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Cancer Research

डोर्सल रूट गैंगलियन एक्सन-ओलिगोडेनरोसाइट सह-संस्कृतियों पर मानव ग्लियोमा सेल माइग्रेशन की वास्तविक समय निगरानी

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

यहां हम वास्तविक समय में मानव ग्लियोमा सेल (एचजीसी) प्रवास के अध्ययन के लिए एक पूर्व वीवो मिश्रित मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल एक विभाजित कक्ष के भीतर एचजीसी और मेरेलेनीकृत और गैर-myelinated अक्षों दोनों के बीच बातचीत का निरीक्षण करने की क्षमता प्रदान करता है।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा व्यापक सेलुलर विषमता और एचजीसी के माइग्रेशन गुणों के कारण सबसे आक्रामक मानव कैंसर में से एक है। ग्लियोमा सेल माइग्रेशन में अंतर्निहित आणविक तंत्रों को बेहतर ढंग से समझने के लिए, ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर एचजीसी और एक्सन के बीच बातचीत का अध्ययन करने की क्षमता आवश्यक है। इस सेलुलर इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए, हमने एचजीसी और पृष्ठीय रूट गैंगलिया (डीआरजी) एक्सॉन-ओलिगोडेन्ट्रोसाइट सह-संस्कृतियों से मिलकर एक मिश्रित संस्कृति प्रणाली विकसित की। डीआरजी संस्कृतियों का चयन किया गया क्योंकि उन्हें कुशलता पूर्वक अलग किया जा सकता है और लंबे, व्यापक अनुमान ों का निर्माण कर सकते हैं जो इस प्रकृति के प्रवास अध्ययनों के लिए आदर्श हैं। शुद्ध चूहा ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स को शुद्ध चूहा डीआरजी एक्सोन पर जोड़ा गया और माइलिनेट के लिए प्रेरित किया गया। कॉम्पैक्ट मायलिन के गठन की पुष्टि करने के बाद, एचजीसी को अंततः सह-संस्कृति में जोड़ा गया और डीआरजी एक्सोन और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के साथ उनकी बातचीत की समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में निगरानी की गई। इन परिस्थितियों में, एचजीसी ट्यूमर जैसी समग्र संरचनाएं बनाते हैं जो GFAP और Ki67 को व्यक्त करते हैं, माइलिनाइट और गैर-myelinated एक्सोनल पटरियों के साथ प्रवास करते हैं और छद्म ओडिया के गठन के माध्यम से इन एक्सोन के साथ बातचीत करते हैं। हमारे पूर्व वीवो सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग एचजीसी माइग्रेशन के उपन्यास सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए किया जा सकता है और संभवतः इन विट्रो ड्रग प्रभावकारिता परीक्षण के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

ग्लियोब्लास्टोमा मानव मस्तिष्क के सबसे आक्रामक और घातक ट्यूमर में से एक है। देखभाल के वर्तमान मानक में ट्यूमर का सर्जिकल रिसेक्शन शामिल है जिसके बाद रेडिएशन1 प्लस सहवर्ती और टेमोजोलोमाइड2का न्यायनिर्णयन प्रशासन होता है। यहां तक कि इस बहु चिकित्सकीय दृष्टिकोण के साथ, ट्यूमर पुनरावृत्ति अपरिहार्य3है । यह आंशिक रूप से ट्यूमर कोशिकाओं की व्यापक प्रवासी प्रकृति के कारण है, जो मस्तिष्क 4 के भीतर कई उंगली की तरह अनुमानों का निर्माण करने वाले मस्तिष्क परन्चिमा पर आक्रमण करता हैजो पूर्ण रीसेक्शन की संभावना नहीं है।

हाल के वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि ग्लियोब्लास्टोमा की आक्रामकता, भाग में, ट्यूमर द्रव्यमान5,6के भीतर कैंसर स्टेम कोशिकाओं की आबादी की उपस्थिति के कारण है, जो उच्च प्रवासी क्षमता7,8,कीमोथेरेपी और विकिरण9,10 के प्रतिरोध और माध्यमिक ट्यूमर11बनाने की क्षमता प्रदर्शित करती है। जीएससी मूल पॉलीक्लोनल ट्यूमर को फिर से बनाने में सक्षम हैं जब नग्न चूहोंको5।

ग्लियोब्लास्टोमा की आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बारे में ज्ञान के धन के बावजूद, ग्लियोमा सेल (जीसी) माइग्रेशन पर अध्ययन वर्तमान में विट्रो में या वीवो माइग्रेशन मॉडल में कुशल की कमी से बाधित हैं। विशेष रूप से, जबकि सेलुलर और पर्यावरणीय कारकों द्वारा संग्राहक ग्लियोमा सेल-एक्सोनल इंटरैक्शन ग्लियोमा आक्रमण का एक मुख्य घटक है, हमारे ज्ञान के लिए वर्तमान में इन बातचीत12,13,14मॉडल करने की क्षमता के साथ कोई प्रायोगिक प्रणाली नहीं है। इस कमी को दूर करने के लिए, हमने प्राथमिक एचजीसी की एक पूर्व वीवो संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो शुद्ध डीआरजी एक्सॉन-ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के साथ सह-संस्कारी है जिसके परिणामस्वरूप विभेदित ट्यूमर मार्कर की ऊंचा अभिव्यक्ति के साथ-साथ माइलिनेटेड और गैर-मायलिनेटेड फाइबर के साथ एचजीसी का व्यापक प्रवास और बातचीत होती है। यह पूर्व वीवो प्लेटफॉर्म, अपने विभाजित लेआउट के कारण, एचजीसी माइग्रेशन पैटर्न पर उपन्यास चिकित्सा के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

