Summary
Wir beschreiben detailliert ein klinisch relevantes Tumormodell der Darmkrebslebermetastasen (CRLM) und den Einfluss der Leberischämie-Reperfusion (I/R) auf Tumorwachstum und Metastasierung. Dieses Modell kann helfen, die Mechanismen, die der chirurgieinduzierten Förderung des metastasierenden Wachstums der Leber zugrunde liegen, besser zu verstehen.
Abstract
Leberischämie und Reperfusion (I/R) Verletzung, eine häufige klinische Herausforderung, bleibt ein unvermeidlicher pathophysiologischer Prozess, der nachweislich mehrere Gewebe- und Organschäden induziert. Trotz der jüngsten Fortschritte und therapeutischen Ansätze ist die allgemeine Morbidität unbefriedigend geblieben, insbesondere bei Patienten mit zugrunde liegenden parenchymalen Anomalien. Im Zusammenhang mit aggressivem Krebswachstum und Metastasierung wird vermutet, dass chirurgische I/R der Promotor ist, der das Tumorrezidiv reguliert. Dieser Artikel zielt darauf ab, ein klinisch relevantes murines Modell der Leber-I/R und kolorektalen Lebermetastasen zu beschreiben. Dabei wollen wir anderen Forschern helfen, dieses Modell für ihre routinemäßige Forschungspraxis zu etablieren und zu perfektionieren, um die Auswirkungen von Leber-I/R auf die Förderung von Lebermetastasen besser zu verstehen.
Introduction
Die Leber ist eine der häufigsten Stellen für die Entwicklung von metastasierenden Erkrankungen1. Die Sterblichkeit ist fast ausnahmslos auf Komplikationen im Zusammenhang mit Tumorwachstum in der Leber zurückzuführen. Bei Patienten mit metastasierenden soliden Tumoren in der Leber bleibt die Chirurgie ein entscheidender Eingriff zur Krankheitskontrolle und ein möglicher heilativer Ansatz. Jedoch, die überwiegende Mehrheit der Patienten schließlich mit wiederkehrenden Erkrankungen, vor allem in der Leber2,3. Während der Leberoperation ist intraoperative Blutung häufig, oft erfordern Bluttransfusion und verschiedene technische Ansätze zur Kontrolle von Blutungen, einschließlich vaskulärer Spannmethoden. Solche Maßnahmen verursachen jedoch hepatische Ischämie/Reperfusion (I/R) im Lebergewebe. Die nebenwirkungen von I/R auf die hepatozelluläre Funktion sind gut dokumentiert. Die Leber I/R Beleidigung entzündet entzündliche Kaskaden während der Wiederherstellung des Blutflusses über entzündliche Bahnen4. Nicht nur Leber-I/R-Verletzung trägt zum Leberversagen bei, aber aktuelle Beweise zeigen auch, dass I/R-Verletzung die Adhäsion der Tumorzellen stimuliert und die Inzidenz der Metastasenbildung und das Wachstum der bestehenden mikrometastasieren Erkrankung fördert5. Wir haben bereits berichtet, dass chirurgischer Stress die Aktivierung von Immunzellen induziert, was nicht nur beim Wachstum des Primärtumors hilft, sondern auch Metastasen erleichtert, indem Krebszellen im Kreislauf erfasst werden6.
Hier beschreiben wir detailliert eine Technik, um ein Lebermetastasen-Maus-Tumor-Modell zu etablieren. In diesem Modell präsentieren wir auch eine Methode, um leberische Ischämie-Reperfusionsverletzungen zu induzieren, die als Ersatz für den chirurgischen Stress wirkt, der klinisch während Hepatektomien vorhanden ist. Die kombinierten Methoden der Krebsinjektion und Leber-I/R können die Entwicklung von CRLM bei Patienten, die sich einer primären Tumorresektion unterzogen haben, erfolgreich interpretieren.
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Protocol
Alle Tierprotokolle werden vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und den Leitlinien der National Institutes of Health (NIH) nachgehalten. Instrumente, die für jeden chirurgischen Eingriff verwendet wurden, wurden gründlich sterilisiert.
1. Erstvorbereitung
- Vor der Injektion von Krebszellen in die Mausmilen, Autoklav und sterilisieren alle Instrumente während des Verfahrens verwendet werden.
