Summary
Ici, nous présentons un système de culture monocouche mixte ex-vivo pour l'étude de la migration des cellules de gliome humain (hGC) en temps réel. Ce modèle permet d'observer les interactions entre les hGC et les axones myélinisés et non myélinisés dans une chambre compartimentée.
Abstract
Le glioblastome est l'un des cancers humains les plus agressifs en raison de l'hétérogénéité cellulaire étendue et des propriétés de migration des hGCs. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la migration des cellules du gliome, une capacité d'étudier l'interaction entre les hGCs et les axones dans le microenvironnement tumoral est essentielle. Afin de modéliser cette interaction cellulaire, nous avons développé un système de culture mixte composé de hGCs et ganglions de racine dorsal (DRG) axone-oligodendrocyte co-cultures. Les cultures DRG ont été sélectionnées parce qu'elles peuvent être isolées efficacement et peuvent former des projections longues et étendues qui sont idéales pour des études de migration de cette nature. Des oligodendrocytes purifiés de rat ont alors été ajoutés sur les axones purifiés de DRG de rat et induits à myélinéine. Après avoir confirmé la formation de myéline compacte, les hGC ont finalement été ajoutés à la co-culture et leurs interactions avec les axones DRG et les oligodendrocytes ont été surveillés en temps réel à l'aide de la microscopie en time-lapse. Dans ces conditions, les hGC forment des structures agrégées tumorales qui expriment GFAP et Ki67, migrent le long des pistes axonales myélinisés et non myélinisés et interagissent avec ces axones par la formation de pseudopodia. Notre système de co-culture ex vivo peut être utilisé pour identifier de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires de la migration hGC et pourrait potentiellement être utilisé pour les tests d'efficacité des médicaments in vitro.
Introduction
Le glioblastome est l'une des tumeurs les plus agressives et mortelles du cerveau humain. La norme actuelle de soins comprend la résection chirurgicale de la tumeur suivie par le rayonnement1 plus l'administration concomitante et adjuvante de temozolomide2. Même avec cette approche multi-thérapeutique, la répétition de tumeur est inévitable3. Cela est dû en partie à la nature migratoire étendue des cellules tumorales, qui envahissent le parenchyme cérébral créant de multiples projections en tant que doigt dans le cerveau4 qui rendent la résection complète peu probable.
Ces dernières années, il est devenu évident que l'agressivité du glioblastome est due, en partie, à la présence d'une population de cellules souches cancéreuses dans la masse tumorale5,6, qui présentent un potentiel migratoire élevé7,8, la résistance à la chimiothérapie et le rayonnement9,10 et la capacité de former des tumeurs secondaires11. Les CGC sont capables de récapituler les tumeurs polyclonales originales lorsqu'elles sont xénogreffes sur des souris nues5.
Malgré la richesse des connaissances sur le contexte génétique des glioblastomes, les études sur la migration des cellules de gliome (GC) sont actuellement entravées par un manque de modèles de migration in vitro ou in vivo efficaces. Notamment, tandis que les interactions cellules-axonales de glioma modulées par des facteurs cellulaires et environnementaux sont une composante fondamentale de l'invasion de gliome, à notre connaissance il n'y a actuellement aucun système expérimental avec la capacité de modéliser ces interactions12,13,14. Pour répondre à cette insuffisance, nous avons développé un système de culture ex vivo des hGCs primaires co-cultivés avec les axon-oligodendrocytes purifiés de DRG qui a comme conséquence l'expression élevée des marqueurs différenciés de tumeur aussi bien que la migration et l'interaction étendues des hGCs avec les fibres myélinies et non myélinies. Cette plate-forme ex vivo, en raison de sa disposition compartimentée, est adaptée pour tester les effets de nouvelles thérapies sur les modèles de migration hGC.,
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Protocol
Les protocoles de collecte, d'isolement et de propagation des cellules humaines de glioma d'origine patiente ont été approuvés par le comité de la CISR de l'hôpital de Rhode Island. Tous les animaux étaient entretenus selon le Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Tous les protocoles d'utilisation des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'hôpital de Rhode Island.
