Summary
Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.
Abstract
Glioblastoma is een van de meest agressieve menselijke kankers als gevolg van uitgebreide cellulaire heterogeniteit en de migratie-eigenschappen van hGCs. Om de moleculaire mechanismen voor de onderliggende glioom Cell migratie beter te begrijpen, is een vermogen om de interactie tussen Hgc's en axonen binnen de tumor micro omgeving te bestuderen essentieel. Om deze cellulaire interactie te modelleren, ontwikkelden we een gemengd cultuur systeem bestaande uit hGCs en dorsale wortel ganglia (DRG) axon-oligodendrocyte co-culturen. DRG-culturen werden geselecteerd omdat ze efficiënt geïsoleerd kunnen worden en de lange, uitgebreide projecties kunnen vormen die ideaal zijn voor migratie studies van deze aard. Gezuiverde rat oligodendrocyten werden vervolgens toegevoegd aan gezuiverde rat DRG axonen en geïnduceerd aan myelinaat. Na het bevestigen van de vorming van compacte myeline, werden Hgc's uiteindelijk toegevoegd aan de co-cultuur en hun interacties met DRG axonen en oligodendrocyten werd in real-time gemonitord met behulp van timelapse-microscopie. Onder deze omstandigheden vormen Hgc's tumor-achtige geaggregeerde structuren die GFAP en Ki67 uitdrukken, migreren langs zowel myelgefluoreerde als niet-myelotische axonale tracks en communiceren met deze axonen door de vorming van pseudopodia. Ons ex vivo-co-cultuur systeem kan worden gebruikt om nieuwe cellulaire en moleculaire mechanismen van hGC-migratie te identificeren en kan mogelijk worden gebruikt voor in-vitro geneesmiddelen werkzaamheids testen.
Introduction
Glioblastoma is een van de meest agressieve en dodelijke tumoren van het menselijk brein. De huidige standaard voorzorg omvat chirurgische resectie van de tumor gevolgd door straling1 plus gelijktijdige en adjuvante toediening van temozolomide2. Zelfs met deze multi-therapeutische aanpak, tumor herhaling is onvermijdelijk3. Dit is deels te wijten aan de uitgebreide migratie aard van de tumorcellen, die de hersen parenchym het creëren van meerdere vinger-achtige projecties binnen de hersenen4 die volledige resectie onwaarschijnlijk maken.
In de afgelopen jaren is het duidelijk geworden dat de agressiviteit van multiform glioblastoom deels te wijten is aan de aanwezigheid van een populatie van kanker stamcellen binnen de tumor massa6,5, dieeen hoog migratie potentieel vertonen7,8, resistentietegen chemotherapie en straling9,10 en de mogelijkheid om secundaire tumoren te vormen11. GSCs zijn geschikt voor het recapituleren van originele polyklonale tumoren bij xenografted aan naakte muizen5.
Ondanks de rijkdom aan kennis met betrekking tot de genetische achtergrond van glioblastomas, worden studies over glioom Cell (GC) migratie momenteel gehinderd door een gebrek aan efficiënte in vitro of in vivo migratie modellen. Met name, terwijl glioom Cell-axonale interacties gemoduleerd door cellulaire en omgevingsfactoren zijn een kerncomponent van glioom invasie, naar onze kennis is er momenteel geen experimenteel systeem met de mogelijkheid om het model van deze interacties12,13,14. Om dit gebrek aan te pakken, ontwikkelden we een ex vivo cultuur systeem van primaire hGCs co-gekweekt met gezuiverde DRG axon-oligodendrocyten die resulteert in verhoogde expressie van gedifferentieerde tumormarkers evenals uitgebreide migratie en interactie van Hgc's met myelfluoren niet-myelgefluoreerde vezels. Dit ex vivo platform, vanwege zijn gecompartimengd lay-out, is geschikt voor het testen van de effecten van nieuwe Therapeutics op hGC-migratiepatronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protocollen voor het verzamelen, isoleren en propagatie van patiënten afkomstige menselijke glioom cellen werden goedgekeurd door het IRB Committee van Rhode Island Hospital. Alle dieren werden gehandhaafd volgens de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle protocollen voor dier gebruik werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Rhode Island Hospital.