- Sterilisieren und/oder Autoklaven eines Heizkissens, chirurgischer Handschuhe, Gaze, Scherenpaaren, kleinen Klemmen, Gefäßdilatators, chirurgischen Zangen und einem Nadelhalter.
- Bereiten Sie postoperatives Analgetikum (0,1 mg/kg Buprenorphin) vor, das nach einer Splenektomie verabreicht wird und alle 12 Stunden für 2 Tage.
2. Zellkultur
- Stellen Sie sicher, dass Krebszellen mit einem Mykoplasmen-ELISA-Kit frei von Mykoplasmen-Kontamination sind.
- Bereiten Sie eine 500 ml Lösung des Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Kultivierungsmediums bei 4 °C für die Kultur der murinen Darmkrebszellen (MC38) vor. Die Kultivierungsmedien sollten durch 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 15 mM HEPES und 200 mM L-Glutamin ergänzt werden.
- Kulturkrebszellen in einem DNAse- und RNAse-freien Kolben (75 cm2). Inkubieren Sie die Zellkultur in einem zell/Gewebe befeuchteten Inkubator mit 5%CO2. Halten Sie die Temperatur bei 37 °C.
- Sobald die proliferierenden Zellen 90–100% Koninfluenza erreichen, die alten Medien ansaugen, Zellen mit 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen und sie dann mit 1x Trypsin (0,25%) behandeln , um Zellen aus dem Kolben zu lösen.
- Sammeln Sie Zellen in einem 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 700 x g.
- Die Medien ansaugen und zweimal durch wiederholte Zentrifugation mit 1x PBS waschen.
- Fahren Sie fort, die Zelllebensfähigkeit zu bestätigen, indem Sie Zellen mit Trypanblaufleck (0,4 %) färben.
- ResuspendZellen auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen / 100 l in 1x PBS. Pipettenzellen gründlich, um Klumpen zu vermeiden. Halten Sie Krebszellen vor der Injektion auf Eis.
3. Injektion von Tumorzellen
- Anästhetisieren Sie 8–12 Wochen alte männliche (C57BL6) Mäuse durch Verabreichung von Ketamin (150 mg/kg) und Xylazin (12 mg/kg) intraperitoneal mit einer 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm) Nadel.
- Rasieren Sie die Bauchhaut der Mäuse mit Clippers, um postoperative Infektionen zu vermeiden.
- Platzieren Sie Mäuse auf dem magnetischen Fixator-Rückzugssystem. Bestätigen Sie, dass die Mäuse vollständig unter dem Effekt der Anästhesie stehen, indem Sie eine Zeh oder den Schwanz kneifen.
- Fügen Sie Saline-Tropfen in die Augen, um Trockenheit während des Eingriffs zu vermeiden.
- Peeling Povidon-Jod-Lösung (7,5%) an die rasierte Bauchwand, um die Haut vor einem chirurgischen Schnitt zu desinfizieren.
- Heben Sie zunächst die Haut mit der Zahnzange an und machen Sie mit Hilfe einer chirurgischen Schere einen Mittellinienschnitt. Dann heben Sie den Bauchmuskel und Peritoneum, um einen Mittellinienschnitt von ca. 3 cm Länge zu erstellen (mittelabdominaler bis xiphoider Prozess, um den Bauchinhalt freizulegen. Seien Sie vorsichtig, den Einschnitt nicht über den xiphoiden Prozess hinaus auszudehnen, um umfangreiche Blutungen zu vermeiden.
- Platzieren Sie das Hämostat auf beiden Seiten des Einschnitts und unter den xiphoiden Prozess. Erweitern Sie den Bauch, indem Sie den Schwanz nach unten ziehen und ihn kleben. Verwenden Sie den 6-Zoll sterilen Baumwollspitzenapplikator, um die Milz vom Bauchspeicheldrüsenfettgewebe zu trennen und auszusetzen.
- Vor der Injektion in die Milz, Wirbel die Krebszellen, um alle Zellklumpen zu vermeiden.
- Verwenden Sie eine 0,5 ml 28 G (0,36 mm x 13 mm) Insulinspritze zur Injektion. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Injizieren Sie langsam und vorsichtig 100 l Zellen in die Spitze der Milz. Legen Sie eine Baumwollspitze und fügen Sie sanften Druck hinzu, um einen Rückfluss in den Bauchbereich zu vermeiden. Eine erfolgreiche Injektion kann beobachtet werden, indem die Veränderung der Farbe der Leber während der Injektion identifiziert wird.
