Summary
Här presenterar vi ett ex-vivo blandat enskiktslager kultur system för studier av Human gliom cell (HGC) migration i realtid. Denna modell ger möjlighet att observera interaktioner mellan hgcs och både myelinerade och icke-myeliniserade axoner inom en uppdelade kammare.
Abstract
Glioblastom är en av de mest aggressiva mänskliga cancerformer på grund av omfattande cellulära heterogenitet och migration egenskaper hGCs. För att bättre förstå molekylära mekanismer bakom gliom cell migration, en förmåga att studera samspelet mellan hgcs och axoner inom tumören mikromiljö är viktigt. För att modellera denna cellulära interaktion, utvecklade vi ett blandat kultur system bestående av hGCs och dorsala root ganglier (DRG) Axon-oligodendrocyte Co-kulturer. DRG kulturer valdes eftersom de kan isoleras effektivt och kan bilda de långa, omfattande prognoser som är idealiska för migration studier av detta slag. Renade råtta oligodendrocyter lades sedan på renade råtta DRG axoner och inducerade till myelinat. Efter att ha bekräftat bildandet av kompakta myelin, var hGCs slutligen till samkulturen och deras interaktioner med DRG axoner och oligodendrocyter övervakades i realtid med hjälp av Time-lapse mikroskopi. Under dessa förhållanden, hgcs bilda tumör-liknande aggregerade strukturer som uttrycker gfap och Ki67, migrera längs både myeliniserade och icke-myeliniserade axonala spår och interagera med dessa axoner genom bildandet av pseudopodia. Vårt ex vivo Co-Culture-system kan användas för att identifiera nya cellulära och molekylära mekanismer för hGC-migration och kan potentiellt användas för in vitro-testning av läkemedels effekt.
Introduction
Glioblastoma är en av de mest aggressiva och dödliga tumörer i den mänskliga hjärnan. Den nuvarande standarden på vården inkluderar kirurgisk resektion av tumören följt av strålning1 plus samtidig och adjuvant administrering av temozolomid2. Även med denna multi-terapeutiska tillvägagångssätt, tumör upprepning är oundvikligt3. Detta beror delvis på den omfattande flyttande natur tumörceller, som invaderar hjärnparenkymet skapa flera finger-liknande projektioner i hjärnan4 som gör fullständig resektion osannolikt.
Under de senaste åren har det blivit uppenbart att aggressivitet glioblastoma beror delvis på närvaron av en population av cancer stamceller inom tumör massan5,6, som uppvisar hög migrations potential7,8, resistens mot kemoterapi och strålning9,10 och förmågan att bilda sekundära tumörer11. GSCs kan rekapitulera ursprungliga polyklonala tumörer när xenografted till naken möss5.
Trots den rikedom av kunskap om den genetiska bakgrunden av glioblastomas, studier på gliom cell (GC) migration hindras för närvarande av brist på effektiva in vitro-eller in vivo migration modeller. Särskilt, medan gliom cell-axonal interaktioner modulerad av cellulära och miljömässiga faktorer är en kärnkomponent i gliom invasion, till vår kännedom finns det för närvarande inget experimentellt system med förmågan att modellera dessa interaktioner12,13,14. För att åtgärda denna brist utvecklade vi ett ex vivo kultur system av primära hgcs Co-odlade med renade DRG Axon-oligodendrocyter som resulterar i förhöjda uttryck av differentierade tumörmarkörer samt omfattande migration och interaktion av hgcs med myelinerade och icke-myeliniserade fibrer. Denna ex vivo plattform, på grund av dess uppdelade layout, är lämplig för att testa effekterna av nya Therapeutics på hGC migrationsmönster.,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen för insamling, isolering, och förökning av patient-derived humana gliom celler godkändes av IRB kommittén för Rhode Island Hospital. Alla djur upprätthölls enligt NIH-guiden för skötsel och användning av försöksdjur. Alla djur användnings protokoll godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Rhode Island Hospital.
1. media och buffertpreparat
- Förbered 50 mL av Neurosphere media: 1x neuronal basal medium w/o vitamin A, 1x serum gratis tillägg w/o vitamin A, 2 mM L-glutamin, 20 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor (EGF), 20 ng/mL grundläggande-fibroblast tillväxtfaktor (FGF), 2 μg/mL heparin, och 1x antibiotika-antimykotisk (anti-anti).