1. media en buffer preparaten
- Bereid 50 mL Neurosphere media voor: 1x neuronale basale medium w/o vitamine A, 1x serum gratis supplement w/o vitamine A, 2 mM L-glutamine, 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 20 ng/mL basis-fibroblast groeifactor (FGF), 2 μg/mL heparine, en 1x antibioticum-antimycotic (anti-anti).
- Bereid 50 mL aangevuld neuronale basale medium: 1x neuronale basale medium, 1x serum gratis supplement, 4 g/L D-glucose, 2 mM L-glutamine, en 50 ng/mL zenuw groeifactor (NGF).
- Bereid 500 mL N2B2 medium: 1:1 Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium-Ham's F12 voedings mengsel (DMEM-F12), 1x insuline-Transferrin-selenium (ITS-G), 66 mg/mL boviene serumalbumine (BSA), 0,1 mg/mL transferrine, 0,01 mg/mL biotine, 6,29 mg/mL progesteron, 5 μg/mL N-acetyl-L-cystine (NAC), en 1 mM putriscine. Vries bij-20 °C.
- Bereid 500 mL C-medium: 1x minimaal essentieel medium (MEM), D-glucose (Final 4 g/L), 10% foetaal runderserum (FBS) en 2 mM L-glutamine. Vries bij-20 °C. Voeg de zenuw groeifactor (NGF) vers toe vóór gebruik (50 ng/mL).
- Bereid 200 mL papaïne buffer: 1x Earle gebalanceerde zoutoplossing (EBSS), 100 mM mg2dus4, 30% GLUCOSE, 0,25 m EGTA, en 1 m NaHCO3.
- Bereid 10 mL DMEM-ITS-G medium: 1x DMEM, 0,5% BSA, en 1x ITS-G.
- Bereid 200 mL van de PB-buffer: 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder CA2 + en mg2 + en 0,5% BSA. Degas de buffer voor gebruik en houd op ijs.
2. isolatie en cultuur van Glioom stamcel Neurosferen
-
Isolatie van neuro sferen
- Verzamelen IRB goedgekeurd en patiënt ingestemd Fresh Human multiform glioblastoom (GBM) weefsel uit de operatiekamer. Transfer GBM monsters op ijs in DPBS met 2x anti-anti tegen een BL2 gecertificeerde biologische veiligheidskast.
- Breng een monster van 1 cm3 GBM met minimale necrose of besmetting van rode bloedcellen over naar een 60 mm plaat en snijd in 1 mm3 fragmenten; Verwijder eventuele overtollige DPBS.
- Verteren het weefsel met 5 mL Collagenase/dispase (1 mg/mL) gedurende 30 minuten bij 37 °C en zwenk het gerecht zachtjes elke 5-10 min.
- Overdracht van verteerde fragmenten naar een buis van 50 ml en wrijf door pipetteren met een 10 ml pipet meerdere malen om het weefsel te ontkoppelen.
- Voeg een gelijke hoeveelheid neurosphere media toe en wrijf het weefsel opnieuw; waardoor de grote fragmenten kunnen worden vereffend.
- Verwijder media zonder weefsel fragmenten en passeren langzaam door een 70 μM celzeef geplaatst over een verse 50 mL buis.
- Herhaal de stappen 2.1.5-2.1.6 totdat al het weefsel is losgekoppeld, het wijzigen van de celzeef indien nodig.
- Draai de celsuspensie gedurende 10 minuten op 110 x g .
- Verwijder het supernatant en rebreng de pellet in 10 ml ACK lyseren buffer om besmetting van rode bloedcellen te verwijderen. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Draai de celsuspensie gedurende 5 minuten op 110 x g .
- Verwijder de supernatant-en respendeer cellen in 10 mL Neurosphere media. Neem 10 μL celsuspensie en Verdun met 10 μL trypaan blauw. Tel 10 μL van de celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer en plaat in 10 mL Neurosphere media met een dichtheid van 3 x 106 cellen in 100 mm suspensie cultuur platen.