- Befeuchten Sie eine sterile Gaze mit 1x PBS und legen Sie sie über den sezierten Bereich.
- Übertragen Sie die Mäuse für 15 Min. auf ein Heizkissen, damit Krebszellen innerhalb des Systems zirkulieren können.
- Um mit chirurgischen Ischämie und Reperfusionsverletzungen fortzufahren, folgen Sie den Schritten 5.3-5.10.
HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird die Wirkung der I/R-induzierten Etablierung von metastasierenden Brennpunkten untersucht.
4. Splenektomie
- Um eine Splenektomie durchzuführen, verwenden Sie ein handgehaltenes Kauteriegerät. Heben Sie die Milz vorsichtig mit glatten Zangen an und kauterisieren Sie die Milzblutgefäße, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Entfernen Sie die Milz, indem Sie die Gefäße am kauterisierten Abschnitt transsektieren.
- Unmittelbar nach dem Eingriff schließen Sie den Schnitt in einem Doppelschichtmuster, indem Sie zuerst die Muskelschicht und dann die Haut nähen. Verwenden Sie 4-0 Polypropylen Nähte für die Bauchwand und die Haut.
- Bevor Sie das Verfahren an einem anderen Tier wiederholen, desinfizieren Sie alle Instrumente, indem Sie sie entweder mit 70% Isopropanol besprühen oder in ein Perlenbad einsetzen.
- Legen Sie Mäuse wieder in originale Käfige und suchen Sie nach Anzeichen von Not und postoperativen Schmerzen.
- Injizieren Sie postoperatives Analgetikum (Buprenorphin 0,1 mg/kg) alle 12 Stunden für 2 Tage, um postoperative Schmerzen zu vermeiden.
5. Ischmia-Reperfusionsverletzung
- Nach 5 Tagen nach der ersten Laparotomie Mäuse durch Verabreichung von Ketamin (150 mg/kg) und Xylazin (12 mg/kg) intraperitoneal mit einer 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm) Nadel ansiedeln. Befolgen Sie die Schritte 3.3–3.4.
- Peeling Povidon-Jod-Lösung (7,5%) auf dem rasierten Bauch der Maus, um die Haut zu desinfizieren und eine Mittellinienlaparotomie durchzuführen, wie oben in Schritt 3.6 beschrieben.
- Bewegen Sie den Darm mit zwei befeuchteten Baumwollspitzen vorsichtig aus der Höhle, um die zugehörigen Strukturen, einschließlich der Portalvene, freizulegen. Sezieren Sie die Leber hilum frei von dem umgebenden Gewebe.
- Heben Sie den Median und linke seitliche Lappen gegen das Zwerchfell. Trennen Sie den quadratischen Lappen vom linken Seitenlappen, indem Sie den Leberhilum mit der Federschere mit einem Operationsmikroskop sezieren, um eine klare Sicht auf die Portal-Triadenstruktur zu ermöglichen.
- Legen Sie einen kleinen feuchten Wattestäbchen zwischen den Medianlappen und den rechten Seitenlappen, um ausreichend Platz zum Spannen zu schaffen. Mit dem Gefäßdilatator Zange, vorsichtig übergeben Sie die 10 cm Gewinde (4,0 Polypropylen Naht), um die Portal Triade zu heben. Alle Strukturen in der Portaltriade (Hepatische Arterie, Portalvene und Gallengang) nach links und mediane Leberlappen verschließen, indem Sie eine mikrovaskuläre Klemme mit einem mikroserrefine Klemmenapplikator mit Schloss platzieren.
- Wenn die Lappen keine signifikante Blanchierung aufweisen, justieren Sie die Klemme durch Entfernen und erneutes Auftragen.
HINWEIS: Wenn das sofortige Blanchieren der Leber auch nach dem Nachjustieren der Klemme nicht auftritt, sollten Sie sorgfältig überlegen, ob sie mit dem I/R fortfahren möchten oder nicht. - Entfernen Sie den kleinen Wattestäbchen zwischen dem Median und rechten seitlichen Lappen. Ersetzen Sie den Darm vorsichtig in die Bauchhöhle. Bedecken Sie die Bauchwand mit einer feuchten Gaze (getränkt mit 1x PBS) und decken Sie sie mit einer Plastikfolie, um den Verdunstungsverlust zu minimieren.