- Förbered 50 mL av kompletterat neuronal basal medium: 1x neuronala basal medium, 1x serum gratis tillägg, 4 g/L D-glukos, 2 mM L-glutamin, och 50 ng/mL nervtillväxtfaktor (NGF).
- Förbered 500 mL av N2B2 medium: 1:1 Dulbecco ' s modifierade Eagle medium-Ham ' s F12 näringsämne blandning (DMEM-F12), 1x insulin-transferrin-selen (ITS-G), 66 mg/mL bovint serum albumin (BSA), 0,1 mg/mL transferrin, 0,01 mg/mL biotin, 6,29 mg/mL progesteron, 5 μg/mL N-acetyl-L-cystin (NAC), och 1 mM putriscine. Och frys vid-20 ° c.
- Förbered 500 mL C-medium: 1x minimum viktigt medium (MEM), D-glukos (slutlig 4 g/L), 10% fetalt bovint serum (FBS), och 2 mM L-glutamin. Och frys vid-20 ° c. Lägg till nervtillväxtfaktor (NGF) färsk före användning (50 ng/mL).
- Förbered 200 mL papain buffert: 1x Earle är balanserad saltlösning (EBSS), 100 mM mg2så4, 30% glukos, 0,25 M EGTA, och 1 M NaHCO3.
- Förbered 10 mL DMEM-ITS-G-medium: 1x DMEM, 0,5% BSA och 1x ITS-G.
- Förbered 200 mL av PB buffert: 1x Dulbecco s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) utan ca2 + och mg2 + och 0,5% BSA. Degas bufferten före användning och hålla på is.
2. isolering och kultur av Glioma stamcells-Neurosfärer
-
Isolering av Neurospheres
- Samla IRB godkända och patienten samtyckt färskt humant glioblastoma (GBM) vävnad från operationssalen. Överför GBM-prover på is i DPBS som innehåller 2x anti-anti mot ett BL2 certifierat biologiskt säkerhetsskåp.
- Överför ett 1 cm3 GBM-prov med minimal nekros eller röd blod cells förorening till en 60 mm-platta och skuren i 1 mm3 fragment; ta bort eventuella överskott DPBS.
- Smälta vävnaden med 5 mL kollagenas/dispase (1 mg/mL) i 30 min vid 37 ° c och snurra försiktigt skålen varje 5-10 min.
- Överför smält fragment till en 50 mL tub och triturat genom att Pipettera med en 10 mL pipett flera gånger för att separera vävnaden.
- Tillsätt en lika volym av neurosphere media och hackad vävnaden igen; så att de stora fragmenten kan bosätta sig.
- Ta bort media utan vävnadfragment och passera sakta genom en 70 μM cell SIL placerad över en ny 50 mL tub.
- Upprepa steg 2.1.5-2.1.6 tills all vävnad har separerats, ändra cellsil efter behov.
- Snurra cellsuspensionen på 110 x g i 10 min.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera pelleten i 10 mL ACK lyserande buffert för att avlägsna förorening av röda blodkroppar. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Snurra cellsuspensionen på 110 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellerna i 10 mL av Neurosphere media. Ta 10 μL av cellsuspensionen och späd med 10 μL trypan Blue. Räkna 10 μL av cellsuspensionen med hjälp av en automatiserad cell räknare eller hemocytometern och tallrik i 10 mL Neurosphere media med en densitet på 3 x 106 celler i 100 mm fjädringsplattor.
- Tillsätt 2 mL färskt Neurosphere media till kulturen 2-3 gånger i veckan.
Obs: Neurospheres kommer att bildas i suspension inom 3-4 veckor. Efter subkultur för 2-4 gånger, bekräfta stemness via den begränsande utspädning analysen och tumör rekapitulation via xenographic transplantation i immunkomprometterade möss som tidigare beskrivits 22.
-
Subkulturering av Neurosfärer
- När sfärer bildas och når en diameter mellan 200-500 μm, överför neurosfärer till en 15 mL tub och snurra på 110 x g i 5 min.
- Omsuspendera neurosfärer i 1 mL förvärmda cell avskiljande lösning.