1. Préparations médias et tampons
- Préparer 50 mL de Neurosphere Media: 1x Neuronal baseal medium w/o vitamin A, 1x serum free supplement w/o vitamin A, 2 mM L-glutamine, 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF), 20 ng/mL basic-fibroblast growth factor (FGF), 2 'g/mL heparin, and 1x antibiotic-antimycotic (anti-anti).
- Préparer 50 mL de neurone al-Basal Medium complété : 1x Milieu basal neuronal, supplément sans sérum 1x, 4 g/L D-glucose, 2 mM L-glutamine, et 50 ng/mL facteur de croissance de nerf (NGF).
- Préparer 500 mL de N2B2 Moyen : 1:1 Le mélange F12 nutritif F12 de L'Aigle modifié de Dulbecco (DMEM-F12), 1x Insuline-Transferin-Selenium (ITS-G), 66 mg/mL d'albumine bovine (BSA), 0,1 mg/mL de transfert, 0,01 mg/mL de biotine, 6,29 mg/mL de progestérone, 5 g/mL N-Acetyl-L-cystine (NAC) et 1 mM de putriscine. Aliquot et congeler à -20 oC.
- Préparer 500 ml de C-Medium : 1x Minimum Essential Medium (MEM), D-glucose (final 4 g/L), 10% fetal bovine serum (FBS), et 2 mM L-glutamine. Aliquot et congeler à -20 oC. Ajouter le facteur de croissance nerveuse (FNG) frais avant utilisation (50 ng/mL).
- Préparer 200 mL de tampon de papaïne : 1x Solution de sel équilibré (EBSS) d'Earle, 100 mM Mg2SO4, 30 % glucose, 0,25 M EGTA et 1 M NaHCO3.
- Préparer 10 mL de DMEM-ITS-G Moyen: 1x DMEM, 0.5% BSA, et 1x ITS-G.
- Préparer 200 ml de tampon PB : 1x la saline tamponnée en phosphate (DPBS) de Dulbecco sans Ca2 et Mg2 et 0,5 % de BSA. Dégazer le tampon avant l'utilisation et le garder sur la glace.
2. Isolement et culture des neurosphères de cellules souches de Glioma
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Isolement des neurosphères
- Recueillir les tissus du glioblastome humain frais (GBM) approuvés et approuvés par le patient dans la salle d'opération. Transférer des échantillons de GBM sur la glace dans dPBS contenant 2x anti-anti à un coffret de sécurité biologique certifié BL2.
- Transférer un échantillon de 1 cm3 GBM avec une nécrose minimale ou une contamination des globules rouges sur une plaque de 60 mm et couper en fragments de 1 mm3; supprimer tout excès de DPBS.
- Diger le tissu avec 5 ml de collagène/dispase (1 mg/ml) pendant 30 min à 37 oC et faire tourbillonner doucement le plat toutes les 5-10 min.
- Transférer les fragments digérés dans un tube de 50 ml et triturate par pipetting avec une pipette de 10 ml plusieurs fois pour dissocier le tissu.
- Ajouter un volume égal de neurosphère média et triturate le tissu à nouveau; permettant aux gros fragments de s'installer.
- Enlever les supports sans fragments de tissu et passer lentement à travers une passoire cellulaire de 70 M placée sur un tube frais de 50 ml.
- Répétez les étapes 2.1.5-2.1.6 jusqu'à ce que tout le tissu ait été dissocié, changeant la passoire de cellules au besoin.
- Faire tourner la suspension cellulaire à 110 x g pendant 10 min.
- Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 10 ml de tampon de lysing ACK pour éliminer la contamination des globules rouges. Incuber 10 min à température ambiante.
- Faire tourner la suspension cellulaire à 110 x g pendant 5 min.