- Voeg 2 mL verse Neurosphere media toe aan de cultuur 2-3 keer per week.
Opmerking: Neuro sferen worden binnen 3-4 weken in suspensie vormgegeven. Na de kweken voor 2-4 keer, bevestig de stemdheid via de beperkende verdunnings test en tumor recapitulatie via xenografische transplantatie bij immuungecompromitteerde muizen zoals eerder beschreven 22.
-
Subculturing neuro sferen
- Wanneer bollen vorm en bereik een diameter tussen 200-500 μm, overdracht van neuro sferen naar een buis van 15 mL en spin bij 110 x g gedurende 5 minuten.
- Respendeer neuro sferen in 1 mL pre-warmed cel loslating oplossing.
- Breng op een buis van 1,5 mL en inincuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten.
- Stel een P200 pipet in op 150 μL en wrijf door Pipetteer op en neer om neurosferen te ontkoppelen.
- Breng gezien cellen over in een buis van 15 ml. Voeg 4 mL Neurosphere media en spin toe bij 300 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder de supernatant-en respendeer cellen in 5 mL Neurosphere media. Neem 10 μL celsuspensie en Verdun met 10 μL trypaan blauw. Tel 10 μL van de celsuspensie met behulp van een geautomatiseerd cellenteller of hemocytometer en plaat met een dichtheid van 1 x 106 cellen/60 mm schaal in een eindvolume van 4 ml.
- Vernieuw Media 2 keer per week en subcultuur cellen indien nodig. Bevriezen hele neuro sferen wanneer gewenst in neuronale basale media w/o vitamine A aangevuld met 10% DMSO. Neuro sferen kunnen worden gebruikt voor experimenten na P4.
3. gecompartimenteerde cultuur van Rat dorsale wortel ganglia (Drg's), oligodendrocyten (OPCs) en Hgc's
- Bereiding van de in de cultuur keuken
Opmerking: Voer de volgende stappen uit op de dagen vóór de geplande oogst van de Drg's.- Verzamel cultuur gerechten.
- Verdun de collageen voorraadoplossing tot 500 μg/mL in steriele gedistilleerde H2O; Meng.
- Met een steriele transferpipet vult u een kweek schaal van 35 mm met 2 mL collageen oplossing; Verwijder de oplossing, laat een dun laagje collageen achter en plaats deze in de volgende 35 mm schaal. Herhaal dit proces en pas zo nodig meer collageen oplossing toe, totdat alle gerechten zijn gecoat.
- Zodra alle platen zijn gecoat, plaatst u de platen in een kweek lade van 245 mm x 245 mm en legt u drie 1 mm x 1 mm gaas pads in het midden van de lade.
- Om het collageen te polymeriseren, natte gaas pads met 1 mL geconcentreerd ammoniumhydroxide en bedekken de trays gedurende 15 minuten.
- Verwijder gaas pads en laat de 35 mm gerechten drogen in de laminaire flow Hood.
- Terwijl de gerechten drogen, laadt u de vat van de spuit smeer applicator met hoog vacuüm vet. Plaats de uitgecompartimenteerde kamers in een grote mond fles gevuld met gedistilleerd water. Steriliseer beide door autoclaven en laat afkoelen.
- Bestand uit het punt van een 18-G behoefde om een stompe tip te maken. Steriliseren in 70% ethanol. Bevestig de naald aan de smeer spuit.
- Steriliseer de PIN rake door te weken in 70% ethanol; laat het aan de lucht drogen in de laminaire stroom afzuigkap.
- Verwijder de deksel van een droge, collageen gecoate 35 mm schotel. Houd het schaaltje tussen de duim en de aanwijzer vinger. Houd de PIN rake met de andere hand. Breng een stevige druk aan om zelfs 200 μM brede krassen te maken over het midden van het gerecht.
- Plaats met behulp van een weide pipet twee druppels van het gesupplementeerd neuronale basale medium in het midden van de krassen.
- Herhaal stap 3.1.10-3.1.11 totdat alle gerechten zijn bekrast.