- Överför till en 1,5 mL tub och inkubera vid 37 ° c i 5 min.
- Ställ en P200-pipett till 150 μL och triturat genom att Pipettera upp och ner för att separera neurospheres.
- Överför separerade celler till en 15 mL tub. Tillsätt 4 mL Neurosphere media och snurra på 300 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellerna i 5 mL av Neurosphere media. Ta 10 μL av cellsuspensionen och späd med 10 μL trypan Blue. Räkna 10 μL av cellsuspensionen med hjälp av en automatiserad cell räknare eller hemocytometern och tallrik med en densitet av 1 x 106 celler/60 mm skålen i en slutlig volym av 4 ml.
- Uppdatera media 2 gånger i veckan och subkulturceller efter behov. Frysa hela neurospheres när så önskas i neuronala basal Media w/o vitamin A kompletteras med 10% DMSO. Neurosfärer kan användas för experiment efter P4.
3. compartmented kultur av råtta dorsala root ganglier (DRGs), oligodendrocyter (OPCs) och hGCs
- Beredning av fackindelade kultur rätter
ANMÄRKNINGAR: utför följande steg dagarna före den planerade skörden av DRGs.- Montera fackindelade kultur rätter.
- Späd kollagen stamlösningen till 500 μg/mL i steril destillerat H2O; blanda noga.
- Med en steril överföringspipett fyller du en 35 mm odlings rätt med 2 mL kollagen lösning; ta bort lösningen, lämnar en tunn hinna av kollagen bakom och placera den i nästa 35 mm skålen. Upprepa denna process, lägga till mer kollagen lösning som behövs, tills alla rätter har bestruket.
- När alla plåtar är belagda, placera plattorna i en 245 mm x 245 mm odlings bricka och Lägg tre 1 mm x 1 mm gasväv kuddar i mitten av facket.
- För att polymerisera kollagen, våta kompress kuddar med 1 mL koncentrerad ammoniumhydroxid och täcka facken i 15 min.
- Ta bort gasväv och låt de 35 mm rätter torka i laminärt flöde huva.
- Medan rätterna torkar, Ladda fat av sprutan fett applikatorn med högvakuum fett. Placera de fackindelade kammarna i en stor mun Media flaska fylld med destillerat vatten. Sterilisera både genom autoklav och låt svalna.
- Fil av poängen med en 18-G nålas att göra en trubbig spets. Sterilisera i 70% etanol. Fäst nålen på fettsprutan.
- Sterilisera stift räfsa genom blötläggning i 70% etanol; Låt den lufttorka i den laminära flödes huven.
- Ta bort locket från en torr, kollagen belagda 35 mm skålen. Håll skålen mellan tummen och pekfingret. Håll stift räfsa med den andra handen. Applicera ett fast tryck för att skapa även 200 μM breda repor över mitten av skålen.
- Med hjälp av en betesmark pipett, placera två droppar kompletteras neuronala basal medium i mitten av repor.
- Upprepa steg 3.1.10-3.1.11 tills alla rätter har repats.
- Torka de uppdelade kammarna i ett laminärt flyt skydd.
- Med sterila hemostatiska forceps, fattningsförmåga en fackindelade kammare vid centrera avdelare. Vänd den hemostatiska tångeps så botten av kammaren är vänd uppåt.
- Applicera silikonfett på den uppdelade kammaren, med början högst upp. Se till att fettet placeras snyggt och överlappar i alla hörn.
- Ta bort locket från en 35 mm maträtt. Vänd skålen och placera repen över kammaren. Knacka ner på botten av plattan försiktigt med ett par tång.
- Vänd försiktigt plattan över med hjälp av den hemostatiska tångeps. Släpp tång.
- Placera en hög med fett vid basen av mittfacket. Fyll varje kammare med kompletteras neuronala basal medium (NB) och kontrollera om läckor. Täta läckor med silikonfett vid behov.
- Fortsätt att montera alla kultur rätter och förvara över natten vid 37 °, 5% CO2.
- Isolering av råtta DRG neuroner och kultur i den uppdelade kammaren
- Offra en tidsinställd gravid E16 Sprague-Dawley råtta genom CO2 kvävning eller genom kemisk överdos.