- Retirez les cellules supernatant et resuspend dans 10 ml de Neurosphere Media. Prendre 10 lde de la suspension cellulaire et diluer avec 10 l de bleu trypan. Comptez 10 l de la suspension cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé ou d'un hémocytomètre et d'une plaque dans 10 ml de Neurosphere Media à une densité de 3 x 106 cellules dans des plaques de culture de suspension de 100 mm.
- Ajoutez 2 ml de Neurosphere Media frais à la culture 2-3 fois par semaine.
REMARQUE : Les neurosphères se formeront en suspension dans les 3-4 semaines. Après subculturing pendant 2-4 fois, confirmer la tige par l'intermédiaire de l'essai limitant de dilution et de la récapitulation de tumeur par l'intermédiaire de la transplantation xénographique dans les souris immunocompromised comme précédemment décrit 22.
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Neurosphères sous-cculturations
- Lorsque les sphères se forment et atteignent un diamètre compris entre 200 et 500 m, transférez les neurosphères dans un tube de 15 ml et tournez à 110 x g pendant 5 min.
- Resuspendre les neurosphères dans 1 ml de solution de détachement cellulaire pré-chauffée.
- Transférer dans un tube de 1,5 ml et couver à 37 oC pendant 5 min.
- Définir une pipette P200 à 150 l et triturate en faisant monter et descendre pour dissocier les neurosphères.
- Transférer les cellules dissociées dans un tube de 15 ml. Ajouter 4 ml de Neurosphere Media et tourner à 300 x g pendant 5 min.
- Retirez le supernatant et resuspendez les cellules dans 5 ml de Neurosphere Media. Prendre 10 lde de la suspension cellulaire et diluer avec 10 l de bleu trypan. Comptez 10 l de la suspension cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé ou d'un hémocytomètre et d'une plaque à une densité de 1 x 106 cellules/60 mm dans un volume final de 4 ml.
- Rafraîchissez les médias 2 fois par semaine et les cellules de sous-culture au besoin. Congeler les neurosphères entières si désiré dans les médias basaux neuronaux w/o vitamine A complété avec 10% DMSO. Les neurosphères peuvent être utilisées pour des expériences après P4.
3. Culture compartimentée des Ganglions de racine de Rat Dorsal (DRGs), oligodendrocytes (OPCs) et hGCs
- Préparation de plats de culture compartimentés
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes les jours précédant la récolte prévue des DRG.- Assembler des plats de culture compartimentés.
- Diluer la solution de stock de collagène à 500 g/mL dans h2O distillé stérile; Mélanger.
- À l'eau d'un transfert stérile, remplissez un plat de culture de 35 mm avec 2 ml de solution de collagène; enlever la solution, en laissant derrière elle un mince film de collagène et placez-la dans le plat suivant de 35 mm. Répétez ce processus, en ajoutant plus de solution de collagène au besoin, jusqu'à ce que tous les plats ont été enrobés.
- Une fois toutes les plaques enduites, placez les plaques dans un plateau de culture de 245 mm x 245 mm et placez trois tampons de gaze de 1 mm x 1 mm au centre du plateau.
- Pour polymériser le collagène, les tampons de gaze humide avec 1 ml d'hydroxyde concentré d'ammonium et recouvrir les plateaux pendant 15 min.
- Retirez les tampons de gaze et laissez sécher les plats de 35 mm dans le capot à écoulement laminaire.
- Pendant que la vaisselle sèche, chargez le baril de l'applicateur de graisse de seringue avec de la graisse à vide élevé. Placer les chambres compartimentées dans une grande bouteille de presse buccale remplie d'eau distillée. Stériliser les deux en autoclant et laisser refroidir.
- Fichier hors du point d'un 18-G aiguillepour de faire une pointe émoussée. Stériliser dans 70% d'éthanol. Fixez l'aiguille à la seringue de graisse.
- Stériliser le râteau de goupille en trempant dans l'éthanol de 70% ; laissez-le sécher à l'air dans le capot à écoulement laminaire.
