Summary
Nous décrivons en détail un modèle de tumeur de métastases de foie de cancer côlorectal médicalement pertinent (CRLM) et l'influence de la reperfusion d'ischémie de foie (I/R) dans la croissance de tumeur et la métastase. Ce modèle peut aider à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la promotion induite par la chirurgie de la croissance métastatique du foie.
Abstract
L'ischémie hépatique et la lésion de reperfusion (I/R), un défi clinique commun, demeure un processus pathophysiologique inévitable qui a été montré pour induire des dommages multiples de tissu et d'organe. En dépit des avances récentes et des approches thérapeutiques, la morbidité globale est restée insatisfaisante particulièrement dans les patients présentant des anomalies parenchymales sous-jacentes. Dans le contexte de la croissance agressive de cancer et de la métastasie, l'I/R chirurgical est suspecté pour être le promoteur régulant la répétition de tumeur. Cet article vise à décrire un modèle murine médicalement pertinent de foie I/R et métastasie colorectale de foie. Ce faisant, nous visons à aider d'autres chercheurs à établir et à perfectionner ce modèle pour leur pratique de recherche de routine afin de mieux comprendre les effets du foie I/R sur la promotion des métastases hépatiques.
Introduction
Le foie est l'un des sites les plus communs pour le développement de la maladie métastatique1. La mortalité est presque invariablement attribuable aux complications liées à la croissance tumorale dans le foie. Dans les patients présentant les tumeurs pleines métastatiques dans le foie, la chirurgie demeure une intervention cruciale pour le contrôle de la maladie et une approche curative possible. Cependant, la grande majorité des patients se présentent finalement avec la maladie récurrente, principalement dans le foie2,3. Pendant la chirurgie hépatique, le saignement peropératoire est commun, nécessitant souvent la transfusion sanguine et différentes approches techniques pour commander le saignement, y compris les méthodes vasculaires de serrage. Cependant, de telles mesures causent l'ischémie/reperfusion hépatique (I/R) au tissu de foie. Les effets défavorables de I/R sur la fonction hépatocellulaire ont été bien documentés. L'insulte de foie I/R enflamme des cascades inflammatoires pendant la restauration du flux sanguin par des voies inflammatoires4. Non seulement les dommages de foie I/R contribuent à l'échec de foie, mais les preuves actuelles montrent également que les dommages d'I/Rstimulent l'adhérence de cellules de tumeur, et favorise l'incidence de la formation de métastases et la croissance de la maladie micrométastatique existante 5. Nous avons précédemment rapporté que le stress chirurgical induit l'activation des cellules immunitaires qui aide non seulement à lacroissance de la tumeur primaire, mais facilite également les métastases en capturant des cellules cancéreuses dans la circulation 6.
Ici nous décrivons en détail une technique pour établir un modèle de tumeur de souris de métastasie de foie. Dans ce modèle, nous présentons également une méthode pour induire des dommages hépatiques de reperfusion d'ischémie qui agit en tant que substitut au stress chirurgical présent médicalement pendant des hepatectomies. Les méthodes combinées de l'injection de cancer et de l'I/R hépatique peuvent interpréter avec succès le développement de CRLM dans les patients qui ont subi la résection primaire de tumeur.
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Protocol
Tous les protocoles sur les animaux sont approuvés par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux et sont respectés aux Lignes directrices des National Institutes of Health (NIH). Les instruments utilisés pour n'importe quelle intervention chirurgicale ont été complètement stérilisés.
1. Préparation initiale
- Avant d'injecter des cellules cancéreuses dans la rate de la souris, autoclave et stériliser tous les instruments à utiliser pendant la procédure.
- Stériliser et/ou autoclaver un coussin chauffant, des gants chirurgicaux, de la gaze, des paires de ciseaux, de petites pinces, un dilatateur de vaisseau, des forceps chirurgicaux et un porte-aiguille.
- Préparer l'analgésique postopératoire (0,1 mg/kg de buprénorphine) à administrer après la splenectomy et tous les 12 h pendant 2 jours.
2. Culture cellulaire
- Assurez-vous que les cellules cancéreuses sont exemptes de contamination par le mycoplasme à l'aide d'un kit Mycoplasma ELISA.