- Placera djuret i ryggläge på en ren yta; desinficera buken med 70% etanol.
- Ta tag i huden på nedre delen av buken med pinps och lyft försiktigt.
- Använda sax, göra en "I" snitt längs mittlinjen av djuret, noga med att inte punktera musklerna i bukväggen.
- Med ett rent par tång, greppa muskelväggen och göra ett tvärgående snitt med en ren sax med försiktighet inte punktera livmodern eller tarmarna.
- Med ett par trubbiga tång, ta tag i livmodern och försiktigt lyfta rakt upp ur peritonealhålan.
- Använda färska, sterila sax, klämma bindväv vid basen av varje livmoder horn.
- Placera hela livmodern i en steril 100 mm vävnad kultur skålen.
- Bär livmodern till en laminär Flow Hood för dissektion.
- Ta bort embryon från livmodern, en i taget, genom att klippa genom fostersäcken och försiktigt retas embryot ut och in i en 60 mm maträtt som innehåller 5 mL L-15 med 1x penna-STREP.
- Med fin tång, placera 3-4 embryon i en 60 mm maträtt som innehåller 5 mL L-15 med 1x penna-STREP.
- Arbeta under en dissekera Mikroskop och med ett embryo i taget, euthanize av halshuggning.
- Ligg embryot ventrala Sidan upp och ta bort armar och ben och svansen.
- Med fin tång, göra en mittlinjen snitt i djuret.
- Ta bort inre organ och vävnad för att exponera rygg strukturer, särskilt ryggmärgen som bör vara synlig vid slutförandet.
- Placera ett blad av mikro-dissekera sax mellan ryggraden och ryggmärgskanalen och försiktigt skära genom ryggraden för att exponera ryggmärgen. Var noga med att inte klämma genom ryggmärgen.
- Med fin tång, lätt ta tag i rostralt änden av ryggmärgen och sakta lyfta ur embryot. DRGs kommer att fästas på ryggmärgen.
- Överför ryggmärgen och bifogade DRGs till en 35 mm maträtt som innehåller 2 ml L-15 med 1x penna-STREP. Plats på isen.
- När alla ryggmärgen har isolerats, Använd fina Pink för att individuellt plocka drgs från ryggmärgen. Placera DRGs i en ny 35 mm maträtt.
- Om nervrötter är närvarande på DRGs, klipp bort dem.
- Ta bort beredda 35 mm rätter från 37 ° c, 5% CO2 inkubator. Ta bort mediet från föregående dag. Placera 80 μL av de kompletterade neuronala basala medierna (NBF) innehållande 10 μM 5-fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) i mittfacket och 250 μL av mediet i varje yttre fack.
- Placera 2 ganglier i varje mittfack. Retur rätter till 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
- Följande dag Tillsätt 2,5 mL NBF.
- Mata kulturerna enligt schemat i tabell 1, ändra schemat baserat på den dag som valts för att börja DRG prep.
- På dag 21 (eller när axoner når slutet av distala fack), antingen frö kulturer med en GBM neurosphere (gå vidare till steg 3.2.26) och levande bild eller myelinate kulturer med oligodendrocyter kulturer (gå vidare till steg 3,3) och sedan utsäde med en GBM neurosphere efter myelinisering.
- Ersätt kompletteras NB medium i varje distala fackindelade kammare som kommer att seedade med en GBM neurosphere med kompletteras NB medium som innehåller 10% FBS.
- Med en P20 pipett inställd på 10 μL, ta bort en GBM neurosphere från kultur skålen. Den GBM neurosphere bör mäta cirka 200 mikrometer i storlek.
- Placera spetsen på pipetten i distala kammaren och utvisa GBM neurosphere långsamt så att den försiktigt faller på axonerna i den del av den distala kammaren som är närmast centrum kammaren, över axonerna nära centrum kammaren. Var noga med att inte låta pipettspetsen störa axonerna.
- Lämna kulturen i biosäkerhets skåpet för 1 h vid rumstemperatur så att GBM neurosphere att fästa.
- När neurosfären har fäst, mycket försiktigt ersätta media i distala facket med kompletteras NB medium.