- Retirer le couvercle d'un plat sec et enrobé de collagène de 35 mm. Tenez le plat entre le pouce et le doigt du pointeur. Tenez le râteau de goupille avec l'autre main. Appliquer une pression ferme pour créer même 200 rayures de large sur le centre du plat.
- À l'aide d'une pipette de pâturage, placer deux gouttes de milieu basal neuronal complété au centre des égratignures.
- Répétez les étapes 3.1.10-3.1.11 jusqu'à ce que tous les plats aient été rayés.
- Séchez les chambres compartimentées dans un capot à écoulement laminaire.
- Avec des forceps hémostatiques stériles, saisissez une chambre compartimentée par le diviseur central. Retournez les forceps hémostatiques pour que le fond de la chambre soit orienté vers le haut.
- Appliquer la graisse de silicone sur la chambre compartimentée, en commençant par le haut. Assurez-vous que la graisse est placée proprement et se chevauche à tous les coins.
- Retirer le couvercle d'un plat de 35 mm. Inverser le plat et placer les rayures sur la chambre. Appuyez doucement sur le fond de la plaque avec une paire de forceps.
- Retournez doucement la plaque en utilisant les forceps hémostatiques. Relâchez les forceps.
- Placez un monticule de graisse à la base du compartiment central. Remplissez chaque chambre avec le milieu basal neuronal complété (NB) et vérifiez s'il y a des fuites. Scellez les fuites avec de la graisse de silicone au besoin.
- Continuer à assembler tous les plats de culture et entreposer la nuit à 37 degrés, 5 % de CO2.
- Isolement des neurones et de la culture de Rat DRG dans la chambre compartimentée
- Sacrifiez un rat E16 Sprague-Dawley enceinte chronométrée par asphyxie au CO2 ou par surdose chimique.
- Placez l'animal en position de supine sur une surface propre; désinfecter l'abdomen avec 70% d'éthanol.
- Saisissez la peau du bas-ventre avec des forceps et soulevez doucement.
- À l'aide de ciseaux, faire une incision « I » le long de la ligne médiane de l'animal, en prenant soin de ne pas perforer les muscles de la paroi abdominale.
- Avec une paire de forceps propres, saisir la paroi musculaire et faire une incision transversale avec une paire de ciseaux propres en utilisant la prudence de ne pas perforer l'utérus ou les intestins.
- À l'aide d'une paire de forceps émoussés, saisissez l'utérus et soulevez doucement la cavité péritonéale.
- À l'aide de ciseaux frais et stériles, couper le tissu conjonctif à la base de chaque corne utérine.
- Placer l'utérus entier dans un plat stérile de culture tissulaire de 100 mm.
- Porter l'utérus à un capuchon à écoulement laminaire pour la dissection.
- Retirez les embryons de l'utérus, un à la fois, en coupant à travers le sac amniotique et en taquinant doucement l'embryon et en un plat de 60 mm contenant 5 ml de L-15 avec 1x pen-strep.
- Avec des forceps fins, placer 3-4 embryons dans un plat de 60 mm contenant 5 ml de L-15 avec 1x pen-strep.
- Travailler sous un microscope disséquer et avec un embryon à la fois, euthanasier par décapitation.
- Allongez le côté ventral de l'embryon vers le haut et retirez les membres et la queue.
- Avec des forceps fins, faire une incision de la ligne médiane chez l'animal.
- Enlever les organes internes et les tissus pour exposer les structures dorsales, en particulier la moelle épinière qui devrait être visible à l'achèvement.
- Placez une lame de ciseaux micro-disséquants entre la colonne vertébrale et le canal rachidien et coupez soigneusement à travers la colonne vertébrale pour exposer la moelle épinière. Prenez soin de ne pas couper à travers la moelle épinière.
- À l'idée de fines forceps, saisir légèrement l'extrémité rostrale de la moelle épinière et sortir lentement de l'embryon. Les DrG seront fixés à la moelle épinière.