- Préparer une solution de 500 ml du milieu de culture de l'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco à 4 oC pour la culture des cellules cancéreuses colorectales murines (MC38). Les supports de culture doivent être complétés par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF), 100 U/mL de pénicilline, 100 g/mL de streptomycine, 15 mM de HEPES et 200 mM de L-glutamine.
- Cellules cancéreuses de culture dans un flacon sans ARN et RNAse (75 cm2). Incuber la culture cellulaire dans un incubateur humidifié cellulaire/tissu contenant 5 % de CO2. Maintenir la température à 37 oC.
- Une fois que les cellules proliférantes atteignent 90 à 100% de confluence, aspirez les vieux médias, lavez les cellules avec 1x saline tamponnée par phosphate (PBS) et les traitez avec 1x trypsine (0,25%) pour détacher les cellules du flacon.
- Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifugeuse pendant 5 min à 700 x g.
- Aspirer les médias et laver avec 1x PBS deux fois par centrifugation répétée.
- Procédez pour confirmer la viabilité cellulaire en taclant les cellules avec la tache bleue de trypan (0.4%).
- Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/ 100 l en 1x PBS. Les cellules pipet s'engouffrent complètement pour éviter les amas. Gardez les cellules cancéreuses sur la glace avant l'injection.
3. Injection de cellules tumorales
- Anesthésiez les souris mâles de 8 à 12 semaines (C57BL6) en administrant de la kétamine (150 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) par voie intrapéritone à l'aide d'une aiguille de 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm).
- Raser la peau abdominale des souris à l'aide de tondeuses pour éviter toute infection postopératoire.
- Placez les souris sur le système de rétraction du fixateur magnétique. Confirmez que les souris sont complètement sous l'effet de l'anesthésie en pinçant un orteil ou la queue.
- Ajouter des gouttes saline dans les yeux pour éviter la sécheresse pendant la procédure.
- Frotter la solution povidone-iode (7,5%) à la paroi abdominale rasée pour désinfecter la peau avant de faire une incision chirurgicale.
- Soulevez d'abord la peau avec les forceps dentés et faites une incision de midline avec l'aide des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, soulevez le muscle abdominal et le péritoine pour créer une incision médiane d'environ 3 cm de longueur (processus midabdominal à xiphoïde pour exposer le contenu abdominal. Prenez garde de ne pas étendre l'incision au-delà du processus de xiphoïde pour éviter les saignements importants.
- Placez l'hemostat des deux côtés de l'incision et sous le processus xiphoïde. Étendre l'abdomen en tirant la queue vers le bas et en l'encaignant. Utilisez l'applicateur de pointe de coton stérile de 6 pouces pour séparer et exposer la rate du tissu adipeux pancréatique.
- Avant l'injection dans la rate, vortex les cellules cancéreuses pour éviter les amas cellulaires.
- Utilisez une seringue à insuline de 0,5 ml 28 G (0,36 mm x 13 mm) pour l'injection. Évitez les bulles d'air.
- Insufflez lentement et soigneusement 100 l de cellules dans la pointe de la rate. Placez une pointe de coton et ajoutez une légère pression pour éviter le reflux dans la région abdominale. Une injection réussie peut être observée en identifiant le changement de couleur du foie pendant l'injection.
- Humidifiez une gaze stérile avec 1x PBS et placez-la sur le secteur disséqué.
- Transférer les souris sur un coussin chauffant pendant 15 minutes pour permettre aux cellules cancéreuses de circuler dans le système.
- Pour procéder à l'ischémie chirurgicale et aux dommages de réperfusion, suivez des étapes 5.3-5.10.
REMARQUE : Cette procédure est d'étudier l'effet de l'établissement induit d'I/R des foyers métastatiques.
4. Splenectomy
- Pour effectuer une splencectomie, utilisez un dispositif de cautérisation portatif. Soulevez soigneusement la rate avec des forceps lisses et cautérisez les vaisseaux sanguins spléniques pour éviter les saignements excessifs. Retirez la rate en transectant les vaisseaux à la section cautérisée.
- Immédiatement après la procédure, fermer l'incision dans un modèle de double couche en sucisant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Utilisez 4-0 sutures en polypropylène pour la paroi abdominale et la peau.
- Avant de répéter la procédure sur un autre animal, désinfectez tous les instruments en les pulvérisant avec 70% d'isopropanol ou en les insérant dans un bain de perles.