- Droog de compartimenteerde kamers in een laminaire stroom afzuigkap.
- Met steriele hemostatische Tang, pak een gecompartimenteerde kamer door de middelste verdeler. Draai de hemostatische Tang zodat de bodem van de kamer naar boven is gericht.
- Breng Siliconenvet aan op de compartimenten kamer, beginnend bij de bovenkant. Zorg ervoor dat vet netjes wordt geplaatst en overlappingen in alle hoeken.
- Verwijder het deksel van een 35 mm schaal. Keer de schaal om en plaats de krassen over de kamer. Tik zachtjes op de onderkant van de plaat met een paar tang.
- Draai de plaat voorzichtig om met de hemostatische Tang. Laat de Tang los.
- Plaats een heuvel vet aan de basis van het middelste compartiment. Vul elke kamer met aangevuld neuronale basale medium (NB) en controleer op lekken. Afdichting lekkages met Siliconenvet indien nodig.
- Ga verder met het assembleren van alle cultuur gerechten en bewaar 's nachts op 37 °, 5% CO2.
- Isolatie van Rat DRG neuronen en cultuur in de Compartimenteerde kamer
- Offer een getimede zwangere e16 Sprague-Dawley rat door co2 verstikking of door chemische overdosering.
- Plaats het dier in rugligging op een schoon oppervlak; Desinfecteer de buik met 70% ethanol.
- Pak de huid van de onderbuik met een tang en til zachtjes op.
- Met behulp van een schaar, maak een "I" incisie langs de middenlijn van het dier, het verzorgen van de spieren van de buikwand niet prik.
- Met een schoon paar tang, pak de spier wand en maak een dwarse incisie met een schoon paar schaar met de nodige voorzichtigheid om de baarmoeder of darmen niet door te prikken.
- Met een paar stompe Tang, pak de baarmoeder en til voorzichtig recht omhoog uit de peritoneale holte.
- Gebruik een frisse, steriele schaar en knip het bindweefsel aan de basis van elke baarmoeder hoorn.
- Plaats de hele baarmoeder in een steriele 100 mm weefselkweek schotel.
- Draag de baarmoeder naar een laminaire flow kap voor dissectie.
- Verwijder embryo's uit de baarmoeder, een voor een, door door de amniotische zak te clippen en het embryo voorzichtig te plagen en in een schaal van 60 mm met 5 mL L-15 met 1x pen-STREP.
- Plaats met Fine Tang 3-4 embryo's in een 60 mm schaaltje met 5 mL L-15 met 1x pen-STREP.
- Werken onder een ontleed Microscoop en met één embryo tegelijk, euthanitatie door onthoofding.
- Lig de embryo ventrale kant omhoog en verwijder de ledematen en de staart.
- Met fijne Tang, maak een middellijn incisie in het dier.
- Verwijder inwendige organen en weefsels om de rugstructuren bloot te leggen, met name het ruggenmerg dat zichtbaar moet zijn na voltooiing.
- Plaats een blad van micro-dissecting schaar tussen de wervelkolom en het wervelkanaal en snijd voorzichtig door de wervelkolom om het ruggenmerg bloot te leggen. Zorg dat u niet door het ruggenmerg clippen.
- Met fijne Tang, pak het rostrale migratoire uiteinde van het ruggenmerg licht en til het langzaam uit het embryo. De Drg's zullen worden bevestigd aan het ruggenmerg.
- Breng de ruggengraat en de bijgevoegde Drg's over in een schaal van 35 mm met 2 ml L-15 met 1x pen-STREP. Plaats op het ijs.
- Als alle ruggengraat koorden geïsoleerd zijn, gebruik dan fijne tang om de Drg's individueel van het ruggenmerg te plukken. Plaats de Drg's in een verse 35 mm schaal.
- Als de zenuwwortels aanwezig zijn op de Drg's, clip ze weg.
- Verwijder voorbereide 35 mm gerechten uit de incubator van 37 °C, 5% CO2 . Verwijder de media van de vorige dag. Plaats 80 μL aangevuld neuronale basale media (NBF) met 10 μM 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) in het middelste compartiment en 250 μL media in elk buitenvak.