- Legen Sie die Maus auf das Heizkissen und wenden Sie die Klemme für einen Zeitraum von 60 min an.
- Während des ischämischen Intervalls suchen Sie nach Beweisen für Ischämieverletzungen, indem Sie das blasse Blanchieren der rechten medialen und linken medialen und seitlichen Lappen visualisieren.
- Initiieren Sie die Reperfusion, indem Sie die Klemmen nach der 60-min-Periode entfernen.
HINWEIS: Der Nachweis einer Reperfusion kann durch eine sofortige Farbänderung des Medians und der linken Seitenlappen beobachtet werden. - Unmittelbar nach der Reperfusion den Schnitt mit einem doppellagigen Nahtmuster schließen, indem Sie zuerst die Muskelschicht und dann die Haut nähen. Verwenden Sie die 4-0 Polypropylen-Nähte mit Hilfe eines Nadelhalters, um die Bauchwand und die Haut zu schließen.
- Bevor Sie das Verfahren an einem anderen Tier wiederholen, desinfizieren Sie alle Instrumente, indem Sie sie entweder mit 70% Isopropanol besprühen oder in ein beheiztes Perlenbad einsetzen.
- Legen Sie Mäuse wieder in originale Käfige und suchen Sie nach Anzeichen von Not und postoperativen Schmerzen.
- Injizieren Sie postoperatives Analgetikum (0,1 mg/kg Buprenorphin) alle 12 stunden für 2 Tage, um postoperative Schmerzen zu vermeiden.
- Für Leber-I/R-Scheinmäuse, führen Laparotomie, Hilum-Sektion und Bauchnähte.
HINWEIS: Die Rolle des chirurgischen Stresses, der die Etablierung von Lebermetastasen beeinflusst, kann durch zwei verschiedene experimentelle Designs untersucht werden. Das obige Protokoll (Modell-1) wird verwendet, um mikrometastasierende Lebererkrankungen zu etablieren und die Wirkung von Leber-I/R auf ihr Wachstum zu untersuchen (Abbildung 1A). Alternativ können Leber-I/R- und Tumorinjektionen gleichzeitig durchgeführt werden (Modell-2), um die Wirkung von I/R-Verletzungen bei der Etablierung neuer metastasierender Brennpunkte zu untersuchen (Abbildung 1B). Um dies zu tun, injizieren Krebszellen in die Milz wie oben beschrieben und lassen Sie sie für 15 min zirkulieren. Führen Sie Leber I/R oder Scheinchirurgie nach der Zirkulierungsphase für 60 min. Führen Sie seitliche Splenektomie 60 min später, und schließen Sie dann die Laparotomie Inzision.
6. Bewertung von operierten Mäusen
- Während des chirurgischen Eingriffs stellen Sie sicher, dass die Mäuse unter dem Einfluss der Anästhesie des Stadiums III stehen, indem Sie einen palpebralen und hornhautartigen Reflextest durchführen. Zusätzliche Anästhesiedosis muss auf die Anzeichen von Reflexen gegeben werden.
- Geben Sie postoperatives Analgetikum (Buprenorphin 0,1mg/kg) direkt nach der Operation und alle 12Stunden für 2 Tage an, um postoperative Schmerzen zu vermeiden.
- Erlauben Sie Mäusen 30–60 min Erholungszeit von der Anästhesie. Überwachen Sie ständig Mäuse und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie vollständig erholt sind.
- Achten Sie auf Notzeichen wie zurückgebeugte, geschlossene Augen, langsame Bewegung und Versagen zu pflegen. Behandeln Sie entsprechend, bis Mäuse zu ihrer normalen Aktivität zurückkehren.
- Supplimentale Pflege einschließlich Flüssigkeiten, Hitze, Yohimbin-Umkehrmittel für Xylazin, weiches Papier Handtuch Bettwäsche (zur Vermeidung von Aspiration) sollte nach der Operation zur Verbesserung der Erholungsphase zur Verfügung gestellt werden.
7. Beurteilung der Leberischämie-Reperfusionsverletzung
- Stellen Sie unmittelbar nach dem Auftragen der Klemme sicher, dass die blasse Blanchierung der medianen und linken seitenlappen im Vergleich zu den Caudate- und Quadratlappen auftritt.