- Replacez les souris dans des cages d'origine et recherchez des signes de détresse et de douleur post-chirurgicale.
- Injecter des analgésiques postopératoires (Buprenorphine 0,1 mg/kg) tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.
5. Blessures de réperfusion d'ischémie
- À 5 jours après la première laparotomie, anesthésiez les souris en administrant de la kétamine (150 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) par voie intrapéritone à l'aide d'une aiguille de 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm). Suivez les étapes 3.3-3.4.
- Frotter la solution povidone-iode (7,5%) sur l'abdomen rasé de la souris pour désinfecter la peau et effectuer une laparotomie de midline comme décrit ci-dessus dans l'étape 3.6.
- À l'aide de deux bouts de coton humidifiés, déplacez doucement l'intestin de la cavité pour exposer les structures associées, y compris la veine du portail. Disséquer le hilum du foie libre du tissu environnant.
- Soulevez les lobes médians et latéraux gauches contre le diaphragme. Séparez le lobe quadrate du lobe latéral gauche en disséquant le hilum du foie avec les ciseaux de ressort à l'aide d'un microscope opératoire pour permettre une visibilité claire vers la structure de la triade du portail.
- Placez un petit coton humide entre le lobe médian et le lobe latéral droit pour créer suffisamment d'espace pour le serrage. À l'aide des forceps du dilatateur du navire, passez soigneusement le fil de 10 cm (4,0 suture en polypropylène) pour soulever la triade du portail. Occlude toutes les structures dans la triade de portail (artère hépatique, veine de portail, et conduit biliaire) aux lobes gaucheets de foie en plaçant une pince microvasculaire utilisant un applicateur de pince micro-serrefine avec la serrure.
- Si les lobes ne montrent pas de blanchiment significatif, réajuster la pince en enlevant et en réappliquant.
REMARQUE : Si le blanchiment immédiat du foie ne se produit pas même après avoir réajusté la pince, examinez attentivement s'il faut procéder ou non à l'I/R. - Retirer le petit coton-tige placé entre les lobes médians et les lobes latéraux droits. Remplacer délicatement l'intestin dans la cavité abdominale. Couvrir la paroi abdominale d'une gaze humide (trempée de 1x PBS) et couvrir d'une pellicule plastique pour minimiser la perte d'évaporation.
- Placer la souris sur le coussin chauffant et appliquer la pince pendant une période de 60 min.
- Tout au long de l'intervalle ischémique, recherchez l'évidence des dommages d'ischémie en visualisant le blanching pâle des lobes médial et latéral médial et gauche s'est prolaissé.
- Initier la réperfusion en enlevant les pinces après la période de 60 min.
REMARQUE : L'évidence de la reperfusion peut être observée par un changement immédiat de couleur des lobes latéraux médians et gauches. - Immédiatement après la réperfusion, fermez l'incision avec un modèle de suture à double couche en sucisant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Utilisez la suture 4-0 en polypropylène à l'aide d'un porte-aiguille pour fermer la paroi abdominale et la peau.
- Avant de répéter la procédure sur un autre animal, désinfectez tous les instruments en les pulvérisant avec 70% d'isopropanol ou en les insérant dans un bain de perles chauffés.
- Replacez les souris dans des cages d'origine et recherchez des signes de détresse et de douleur post-chirurgicale.
- Injecter des analgésiques postopératoires (0,1 mg/kg de buprénorphine) tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.
- Pour les souris de faux foie I/R, effectuer la laparotomie, dissection hilum et sutures abdominales.
REMARQUE: Le rôle du stress chirurgical influençant l'établissement des métastases hépatiques peut être étudié à travers deux conceptions expérimentales différentes. Le protocole ci-dessus (Modèle-1) est utilisé pour établir une maladie hépatique micrométastatique et étudier l'effet du foie I/R sur leur croissance (Figure 1A). Alternativement, l'injection de foie I/R et de tumeur peut être exécutée simultanément (modèle-2) pour étudier l'effet des dommages d'I/R dans l'établissement de nouveaux foyers métastatiques (figure 1B). Pour ce faire, injecter des cellules cancéreuses dans la rate comme décrit ci-dessus et leur permettre de circuler pendant 15 min. Effectuer le foie I / R ou une chirurgie simulée après la période de circulation pendant 60 min. Effectuer splenectomy latérale 60 min plus tard, puis fermer l'incision laparotomy.