- Transférer la moelle épinière et les DRG attachés dans un plat de 35 mm contenant 2 ml de L-15 avec 1x pen-strep. Placer sur la glace.
- Une fois que toutes les moelles épinières ont été isolées, utilisez des forceps fins pour arracher individuellement les DRG de la moelle épinière. Placer les DRG dans un plat frais de 35 mm.
- Si des racines nerveuses sont présentes sur les DrG, coupez-les.
- Retirer les plats préparés de 35 mm de l'incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %. Retirez les médias de la veille. Placez 80 ll de milieux basaux neuronaux complémentaires (NBF) contenant 10 'M 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) dans le compartiment central et 250 'L de milieux dans chaque compartiment externe.
- Placer 2 ganglions dans chaque compartiment central. Remettre les plats à l'incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.
- Le lendemain ajouter 2,5 mL de FNB.
- Nourrir les cultures selon l'horaire du tableau 1, en modifiant l'horaire en fonction de la journée choisie pour commencer la préparation DRG.
- Le jour 21 (ou lorsque les axones atteignent la fin des compartiments distales), soit les cultures de graines avec une neurosphère GBM (Proceed à l'étape 3.2.26) et l'image en direct ou myelinate les cultures avec des cultures oligodendrocytes (Procéder à l'étape 3.3) et ensuite semer avec une neurosphère GBM après la myélinisation.
- Remplacer le moyen supplémentaire de NB dans chaque chambre compartimentée distale qui sera ensemencée avec une neurosphère gbM avec le moyen supplémentaire de NB contenant 10% FBS.
- Avec une pipette P20 fixée à 10 l, retirer une neurosphère GBM du plat de culture. La neurosphère GBM devrait mesurer environ 200 microns de taille.
- Placez la pointe de la pipette dans la chambre distale et expulsez la neurosphère GBM lentement de sorte qu'elle tombe doucement sur les axones dans la partie de la chambre distale qui est la plus proche de la chambre centrale, au-dessus des axones près de la chambre centrale. Veillez à ne pas laisser la pointe de pipette perturber les axones.
- Laissez la culture dans l'armoire de biosécurité pendant 1 h à température ambiante pour permettre à la neurosphère GBM de se fixer.
- Une fois que la neurosphère s'est attachée, remplacez très soigneusement les milieuis dans le compartiment distal par le moyen nb complété.
- Cultures d'images en direct pendant 3-7 jours, ajoutant des médias au besoin. Dans ce cas, un boîtier de cellules vivantes CO2 contrôlé attaché au microscope (p. ex. Zeiss Axiovert) a été utilisé pour surveiller en permanence la migration cellulaire pendant 7 jours à l'aide de Brightfield. Des images ont été acquises toutes les 10 min à l'aide du logiciel associé. Répétez le même protocole à l'aide de hGCs qui ont été poignardés transfected pour exprimer GFP et les images ont été capturées en utilisant une combinaison de brightfield et 488 nm laser.
REMARQUE : Les neurosphères peuvent être transdulées avec le lentivirus ou transfectées avec des plasmides ou des siARN. Les compartiments peuvent également être traités avec les inhibiteurs de petites molécules désirés pour étudier la migration.
- Myélinisation des Axons DRG avec Oligodendrocytes
- La veille de l'isolement des oligodendrocytes, remplacez le médium nb dans les DRG par C-Medium.
- Avant la dissection, placer 10 ml de tampon de papain dans un plat de 60 mm dans l'incubateur pour l'équilibre.
- Dans une hotte à débit laminaire, remplir un plat de 100 mm et un plat de 60 mm avec du HBSS glacé. Placer sur la glace.
- Sacrifiez un chiot rat P2 par décapitation. Retirer la peau à l'aide d'une paire de ciseaux. Après l'enlèvement de la peau, couper le crâne le long de la ligne médiane avec une paire de ciseaux fins.