- Levande bild kulturer för 3-7 dagar, lägga till media efter behov. I det här fallet användes ett kontrollerat CO2 Live-cellhölje som är anslutet till mikroskopet (t. ex. Zeiss Axiovert) för att kontinuerligt övervaka cellmigrering i 7 dagar med hjälp av brightfield. Bilder förvärvades varje 10 min med hjälp av tillhörande programvara. Upprepa samma protokoll med hjälp av hgcs som har stabilt transfekterade till Express GFP och bilder fångades med hjälp av en kombination av brightfield och 488 nm Laser.
Obs: neurosfärer kan vara sensorik med lentivirus eller transfekterade med plasmider eller sirnas. Fack kan också behandlas med önskade små molekyler hämmare för att studera migration.
- Myelinisering av DRG axoner med oligodendrocyter
- Dagen innan oligodendrocyte isolering, ersätta NB mediet i DRGs med C-medium.
- Innan dissektion, placera 10 mL papain buffert i en 60 mm maträtt i inkubatorn att equilibrate.
- I en laminär Flow Hood, Fyll 1 100 mm skålen och 1 60 mm skålen med iskallt HBSS. Plats på isen.
- Offra en P2 råtta PUP vid Decapitation. Ta bort huden med ett par sax. Efter att huden avlägsnats, skär skallen längs mittlinjen med ett par fin sax.
- Ta försiktigt bort skallen med fina pinps. Med hjälp av en spatel, försiktigt skopa hjärnan från botten av skallen och överföra till en inverterad vävnad kultur plattan locket.
- Ta bort lillhjärnan och dela upp storhjärnan i två hjärn halvklot. Ta bort lukt lökar, Hippocampus, och basal ganglier under hjärnbarken i varje halvklotet. Placera hjärnbarken i 100 mm skålen som innehåller HBSS. Upprepa steg 3.3.4-3.3.6 för de kvarvarande djuren.
- Arbeta med en cortex i taget, ta bort hjärnhinnorna med fina Dumont pinps. Placera alla meninges-fria cortices i färska 60 mm rätter med HBSS.
- Tärna den kortikala vävnaden i 1 mm3 stycken. Plats på isen.
- Placera den tempererade papain-bufferten i ett 15 mL-rör. Tillsätt 200 enheter papain och 2 mg L-cystein. Filtrera sterilisera och tillsätt 200 μL steril DNase I.
- Ta bort HBSS från den tärnade hjärnvävnaden och Ersätt med papain buffert från 3.3.2. Placera skålen i 37 ° c, 5% CO2 inkubator för 80 min, försiktigt skaka var 15 min.
- Överför den smälta vävnaden till ett 50 mL-rör och tillsätt 2 mL C-medium.
- Triturate med en 5 ml serologiska pipett att separera vävnaden; Låt större bitar av vävnad att bosätta sig. Avlägsna supernatanten och placera den i ett sterilt 15 mL rör.
- Tillsätt 2 ml C-medium och upprepa triturering med en 5 ml serologiska pipett en gång till. Byt till en 1 mL pipettspets och triturat tills vävnaden är helt separerad. Överför till 15 mL-röret.
- Snurra den triturerade vävnaden vid 300 x g i 15 min. Ta försiktigt bort supernatanten och Omsuspendera pelleten i 8 ml av DMEM-its-g-mediet.
- Pre-våt en steril 30 μM cell SIL med 2 mL av PB buffert. Placera cellen SIL över en 50 mL rör och filtrera cellsuspensionen 1 mL i taget. Skölj filtret med 5 mL PB-buffert.
- Överför cellsuspensionen till en 100 mm bakteriologisk platta; Inkubera i 15 minuter i en 37 ° c, 5% Co2 inkubator så att mikroglia kan fästas.
- Ta bort material och placera det i en 15 mL tub. Skölj plattan försiktigt med 2 mL DMEM-ITS-G-medium och överför till 15 mL-röret.
- Omsuspendera cellsuspensionen varsamt. Ta 10 μL av cellsuspensionen och späd med 10 μl trypan Blue. Räkna 10 μl av cellsuspensionen med hjälp av en automatiserad cell räknare eller hemocytometer.
- Snurra cellsuspensionen på 300 x g i 10 min.