- Plaats 2 ganglia in elk middenvak. Maaltijden terug naar de 37 °C, 5% CO2 incubator.
- De volgende dag toevoegen 2,5 mL NBF.
- Voed de culturen volgens het schema in tabel 1, en wijzigt het schema op basis van de gekozen dag om de DRG prep te starten.
- Op dag 21 (of wanneer axonen het einde van de distale compartimenten bereiken), ofwel zaad culturen met een GBM neurosphere (Ga verder naar stap 3.2.26) en live beeld of myelinaat de culturen met oligodendrocyten culturen (Ga verder naar stap 3,3) en vervolgens zaad met een GBM neurosphere na myelinisatie.
- Vervang aangevuld NB medium in elke distale gecompartimenteerde kamer die zal worden gescheiden met een GBM neurosphere met aangevuld NB medium met 10% FBS.
- Met een P20-pipet ingesteld op 10 μL, verwijdert u één GBM-neurosphere uit de kweek schaal. De GBM neurosphere moet ongeveer 200 micron in grootte meten.
- Plaats de punt van de pipet in de distale kamer en verleg de GBM-neurosphere langzaam zodat deze zachtjes op de axonen valt in het gedeelte van de distale kamer dat zich het dichtst bij de middelste kamer bevindt, over de axonen in de buurt van de middelste kamer. Zorg ervoor dat de pipetpunt de axonen niet verstoort.
- Laat de cultuur in de bioveiligheidskast 1 uur bij kamertemperatuur staan, zodat de GBM neurosphere kan worden bevestigd.
- Zodra de neurosphere heeft bevestigd, zeer zorgvuldig vervangen van de media in het distale compartiment met aangevuld NB medium.
- Live-beeld culturen gedurende 3-7 dagen, waarbij media indien nodig worden toegevoegd. In dit geval werd een gecontroleerde CO2 Live cel behuizing bevestigd aan de Microscoop (bijv. Zeiss Axiovert) gebruikt om de Celmigratie gedurende 7 dagen continu te monitoren met brightfield. Afbeeldingen werden elke 10 min met behulp van de bijbehorende software verworven. Herhaal hetzelfde protocol met behulp van Hgc's die stabiel zijn getransffecteerd tot Express GFP en beelden werden vastgelegd met behulp van een combinatie van brightfield en 488 nm laser.
Opmerking: Neurosferen kunnen worden getransducteerd met lentivirus of met plasmiden of Sirna's. Compartimenten kunnen ook worden behandeld met de gewenste kleine molecuul remmers om de migratie te bestuderen.
- Myelinisatie van DRG-axonen met oligodendrocyten
- De dag voor Oligodendrocyt isolatie, vervang de nb medium in de drg's met C-medium.
- Plaats voor het dissectie 10 mL papaïne buffer in een schaal van 60 mm in de incubator om deze te equilibreren.
- Vul in een laminaire flow kap 1 100 mm schaal en 1 60 mm schaal met ijskoude HBSS. Plaats op ijs.
- Offer een P2 rat pup door onthoofding. Verwijder de huid met een schaar. Nadat de huid is verwijderd, snijd de schedel langs de middenlijn met een paar fijne schaar.
- Verwijder voorzichtig de schedel met een fijne Tang. Met behulp van een spatel, schep voorzichtig de hersenen van de bodem van de schedel en overbrengen naar een omgekeerde weefselcultuur plaat deksel.
- Verwijder het cerebellum en verdeel de hersenen in twee hersenhelften. Verwijder de olfactorische bollen, Hippocampus, en basale ganglia onder de hersenschors van elke halfrond. Plaats de hersenschors in de 100 mm schaal met HBSS. Herhaal stap 3.3.4-3.3.6 voor de overige dieren.
- Met één cortex tegelijk werken, verwijder de hersenvliezen met de Fine Dumont-Tang. Plaats alle meninges-vrije cortices in verse 60 mm gerechten met HBSS.