6. Évaluation des souris opérées
- Pendant la procédure chirurgicale s'assurer que les souris sont sous l'influence de l'anesthésie de stade III en effectuant l'essai palpebral et cornéen de réflexe. Une dose anesthésique supplémentaire doit être administrée sur les signes de réflexes.
- Fournir des analgésiques postopératoires (Buprenorphine 0,1 mg/kg) juste après la chirurgie et tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.
- Laissez les souris de 30 à 60 min de temps de récupération après l'anesthésie. Surveillez constamment les souris et ne les laissez pas sans surveillance jusqu'à ce qu'elles soient complètement guéries.
- Recherchez les signes de détresse tels que le dos voûté, les yeux fermés, le mouvement lent et l'incapacité à se toiletter. Traiter en conséquence jusqu'à ce que les souris retournent à leur activité normale.
- Les soins supplimental comprenant des fluides, la chaleur, l'agent d'inversion de Yohimbine pour la xylazine, la literie douce de serviette de papier (pour éviter l'aspiration) devraient être fournis après la chirurgie pour améliorer la période de rétablissement.
7. Évaluation des lésions de réperfusion d'ischémie hépatique
- Immédiatement après l'application de la pince, assurez-vous que le blanchissement pâle des lobes latéraux médians et gauches se produit par rapport aux lobes de caudate et de quadrate.
- Évaluer les lésions ischémiques hépatiques en mesurant les niveaux de transaminase d'alanine (sALT) de sérum, d'aspartate de sérum (sAST) et de lactate de lactate de séride (sLDH). Le sang peut être prélevé dans la veine faciale pour extraire le sérum de 3 à 6 h après l'initiation de la réperfusion. Effectuer l'histologie du foie pour analyser la zone de la tumeur pour cent dans le lobe ischémique.
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Representative Results
Toutes les souris de type sauvage (C57BL6) (n - 20) ont été soumises au modèle de métastases hépatiques en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Toutes les souris injectées avec ou sans lésion de réperfusion d'ischémie ont survécu jusqu'à la date du sacrifice. Le diagramme schématique Figure 1A d'un foie cancéreux illustre le serrage de la triade du portail (artère hépatique, veine de portail, et canal biliaire) qui induit un ischémique partiel de foie (70%) insulter les lobes latéraux médians et gauches. Une augmentation du nombre de métastases hépatiques peut être observée dans les 2-3 semaines après les lésions de réperfusion d'ischémie. Les souris injectées avec des cellules cancéreuses MC38 ont été divisées au hasard en groupes fictifs et I/R. Comme le montre la figure 1B, le premier groupe de souris a subi une splenectomy 15 min après l'injection de cancer. La chirurgie de reperfusion d'ischémie de foie a été exécutée 5 jours après l'injection. Ce modèle permet aux cellules cancéreuses circulantes (CC) de s'établir dans les organes. La figure 2A montre que le stress chirurgical a considérablement augmenté la quantité de micrométastases préétablies dans le foie. Le deuxième groupe (Figure 1C) a subi une intervention chirurgicale I/R 15 min après l'injection de cancer. La réperfusion a été induite en enlevant la pince microvasculaire 60 min après l'application. L'influence simultanée du stress chirurgical conduit (Figure 2B) à la capture de cellules cancéreuses récemment injectées dans le foie établissant un foyers micrométastatiques. Ceci a augmenté de manière significative le nombre de nodules métastatiques dans le foie.