- Aspirera supernatanten fullständigt och Omsuspendera cellerna i 70 μL PB-buffert för varje 1 x 107 celler. Blanda väl och inkubera vid 4 ° c i 10 min.
- Tillsätt 20 μl anti-A2B5 mikropärlor för varje 1 x 107 celler. Blanda väl och inkubera vid 4 ° c.
- Tillsätt 1-2 mL PB-buffert för varje 1 x 107 -cells celler och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter i en 4 ° c centrifug.
- Aspirera supernatanten helt. Omsuspendera upp till totalt 108 celler i 500 μl PB-buffert. Håll på is.
- Placera en magnetisk pärlkolonn i magnetfältet på en separator.
- Förbered kolonnen genom att skölja med 500 μL PB-buffert. Applicera cellsuspensionen i kolumnen. Kassera genomflöde i en avfallsbehållare (detta innehåller un-märkta celler).
- Tvätta kolonnen med 500 μL PB-buffert 3 gånger. Kassera genomflöde.
- Ta bort kolonnen från magnet separator och placera i ett samlingsrör.
- Pipettera över 1 mL PB-buffert till kolonnen. Spola magnetiskt märkta celler genom att trycka hårt på kolven i kolonnen.
- Tillsätt 4 mL C-medium till cell fraktionen och snurra på 300 x g i 10 minuter.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera i 5 mL N2B2 medium. Ta 10 μL av cellsuspensionen och späd med 10 μL trypan Blue. Räkna 10 μL av cellsuspensionen med hjälp av en automatiserad cell räknare eller hemocytometer.
- Platta oligodendrocyter vid en koncentration av 150 000 celler per uppdelad kammare som innehåller en DRG med helt förlängda axoner.
- Följande dag ändra media i den uppdelade kammaren till N2B2 att möjliggöra för myelinisering. Ersätt Media varje 2-3 dagar. Myelinisering kommer att slutföras inom 14 dagar.
- På dag 14, frö kultur med en GBM neurosphere som i 3.2.26-3.2.32. Upprätthålla myeliniserade kulturer i N2B2 medium under hela experiment.
Anmärkning: protokollet presenteras som ett flödesschema schematiskt i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att studera interaktionen mellan hgcs och axoner genererade vi renade DRG axoner som tidigare beskrivits15,16,17,18. Dessa renade DRG axoner var sedan seedad med hGCs, som bildade GFAP +/Ki67 + tumörliknande strukturer integreras i axonala nätverk, medan enskilda hGCs migreras antingen i förening eller mellan axonerna (figur 2). För att avgöra hur hgcs interagerar med myeliniserade axoner, såddes vi DRG Axon kulturer med renade råtta oligodendrocyter och inducerad myelinisering som tidigare beskrivits19,20,21. Tillsats av hGCs på den myelinerade DRG-oligodendrocyte Co-kulturer visade att hGCs migrera i samband med de myelinerade axoner och bort från tumör massan genom bildandet av pseudopodia som visas i vår senaste papper (figur 3)22. Oligodendrocyte myelinisering kan bestämmas med hjälp av myelin Basic protein (MBP) färgning av kulturerna. För att kvantifiera migrationen av hGCs i dessa kulturer vi mätt den totala arealen av kulturen upptas av den migrerande hGCs med hjälp av bild J programvara22.
| Måndag | Onsdag | Fredag | |
| DAG 1 | Nbf | ||
| VECKA 1 | Nb | Nbf | Nb |
| VECKA 2 | Nbf | Nb | Nb |
| VECKA 3 | Nb | Nb |
Tabell 1: matnings schema för DRG-kulturer.