- Dobbelsteen het corticale weefsel in 1 mm3 stuks. Plaats op ijs.
- Plaats een geëquilibreerd papain buffer in een buis van 15 ml. Voeg 200 eenheden van papaïne en 2 mg L-cysteïne. Filter steriliseren en voeg 200 μL steriele DNase I toe.
- Verwijder HBSS uit het blokjes hersenweefsel en vervang het met de papaïne buffer van 3.3.2. Plaats de schaal in 37 °C, 5% CO2 incubator voor 80 min, zachtjes schudden elke 15 min.
- Breng het verteerde weefsel over in een tube van 50 mL en voeg 2 mL C-medium toe.
- Trituraat met een serologische Pipet van 5 mL om het weefsel te ontkoppelen; Laat grotere stukjes weefsel te vestigen. Verwijder supernatant en plaats in een steriele 15 mL Tube.
- Voeg nogmaals 2 mL C-medium en herhaalde trituratie toe met een serologische Pipet van 5 mL. Ga naar een pipetpunt van 1 ml en wrijf totdat het weefsel volledig is losgekoppeld. Transfer naar de 15 mL Tube.
- Draai het getritureerd weefsel op 300 x g gedurende 15 min. Verwijder voorzichtig de supernatant en respendeer pellet in 8 ml DMEM-its-g medium.
- Pre-natte een steriele 30 μM celzeef met 2 mL PB buffer. Plaats de celzeef over een buis van 50 mL en filtreer de celsuspensie 1 mL tegelijk. Spoel het filter af met 5 mL PB-buffer.
- Breng de celsuspensie over in een bacteriologische plaat van 100 mm; incuberen gedurende 15 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO2 om Microglia toe te voegen.
- Verwijder de media en plaats ze in een buis van 15 mL. Spoel de plaat voorzichtig met 2 mL DMEM-ITS-G medium en breng deze over naar de 15 mL buis.
- Rebreng de celsuspensie zachtjes door. Neem 10 μL celsuspensie en Verdun met 10 μl trypaan blauw. Tel 10 μl van de celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer.
- Draai de celsuspensie gedurende 10 minuten op 300 x g .
- Aspirate supernatant volledig en respendeer cellen in 70 μL PB-buffer voor elke 1 x 107 -cellen. Meng goed en incuberen bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Voeg 20 μl anti-A2B5 microbeads toe voor elke 1 x 107 cellen. Meng goed en incuberen bij 4 °C.
- Voeg voor elke 1 x 107 cellen 1-2 ml PB-buffer toe en centrifugeer 10 minuten bij 300 x g bij een centrifuge van 4 °c.
- Aspirate supernatant volledig. Respendeert tot een totaal van 108 cellen in 500 μL PB-buffer. Blijf op ijs.
- Plaats een magnetische kraal kolom in het magnetische veld van een scheidingsteken.
- Bereid de kolom voor door het spoelen met 500 μL PB-buffer. Pas de celsuspensie toe op de kolom. Verwijder doorstroming in een afvalbak (dit bevat niet-gelabelde cellen).
- Was de kolom met 500 μL van de PB-buffer 3 keer. Doorstroom verwijderen.
- Verwijder de kolom uit het magnetische scheidingsteken en plaats deze in een verzamelbuis.
- Pipetteer 1 mL van de PB-buffer op de kolom. Spoel de magnetisch gelabelde cellen door de zuiger stevig in de kolom te duwen.
- Voeg 4 mL C-medium toe aan de celbreuk en draai bij 300 x g gedurende 10 minuten.
- Verwijder supernatant en respendeer in 5 mL N2B2 medium. Neem 10 μL celsuspensie en Verdun met 10 μL trypaan blauw. Tel 10 μL van de celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer.
- Plaat oligodendrocyten met een concentratie van 150.000 cellen per gecompartimenteerde kamer met een DRG met volledig verlengde axonen.
- De volgende dag Verander de media in de compartimenteerde kamer naar N2B2 om myelinisatie mogelijk te maken. Vervang media elke 2-3 dagen. Myelinisatie is voltooid in 14 dagen.