Figure 1 : Une représentation schématique de la conception expérimentale. (A) Le diagramme schématique d'un foie injecté par cancer illustre le serrage de la triade du portail (artère hépatique, veine de portail, et canal biliaire) qui induit une partie (70%) l'insulte ischémique de foie vers les lobes latéraux médians et gauches. Une augmentation du nombre de métastases hépatiques peut être observée dans les lobes ischémiques dans les 2-3 semaines après la réperfusion. Initialement, des souris ont été soumises à l'injection intrasplinienne du cancer côlorectal de MC38 dans la capture de tumeur (B) et le modèle de croissance de tumeur (C). Les souris de Sham ont été également soumises à la laparotomie sans l'application des pinces microvasculaires. Deux-trois semaines après le I/R, des souris ont été sacrifiées, et le tissu de foie a été moissonné. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives de souris injectées avec un cancer de la murine. (A) Image représentative de métastasie de foie d'un modèle de croissance de tumeur (modèle-1) montrant une augmentation significative des nodules bruts de tumeur à la surface du foie après avoir induimi en induisant le groupe hepatic I/R comparé au groupe non-I/R. (B) De même, dans le cadre du modèle de capture de tumeur (modèle-2), le foie I/R a montré une augmentation significative des nodules de tumeur 2 semaines après I/R comparé au groupe non-I/R. P lt; 0,05. Les résultats sont exprimés comme l'écart moyen de la norme. Des comparaisons de groupe ont été effectuées à l'aide du test t de l'étudiant (n 5/groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le modèle animal décrit dans ce manuscrit est basé sur deux approches principales. La première est de reconnaître la capacité des cellules cancéreuses à localiser et à proliférer dans les lobes du foie. La deuxième est d'étudier l'effet des dommages hépatiques de reperfusion d'ischémie influençant la croissance et les métastases de tumeur. Ce modèle permet l'étude pertinente des métastases hépatiques en l'absence de métastases secondaires chez une souris immunocompétente. Le modèle est utile pour aborder les questions de l'efficacité métastatique, telles que les extravasations de survie cellulaire et la prolifération.
Dans le premier modèle, les cellules cancéreuses sont injectées en premier et la maladie micrométastatique est autorisée à se former. Par la suite, le foie I/R est exécuté 5 jours plus tard. Ce modèle est important en étudiant l'effet de la chirurgie sur la maladie micrométastatique déjà établie. Bien que la formation image s'est considérablement améliorée au cours de la dernière décennie, il y a toujours la possibilité de la présence de la maladie micrométastatique qui peut ne pas être détectée par la formation image et est laissée derrière après une résection prévue de foie avec l'intention de guérir. Cette maladie microscopique résiduelle est affectée par les changements inflammatoires accompagnant la chirurgie, spécifiquement le foie I/R, et la croissance est exponentiellement augmentée. D'autre part, dans le deuxième modèle de foie I / R et l'injection de tumeur sont effectuées en même temps. Ce modèle se concentre sur les effets du foie I/R sur les cellules cancéreuses circulantes et l'établissement de nouveaux foyers métastatiques. Pendant la chirurgie de foie, la manipulation de la tumeur libère des cellules de tumeur dans la circulation. Bien que la plupart des cellules circulantes soient prises en charge par la surveillance immunitaire de l'hôte, un certain nombre de cellules peuvent établir des foyers métastatiques. Ce deuxième modèle est conçu pour étudier ce phénomène.
Les modèles animaux, tels que l'injection orthotopic de foie7 et l'injection de veinedequeue 8, peuvent ne pas être anatomiquement faisables pour de telles études. Il a été démontré que l'injection de veine de la queue entraîne généralement une métasse accrue du poumon par rapport au foie. Le modèle orthotopique de cancer injecté a un plus grand risque de dommages de foie influençant le microenvironnement pour que la tumeur se développe. Comme alternative à l'injection splénique des tumeurs, la veine de portail peut également être employée. L'injection de veine de portail a été un modèle métastatique bien établi en étudiant des métastases de foie9,10,11. L'injection de cellules cancéreuses par la veine du portail ne compromet pas l'ablation de la rate par rapport au modèle décrit ci-dessus. Cela permettra en effet d'éviter les conséquences immunitaires. Cependant, l'injection de veine de portail a un plus grand risque de saignement excessif dû à la déchirure veineuse (au site de l'injection) et de thrombose pendant ou après l'application de la pince microvasculaire à la triade de portail. Ces risques sont augmentés de façon exponentielle lorsque l'injection tumorale et le serrage sont effectués le même jour. Notre groupe a effectué les deux méthodes et nous avons obtenu des résultats similaires9,12. Nous reconnaissons que l'injection de veine de portail exige des qualifications techniques plus élevées une fois faite en même temps que le serrage et est associée aux complications plus élevées. Les deux méthodes sont valides pour étudier les métastases hépatiques.