- Enlever délicatement le crâne avec de fines forceps. À l'aide d'une spatule, ramasser délicatement le cerveau du bas du crâne et le transférer dans un couvercle de plaque de culture tissulaire inversé.
- Retirez le cervelet et divisez le cerveau en deux hémisphères cérébraux. Enlevez les ampoules olfactives, l'hippocampe, et les ganglions basiques au-dessous du cortex cérébral de chaque hémisphère. Placez le cortex cérébral dans le plat de 100 mm contenant du HBSS. Répétez les étapes 3.3.4-3.3.6 pour les animaux restants.
- En travaillant avec un cortex à la fois, enlevez les méninges avec de fines forceps Dumont. Placez tous les cortices sans méninges dans des plats frais de 60 mm avec HBSS.
- Couper le tissu cortical en morceaux de 1 mm3. Placer sur la glace.
- Placer le tampon papaïne aquilibté dans un tube de 15 ml. Ajouter 200 unités de papaïne et 2 mg de L-cystéine. Filtrer stériliser et ajouter 200 l de DNase I stérile.
- Retirez le HBSS du tissu cérébral coupé en dés et remplacez-le par le tampon de papaïne de 3.3.2. Placer le plat dans un incubateur de CO2 de 37 oC à 5 % pendant 80 min, en secouant doucement toutes les 15 min.
- Transférer le tissu digéré dans un tube de 50 ml et ajouter 2 ml de C-moyen.
- Triturate avec une pipette sérologique de 5 ml pour dissocier le tissu; laisser s'installer de plus gros morceaux de tissu. Retirer le supernatant et placer dans un tube stérile de 15 ml.
- Ajouter 2 ml de C-Medium et répéter la trituration avec une pipette sérologique de 5 ml une fois de plus. Passer à une pointe de pipette de 1 ml et triturate jusqu'à ce que le tissu soit complètement dissocié. Transférer dans le tube de 15 ml.
- Faire tourner le tissu trituré à 300 x g pendant 15 min. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez les granulés dans 8 ml de DMEM-ITS-G Medium.
- Prémouiller une passoire stérile de 30 m avec 2 ml de tampon PB. Placer la passoire cellulaire sur un tube de 50 ml et filtrer la suspension cellulaire 1 ml à la fois. Rincer le filtre avec 5 ml de tampon PB.
- Transférer la suspension cellulaire sur une plaque bactériologique de 100 mm; incuber pendant 15 min dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 % pour permettre aux microglies de se fixer.
- Retirer le support et placer dans un tube de 15 ml. Rincer délicatement la plaque avec 2 ml de milieu DMEM-ITS-G et transférer dans le tube de 15 ml.
- Resuspendre doucement la suspension de la cellule. Prendre 10 l de la suspension cellulaire et diluer avec 10 'l de bleu trypan. Comptez 10 l de la suspension cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé ou d'un hémocytomètre.
- Faire tourner la suspension cellulaire à 300 x g pendant 10 min.
- Aspirez complètement les supernatants et resuspendez les cellules dans 70 L de tampon DE PB pour chaque 1 x 107 cellules. Bien mélanger et incuber à 4 oC pendant 10 min.
- Ajouter 20 l de microbilles anti-A2B5 pour 1 x 107 cellules. Bien mélanger et incuber à 4 oC.
- Ajouter 1-2 ml de tampon PB pour chaque 1 x 107 cellules et centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min dans une centrifugeuse de 4 oC.
- Aspirez le supernatant complètement. Resuspendre jusqu'à un total de 108 cellules dans 500 L de TAMPON PB. Restez sur la glace.
- Placez une colonne de perles magnétiques dans le champ magnétique d'un séparateur.
- Préparer la colonne en rinçant avec 500 L de tampon PB. Appliquer la suspension cellulaire sur la colonne. Jeter le flux dans un conteneur à déchets (qui contient des cellules non étiquetées).
- Laver la colonne avec 500 l de PB Buffer 3 fois. Jeter le flux à travers.
- Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la dans un tube de collecte.
- Pipette 1 mL de tampon PB sur la colonne. Rincer les cellules étiquetées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne.
- Ajouter 4 ml de C-Medium à la fraction cellulaire et tourner à 300 x g pendant 10 min.
- Retirer le supernatant et le resuspendre en 5 ml de N2B2 Medium. Prendre 10 lde de la suspension cellulaire et diluer avec 10 l de bleu trypan. Comptez 10 l de la suspension cellulaire à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé ou d'un hémocytomètre.
- Les oligodendrocytes de plaque à une concentration de 150.000 cellules par chambre compartimentée contenant un DRG avec des axones entièrement étendus.
- Le lendemain, changer les médias dans la chambre compartimentée à N2B2 pour permettre la myélinisation. Remplacez les médias tous les 2-3 jours. La myélinisation sera terminée dans 14 jours.
- Le jour 14, la culture des semences avec une neurosphère GBM comme dans 3.2.26-3.2.32. Maintenir les cultures myélinisés dans N2B2 Medium pendant toute expérience.
REMARQUE : Le protocole est présenté comme un schéma de diagramme de flux dans la figure 1.
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Representative Results
Afin d'étudier l'interaction des hGCs avec des axones, nous avons généré des axones DRG purifiés comme précédemment décrit15,16,17,18. Ces axones DRG purifiés ont ensuite été ensedus de hGCs, qui formaient des structures tumorales GFAPMD/Ki67MD intégrées dans le réseau axonal, tandis que les hGC individuels migrent soit en association, soit entre les axones (figure 2). Pour déterminer comment les hGC interagissent avec les axones myélinisés, nous avons semé les cultures d'axone de DRG avec les oligodendrocytes purifiés de rat et la myélinisation induite comme précédemment décrit19,20,21. L'addition des hGCs sur les co-cultures myélinisés de DRG-oligodendrocyte a prouvé que les hGCs migrent en association avec les axones myélinisés et loin de la masse de tumeur par la formation de pseudopodia comme indiqué dans notre article récent (figure 3)22. La myélinisation de l'oligodendrocyte peut être déterminée à l'aide de la coloration des cultures par myéline (MBP). Pour quantifier la migration des hCGC dans ces cultures, nous avons mesuré la superficie totale de la culture occupée par les hPC migrateurs à l'aide du logiciel Image J22.
| Lundi | Mercredi | Vendredi | |
| JOUR 1 | Fbn | ||
| SEMAINE 1 | Nb | Fbn | Nb |
| SEMAINE 2 | Fbn | Nb | Nb |
| SEMAINE 3 | Nb | Nb |
Tableau 1 : Horaire d'alimentation des cultures DRG.
Figure 1 : Résumé schématique du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les hGC forment des structures tumorales en co-culture avec les axones DRG. La culture a été fixée et tachée pour les marqueurs tumoraux GFAP (rouge) et Ki67 (vert), tandis que les axones ont été tachés de Neurofilament (bleu). Barre d'échelle : 200 m. Ce chiffre a été modifié à partir de notre article publié récemment22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les hGC migrent le long des voies axonales myélinisés. les hGCs exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) migrent le long des pistes axonales myélinies teintées rouge pour MBP dans le système de culture hGC-DRG-oligodendrocyte. Barre d'échelle : 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les études de migration pour les hGC peuvent être exécutées en utilisant des systèmes de chambre De Boyden ou des essais de rayures. Cependant, tandis que ces expériences ne donnent aucune information concernant les interactions des cellules de tumeur avec d'autres tissus environnants, le système actuel peut récapituler des interactions de GC avec les fibres myélinisés et non-myélinisés. En outre, pour étudier la formation de tumeur et la migration de point final, les cultures organotypic de tranche du cerveau de rongeur ou l'implantation in vivo des cellules de glioma dans le cerveau ou le flanc de rongeur ont été précédemment employées23,24,25. Des efforts plus récents sur la modélisation tridimensionnelle des cellules de gliome ont utilisé des systèmes comme les couches de collagène26,27,28, échafaudages à base d'astrocytes29,30, couches de matrice extracellulaire31, nanofibres électrospun32, et hydrogels33. Bien que ces expériences produisent des résultats finaux satisfaisants en ce qui concerne la migration, elles n'ont pas la capacité d'être étudiées en temps réel par microscopie à haute résolution.