रोगी से व्युत्पन्न मानव ग्लियोमा कोशिकाओं के संग्रह, अलगाव और प्रचार के लिए प्रोटोकॉल को रोड आइलैंड अस्पताल की आईआरबी समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड के अनुसार सभी जानवरों को बनाए रखा गया था । सभी पशु उपयोग प्रोटोकॉल को रोड आइलैंड अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. मीडिया और बफर तैयारी

  1. न्यूरोस्फीयर मीडिया के 50 mL तैयार करें: 1x न्यूरोनल बेसल मीडियम डब्ल्यू/ओ विटामिन ए, 1x सीरम फ्री सप्लीमेंट डब्ल्यू/ओ विटामिन ए, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 20 एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 20 एनजी/एमएल बेसिक-फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ), 2 μg/mL heparin, और 1x-एंटीबायोटिक एंटीकोटिक (एंटी-एंटी-एंटी)।
  2. पूरक न्यूरोनल बेसल मीडियम के 50 एमएएल तैयार करें: 1x न्यूरोनल बेसल मीडियम, 1x सीरम फ्री सप्लीमेंट, 4 जी/एल डी-ग्लूकोज, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 50 एनजी/एमएल नर्व ग्रोथ फैक्टर (एनजीएफ)।
  3. N2B2 मध्यम के ५०० एमएल तैयार: 1:1 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम है हैम F12 पोषक तत्व मिश्रण (DMEM-F12), 1x इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम (आईटीएस-जी), ६६ मिलीग्राम/एमएल बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए), ०.१ मिलीग्राम/mL ट्रांसफरिन, 0.01 मिलीग्राम/एमएल बायोटिन, 6.29 मिलीग्राम/एमएल प्रोजेस्टेरोन, 5 μg/mL एन-एसीटाइल-एल-सिस्टिन (एनएसी), और 1 mM putriscine। अलीकोट और फ्रीज -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. सी-मीडियम के 500 एमएएल तैयार करें: 1x मिनिमम क्लरी मीडियम (एमईएम), डी-ग्लूकोज (अंतिम 4 जी/एल), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन। अलीकोट और फ्रीज -20 डिग्री सेल्सियस पर। उपयोग से पहले तंत्रिका विकास कारक (एनजीएफ) ताजा जोड़ें (50 एनजी/एमएल)।
  5. पैकिन बफर के 200 मिलीग्राम तैयार करें: 1x अर्ल का संतुलित नमक समाधान (ईबीएसएसएस), 100 एमएम एमजी2एसओ4,30% ग्लूकोज, 0.25 एम ईजीटीए, और 1 एम नाहको3.
  6. डीएमईएम-आईटीएस-जी मीडियम के 10 एमएल तैयार करें: 1x डीएमईएम, 0.5% बीएसए, और 1x आईटीएस-जी।
  7. पीबी बफर के 200 मिलीग्राम तैयार करें: 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफर लवण (DPBS) सीए2 + और एमजी2 + और 0.5% बीएसए के बिना। उपयोग से पहले बफर को डेगास करें और बर्फ पर रखें।

2. ग्लियोमा स्टेम सेल न्यूरोस्फीयर का अलगाव और संस्कृति

  1. न्यूरोस्फीयर का अलगाव
    1. आईआरबी को अनुमोदित करें और रोगी ने ऑपरेटिंग रूम से ताजा मानव ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) ऊतक की सहमति दी। एक BL2 प्रमाणित जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए 2x विरोधी विरोधी युक्त DPBS में बर्फ पर जीबीएम नमूनों स्थानांतरण ।
    2. न्यूनतम परिगलन या लाल रक्त कोशिका संदूषण के साथ एक 1 सेमी3 जीबीएम नमूना 60 मिमी प्लेट में स्थानांतरित करें और 1 मिमी3 टुकड़ों में कटौती करें; किसी भी अतिरिक्त डीपीबीएस को हटा दें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए कोलेजेनेज/डिस्पास (1 मिलीग्राम/एमएल) के 5 मिलील के साथ ऊतक को पचाएं और हर 5-10 मीटर में पकवान को धीरे से चक्कर लगाएं।
    4. एक 50 मिलीआर ट्यूब के लिए पचा टुकड़े हस्तांतरण और ऊतक को अलग करने के लिए कई बार एक 10 mL पिपेट के साथ पाइपिंग द्वारा triturate।
    5. न्यूरोस्फीयर मीडिया की बराबर मात्रा जोड़ें और ऊतक को फिर से त्रिकोणाित करें; बड़े टुकड़ों को व्यवस्थित करने की अनुमति देना।
    6. ऊतक के टुकड़ों के बिना मीडिया निकालें और एक ताजा 50 मीटर ट्यूब पर रखा एक 70 μM सेल छलनी के माध्यम से धीरे से गुजरती हैं।
    7. 2.1.5-2.1.6 चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी ऊतकों को विप्रेरित न किया जाए, आवश्यकतानुसार सेल छलनी को बदल दिया जाए।
    8. 10 00 00 के लिए 110 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन।
    9. लाल रक्त कोशिका संदूषण को दूर करने के लिए ACK lysing बफर के 10 mL में अतिशयोक्ति निकालें और गोली को फिर से निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
    10. 5 मिन के लिए 110 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन।
    11. न्यूरोस्फीयर मीडिया के 10 एमसीएल में सुपरनेटेंट और रिसस्पेंड कोशिकाओं को हटा दें। सेल निलंबन के 10 μL ले लो और tripan नीले रंग के 10 μL के साथ पतला। 100 मिमी सस्पेंशन कल्चर प्लेटमें 3 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर न्यूरोस्फीयर मीडिया के 10 मिलील में एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर और प्लेट का उपयोग करके सेल निलंबन के 10 माइक्रोन की गणना करें।
    12. सप्ताह में 2-3 बार संस्कृति में ताजा न्यूरोस्फीयर मीडिया के 2 मिलील जोड़ें।
      नोट: न्यूरोस्फीयर 3-4 सप्ताह के भीतर निलंबन में बनेंगे। 2-4 बार के लिए विश्राम के बाद, इम्यूनोसमझौता चूहों में विद्वेष प्रत्यारोपण के माध्यम से सीमित कमजोर पड़ने परख और ट्यूमर संक्षिप्त ीकरण के माध्यम से उपजीपन की पुष्टि के रूप में पहले 22वर्णित है ।
  2. उप-सत्कार न्यूरोस्फीयर
    1. जब गोले बनते हैं और 200-500 माइक्रोन के बीच व्यास तक पहुंचते हैं, तो न्यूरोस्फीयर को 15 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 5 मिन के लिए 110 x ग्राम पर स्पिन करें।
    2. पूर्व गर्म सेल टुकड़ी समाधान के 1 mL में न्यूरोस्फीयर को फिर से निलंबित करें।
    3. 1.5 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. 150 माइक्रोन के लिए एक P200 पिपेट सेट करें और न्यूरोस्फीयर को अलग करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ट्राइट्यूरेट करें।
    5. एक 15 mL ट्यूब के लिए विसोसिएट कोशिकाओं स्थानांतरण। न्यूरोस्फीयर मीडिया के 4 mL जोड़ें और 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें।
    6. न्यूरोस्फीयर मीडिया के 5 mL में सुपरनेटेंट और रीसस्पेंड कोशिकाओं को हटा दें। सेल निलंबन के 10 μL ले लो और tripan नीले रंग के 10 μL के साथ पतला। 4 mL की अंतिम मात्रा में 1 x 106 कोशिकाओं/60 मिमी पकवान के घनत्व पर एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर और प्लेट का उपयोग करसेल निलंबन के 10 μL गिनती ।
    7. जरूरत के अनुसार सप्ताह में 2 बार मीडिया और उपसंस्कृति कोशिकाओं को ताज़ा करें। जब न्यूरोनल बेसल मीडिया w/o विटामिन ए में वांछित पूरे न्यूरोस्फीयर फ्रीज 10% DMSO के साथ पूरक । P4 के बाद प्रयोगों के लिए न्यूरोस्फीयर का उपयोग किया जा सकता है।

3. चूहा पृष्ठीय रूट गंगलिया (डीआरजी), ओलिगोडेन्रोसाइट्स (ओपीसी) और एचजीसी की विभाजित संस्कृति

  1. डिब्बाित संस्कृति व्यंजन ों की तैयारी
    नोट: डीआरजी की नियोजित फसल से पहले के दिनों में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें।
    1. विभाजित संस्कृति व्यंजन ों को इकट्ठा करें।
    2. बाँझ आसुत एच2ओ में 500 μg/mL के लिए पतला कोलेजन स्टॉक समाधान; अच्छी तरह मिलाएं।
    3. बाँझ हस्तांतरण पिपेट के साथ, कोलेजन समाधान के 2 मिलील के साथ एक 35 मिमी संस्कृति पकवान भरें; समाधान निकालें, पीछे कोलेजन की एक पतली फिल्म छोड़कर अगले 35 मिमी पकवान में रखें। इस प्रक्रिया को दोहराएं, आवश्यकतानुसार अधिक कोलेजन समाधान जोड़ें, जब तक कि सभी व्यंजनों को लेपित न किया जाए।
    4. एक बार सभी प्लेटों को लेपित कर दिया जाता है, एक २४५ मिमी x २४५ मिमी संस्कृति ट्रे में प्लेटों जगह है और ट्रे के केंद्र में तीन 1 मिमी x 1 मिमी धुंध पैड रखना ।
    5. कोलेजन को बहुलक बनाने के लिए, केंद्रित अमोनियम हाइड्रोक्साइड के 1 एमएल के साथ गीले धुंध पैड और 15 मिन के लिए ट्रे को कवर करें।
    6. धुंध पैड निकालें और लैमिनार प्रवाह हुड में सूखने के लिए 35 मिमी व्यंजन की अनुमति दें।
    7. जबकि व्यंजन सूख रहे हैं, उच्च वैक्यूम तेल के साथ सिरिंज तेल एप्लिकेटर की बैरल लोड। डिब्बाबंद कक्षों को आसुत पानी से भरी एक बड़ी माउथ मीडिया बोतल में रखें। ऑटोक्लेव िंग द्वारा दोनों को स्टरलाइज करें और ठंडा होने दें।
    8. एक कुंद टिप बनाने के लिए एक 18-जी की बात से फ़ाइल । 70% इथेनॉल में स्टरलाइज करें। तेल सिरिंज के लिए सुई संलग्न करते हैं।
    9. 70% इथेनॉल में भिगोकर पिन रेक को स्टरलाइज करें; इसे लैमिनार फ्लो हुड में हवा-सूखी होने दें।
    10. एक सूखी, कोलेजन लेपित 35 मिमी पकवान से ढक्कन निकालें। अंगूठे और सूचक उंगली के बीच पकवान पकड़ो। पिन रेक को दूसरे हाथ से पकड़ो। पकवान के केंद्र में भी 200 μM व्यापक खरोंच बनाने के लिए एक दृढ़ दबाव लागू करें।
    11. एक चरागाह पिपेट का उपयोग करके, खरोंच के केंद्र में पूरक न्यूरोनल बेसल मीडियम की दो बूंदें रखें।
    12. सभी व्यंजनों को खरोंच नहीं किया गया है जब तक चरण 3.1.10-3.1.11 दोहराएं।
    13. एक लैमिनार प्रवाह हुड में डिब्बाों कक्षों सूखी।
    14. बाँझ हीमोस्टैटिक संदंश के साथ, केंद्र डिवाइडर से एक डिब्बाबंद कक्ष को समझें। हीमोस्टैटिक संदंश को पलटें ताकि कक्ष के नीचे का सामना करना पड़ रहा हो।
    15. शीर्ष पर शुरू होते हुए डिब्बाों वाले कक्ष में सिलिकॉन तेल लगाएं। सुनिश्चित करें कि तेल बड़े करीने से रखा जाता है और सभी कोनों पर ओवरलैप करता है।
    16. ढक्कन को 35 एमएम डिश से निकाल लें। पकवान उलटा और कक्ष के ऊपर खरोंच जगह है। प्लेट के नीचे धीरे-धीरे संदंश की एक जोड़ी के साथ टैप करें।
    17. धीरे-धीरे हीमोस्टैटिक संदंश का उपयोग करके प्लेट को पलटें। संदंश जारी करें।
    18. केंद्र के डिब्बे के आधार पर तेल का एक टीला रखें। प्रत्येक कक्ष को पूरक न्यूरोनल बेसल मीडियम (एनबी) से भरें और लीक की जांच करें। जरूरत के अनुसार सिलिकॉन तेल के साथ सील लीक।
    19. सभी संस्कृति व्यंजन कोडांतरण जारी रखें और 37 ° पर रात भर स्टोर करें, 5% सीओ2।
  2. डिब्बाित चैंबर में चूहा डीआरजी न्यूरॉन्स और संस्कृति का अलगाव
    1. सीओ2 एस्फिक्सिशन या रासायनिक ओवरडोज द्वारा एक समय पर गर्भवती E16 स्प्राग-डावले चूहे का बलिदान करें।
    2. जानवर को एक साफ सतह पर सुपीन स्थिति में रखें; पेट को 70% इथेनॉल से कीटाणुरहित कर दें।
    3. संदंश के साथ निचले पेट की त्वचा को समझें और धीरे से उठाएं।
    4. कैंची का उपयोग करना, जानवर के मिडलाइन के साथ एक "मैं" चीरा बनाने के लिए, ध्यान रखने के लिए पेट की दीवार की मांसपेशियों पंचर नहीं है ।
    5. संदंश की एक साफ जोड़ी के साथ, मांसपेशियों की दीवार को समझें और गर्भाशय या आंतों को पंचर न करने के लिए सावधानी का उपयोग करके कैंची की एक साफ जोड़ी के साथ एक ट्रांसवर्स चीरा बनाएं।
    6. कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ, गर्भाशय को समझें और धीरे-धीरे सीधे पेरिटोनियल गुहा से बाहर उठाएं।
    7. ताजा, बाँझ कैंची का उपयोग करना, प्रत्येक गर्भाशय सींग के आधार पर संयोजी ऊतक क्लिप।
    8. पूरे गर्भाशय को बाँझ 100 एमएम टिश्यू कल्चर डिश में रखें।
    9. गर्भाशय को विच्छेदन के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड में ले जाएं।
    10. गर्भाशय से भ्रूण निकालें, एक समय में एक, एमनियोटिक थैली के माध्यम से कतरन और धीरे से भ्रूण बाहर चिढ़ा और एक ६० मिमी 1x कलम-स्ट्रेप के साथ एल-15 के 5 mL युक्त पकवान में ।
    11. ठीक संदंश के साथ, एक 60 मिमी 1x कलम-स्ट्रीप के साथ एल-15 के 5 mL युक्त पकवान में 3-4 भ्रूण जगह है।
    12. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत काम करना और एक समय में एक भ्रूण के साथ, डेपुटेशन द्वारा इच्छामृत्यु।
    13. भ्रूण वेंट्रल साइड ऊपर लेट जाएं और अंगों और पूंछ को हटा दें।
    14. ठीक संदंश के साथ, जानवर में एक मिडलाइन चीरा बनाएं।
    15. पृष्ठीय संरचनाओं, विशेष रूप से रीढ़ की हड्डी जो पूरा होने पर दिखाई देना चाहिए बेनकाब करने के लिए आंतरिक अंगों और ऊतकों को हटा दें।
    16. कशेरुकी स्तंभ और रीढ़ की हड्डी नहर के बीच माइक्रो-विच्छेदन कैंची का एक ब्लेड रखें और रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए कशेरुकी स्तंभ के माध्यम से सावधानी से काटा जाए। रीढ़ की हड्डी के माध्यम से क्लिप न करने का ध्यान रखें।
    17. ठीक संदंश के साथ, रीढ़ की हड्डी के रोस्ट्रल अंत को हल्के से समझें और धीरे-धीरे भ्रूण से बाहर निकलें। डीआरजी को रीढ़ की हड्डी से जोड़ा जाएगा।
    18. रीढ़ की हड्डी ट्रांसफर करें और डीआरजी को 35 एमएम डिश से अटैच करें जिसमें 1x पेन-स्ट्रेप के साथ एल-15 की 2 मिलीलीटर हो। बर्फ पर रखें।
    19. एक बार सभी रीढ़ की हड्डी अलग कर दिया गया है, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत रूप से रीढ़ की हड्डी से DRGs बांधना । डीआरजी को एक ताजा 35 मिमी पकवान में रखें।
    20. यदि द्रग पर तंत्रिका जड़ें मौजूद हैं, तो उन्हें क्लिप करें।
    21. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर से तैयार 35 मिमी व्यंजन निकालें। मीडिया को पिछले दिन से हटा दें। केंद्र के डिब्बे में 10 माइक्रोन 5-फ्लोरो-2'-डिऑक्सीयूरीडीन (FUDR) युक्त पूरक न्यूरोनल बेसल मीडिया (एनबीएफ) के 80 माइक्रोन और प्रत्येक बाहरी डिब्बे में मीडिया के 250 माइक्रोन रखें।
    22. प्रत्येक केंद्र के डिब्बे में 2 गैंगलिया रखें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के लिए व्यंजन वापस करें।
    23. अगले दिन एनबीएफ का 2.5 एमएल जोड़ें।
    24. तालिका 1में अनुसूची के बाद संस्कृतियों को खिलाएं, डीआरजी प्रस्तुत करने के लिए चुने गए दिन के आधार पर शेड्यूल में फेरबदल करें।
    25. 21 दिन (या जब एक्सोन डिस्टल डिब्बों के अंत तक पहुंचते हैं), या तो जीबीएम न्यूरोस्फीयर के साथ बीज संस्कृतियां (3.2.26 कदम आगे बढ़ें) और लाइव छवि या ओलिगोडेन्क्रोसाइट्स संस्कृतियों के साथ संस्कृतियों को myelinate (3.3 कदम के लिए आगे बढ़ें) और फिर जीबीएम न्यूरोस्फीयर के साथ बीज myelination के बाद।
    26. प्रत्येक डिस्टल डिब्बाडेड चैंबर में पूरक एनबी मीडियम को प्रतिस्थापित करें जिसे 10% एफबीएस वाले पूरक एनबी माध्यम के साथ जीबीएम न्यूरोस्फीयर के साथ वरीयता प्राप्त किया जाएगा।
    27. 10 μL करने के लिए सेट एक P20 पिपेट के साथ, संस्कृति पकवान से एक जीबीएम न्यूरोस्फीयर हटा दें । जीबीएम न्यूरोस्फीयर आकार में लगभग 200 माइक्रोन को मापना चाहिए।
    28. डिस्टल चैंबर में पिपेट की नोक रखें और धीरे-धीरे जीबीएम न्यूरोस्फीयर को निष्कासित करें ताकि यह धीरे-धीरे डिस्टल चैंबर के हिस्से में अक्षों पर गिर जाए जो केंद्र कक्ष के सबसे करीब है, केंद्र कक्ष के पास एक्सोन पर। पिपेट टिप को अक्षत को बाधित न होने देने के लिए सावधान रहें।
    29. जीबीएम न्यूरोस्फीयर को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में संस्कृति छोड़ दें।
    30. एक बार न्यूरोस्फीयर संलग्न हो जाने के बाद, बहुत सावधानी से डिस्टेंस डिब्बे में मीडिया को पूरक एनबी माध्यम से बदल ें।
    31. 3-7 दिनों के लिए लाइव छवि संस्कृतियों, जरूरत के रूप में मीडिया जोड़ने । इस मामले में, माइक्रोस्कोप (जैसे, Zeiss Axiovert) से जुड़े एक नियंत्रित सीओ2 लाइव सेल बाड़े का उपयोग ब्राइटफील्ड का उपयोग करके 7 दिनों तक सेल माइग्रेशन की लगातार निगरानी करने के लिए किया गया था। छवियों को संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर हर 10 min का अधिग्रहण किया गया । एचजीसी का उपयोग करके उसी प्रोटोकॉल को दोहराएं जो एफएफपी को व्यक्त करने के लिए स्थिर रूप से ट्रांसट्रांस किया गया है और छवियों को ब्राइटफील्ड और 488 एनएम लेजर के संयोजन का उपयोग करके कैप्चर किया गया था।
      नोट: न्यूरोस्फीयर लेंटिवायरस के साथ ट्रांसड्यू किया जा सकता है या प्लाज्मिड या सिनासे से ट्रांस्प हो सकता है। डिब्बों को प्रवास का अध्ययन करने के लिए वांछित छोटे अणु अवरोधकों के साथ भी इलाज किया जा सकता है।
  3. ओलिगोडेन्रोसाइट्स के साथ डीआरजी एक्सन्स का Myelination
    1. ओलिगोडेन्रोसाइट आइसोलेशन से एक दिन पहले डीआरजी में एनबी मीडियम को सी-मीडियम से बदल दें ।
    2. विच्छेदन से पहले, पाकिन बफर के 10 mL को इनक्यूबेटर में 60 मिमी पकवान में समान करने के लिए रखें।
    3. लैमिनार फ्लो हुड में, एक 100 मिमी डिश और बर्फ ठंडएचएसएस के साथ एक 60 मिमी पकवान भरें। बर्फ पर रखें।
    4. डेपुटेशन द्वारा पी 2 चूहे के पिल्ले का त्याग करें। कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर त्वचा को हटा दें। त्वचा को हटाने के बाद, ठीक कैंची की एक जोड़ी के साथ मिडलाइन के साथ खोपड़ी काट ें।
    5. धीरे-धीरे ठीक संदंश के साथ खोपड़ी को हटा दें। एक स्पैटुला का उपयोग करना, धीरे-धीरे खोपड़ी के नीचे से मस्तिष्क को स्कूप करें और उल्टे ऊतक संस्कृति प्लेट ढक्कन में स्थानांतरित करें।
    6. सेरिबैलम निकालें और सेरेब्रल मगोलों में सेरेब्रम विभाजित करें। प्रत्येक गोलार्द्ध के सेरेब्रल कॉर्टेक्स के नीचे घ्राण बल्ब, हिप्पोकैम्पस और बेसल गैंगलिया निकालें। सेरेब्रल कॉर्टेक्स को एचबीएसयुक्त 100 एमएम डिश में रखें। शेष जानवरों के लिए चरण 3.3.4-3.3.6 दोहराएं।
    7. एक समय में एक कॉर्टेक्स के साथ काम करना, ठीक ड्यूमोंट संदंश के साथ मेनिंग्स को हटा दें। सभी मेनिंग्स-फ्री कॉर्टिस को एचबीएसके साथ ताजा 60 मिमी व्यंजनों में रखें।
    8. कॉर्टिकल ऊतक को 1 मिमी3 टुकड़ों में पासा करें। बर्फ पर रखें।
    9. एक 15 mL ट्यूब में समान पापिन बफर रखें। पाकिन और 2 मिलीग्राम एल-साइस्टीन की 200 यूनिट्स जोड़ें। बाँझ DNase I के 200 μL जोड़ें और फ़िल्टर करें।
    10. diced मस्तिष्क ऊतक से HBSS निकालें और 3.3.2 से Papain बफर के साथ बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस में डिश रखें, 80 मिन के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर, धीरे-धीरे हर 15 मिन मिलाते हैं।
    11. पचाने वाले ऊतक को 50 मिलीएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें और सी-मीडियम के 2 एमसीएल जोड़ें।
    12. ऊतक को अलग करने के लिए 5 mL सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ ट्राइटुरेट; ऊतक के बड़े टुकड़ों को व्यवस्थित करने की अनुमति दें। अधिनेता निकालें और एक बाँझ 15 mL ट्यूब में जगह है।
    13. सी-मीडियम के 2 mL जोड़ें और एक बार फिर 5 mL सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ ट्राइट्यूरेशन दोहराएं। एक 1 mL पिपेट टिप पर स्विच करें और तब तक ट्राइट्यूरेट करें जब तक कि ऊतक पूरी तरह से अलग न हो जाए। 15 mL ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
    14. 15 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर त्रिवित ऊतक को स्पिन करें। DMEM-ITS-G मध्यम के 8 mL में सुपरनेटेंट को सावधानी से हटा दें और पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    15. प्री-वेट एक बाँझ 30 माइक्रोएम सेल छलनी पीबी बफर के 2 mL के साथ। एक 50 mL ट्यूब पर सेल छलनी रखें और एक समय में सेल निलंबन 1 mL फ़िल्टर करें। पीबी बफर के 5 mL के साथ फिल्टर कुल्ला।
    16. सेल निलंबन को 100 मिमी जीवाणु प्लेट में स्थानांतरित करें; माइक्रोग्लिया को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 15 मिन के लिए इनक्यूबेटर।
    17. मीडिया निकालें और एक 15 mL ट्यूब में जगह है । डीएमईएम-आईटीएस-जी माध्यम के 2 mL के साथ प्लेट को धीरे से कुल्ला एंटोक करें और 15 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    18. सेल निलंबन को धीरे से फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन के 10 μL ले लो और tripan नीले रंग के 10 μl के साथ पतला। एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करसेल निलंबन के 10 μl गिनती।
    19. 10 00 00 मीटर के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन।
    20. एस्पिरेट सुपरनेटेंट पूरी तरह से और हर 1 x 107 कोशिकाओं के लिए पीबी बफर के 70 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 10 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    21. हर 1 x 107 कोशिकाओं के लिए एंटी-A2B5 माइक्रोमोतियों के 20 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    22. 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र में 10 मिन के लिए हर 1 x 107 कोशिकाओं के लिए पीबी बफर का 1-2 मीटर और 300 x ग्राम पर अपकेंद्री जोड़ें।
    23. एस्पिरेट सुपरनेट पूरी तरह से। पीबी बफर के 500 माइक्रोन में कुल 108 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर रखें।
    24. एक सेपरेटर के चुंबकीय क्षेत्र में एक चुंबकीय मनका कॉलम रखें।
    25. पीबी बफर के 500 माइक्रोन के साथ रिंसिंग करके कॉलम तैयार करें। कॉलम में सेल सस्पेंशन लगाएं। अपशिष्ट कंटेनर में प्रवाह-थ्रू को त्यागें (इसमें संयुक्त राष्ट्र-लेबल कोशिकाएं शामिल हैं)।
    26. कॉलम को 3 बार पीबी बफर के 500 माइक्रोन के साथ धोएं। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    27. कॉलम को चुंबकीय विभाजक से निकालें और संग्रह ट्यूब में रखें।
    28. कॉलम पर पीबी बफर का पिपेट 1 एमएल। कॉलम में प्लंजर को मजबूती से धकेलकर चुंबकीय लेबल वाली कोशिकाओं को फ्लश करें।
    29. सेल अंश में सी-मीडियम का 4 mL जोड़ें और 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर स्पिन करें।
    30. N2B2 मीडियम के 5 mL में सुपरनेट और रिसस्पेंड निकालें। सेल निलंबन के 10 μL ले लो और tripan नीले रंग के 10 μL के साथ पतला। एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करसेल निलंबन के 10 μL गिनती।
    31. प्लेट ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स प्रति विभाजित कक्ष में 150,000 कोशिकाओं की एकाग्रता पर पूरी तरह से विस्तारित एक्सोन के साथ डीआरजी युक्त होती है।
    32. अगले दिन बिहेजाकक्ष में मीडिया को N2B2 में बदलने के लिए myelination के लिए अनुमति देते हैं । हर 2-3 दिन में मीडिया को बदलें। 14 दिन में मायलेशन पूरा हो जाएगा।
    33. 14 दिन, 3.2.26-3.2.32 में एक जीबीएम न्यूरोस्फीयर के साथ बीज संस्कृति। किसी भी प्रयोग की अवधि के लिए N2B2 मध्यम में myelinated संस्कृतियों को बनाए रखें ।
      नोट: प्रोटोकॉल चित्रा 1में एक प्रवाह चार्ट योजनाबद्ध के रूप में प्रस्तुत किया गया है ।

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Representative Results

एचजीसी की बातचीत का अध्ययन करने के लिए हमने शुद्ध डीआरजी एक्सोन उत्पन्न किए जैसा कि पहले15,16,17,18वर्णित था। इन शुद्ध डीआरजी एक्सॉन को तब एचजीसी के साथ वरीयता दी गई थी, जिसने एक्सोनल नेटवर्क के भीतर एकीकृत GFAP +/Ki67 + ट्यूमर जैसी संरचनाओं का गठन किया था, जबकि व्यक्तिगत एचजीसी या तो सहयोग में या एक्सॉन(चित्रा 2)के बीच चले गए थे । यह निर्धारित करने के लिए कि एचजीसी मायलिनाल्ड एक्सोन के साथ कैसे बातचीत करते हैं, हमने डीआरजी एक्सॉन संस्कृतियों को शुद्ध चूहा ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के साथ वरीयता दी और पहलेवर्णित 19,20,21के रूप में myelination को प्रेरित किया। माइलिनेट डीआरजी-ओलिगोडेनरोसाइट सह-संस्कृतियों पर एचजीसी के अलावा यह पता चला है कि एचजीसी माइलिनेट किए गए एक्सोन के सहयोग से माइग्रेट होता है और हमारे हालिया पेपर(चित्रा 3)22में दिखाए गए छद्म ओजस्वी के गठन के माध्यम से ट्यूमर द्रव्यमान से दूर होजाता है। ओलिगोडेन्रोसाइट मायलेनेशन को मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) संस्कृतियों के धुंधला होने का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। इन संस्कृतियों में एचजीसी के प्रवास की मात्रा निर्धारित करने के लिए हमने छवि जे सॉफ्टवेयर22का उपयोग करके पलायन करने वाले एचजीसी द्वारा कब्जा की गई संस्कृति के कुल क्षेत्रफल को मापा ।

सोमवार बुधवार शुक्रवार
दिन 1 एनबीएफ
सप्ताह 1 एनबी एनबीएफ एनबी
सप्ताह 2 एनबीएफ एनबी एनबी
सप्ताह 3 एनबी एनबी

तालिका 1: डीआरजी संस्कृतियों का भोजन कार्यक्रम।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सारांश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एचजीसी डीआरजी एक्सोन के साथ सह-संस्कृति में ट्यूमर जैसी संरचनाएं बनाते हैं। संस्कृति तय की और ट्यूमर मार्कर GFAP (लाल) और Ki67 (हरे रंग) के लिए दाग था, जबकि एक्सोन न्यूरोफिलामेंट (नीला) के साथ दाग थे । स्केल बार: 200 माइक्रोन। इस आंकड़े को हमारे हाल ही में प्रकाशित पत्र22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एचजीसीएस myelinated अक्षीय पटरियों के साथ प्रवास । एचजीसी-डीआरजी-ओलिगोडेन्ट्रोसाइट संस्कृति प्रणाली में एमबीपी के लिए लाल रंग से सना हुआ माइलिनाइज्ड एक्सोनल पटरियों के साथ स्थानांतरित होने वाले एचजीसी। स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एचसीसी के लिए माइग्रेशन अध्ययन बॉयडन चैंबर सिस्टम या स्क्रैच परख का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, हालांकि ये प्रयोग अन्य आसपास के ऊतकों के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत के बारे में कोई जानकारी देने में विफल रहते हैं, वर्तमान प्रणाली माइलिनेड और गैर-myelinated फाइबर के साथ जीसी बातचीत को संक्षिप्त कर सकती है। इसके अलावा, ट्यूमर गठन और अंत बिंदु प्रवास का अध्ययन करने के लिए, कृंतक मस्तिष्क की ऑर्गानाटिपिक स्लाइस संस्कृतियों या कृंतक मस्तिष्क या पार्श्व में ग्लियो कोशिकाओं के वीवो प्रत्यारोपण में पहले23,24,25का उपयोग किया गया है। ग्लियोमा कोशिकाओं के त्रि-आयामी मॉडलिंग पर हाल के प्रयासों में कोलेजन लेयर्स26,27,28, एस्ट्रोसाइट आधारित मचान29,30, अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स परतें31, इलेक्ट्रोस्पन नैनोफाइबर32और हाइड्रोगेल33जैसी प्रणालियों का उपयोग किया गया है । हालांकि इन प्रयोगों से प्रवासन के बारे में संतोषजनक अंत बिंदु परिणाम पैदा होते हैं, लेकिन उनमें उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी द्वारा वास्तविक समय में अध्ययन करने की क्षमता की कमी होती है ।