Il y a de nombreux aspects importants qui doivent être pris en considération avant et pendant toute la procédure. L'utilisation de cellules cancéreuses spécifiquement avec le même fond d'espèce est reprise avant l'injection. Le nombre de cellules est également important à considérer dans cette étude, car un petit nombre de cellules peut ne pas être suffisant pour terminer l'étude dans un court laps de temps (3 semaines). L'augmentation du nombre de cellules cancéreuses doit être évitée car elle peut causer un effet d'embolie conduisant à la thrombose et la mort du rongeur. Le modèle décrit dans ce manuscrit avec la concentration cellulaire de 1 x 106 est spécifique à la ligne cellulaire MC38 et nous a permis d'observer une différence significative dans la croissance tumorale stimulée par l'effet des dommages chirurgicaux de réperfusion d'ischémie. Nous recommandons fortement d'essayer différentes concentrations de cellules cancéreuses en fonction de l'expérience spécifique avec la ligne d'intérêt souhaitée de cellules cancéreuses. De même, l'étiquetage des cellules cancéreuses pourrait être très utile dans de nombreuses études sur les métastes. Cela donnerait une idée concernant le pourcentage de cellules qui sont capables de semer et de proliférer. En outre, l'application appropriée de la pince de portail pour induire des dommages hépatiques d'ischémie est très importante dans ce modèle. L'incapacité de bloquer complètement le flux sanguin peut entraîner moins ou pas d'impact sur les cellules cancéreuses. Comme décrit dans les méthodes, il est important de s'assurer que le blanchiment des lobes du foie se produit après l'application des pinces microvasculaires. Enfin, il est essentiel de coaguler correctement les vaisseaux par cautérisation pour éviter les saignements internes. Dans notre expérience, particulièrement avec l'utilisation de l'électrocautérisation, le saignement du lit splénique est extrêmement rare et puisque nous effectuons une laparotomie répétée seulement 5 jours après la première opération, la quantité d'adhérence est minimale. Cependant, si des saignements sont rencontrés, cela peut poser une deuxième opération plus difficile. Si le saignement se produit après la splenectomy, ceci peut indiquer que les cellules cancéreuses circulantes peuvent également avoir implanté dans la cavité péritonéale et ainsi peuvent affecter les résultats des expériences. Il est conseillé de faire preuve de prudence lors de la gestion de ce problème, car il peut affecter les expériences et les résultats. Une réflexion attentive doit être accordée pour déterminer si oui ou non de procéder avec I / R chez ces souris.
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Disclosures
Les auteurs ne révèlent aucun conflit d'intérêts qui se rapporte à ce travail.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Sara Minemyer et Alexander Comerci pour la révision linguistique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 900-108 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-081 | |
| Penicilin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| Stretomysin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| HEPES | Fisher Scientific | SH3023701 | |
| Trypsin | Hyclone | sh30042.02 | |
| Cell culture Flask 75cm | 5 Cells Star | 658170 | |
| 15ml PP Conical Tubes | BioExcell | 41021037 | |
| Trypan Blue Stain | Giibco | 15250-061 | |
| Gauze | Fisherbrand | 1376152 | |
| Cautry | Bovie | AA01 | |
| Microvascular clamp | Finescience tools | 18055-03 | |
| Micro-Serrefine clamp applicator with lock | Fine science toosl | FST-18056-14 | |
| Spring scissor | Fine science toosl | FST-15021-15 | |
| Vessel Dilator | Fine science toosl | FST-00276-13 | |
| Magnetic fixator Retraction system | Fine science toosl | FST-18200020 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11019-12 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11018-12 | |
| 4-0 polypropylene suture | Ethicon | K881H | |
| Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8826 | |
| Heating Pad | Fisher scientific | 1443915 | |
| Clipper | Oster | 559A | |
| Povidone-Iodine solution | Medline | MDS093945 | |
| Syringe 1ml 25G | BD safety Glide | 305903 | |
| Insulin syringe 0.5 ml | BD insulin Syringes | 32946 | |
| Cotton -Tipped Applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Surgical Microscope | Leica | LR92240 | |
| Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
| Ketamine | Putney | #056344 | |
| Xylazine | NADA | #139-236 | |
| ALT strip | Heska | 15809554 | |
| AST strip | Heska | 15809542 | |
| LDH strip | Heska | 15809607 |
References
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