Ici, nous avons démontré une nouvelle approche pour étudier la migration des hGC en préparant une co-culture DRG dans une chambre compartimentée. Si l'accès au tissu frais de GBM est disponible, les hGC peuvent être isolés et cultivés de manière fiable. Bien que les hGC prennent beaucoup de temps à former des neurosphères au départ, les cultures sont faciles à maintenir et la sous-culture une fois que les sphères se forment. Pour assurer le succès de la culture hGC, le tissu doit être traité aussi rapidement que possible. Le temps entre la résection et le traitement doit être réduit au minimum autant que possible, et les échantillons doivent toujours être transportés sur la glace.
Le DRG est également facile à isoler, étend ses axones plus longtemps que les neurones corticaux et peut être facilement myélinisé en culture avec des oligodendrocytes. les neurosphères hGC ou hGCs dissociés sont co-cultivés dans les compartiments distal des chambres, permettant l'imagerie cellulaire vivante et la quantification en temps réel des interactions cellulaires avec des axones et des fibres myélinisées. En outre, ce protocole n'est pas limité aux seules cultures DRG, car les neurones corticaux peuvent également être isolés et myélinisés avec peu de modifications à ce protocole. Ce modèle peut également être utilisé pour étudier d'autres formes de cancer du cerveau.
Bien que le DRG soit relativement simple à isoler et à entretenir, l'ajout de la chambre compartimentée prend beaucoup de temps et crée une multitude de limitations techniques qui nécessitent de la formation et de la pratique pour réussir. Critique pour le succès de ce protocole est uniforme collagen revêtement et grattage des plats de culture parce que le collagène inégal ou excessivement épais a tendance à peler. Il faut également faire très attention à la graisse de silicone sur les chambres compartimentées. Si même la pression n'est pas utilisée lors de la distribution de la graisse de silicone, il y aura des lacunes le long du fond de la chambre compartimentée qui nécessiteront l'étanchéité avec l'excès de graisse pour empêcher les fuites de médias. En outre, une pression minimale doit être utilisée lors de l'adhérence des chambres compartimentées au plancher de plat de culture. Si les axones ne parviennent pas à traverser le compartiment central après la première semaine et que le DRG semble en bonne santé, il est probable que trop de pression a été exercée lors de la mise en place de la chambre compartimentée ou une quantité excessive de graisse a été utilisée.
La migration de hGC le long des voies axonales myélinisés et non myélinisés dans le cerveau n'a pas été bien décrite en raison du manque des modèles ex vivo efficaces et reproductibles. Nous décrivons ici le développement d'un système de culture ex vivo innovant pour étudier comment les cellules de gliome migrent le long des axones et de la myéline, un composant crucial dans le développement de nouveaux traitements qui ciblent spécifiquement la migration de cellules tumorales. Notre système de culture est polyvalent car il y a un isolement fluide entre les compartiments, facilitant la capacité d'étudier divers traitements nouveaux ou des concentrations différentes de substances qui affectent la migration des cellules du gliome. Un autre avantage de notre système de co-culture est la capacité de surveiller la migration hGC et les effets des différents traitements en temps réel. Le protocole décrit ici est actuellement utilisé comme base pour le développement de systèmes ex vivo biomimétiques plus sophistiqués utilisant des composants cellulaires exclusivement humains qui pourraient être utilisés pour évaluer la toxicologie et l'efficacité de nouveaux médicaments.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds internes du Département de neurochirurgie de l'Université Brown à N.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E.
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C.
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