- Op dag 14, zaad cultuur met een GBM neurosphere zoals in 3.2.26-3.2.32. Behoud myelinehoudende culturen in N2B2 medium voor de duur van alle experimenten.
Opmerking: het protocol wordt weergegeven als een schema voor stroomdiagrammen in Figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de interactie van hgc's met axonen te bestuderen, hebben we gezuiverde DRG axonen gegenereerd zoals eerder beschreven15,16,17,18. Deze gezuiverde DRG axonen werden vervolgens geseerd met Hgc's, die GFAP +/Ki67 + tumor-achtige structuren vormden in het axonale netwerk, terwijl individuele Hgc's ofwel in associatie of tussen de axonen migreerden (Figuur 2). Om te bepalen hoe hgc's omgaan met myelinehoudende axonen, hebben we DRG axon culturen met gezuiverde rat oligodendrocyten en geïnduceerde myelinisatie zoals eerder beschreven19,20,21. Toevoeging van Hgc's op de co-culturen van DRG-oligodendrocyte toonde aan dat hGCs migreren in samenwerking met de myelgefluoreerde axonen en weg van de tumor massa door de vorming van pseudopodia zoals weergegeven in ons recente papier (Figuur 3)22. Oligodendrocyte myelinisatie kan worden bepaald met behulp van myeline Basic protein (MBP) kleuring van de culturen. Om de migratie van Hgc's in deze culturen te kwantificeren, hebben we de totale oppervlakte van de door de migrerende Hgc's bezette cultuur gemeten met behulp van image J-software22.
| Maandag | Woensdag | Vrijdag | |
| DAG 1 | NBF | ||
| WEEK 1 | NB | NBF | NB |
| WEEK 2 | NBF | NB | NB |
| WEEK 3 | NB | NB |
Tabel 1: Voedingsschema van de DRG-culturen.
Figuur 1: schematische samenvatting van het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Hgc's vormen tumorachtige structuren in co-cultuur met DRG axonen. De cultuur was vast en gekleurd voor de tumormarkers GFAP (rood) en Ki67 (groen), terwijl de axonen werden gekleurd met Neurofilament (blauw). Schaal: 200 μm. Dit cijfer is gewijzigd van ons onlangs gepubliceerde papier22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: hGCs migreren langs myelinehoudende axonale sporen. Hgc's die het groene fluorescerende eiwit (GFP) uitdrukken, migreren langs myelinehoudende axonale sporen die rood gekleurd zijn voor MBP in het cultuur systeem hGC-DRG-oligodendrocyte. Schaal: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migratie studies voor Hgc's kunnen worden uitgevoerd met behulp van Boyden Chamber Systems of Scratch assays. Echter, terwijl deze experimenten niet om enige informatie met betrekking tot de interacties van tumorcellen met andere omringende weefsels geven, het huidige systeem kan GC interacties met myelineerde en niet-myelinehoudende vezels recapituleren. Bovendien, om tumorvorming en eindpunt migratie te bestuderen, zijn organotypische segment culturen van het knaagdier brein of in vivo implantatie van glioom cellen in de hersenen of flank van het knaagdier eerder gebruikt23,24,25. Meer recente inspanningen op driedimensionale modellering van glioom cellen hebben gebruikt systemen zoals collageen lagen26,27,28, astrocyte-gebaseerde steigers29,30, extracellulaire matrix lagen31, electrospun nanovezels32, en hydrogels33. Hoewel deze experimenten bevredigende eindpunt resultaten opleveren met betrekking tot migratie, missen ze het vermogen om in real-time te worden bestudeerd door middel van hoge-resolutie microscopie.
Hier hebben we een nieuwe benadering getoond om de migratie van Hgc's te bestuderen door een DRG-co-cultuur in een gecompartimenteerde kamer voor te bereiden. Als de toegang tot vers GBM weefsel beschikbaar is, kunnen Hgc's op betrouwbare wijze worden geïsoleerd en gekweekt. Hoewel Hgc's in eerste instantie een lange tijd hebben om neurosferen te vormen, zijn de culturen gemakkelijk te onderhouden en te subcultuur zodra de bollen vorm hebben. Om het succes van de hGC-cultuur te garanderen, moet het weefsel zo snel mogelijk worden verwerkt. De tijd tussen resectie en verwerking moet zoveel mogelijk worden geminimaliseerd en monsters moeten altijd op ijs worden vervoerd.