- Beurteilung der Leberischämie-Verletzung durch Messung der Serum-Alanin-Transaminase (sALT), der Serum-Aspartat-Transaminase (sAST) und der Serumlactat-Dehydrogenase (sLDH).- Das Blut kann aus der Gesichtsvene entnommen werden, um Serum 3-6 h nach Beginn der Reperfusion zu extrahieren. Führen Sie Leberhistologie durch, um den prozentualen Tumorbereich innerhalb des ischämischen Lappens zu analysieren.
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Representative Results
Alle Wildtyp-Mäuse (C57BL6) (n = 20) wurden dem Lebermetastasenmodell mit dem oben beschriebenen Protokoll unterzogen. Alle injizierten Mäuse mit oder ohne Ischämie-Reperfusionsverletzung überlebten bis zum Opferdatum. Das schematische Diagramm Abbildung 1A einer krebsinjizierten Leber veranschaulicht die Klemmung der Portaltriade (Hepatische Arterie, Portalvene und Gallengang), die eine partielle Leberischämische induziert (70%) Beleidigung in Richtung des Medians und der linken Seitenlappen. Eine Zunahme der Anzahl der Lebermetastasen kann innerhalb von 2-3 Wochen nach der Ischämie-Reperfusionsverletzung beobachtet werden. Mäuse, die mit MC38-Krebszellen injiziert wurden, wurden nach dem Zufallsprinzip in Schein- und I/R-Gruppen unterteilt. Wie in Abbildung 1Bdargestellt, unterzog sich die erste Gruppe von Mäusen 15 min nach der Krebsinjektion einer Splenektomie. Leber Ischämie Reperfusion Chirurgie wurde 5 Tage nach der Injektion durchgeführt. Dieses Modell ermöglicht es den zirkulierenden Krebszellen (CCs), sich in den Organen zu etablieren. Abbildung 2A zeigt, dass chirurgischer Stress die Menge an vorgefertigten Mikrometastasen in der Leber signifikant erhöhte. Die zweite Gruppe (Abbildung 1C) wurde 15 min nach der Krebsinjektion chirurgisch i/R unterzogen. Die Reperfusion wurde durch Entfernen der mikrovaskulären Klemme 60 min nach der Anwendung induziert. Der gleichzeitige Einfluss des chirurgischen Stresses führt (Abbildung 2B) zur Erfassung kürzlich injizierter Krebszellen in der Leber und stellt einen mikrometastasierenden Brennpunkte auf. Dies erhöhte signifikant die Anzahl der metastasierenden Knötchen in der Leber.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung des experimentellen Entwurfs. (A) Das schematische Diagramm einer krebsinjizierten Leber veranschaulicht die Klemmung der Portaltriade (Hepatische Arterie, Portalvene und Gallengang), die eine partielle (70%) induziert. Leber ischämische Beleidigung gegenüber dem Median und linken Seitenlappen. Eine Zunahme der Anzahl der Lebermetastasen kann in den ischämischen Lappen innerhalb von 2-3 Wochen nach der Reperfusion beobachtet werden. Anfangs wurden Mäuse einer intrasplenischen Injektion von MC38-Dickdarmkrebs sowohl bei der Tumorerfassung (B) als auch beim Tumorwachstum (C) unterzogen. Scheinmäuse wurden auch einer Laparotomie ohne die Anwendung von mikrovaskulären Klammern unterzogen. Zwei-drei Wochen nach dem I/R wurden Mäuse geopfert und Lebergewebe geerntet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von Mäusen, die mit murinem Krebs injiziert wurden. (A) Repräsentatives Lebermetastasenbild eines Tumorwachstumsmodells (Modell-1), das eine signifikante Zunahme der Grobtumorknötchen an der Leberoberfläche zeigt, nachdem es Leber-I/R im Vergleich zur Nicht-I/R-Gruppe induzieren musste. (B) In ähnlicher Weise zeigte Leber-I/R bei der Einstellung des Tumor-Capture-Modells (Modell-2) 2 Wochen nach I/R im Vergleich zur Nicht-I/R-Gruppe einen signifikanten Anstieg der Tumorknollen. *, P < 0,05. Die Ergebnisse werden als Mittelwert - Standardabweichung ausgedrückt. Gruppenvergleiche wurden mit dem Schüler-t-Test (n = 5/Gruppe) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das in diesem Manuskript beschriebene Tiermodell basiert auf zwei Hauptansätzen. Die erste besteht darin, die Fähigkeit von Krebszellen zu erkennen, sich in den Leberlappen zu lokalisieren und zu vermehren. Die zweite besteht darin, die Wirkung einer Leber-Ischämie-Reperfusionsverletzung zu untersuchen, die das Tumorwachstum und metastases beeinflusst. Dieses Modell ermöglicht die relevante Untersuchung von Lebermetastasen in Ermangelung von sekundären Metastasen in einer immunkompetenten Maus. Das Modell ist nützlich, um die Fragen der metastasierenden Effizienz, wie Zellüberleben Extravasationen und Proliferation zu adressieren.
