше, чем корковые нейроны и может быть легко миелинированв в культуре с олигодендроцитами. нейросферы hGC или разрозненные hGCs совместно культивируются в дистальных отсеках камер, что позволяет в реальном времени сотворить и в режиме реального времени количественное взаимодействие клеточных взаимодействий с аксономи и миелинатированными волокнами. Кроме того, этот протокол не ограничивается только культурами DRG, так как корковые нейроны также могут быть изолированы и миелинизированы с несколькими изменениями в этом протоколе. Эта модель также может быть использована для изучения других форм рака мозга.

В то время как DRG относительно прост в изоляции и обслуживании, добавление разрозненные камеры занимает много времени и создает множество технических ограничений, которые требуют обучения и практики для достижения успеха. Критически к успеху этого протокола равномерное покрытие коллагена и царапать тарелок культуры потому что неравномерно или чрезмерно толщиной коллаген клонит очистить. Крайняя осторожность также следует принимать при размещении силиконовой смазки на разрозненных камерах. Если даже давление не используется при распределении силиконовой смазки, будут пробелы внижне йожей камеры, которые потребуют уплотнения с избытком жира для предотвращения утечки средств массовой информации. Кроме того, минимальное давление должно быть использовано при примыкает к разрозненные камеры на пол тарелки культуры. Если аксоны не могут пересечь из среднего отсека после первой недели и DRG выглядит иначе здоровым, вполне вероятно, что слишком большое давление было применено при размещении разобщенной камеры или избыточное количество жира было использовано.

hGC миграции вдоль миелинированных и немиелинированных аксональных трактов в головном мозге не была хорошо описана из-за отсутствия эффективных и воспроизводимых моделей ex vivo. Мы описываем здесь развитие инновационной системы культуры ex vivo для изучения того, как клетки глиомы мигрируют вдоль аксонов и миелина, важнейшего компонента в разработке новых методов лечения, которые конкретно нацелены на миграцию опухолевых клеток. Наша культурная система является универсальной, так как существует жидкая изоляция между отсеками, облегчающая возможность изучения различных новых методов лечения или различных концентраций веществ, влияющих на миграцию клеток глиомы. Дополнительным преимуществом нашей системы совместной культуры является способность контролировать миграцию hGC и последствия различных методов лечения в режиме реального времени. Описанный здесь протокол в настоящее время используется в качестве основы для разработки более сложных биомиметических трехмерных систем ex vivo с использованием исключительно человеческих клеточных компонентов, которые могут быть использованы для оценки токсикологии и эффективности новых препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана внутренними фондами кафедры нейрохирургии, Университета Брауна в Н.Т.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
  3. Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
  4. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  5. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  6. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
  7. Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
  8. Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
  9. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  10. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  11. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
  12. Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
  13. Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
  14. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
  15. Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
  16. Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
  17. Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
  18. Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
  19. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  20. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  21. Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
  22. Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
  23. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
  24. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  26. Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
  27. Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
  28. Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
  29. Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
  30. Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  31. Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
  32. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
  33. Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).

Tags

Исследования рака выпуск 154 стволовые клетки глиомы миграция модель ex vivo со-культура аксоны DRG миелин
Мониторинг в режиме реального времени миграции клеток глиомы человека на dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zepecki, J. P., Snyder, K. M.,… More

Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter