Summary
Hier präsentieren wir ein ex-vivo gemischtes monolayer Kultursystem zur Erforschung der Migration menschlicher Gliomzellen (hGC) in Echtzeit. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen hGCs und myelinierten und nicht myelinierten Axonen innerhalb einer abgeteilten Kammer zu beobachten.
Abstract
Glioblastom ist eine der aggressivsten menschlichen Krebsarten aufgrund der umfangreichen zellulären Heterogenität und der Migrationseigenschaften von hGCs. Um die molekularen Mechanismen, die der Gliomzellmigration zugrunde liegen, besser zu verstehen, ist die Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen hGCs und Axonen innerhalb der Tumormikroumgebung zu untersuchen, unerlässlich. Um diese zelluläre Interaktion zu modellieren, haben wir ein Gemischtes Kultursystem entwickelt, das aus hGCs und dorsalen Wurzelganglien (DRG) Axon-Oligodendrozyten-Kokulturen besteht. DRG-Kulturen wurden ausgewählt, weil sie effizient isoliert werden können und die langen, umfangreichen Projektionen bilden können, die für Migrationsstudien dieser Art ideal sind. Gereinigte Rattenoligodendrozyten wurden dann auf gereinigten Ratten-DRG-Axonen zugegeben und zu Myelinat induziert. Nach der Bestätigung der Bildung von kompaktem Myelin wurden hGCs schließlich der Kokultur hinzugefügt und ihre Wechselwirkungen mit DRG-Axonen und Oligodendrozyten wurden in Echtzeit mittels Zeitraffermikroskopie überwacht. Unter diesen Bedingungen bilden hGCs tumorähnliche Aggregatstrukturen, die GFAP und Ki67 exprimieren, sowohl myelinierte als auch nicht myelinierte axonale Spuren migrieren und mit diesen Axonen durch die Bildung von Pseudopodien interagieren. Unser Ex-vivo-Cokultursystem kann verwendet werden, um neuartige zelluläre und molekulare Mechanismen der hGC-Migration zu identifizieren und könnte potenziell für In-vitro-Arzneimittel-Wirksamkeitstests verwendet werden.
Introduction
Glioblastom ist einer der aggressivsten und tödlichsten Tumoren des menschlichen Gehirns. Der aktuelle Standard der Behandlung umfasst die chirurgische Resektion des Tumors gefolgt von Strahlung1 plus gleichzeitige und adjuvante Verabreichung von Temozolomid2. Selbst mit diesem multitherapeutischen Ansatz ist ein Tumorrezidiv unvermeidlich3. Dies ist teilweise auf die ausgedehnte Migrationsnatur der Tumorzellen zurückzuführen, die in das Gehirnparenchym eindringen und mehrere fingerähnliche Projektionen innerhalb des Gehirns4 erzeugen, die eine vollständige Resektion unwahrscheinlich machen.
In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Aggressivität des Glioblastoms zum Teil auf das Vorhandensein einer Population von Krebsstammzellen innerhalb der Tumormasse5,6zurückzuführen ist, die ein hohes Migrationspotenzialaufweisen 7,8, Resistenz gegen Chemotherapie und Bestrahlung9,10 und die Fähigkeit, sekundäre Tumoren zu bilden11. GSCs sind in der Lage, ursprüngliche polyklonale Tumoren zu rekapitulieren, wenn xenografted zu nackten Mäusen5.
Trotz des Wissens über den genetischen Hintergrund von Glioblastomen werden Studien zur Gliomzellmigration (GC) derzeit durch einen Mangel an effizienten In-vitro- oder In-vivo-Migrationsmodellen behindert. Bemerkenswert ist, dass, während gliomzellaxonale Wechselwirkungen, moduliert durch zelluläre und Umweltfaktoren, ein Kernbestandteil der Gliominvasion sind, gibt es nach unserem Wissen derzeit kein experimentelles System mit der Fähigkeit, diese Wechselwirkungen zu modellieren12,13,14. Um diesen Mangel zu beheben, entwickelten wir ein ex vivo-Kultursystem von primären hGCs, die mit gereinigten DRG-Axon-Oligodendrozyten kokultiviert werden, was zu einer erhöhten Expression differenzierter Tumormarker sowie einer umfangreichen Migration und Interaktion von hGCs mit myelinierten und nicht myelinierten Fasern führt. Diese ex vivo-Plattform eignet sich aufgrund ihres unterteilten Layouts für die Erprobung der Auswirkungen neuartiger Therapeutika auf hGC-Migrationsmuster.,
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Protocol
Die Protokolle für die Sammlung, Isolierung und Ausbreitung von patientenabgeleiteten menschlichen Gliomzellen wurden vom IRB-Ausschuss des Rhode Island Hospital genehmigt. Alle Tiere wurden gemäß dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren gepflegt. Alle Tiernutzungsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Rhode Island Hospital genehmigt.
1. Medien- und Pufferpräparate
- Bereiten Sie 50 ml Neurosphäre nimin vor: 1x Neuronales Basalmedium mit Vitamin A, 1x serumfreie Ergänzung mit Vitamin A, 2 mM L-Glutamin, 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml Grundfibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), 2 g/ml Heparin und 1x Antimykotikum (Anti-Anti-Anti).
- Bereiten Sie 50 ml ergänztneuronalbasales Medium vor: 1x Neuronalbasales Medium, 1x serumfreie Ergänzung, 4 g/L D-Glucose, 2 mM L-Glutamin und 50 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF).
- 500 ml N2B2 Medium: 1:1 Dulbecco es Modified Eagle Medium-Ham es F12 Nutrient Mixture (DMEM-F12), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G), 66 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 mg/ml Transferrin, 0,01 mg/ml Biotin, 6,29 mg/ml Progesteron, 5 g/ml N-Acetyl-L-Cystin (NAC) und 1 mM Putriscin. Aliquot und einfrieren bei -20 °C.
- Bereiten Sie 500 ml C-Medium vor: 1x Minimum Essential Medium (MEM), D-Glucose (endend 4 g/L), 10% fetales Rinderserum (FBS) und 2 mM L-Glutamin. Aliquot und einfrieren bei -20 °C. Fügen Sie den Nervenwachstumsfaktor (NGF) vor dem Gebrauch frisch hinzu (50 ng/ml).
- Bereiten Sie 200 ml Papain Buffer vor: 1x Earle es Balanced Salt Solution (EBSS), 100 mM Mg2SO4, 30% Glucose, 0.25 M EGTA und 1 M NaHCO3.
- Bereiten Sie 10 ml DMEM-ITS-G Medium vor: 1x DMEM, 0,5% BSA und 1x ITS-G.
- Bereiten Sie 200 ml PB-Puffer vor: 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochchen (DPBS) ohne Ca2+ und Mg2+ und 0,5% BSA. Entgasen Sie den Puffer vor dem Gebrauch und halten Sie auf Eis.
2. Isolation und Kultur von Glioma Stammzell-Neurosphären
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Isolation von Neurosphären
- Sammeln Sie IRB-zugelassenes und geduldiges frisches humanes Glioblastom (GBM) Gewebe aus dem Operationssaal. ÜBERTRAGEN Sie GBM-Proben auf Eis in DPBS mit 2x Anti-Anti-Anti auf einen BL2-zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank.
- Eine 1 cm3 GBM Probe mit minimaler Nekrose oder roter Blutkörperchen Kontamination auf eine 60 mm Platte übertragen und in 1 mm3 Fragmente schneiden; überschüssigen DPBS zu entfernen.
- Das Gewebe mit 5 ml Kollagennase/Dispase (1 mg/ml) 30 min bei 37 °C verdauen und alle 5-10 min sanft wirbeln.
- Übertragen Sie verdaute Fragmente auf ein 50 ml-Rohr und trituieren Sie durch Pipettieren mit einer 10 ml Pipette mehrmals, um das Gewebe zu dissoziieren.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen von Neurosphere Media hinzu und trituieren Sie das Gewebe erneut; die großen Fragmente begleichen.
- Entfernen Sie Medien ohne Gewebefragmente und passieren Sie langsam ein 70 -M-Zellsieb, das über ein frisches 50 ml-Rohr gelegt wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.5-2.1.6, bis das gesamte Gewebe getrennt ist, wodurch das Zellsieb nach Bedarf geändert wird.
- Drehen Sie die Zellsuspension bei 110 x g für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 ml ACK-Lysing-Puffer wieder auf, um die Kontamination roter Blutkörperchen zu entfernen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Drehen Sie die Zellsuspension bei 110 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in 10 ml Neurosphere Media wieder aus. Nehmen Sie 10 l der Zellsuspension und verdünnen Sie sie mit 10 l Trypan blau. Zählen Sie 10 l l der Zellsuspension mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer und einer Platte in 10 ml Neurosphere Media bei einer Dichte von 3 x 106 Zellen in 100 mm Suspensionskulturplatten.
- Fügen Sie 2 ml frische Neurosphere Media zur Kultur 2-3 mal pro Woche hinzu.
HINWEIS: Neurosphären werden sich innerhalb von 3-4 Wochen in Suspension bilden. Nach der Subkulierung für 2-4 mal, bestätigen Sie die Stammkraft über die begrenzende Verdünnung Assay und Tumorrekapitulation durch xenografische Transplantation bei immungeschwächten Mäusen wie zuvor beschrieben 22.
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Subkultivierung neurosphärender
- Wenn sich Kugeln bilden und einen Durchmesser zwischen 200-500 m erreichen, übertragen Sie Neurosphären auf ein 15 ml-Rohr und drehen Sie bei 110 x g für 5 min.
- Resuspend Neurosphären in 1 ml vorgewärmter Zellablösung.
- Auf ein 1,5 ml-Rohr übertragen und bei 37 °C 5 min inkubieren.
- Stellen Sie eine P200-Pipette auf 150 L und Triturat durch Pipettieren nach oben und unten, um Neurosphären zu dissoziieren.
- Übertragen Sie dissoziierte Zellen in ein 15 ml-Rohr. 4 ml Neurosphere Media hinzufügen und bei 300 x g für 5 min drehen.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in 5 ml Neurosphere Media wieder auf. Nehmen Sie 10 l der Zellsuspension und verdünnen Sie sie mit 10 l Trypan blau. Mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer und einer Platte mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/60 mm Schale in einem Endvolumen von 4 ml zählen Sie 10 l der Zellsuspension.
- Aktualisieren Sie Medien 2 mal pro Woche und Subkulturzellen nach Bedarf. Einfrieren ganze Neurosphären, wenn gewünscht in Neuronal Basalmedien mit Vitamin A ergänzt mit 10% DMSO. Neurosphären können für Experimente nach P4 verwendet werden.
3. Fachkultur von Rattendorsalwurzelganglien (DRGs), Oligodendrozyten (OPCs) und hGCs
- Zubereitung von Fachkulturgerichten
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in den Tagen vor der geplanten Ernte der DRGs aus.- Montieren Sie fachkundige Kulturgerichte.
- Kollagen-Stammlösung auf 500 g/ml in steril destillierterH2O verdünnen; gründlich mischen.
- Mit einer sterilen Transferpipette eine 35 mm Kulturschale mit 2 ml Kollagenlösung füllen; Entfernen Sie die Lösung, lassen Sie einen dünnen Film von Kollagen zurück und legen Sie es in die nächste 35 mm Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie bei Bedarf weitere Kollagenlösung hinzufügen, bis alle Gerichte beschichtet sind.
- Sobald alle Platten beschichtet sind, legen Sie die Platten in ein 245 mm x 245 mm Kulturtablett und legen Sie drei 1 mm x 1 mm Gazepads in der Mitte des Tabletts.
- Um das Kollagen zu polymerisieren, nass gaze Pads mit 1 ml konzentrierten Ammoniumhydroxid und decken Sie die Schalen für 15 min.
- Entfernen Sie Gaze-Pads und lassen Sie die 35 mm Geschirr in der laminaren Strömungshaube trocknen.
- Während der Geschirrtrocknung den Lauf des Spritzenfettapplikators mit Hochvakuumfett beladen. Legen Sie die abgetrennten Kammern in eine große Mundmedienflasche, die mit destilliertem Wasser gefüllt ist. Sterilisieren Sie sowohl durch Autoklavieren und lassen Sie abkühlen.
- Datei aus dem Punkt eines 18-G benötigt, um eine stumpfe Spitze zu machen. Sterilisieren Sie in 70% Ethanol. Befestigen Sie die Nadel an der Fettspritze.
- Sterilisieren Sie den Pin-Rake durch Einweichen in 70% Ethanol; lufttrocknen lassen in der laminaren Strömungshaube.
- Entfernen Sie den Deckel von einer trockenen, kollagenbeschichteten 35 mm Schale. Halten Sie die Schale zwischen Daumen und Zeigefinger. Halten Sie den Pin Rake mit der anderen Hand. Tragen Sie einen festen Druck auf, um sogar 200 M breite Kratzer in der Mitte der Schale zu erzeugen.
- Mit einer Weide Pipette, legen Sie zwei Tropfen von Supplemented Neuronal basal Medium in der Mitte der Kratzer.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.10-3.1.11, bis alle Gerichte zerkratzt sind.
- Trocknen Sie die abgetrennten Kammern in einer laminaren Durchflusshaube.
- Mit sterilen hämostatischen Zangen, greifen Sie eine abgeteilte Kammer durch den Mittelteiler. Drehen Sie die hämostatischen Zangen, so dass der Boden der Kammer nach oben gerichtet ist.
- Tragen Sie Silikonfett auf die Fachkammer auf, beginnend mit der Oberseite. Stellen Sie sicher, dass das Fett sauber platziert ist und sich an allen Ecken überlappt.
- Entfernen Sie den Deckel von einer 35 mm Schale. Invertieren Sie die Schale und legen Sie die Kratzer über die Kammer. Tippen Sie vorsichtig mit einem Zangenpaar auf die Unterseite der Platte.
- Drehen Sie die Platte vorsichtig um, indem Sie die hämostatischezange verwenden. Lassen Sie die Zange los.
- Legen Sie einen Fetthaufen an die Basis des Mittelfachs. Füllen Sie jede Kammer mit Supplemented Neuronal Basal Medium (NB) und überprüfen Sie auf Leckagen. Dichtunglecks mit Silikonfett nach Bedarf.
- Setzen Sie alle Kulturgerichte zusammen und lagern Sie über Nacht bei 37°, 5% CO2.
- Isolierung von Ratten-DRG-Neuronen und Kultur in der Fachkammer
- Opfern Sie eine schwangere E16 Sprague-Dawley-Ratte durchCO2-Erstickung oder chemische Überdosierung.
- Das Tier in die Supine-Position auf einer sauberen Oberfläche legen; den Bauch mit 70% Ethanol zu desinfizieren.
- Greifen Sie die Haut des Unterbauchs mit Zange und heben Sie sanft.
- Mit der Schere, machen Sie einen "Ich" Schnitt entlang der Mittellinie des Tieres, achten Sie darauf, nicht die Muskeln der Bauchwand zu durchstechen.
- Mit einem sauberen Paar Zange, greifen Sie die Muskelwand und machen einen Querschnitt mit einer sauberen Schere mit Vorsicht nicht die Gebärmutter oder Darm zu punktieren.
- Mit einem Paar stumpfer Zange, greifen Sie die Gebärmutter und heben Sie sanft gerade aus der Peritonealhöhle.
- Mit frischen, sterilen Scheren, clip das Bindegewebe an der Basis jedes Gebärmutterhorns.
- Legen Sie die gesamte Gebärmutter in eine sterile 100 mm Gewebekulturschale.
- Tragen Sie die Gebärmutter zu einer laminaren Strömungshaube zur Zerlegung.
- Entfernen Sie Embryonen aus der Gebärmutter, nacheinander, indem Sie durch den Fruchtwassersack schneiden und den Embryo sanft aus und in eine 60-mm-Schale mit 5 ml L-15 mit 1x Pen-Strep necken.
- Mit feinen Zangen 3-4 Embryonen in eine 60-mm-Schale mit 5 ml L-15 mit 1x Pen-Strep geben.
- Arbeiten unter einem Sezieren Mikroskop und mit einem Embryo zu einer Zeit, einschläfern durch Enthauptung.
- Legen Sie die embryoventrale Seite nach oben und entfernen Sie die Gliedmaßen und den Schwanz.
- Mit feinen Zangen, machen Sie einen Mittellinienschnitt im Tier.
- Entfernen Sie innere Organe und Gewebe, um die dorsalen Strukturen, insbesondere das Rückenmark, das nach Fertigstellung sichtbar sein sollte, freizulegen.
- Legen Sie eine Klinge einer mikrosezierenden Schere zwischen der Wirbelsäule und dem Rückenmarkskanal und schneiden Sie vorsichtig durch die Wirbelsäule, um das Rückenmark freizulegen. Achten Sie darauf, nicht durch das Rückenmark zu klemmen.
- Mit feiner Zange das rostrale Ende des Rückenmarks leicht erfassen und langsam aus dem Embryo herausheben. Die DRGs werden am Rückenmark befestigt.
- Rückenmark und drGs auf eine 35-mm-Schale mit 2 ml L-15 mit 1x Pen-Strep übertragen. Aufs Eis stellen.
- Sobald alle Rückenmarkse isoliert sind, verwenden Sie feine Zangen, um DRGs einzeln aus dem Rückenmark zu pfen. DRGs in eine frische 35 mm Schale geben.
- Wenn Nervenwurzeln auf DRGs vorhanden sind, schneiden Sie sie weg.
- Vorbereitete 35 mm Geschirr aus dem 37 °C, 5% CO2-Inkubator entfernen. Entfernen Sie die Medien vom Vortag. Platzieren Sie 80 L des supplementierten Neuronal Basal Media (NBF) mit 10 'M 5-Fluor-2'-Deoxyuridin (FUDR) im Mittelfach und 250 l Medien in jedem äußeren Fach.
- Platzieren Sie 2 Ganglien in jedem Mittelfach. Zurück Zum 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
- Am nächsten Tag 2,5 ml NBF hinzufügen.
- Füttern Sie die Kulturen nach dem Zeitplan in Tabelle 1, und ändern Sie den Zeitplan basierend auf dem Tag, der für den Beginn der DRG-Vorbereitung ausgewählt wurde.
- Am 21. Tag (oder wenn Axone das Ende der distalen Fächer erreichen), entweder Samenkulturen mit einer GBM-Neurosphäre (Weiter zu Schritt 3.2.26) und Live-Bild oder Myelinat der Kulturen mit Oligodendrozytenkulturen (Proceed to Step 3.3) und dann Samen mit einer GBM-Neurosphäre nach der Myelinisierung.
- Ersetzen Sie Das ergänzte NB Medium in jeder distalen Kammer, die mit einer GBM-Neurosphäre mit einem ergänzten NB Medium mit 10% FBS gesät wird.
- Entfernen Sie eine GBM-Neurosphäre aus der Kulturschale, wenn eine P20-Pipette auf 10 L eingestellt ist. Die GBM-Neurosphäre sollte etwa 200 Mikrometer groß sein.
- Legen Sie die Spitze der Pipette in die distale Kammer und vertreiben Sie die GBM-Neurosphäre langsam, so dass sie sanft auf die Axone im Teil der distalen Kammer fällt, der der Mittelkammer am nächsten ist, über die Axone in der Nähe der Mittelkammer. Achten Sie darauf, dass die Pipettespitze die Axone nicht stören lässt.
- Lassen Sie die Kultur im Biosicherheitsschrank für 1 h bei Raumtemperatur, damit die GBM-Neurosphäre befestigt werden kann.
- Sobald die Neurosphäre befestigt ist, ersetzen Sie sehr sorgfältig die Medien im distalen Fach durch Supplemented NB Medium.
- Live-Bildkulturen für 3-7 Tage, Hinzufügen von Medien nach Bedarf. In diesem Fall wurde ein kontrolliertes CO2-Lebendzellgehäuse, das am Mikroskop befestigt ist (z.B. Zeiss Axiovert), verwendet, um die Zellmigration 7 Tage lang kontinuierlich mit Hellfeld zu überwachen. Die Bilder wurden alle 10 min mit der zugehörigen Software aufgenommen. Wiederholen Sie das gleiche Protokoll mit hGCs, die stabil transfiziert wurden, um GFP auszudrücken, und Bilder wurden mit einer Kombination aus Hellfeld- und 488 nm-Laser aufgenommen.
HINWEIS: Neurosphären können mit Lentivirus transduziert oder mit Plasmiden oder SiRNAs transfiziert werden. Kompartimente können auch mit gewünschten kleinen Molekülinhibitoren behandelt werden, um Migration zu studieren.
- Myelination von DRG Axonen mit Oligodendrozyten
- Ersetzen Sie am Tag vor der Oligodendrozytenisolierung das NB Medium in den DRGs durch C-Medium.
- Vor der Zerlegung 10 ml Papain-Puffer in eine 60-mm-Schale im Brutkasten geben, um auszudemt.
- In einer laminaren Fließhaube eine 100-mm-Schale und eine 60-mm-Schale mit eiskaltem HBSS füllen. Auf Eis legen.
- Opfern Sie einen P2-Rattenwelpen durch Enthauptung. Entfernen Sie die Haut mit einer Schere. Nachdem die Haut entfernt wurde, schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie mit einer feinen Schere.
- Entfernen Sie den Schädel vorsichtig mit feinen Zangen. Mit einem Spachtel, schaufeln Sie das Gehirn vorsichtig von der Unterseite des Schädels und übertragen Sie auf eine umgekehrte Gewebekultur Platte Deckel.
- Entfernen Sie das Kleinhirn und teilen Sie das Großhirn in zwei zerebrale Hemisphären. Entfernen Sie die olfaktorischen Zwiebeln, Hippocampus, und BasalGanglien unter der Großhirnrinde jeder Hemisphäre. Legen Sie die Großhirnrinde in die 100 mm Schale, die HBSS enthält. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.4-3.3.6 für die verbleibenden Tiere.
- Arbeiten mit einem Kortex nach dem anderen, entfernen Sie die Meninges mit feinen Dumont Zange. Legen Sie alle meninges-freien Kortiken mit HBSS in frische 60-mm-Gerichte.
- Das kortikale Gewebe in 1 mm3 Stück würfeln. Auf Eis legen.
- Den ausgeglichenen Papain-Puffer in ein 15 ml-Rohr geben. Fügen Sie 200 Einheiten Papain und 2 mg L-Cystein hinzu. Filter sterilisieren und fügen Sie 200 l sterile DNase I hinzu.
- Entfernen Sie HBSS aus dem gewürfelten Hirngewebe und ersetzen Sie es durch Papain Buffer von 3.3.2. Teller in 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 80 min legen, alle 15 min sanft schütteln.
- Übertragen Sie das verdaute Gewebe in ein 50 ml-Rohr und fügen Sie 2 ml C-Medium hinzu.
- Trituat mit einer 5 ml serologischen Pipette, um das Gewebe zu dissoziieren; größere Gewebestücke absetzen lassen. Überstand entfernen und in ein steriles 15 ml-Rohr geben.
- 2 ml C-Medium hinzufügen und Trituration mit einer 5 ml serologischen Pipette noch einmal wiederholen. Wechseln Sie zu einer 1 ml Pipettenspitze und triturat, bis das Gewebe vollständig getrennt ist. Transfer in das 15 ml Rohr.
- Drehen Sie das trituierte Gewebe bei 300 x g für 15 min. Entfernen Sie überstand und resuspendpellet in 8 ml DMEM-ITS-G Medium.
- Vorbefeuchten sie ein steriles 30-M-Zellsieb mit 2 ml PB-Puffer. Legen Sie das Zellsieb über ein 50 ml-Rohr und filtern Sie die Zellsuspension 1 ml gleichzeitig. Spülen Sie den Filter mit 5 ml PB-Puffer.
- Die Zellsuspension auf eine 100 mm bakteriologische Platte übertragen; 15 min in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, um Mikroglia anbringen zu können.
- Entfernen Sie die Medien und legen Sie sie in ein 15 ml Rohr. Spülen Sie die Platte vorsichtig mit 2 ml DMEM-ITS-G Medium und übertragen Sie auf das 15 ml Rohr.
- Setzen Sie die Zellsuspension vorsichtig aus. Nehmen Sie 10 l der Zellsuspension und verdünnen Sie sie mit 10 l Trypan blau. Zählen Sie mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer 10 l der Zellsuspension.
- Drehen Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min.
- Aspirieren Sie Überstand vollständig und resuspendieren Zellen in 70 l PB Puffer für alle 1 x 107 Zellen. Gut mischen und bei 4 °C für 10 min inkubieren.
- Fügen Sie 20 l Anti-A2B5-Mikroperlen für je 1 x 107 Zellen hinzu. Gut mischen und bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie 1-2 ml PB-Puffer für je 1 x 107 Zellen und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min in einer 4 °C Zentrifuge hinzu.
- Aspirat Überstand vollständig. Resuspend bis zu insgesamt 108 Zellen in 500 l PB-Puffer. Auf Eis bleiben.
- Legen Sie eine magnetische Perlensäule in das Magnetfeld eines Separators.
- Bereiten Sie die Spalte vor, indem Sie sie mit 500 L PB-Puffer spülen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die Spalte an. Entsorgen Sie den Durchfluss in einem Abfallbehälter (dieser enthält nicht gekennzeichnete Zellen).
- Waschen Sie die Säule mit 500 L PB-Puffer 3 mal. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Trennzeichen und legen Sie sie in ein Sammelrohr.
- Pipette 1 ml PB-Puffer auf die Säule. Spülen Sie die magnetisch beschrifteten Zellen, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.
- 4 ml C-Medium in die Zellfraktion geben und bei 300 x g 10 min drehen.
- Überstand entfernen und in 5 ml N2B2 Medium wieder aufhängen. Nehmen Sie 10 l der Zellsuspension und verdünnen Sie sie mit 10 l Trypan blau. Zählen Sie mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer 10 l der Zellsuspension.
- Plattenoligodendrozyten in einer Konzentration von 150.000 Zellen pro Gekammer, die ein DRG mit vollständig verlängerten Axonen enthält.
- Am nächsten Tag ändern Sie die Medien in der abgetrennten Kammer auf N2B2, um eine Myelinisierung zu ermöglichen. Ersetzen Sie die Medien alle 2-3 Tage. Die Myelinisierung wird in 14 Tagen abgeschlossen sein.
- Am 14. Tag, Samenkultur mit einer GBM-Neurosphäre wie in 3.2.26-3.2.32. Bewahren Sie myelinierte Kulturen in N2B2 Medium für die Dauer aller Experimente auf.
HINWEIS: Das Protokoll wird in Abbildung 1als Flussdiagrammschema dargestellt.
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Representative Results
Um die Wechselwirkung von hGCs mit Axonen zu untersuchen, erzeugten wir gereinigte DRG-Axone wie zuvor beschrieben15,16,17,18. Diese gereinigten DRG-Axone wurden dann mit hGCs gesät, die GFAP+/Ki67+ tumorähnliche Strukturen bildeten, die in das axonale Netzwerk integriert waren, während einzelne hGCs entweder in Assoziation oder zwischen den Axonen migrierten (Abbildung 2). Um zu bestimmen, wie hGCs mit myelinierten Axonen interagieren, säten wir DRG-Axonkulturen mit gereinigten Rattenoligodendrozyten und induzierte Myelinisierung wie zuvor beschrieben19,20,21. Die Zugabe von hGCs an den myelinierten DRG-Oligodendrozyten-Kokulturen zeigte, dass hGCs in Verbindung mit den myelinierten Axonen wandern und durch die Bildung von Pseudopodien weg von der Tumormasse weg wandern, wie in unserer aktuellen Arbeit gezeigt (Abbildung 3)22. Oligodendrozytenmyelination kann mit Myelin Basic Protein (MBP) Färbung der Kulturen bestimmt werden. Um die Migration von hGCs in diesen Kulturen zu quantifizieren, haben wir die Gesamtfläche der Kultur gemessen, die von den migrierenden hGCs mit Der Image J Software22belegt wird.
| Montag | Mittwoch | Freitag | |
| TAG 1 | Nbf | ||
| WOCHE 1 | Nb | Nbf | Nb |
| WOCHE 2 | Nbf | Nb | Nb |
| WOCHE 3 | Nb | Nb |
Tabelle 1: Fütterungsplan der DRG-Kulturen.
Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: hGCs bilden tumorähnliche Strukturen in der Kokultur mit DRG-Axonen. Die Kultur wurde für die Tumormarker GFAP (rot) und Ki67 (grün) fixiert und gebeizt, während die Axone mit Neurofilament (blau) gefärbt wurden. Maßstabsleiste: 200 m. Diese Zahl wurde aus unserer kürzlich veröffentlichten Arbeit22geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: hGCs migrieren entlang myelinierter axonaler Spuren. hGCs, die das grüne fluoreszierende Protein (GFP) exezieren, wandern entlang myelinierter axonaler Spuren, die für MBP im hGC-DRG-Oligodendrozytenkultursystem rot gefärbt sind. Maßstabsleiste: 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Migrationsstudien für hGCs können mit Boyden-Kammersystemen oder Scratch-Assays durchgeführt werden. Während diese Experimente jedoch keine Informationen über die Wechselwirkungen von Tumorzellen mit anderen umgebenden Geweben geben, kann das gegenwärtige System GC-Wechselwirkungen mit myelinierten und nicht myelinierten Fasern rekapitulieren. Darüber hinaus wurden zur Untersuchung der Tumorbildung und Endpunktmigration, organotypischer Scheibenkulturen des Nagetierhirns oder der In-vivo-Implantation von Gliomzellen in das Nagetierhirn oder die Nagetierflanke bisher23,24,25verwendet. Neuere Bemühungen zur dreidimensionalen Modellierung von Gliomzellen haben Systeme wie Kollagenschichten26,27,28, Astrozyten-basierte Gerüste29,30, extrazelluläre Matrixschichten31, elektrogesponnene Nanofasern32und Hydrogele33verwendet. Während diese Experimente zufriedenstellende Endpunktergebnisse in Bezug auf Migration liefern, fehlt es ihnen an der Fähigkeit, in Echtzeit durch hochauflösende Mikroskopie untersucht zu werden.
Hier haben wir einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Migration von hGCs demonstriert, indem wir eine DRG-Kokultur in einer abgetrennten Kammer vorbereitet haben. Wenn der Zugang zu frischem GBM-Gewebe verfügbar ist, können hGCs zuverlässig isoliert und kultiviert werden. Obwohl hGCs zunächst eine lange Zeit brauchen, um Neurosphären zu bilden, sind die Kulturen leicht zu pflegen und Subkultur, sobald sich die Sphären bilden. Um den Erfolg der hGC-Kultur zu gewährleisten, sollte das Gewebe so schnell wie möglich verarbeitet werden. Die Zeit zwischen Resektion und Verarbeitung sollte so weit wie möglich minimiert werden, und Proben sollten immer auf Eis transportiert werden.
Das DRG ist auch leicht zu isolieren, verlängert seine Axone länger als kortikale Neuronen und kann in der Kultur mit Oligodendrozyten leicht myeliniert werden. hGC-Neurosphären oder dissoziierte hGCs werden in den distalen Abteilungen der Kammern mitkultiviert, was eine Live-Zell-Bildgebung und Echtzeit-Quantifizierung zellulärer Wechselwirkungen mit Axonen und myelinierten Fasern ermöglicht. Darüber hinaus ist dieses Protokoll nicht nur auf DRG-Kulturen beschränkt, da kortikale Neuronen auch isoliert und mit wenigen Änderungen an diesem Protokoll myeliniert werden können. Dieses Modell kann auch verwendet werden, um andere Formen von Hirntumor zu studieren.
Während das DRG relativ einfach zu isolieren und zu warten ist, ist die Zugabe der Fachkammer zeitaufwändig und schafft eine Vielzahl von technischen Einschränkungen, die Training und Übung erfordern, um erfolgreich zu sein. Entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls ist eine gleichmäßige Kollagenbeschichtung und Das Kratzen der Kulturgerichte, da ungleichmäßiges oder zu dickes Kollagen tendenziell zu schälen neigt. Auch beim Auflegen von Silikonfett auf die Fachkammern ist äußerste Vorsicht geboten. Wenn beim Dosieren des Silikonfetts nicht einmal Druck verwendet wird, gibt es Lücken entlang der Unterseite der Fachkammer, die mit überschüssigem Fett abgesiegelt werden müssen, um Einsickern von Medien zu verhindern. Darüber hinaus sollte bei der Anhaftung der Abteilkammern am Kulturschalenboden ein Minimaldruck verwendet werden. Wenn Axone nach Woche eins nicht aus dem mittleren Fach herauskreuzen und das DRG ansonsten gesund aussieht, ist es wahrscheinlich, dass beim Platzieren der Fachkammer zu viel Druck ausgeübt wurde oder eine überschüssige Menge Fett verwendet wurde.
hGC Migration entlang myelinierter und nicht myelinierter Axonaltrakte im Gehirn wurde aufgrund des Mangels an effizienten und reproduzierbaren Ex-vivo-Modellen nicht gut beschrieben. Wir beschreiben hier die Entwicklung eines innovativen Ex-vivo-Kultursystems, um zu untersuchen, wie Gliomzellen entlang von Axonen und Myelin wandern, eine entscheidende Komponente bei der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, die speziell auf die Tumorzellmigration abzielen. Unser Kultursystem ist vielseitig, da es eine flüssige Isolierung zwischen den Fächern gibt, was die Möglichkeit erleichtert, verschiedene neuartige Behandlungen oder unterschiedliche Konzentrationen von Substanzen zu studieren, die die Gliomzellmigration beeinflussen. Ein weiterer Vorteil unseres Co-Kultur-Systems ist die Möglichkeit, die hGC-Migration und die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen in Echtzeit zu überwachen. Das hier beschriebene Protokoll wird derzeit als Grundlage für die Entwicklung ausgeklügelterer biomimetischer 3-dimensionaler Ex-vivo-Systeme verwendet, die ausschließlich menschliche zelluläre Komponenten verwenden, die zur Beurteilung der Toxikologie und Wirksamkeit neuartiger Medikamente verwendet werden könnten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Department of Neurosurgery, Brown University to N.T. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
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