Im ersten Modell werden zunächst Krebszellen injiziert und mikrometastasierende Erkrankungen können sich bilden. Anschließend wird Leber-I/R 5 Tage später durchgeführt. Dieses Modell ist wichtig, wenn man die Wirkung einer Operation auf bereits etablierte mikrometastasische Erkrankungen untersucht. Obwohl sich die Bildgebung in den letzten zehn Jahren deutlich verbessert hat, besteht immer noch die Möglichkeit, dass mikrometastasierende Erkrankungen auftreten, die möglicherweise nicht durch Bildgebung erkannt werden und nach einer geplanten Leberresektion mit der Absicht der Heilung zurückgelassen werden. Diese restliche mikroskopische Erkrankung wird durch die entzündlichen Veränderungen, die mit der Operation einhergehen, insbesondere Leber I/R, beeinflusst, und das Wachstum wird exponentiell erhöht. Andererseits werden im zweiten Modell Leber-I/R- und Tumorinjektionen gleichzeitig durchgeführt. Dieses Modell konzentriert sich auf die Auswirkungen von Leber-I/R auf die zirkulierenden Krebszellen und die Etablierung neuer metastasierender Brennpunkte. Während der Leberoperation setzt die Manipulation des Tumors Tumorzellen in den Kreislauf frei. Obwohl die meisten zirkulierenden Zellen durch die Immunüberwachung des Wirts versorgt werden, können eine Reihe von Zellen metastasierende Brennpunkte etablieren. Dieses zweite Modell soll dieses Phänomen untersuchen.
Tiermodelle, wie orthotopische Leberinjektion7 und Schwanzveneninjektion8, sind für solche Studien möglicherweise nicht anatomisch durchführbar. Es hat sich gezeigt, dass die Injektion der Schwanzvene in der Regel zu einer erhöhten Metastasierung der Lunge im Vergleich zur Leber führt. Das orthotopisch injizierte Krebsmodell hat ein erhöhtes Risiko für Leberschäden, die die Mikroumgebung beeinflussen, damit der Tumor wächst. Als Alternative zur Milzinjektion von Tumoren kann auch die Portalvene genutzt werden. Die Portalveneninjektion ist ein etabliertes metastasierendes Modell bei der Untersuchung von Lebermetastasen9,10,11. Die Injektion von Krebszellen durch die Portalvene beeinträchtigt die Entfernung der Milz im Vergleich zu dem oben beschriebenen Modell nicht. Dies wird in der Tat die Immunfolgen zu vermeiden. Die Injektion der Portalvene hat jedoch ein erhöhtes Risiko für übermäßige Blutungen durch venöses Reißen (an der Injektionsstelle) und Thrombose während oder nach der Anwendung der mikrovaskulären Klemme an der Portaltriade. Diese Risiken sind exponentiell erhöht, wenn sowohl Tumorinjektion und Klemmung am selben Tag durchgeführt werden. Unsere Gruppe hat beide Methoden durchgeführt und wir haben ähnliche Ergebnisse9,12erhalten. Wir erkennen an, dass die Portalveneninjektion höhere technische Fähigkeiten erfordert, wenn sie gleichzeitig mit dem Spannen durchgeführt wird und mit höheren Komplikationen verbunden ist. Beide Methoden sind gültig, um Lebermetastasen zu studieren.