Figur 1: Schematisk Sammanfattning av protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: hGCs bildar tumörliknande strukturer i medkulturen med DRG axoner. Kulturen var fast och färgas för tumörmarkörer GFAP (röd) och Ki67 (grön), medan axonerna var färgade med Neurofilament (blå). Skalbar: 200 μm. Denna siffra har modifierats från vårt nyligen publicerade Paper22. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: hgcs migrerar längs myeliniserade axonal spår. hgcs uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) migrera längs myeliniserade axonal spår färgade röda för MBP i HGC-DRG-oligodendrocyte kultur system. Skalbar: 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migrationsstudier för hGCs kan utföras med hjälp av Boyden kammar system eller Scratch analyser. Men medan dessa experiment misslyckas med att ge någon information om samspelet mellan tumörceller med andra omgivande vävnader, kan det nuvarande systemet recapitulate GC interaktioner med myeliniserade och icke-myeliniserade fibrer. Vidare, för att studera tumör bildning och slutpunkts migration, organotypic slice kulturer av gnagare hjärnan eller in vivo implantation av gliom celler i gnagare hjärnan eller flanken har tidigare utnyttjats23,24,25. Nyare insatser på tredimensionell modellering av gliom celler har utnyttjat system som kollagen lager26,27,28, astrocytbaserade ställningar29,30, extracellulära matrix lager31, elektrospun nanofibrer32, och hydrogeler33. Även om dessa experiment ger tillfredsställande slutpunkts resultat när det gäller migration, saknar de förmågan att studeras i realtid av högupplöst mikroskopi.
Här har vi visat en ny metod för att studera migration av hGCs genom att förbereda en DRG-samodling i en avdelad kammare. Om det finns tillgång till färsk GBM-vävnad kan hGCs isoleras och odlas på ett tillförlitligt sätt. Även om hGCs ta lång tid att bilda neurospheres inledningsvis, kulturerna är lätta att underhålla och subkultur när sfärerna form. För att säkerställa framgången för hGC-kulturen bör vävnaden bearbetas så snabbt som möjligt. Tiden mellan resektion och bearbetning bör minimeras så mycket som möjligt, och prover bör alltid transporteras på is.
Den DRG är också lätt att isolera, förlänger dess axoner längre än kortikala neuroner och kan lätt myeliniserade i kulturen med oligodendrocyter. HGC neurospheres eller dissocierade hgcs är co-odlade i den distala fack i kamrarna, vilket möjliggör levande cell avbildning och realtid kvantifiering av cellulära interaktioner med axoner och myeliniserade fibrer. Dessutom, detta protokoll är inte begränsat till endast DRG kulturer, som kortikala nervceller kan också isoleras och myeliniserade med några ändringar i detta protokoll. Denna modell kan också användas för att studera andra former av hjärncancer.
Medan DRG är relativt enkel att isolera och underhålla, är tillägget av den uppdelade kammaren tidskrävande och skapar en mängd tekniska begränsningar som kräver utbildning och praktik för att lyckas. Kritisk till framgången för detta protokoll är enhetlig kollagen beläggning och repor på kulturen rätter eftersom ojämn eller överdrivet tjockt kollagen tenderar att skala. Extrem försiktighet bör också iakttas när du placerar silikonfett på de uppdelade kamrarna. Om även tryck inte används medan dispensering av silikonfett, kommer det att finnas luckor längs botten av den uppdelade kammaren som kommer att kräva tätning med överflödigt fett för att förhindra läckage av media. Dessutom bör minimalt tryck användas när man ansluter sig till de uppdelade kamrarna till kultur rätt golvet. Om axoner inte passera ur mitten facket efter vecka ett och DRG ser annars frisk, är det troligt att för mycket tryck tillämpades när du placerar den uppdelade kammaren eller en överflödig mängd fett användes.
hGC-migrering längs myelinerade och icke-myelinerade axonala skrifter i hjärnan har inte varit väl beskrivna på grund av bristen på effektiva och reproducerbara ex vivo-modeller. Vi beskriver här utvecklingen av en innovativ ex vivo kultur system för att studera hur gliom celler migrerar längs axoner och myelin, en viktig komponent i att utveckla nya behandlingar som specifikt riktar tumör cell migration. Vårt kultur system är mångsidigt eftersom det finns fluidisk isolering mellan fack, vilket underlättar möjligheten att studera olika nya behandlingar eller olika koncentrationer av substanser som påverkar gliom cell migration. En ytterligare fördel med vårt Co-Culture-system är möjligheten att övervaka hGC-migration och effekterna av de olika behandlingarna i realtid. Det protokoll som beskrivs här används för närvarande som grund för utvecklingen av mer sofistikerade biomimetiska 3-dimensionella ex vivo-system med uteslutande humana cellulära komponenter som kan användas för att bedöma toxikologi och effekt av nya läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av interna medel från Institutionen för neurokirurgi, Brown University till N.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