यहां हमने एक कंपार्टेड चैंबर में डीआरजी सह संस्कृति तैयार करएचसी के प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक नए दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है । यदि ताजा जीबीएम ऊतक तक पहुंच उपलब्ध है, तो एचजीसीएस को अलग और सुसंस्कृत मज़बूती से किया जा सकता है। हालांकि एचजीसी शुरू में न्यूरोस्फीयर बनाने में लंबा समय लेते हैं, लेकिन क्षेत्रों के एक बार क्षेत्रों के रूप में बनाए रखने और उपसंस्कृति करने के लिए संस्कृतियों को आसानी होती है। एचजीसी संस्कृति की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक को जितनी जल्दी हो सके संसाधित किया जाना चाहिए। रिसेक्शन और प्रसंस्करण के बीच के समय को यथासंभव कम किया जाना चाहिए, और नमूनों को हमेशा बर्फ पर ले जाया जाना चाहिए।

डीआरजी को अलग करना भी आसान है, कॉर्टिकल न्यूरॉन्स की तुलना में अपने एक्सोन को लंबा बढ़ाता है और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के साथ संस्कृति में आसानी से myelinated किया जा सकता है। एचजीसी न्यूरोस्फीयर या विसोसिएटेड एचजीसी को कक्षों के डिस्टल डिब्बों में सह-संस्कारी किया जाता है, जो लाइव सेल इमेजिंग और एक्सोन और माइलिनेट फाइबर के साथ सेलुलर इंटरैक्शन के वास्तविक समय की मात्रा के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल केवल डीआरजी संस्कृतियों तक ही सीमित नहीं है, क्योंकि कॉर्टिकल न्यूरॉन्स भी अलग-थलग हो सकते हैं और इस प्रोटोकॉल में कुछ संशोधनों के साथ myelinated हो सकते हैं। इस मॉडल का उपयोग मस्तिष्क कैंसर के अन्य रूपों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

जबकि डीआरजी को अलग-थलग करने और बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत सरल है, डिब्बाों वाले कक्ष के अलावा समय लगता है और तकनीकी सीमाओं की एक भीड़ बनाता है जिसके सफल होने के लिए प्रशिक्षण और अभ्यास की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण एक समान कोलेजन कोटिंग और संस्कृति व्यंजनों की खरोंच है क्योंकि असमान या जरूरत से ज्यादा मोटी कोलेजन छील जाता है । डिब्बाों वाले कक्षों पर सिलिकॉन तेल रखते समय अत्यधिक सावधानी भी बरती जानी चाहिए। यदि सिलिकॉन तेल को वितरित करते समय दबाव का भी उपयोग नहीं किया जाता है, तो डिब्बाबंद कक्ष के नीचे अंतराल होगा जिसे मीडिया रिसाव को रोकने के लिए अतिरिक्त तेल के साथ सीलिंग की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, संस्कृति डिश फर्श के लिए डिब्बाों कक्षों का पालन करते समय न्यूनतम दबाव का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि एक्सोन एक सप्ताह के बाद बीच के डिब्बे से बाहर पार करने में विफल रहते हैं और डीआरजी अन्यथा स्वस्थ दिखता है, तो यह संभावना है कि डिब्बाों वाले कक्ष या तेल की अधिक मात्रा रखने पर बहुत अधिक दबाव लागू किया गया था।

मस्तिष्क में myelinated और गैर-myelinated एक्सोनल ट्रैक्ट के साथ एचजीसी माइग्रेशन को कुशल और प्रजनन पूर्व वीवो मॉडल की कमी के कारण अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है। हम यहां एक अभिनव पूर्व वीवो संस्कृति प्रणाली के विकास का अध्ययन करने के लिए कैसे ग्लियोमा कोशिकाओं एक्सोन और myelin, नए उपचार है कि विशेष रूप से ट्यूमर सेल प्रवास को लक्षित विकसित करने में एक महत्वपूर्ण घटक के साथ प्रवास का वर्णन । हमारी संस्कृति प्रणाली बहुमुखी है क्योंकि डिब्बों के बीच तरल अलगाव है, विभिन्न उपन्यास उपचारों का अध्ययन करने की क्षमता या ग्लियोमा सेल माइग्रेशन को प्रभावित करने वाले पदार्थों की अलग सांद्रता को सुविधाजनक बनाता है। हमारी सह-संस्कृति प्रणाली का एक अतिरिक्त लाभ एचजीसी माइग्रेशन और वास्तविक समय में विभिन्न उपचारों के प्रभावों की निगरानी करने की क्षमता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल वर्तमान में विशेष रूप से मानव सेलुलर घटकों का उपयोग करके अधिक परिष्कृत बायोमिमेटिक 3-आयामी पूर्व वीवो प्रणालियों के विकास के लिए आधार के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है जिसका उपयोग विषाक्त विज्ञान और उपन्यास दवाओं की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को न्यूरोसर्जरी विभाग, ब्राउन यूनिवर्सिटी के इंटरनल फंड्स ने एनटी को सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

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References

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