De DRG is ook gemakkelijk te isoleren, breidt zijn axonen langer uit dan corticale neuronen en kan gemakkelijk worden myelineerd in de cultuur met oligodendrocyten. hGC-neurosferen of gedisiteerde Hgc's worden in de distale compartimenten van de kamers gecultiveerde, wat zorgt voor Live-celbeeldvorming en real-time kwantificering van cellulaire interacties met axonen en myelinehoudende vezels. Bovendien is dit protocol niet beperkt tot alleen DRG-culturen, omdat corticale neuronen ook kunnen worden geïsoleerd en myelfluormet enkele wijzigingen van dit protocol. Dit model kan ook worden gebruikt om andere vormen van hersenkanker te bestuderen.
De DRG is relatief eenvoudig te isoleren en te onderhouden, maar de toevoeging van de compartimenten is tijdrovend en creëert een veelheid aan technische beperkingen die training en praktijk vereisen om te slagen. Cruciaal voor het succes van dit protocol is uniforme collageen coating en krabben van de cultuur gerechten omdat ongelijkmatig of buitensporig dik collageen de neiging heeft om te schillen. Extreme zorg moet ook worden genomen tijdens het plaatsen van siliconen vet op de compartimenteerde kamers. Als er zelfs geen druk wordt gebruikt bij het doseren van het siliconen vet, zullen er openingen langs de onderkant van de gecompartimenteerde kamer zijn die moeten worden afdichten met overtollig vet om media lekkage te voorkomen. Bovendien moet de minimumdruk worden gebruikt bij het vasthouden van de gecompartimenteerde kamers op de bodem van de kweek schotel. Als axonen na week één niet uit het middelste compartiment kruisen en de DRG er anders gezond uitziet, is het waarschijnlijk dat er te veel druk werd uitgeoefend bij het plaatsen van de gecompartimenteerde kamer of een overtollige hoeveelheid vet werd gebruikt.
hGC-migratie langs myelinehoudende en niet-myelinehoudende axonale tracten in de hersenen is niet goed beschreven vanwege het gebrek aan efficiënte en reproduceerbare ex vivo-modellen. We beschrijven hier de ontwikkeling van een innovatief ex vivo-cultuur systeem om te bestuderen hoe glioom-cellen zich migreren langs axonen en myeline, een cruciaal onderdeel bij de ontwikkeling van nieuwe behandelingen die specifiek gericht zijn op tumor Celmigratie. Ons cultuur systeem is veelzijdig omdat er fluidic isolatie is tussen compartimenten, waardoor het mogelijk is om verschillende nieuwe behandelingen of verschillende concentraties van stoffen te bestuderen die de Celmigratie van glioom beïnvloeden. Een bijkomend voordeel van ons co-cultuur systeem is de mogelijkheid om de hGC-migratie en de effecten van de verschillende behandelingen in real-time te monitoren. Het hier beschreven protocol wordt momenteel gebruikt als basis voor de ontwikkeling van geavanceerdere biomimetische 3-dimensionale ex vivo-systemen met uitsluitend menselijke cellulaire componenten die kunnen worden gebruikt om de toxicologie en werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door interne fondsen van het Department of neuro Surgery, Brown University to N.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
| 60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
| Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
| Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
| AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
| Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
| Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
| Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
| Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| D-Glucose | Sigma | G5146 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
| DNase I | Sigma | D7291 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
| EBSS | Sigma | E7510 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
| HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
| Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
| Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
| Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
| NAC | Sigma | A8199 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
| Ordinary forceps | |||
| P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
| Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
| Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Uridine | Sigma | U3003 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
- Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
- Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
- Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
- Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
- Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
- Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
- Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
- Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
- Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
- Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
- Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
- Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
- Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
- Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
- Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
- Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).