Es gibt zahlreiche wichtige Aspekte, die vor und während des gesamten Verfahrens berücksichtigt werden müssen. Die Verwendung von Krebszellen speziell mit dem gleichen Artenhintergrund wird vor der Injektion wieder aufgenommen. Die Zellzahl ist auch wichtig in dieser Studie zu berücksichtigen, da eine kleine Anzahl von Zellen möglicherweise nicht ausreichen, um die Studie in kurzer Zeit (3 Wochen) abzuschließen. Eine Erhöhung der Anzahl der Krebszellen sollte vermieden werden, da es eine Embolie-Wirkung verursachen kann, die zu Thrombose und Tod des Nagetiers führt. Das in diesem Manuskript beschriebene Modell mit einer Zellkonzentration von 1 x 106 ist spezifisch für die MC38-Zelllinie und hat es uns ermöglicht, einen signifikanten Unterschied im Tumorwachstum zu beobachten, das durch die Wirkung einer chirurgischen Ischämie-Reperfusionsverletzung stimuliert wird. Wir empfehlen, verschiedene Konzentrationen von Krebszellen zu versuchen, abhängig von dem spezifischen Experiment mit der gewünschten Krebszelllinie von Interesse. In ähnlicher Weise könnte die Kennzeichnung von Krebszellen in vielen Metastasenstudien sehr nützlich sein. Dies würde eine Idee über den Prozentsatz der Zellen liefern, die in der Lage sind, auszusäen und zu vermehren. Darüber hinaus ist die richtige Anwendung der Portalklemme zur Induzieren von Leber-Ischämie-Verletzungen in diesem Modell sehr wichtig. Die Unfähigkeit, den Blutfluss vollständig zu blockieren, kann zu weniger oder gar keinen Auswirkungen auf die Krebszellen führen. Wie in den Methoden beschrieben, ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Blanchieren der Leberlappen nach dem Auftragen der mikrovaskulären Klammern auftritt. Schließlich ist die ordnungsgemäße Koagulierung von Gefäßen über die Kauterie von entscheidender Bedeutung, um innere Blutungen zu vermeiden. Nach unserer Erfahrung, vor allem mit der Verwendung von Elektrokauterie, Blutungen aus dem Milzbett ist extrem ungewöhnlich und da wir eine wiederholte Laparotomie nur 5 Tage nach der ersten Operation durchführen, ist die Menge der Adhäsionen minimal. Wenn jedoch Blutungen auftreten, kann dies eine schwierigere zweite Operation darstellen. Wenn Blutungen nach der Splenektomie auftreten, kann dies darauf hindeuten, dass zirkulierende Krebszellen auch in die Peritonealhöhle implantiert worden sein können und somit die Ergebnisse der Experimente beeinflussen können. Es wird empfohlen, Vorsicht zu verwenden, wenn Sie mit diesem Problem umgehen, da es die Experimente und Ergebnisse beeinflussen kann. Es muss sorgfältig darüber nachgedacht werden, ob bei diesen Mäusen mit I/R fortgefahren werden soll oder nicht.
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Disclosures
Die Autoren geben keine Interessenkonflikte offen, die mit diesem Werk zu tun haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Sara Minemyer und Alexander Comerci für die sprachliche Überarbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 900-108 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-081 | |
| Penicilin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| Stretomysin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| HEPES | Fisher Scientific | SH3023701 | |
| Trypsin | Hyclone | sh30042.02 | |
| Cell culture Flask 75cm | 5 Cells Star | 658170 | |
| 15ml PP Conical Tubes | BioExcell | 41021037 | |
| Trypan Blue Stain | Giibco | 15250-061 | |
| Gauze | Fisherbrand | 1376152 | |
| Cautry | Bovie | AA01 | |
| Microvascular clamp | Finescience tools | 18055-03 | |
| Micro-Serrefine clamp applicator with lock | Fine science toosl | FST-18056-14 | |
| Spring scissor | Fine science toosl | FST-15021-15 | |
| Vessel Dilator | Fine science toosl | FST-00276-13 | |
| Magnetic fixator Retraction system | Fine science toosl | FST-18200020 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11019-12 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11018-12 | |
| 4-0 polypropylene suture | Ethicon | K881H | |
| Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8826 | |
| Heating Pad | Fisher scientific | 1443915 | |
| Clipper | Oster | 559A | |
| Povidone-Iodine solution | Medline | MDS093945 | |
| Syringe 1ml 25G | BD safety Glide | 305903 | |
| Insulin syringe 0.5 ml | BD insulin Syringes | 32946 | |
| Cotton -Tipped Applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Surgical Microscope | Leica | LR92240 | |
| Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
| Ketamine | Putney | #056344 | |
| Xylazine | NADA | #139-236 | |
| ALT strip | Heska | 15809554 | |
| AST strip | Heska | 15809542 | |
| LDH strip | Heska | 15809607 |
References
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