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Bioengineering

मानव फाइब्रोमस्क्युलर ऊतक कल्पना करने के लिए फॉस्फोटंगस्टिक एसिड तैयारी के साथ माइक्रो एक्स-रे कम्प्यूटेड टॉमोग्राफी का उपयोग

doi: 10.3791/59752 Published: September 5, 2019

Summary

माइक्रो एक्स-रे गणना टोमोग्राफी क्षतिग्रस्त मानव नमूनों से तीन आयामी जानकारी प्राप्त करने में प्रभावी है, लेकिन नरम ऊतकों को देखने में सीमित सफलता है। फॉस्फोतुंगस्टिक एसिड कंट्रास्ट एजेंट का उपयोग इस समस्या को हल कर सकते हैं। हम मानव नाजुक फाइब्रोमस्क्युलर ऊतकों की जांच करने के लिए इस विपरीत एजेंट लागू किया (ऑर्बिकुलरिस बनाए रखने स्नायु).

Abstract

मैनुअल विच्छेदन और हिस्टोलॉजिकल अवलोकन मानव ऊतकों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाने वाली सामान्य विधियाँ हैं। हालांकि, मैनुअल विच्छेदन नाजुक संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकता है, जबकि प्रसंस्करण और हिस्टोलॉजिकल अवलोकन क्रॉस-सेक्शनल इमेजिंग के माध्यम से सीमित जानकारी प्रदान करते हैं। माइक्रो एक्स-रे गणना टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) हानिकारक नमूनों के बिना तीन आयामी जानकारी प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। हालांकि, यह नरम ऊतक भागों differentiating में सीमित दक्षता से पता चलता है. फॉस्फोतुंगस्टिक एसिड (पीटीए) जैसे इसके विपरीत बढ़ाने वाले एजेंटों का उपयोग, नरम ऊतक कंट्रास्ट में सुधार करके इस समस्या को हल कर सकता है। हम पीटीए के साथ microCT लागू करने के लिए मानव orbicularis बनाए रखने स्नायु (ORL), जो कक्षा क्षेत्र में एक नाजुक संरचना है की जांच. इस विधि में, काटा नमूनों formalin में तय कर रहे हैं, सीरियल इथेनॉल समाधान में निर्जलित, और एक पीटीए समाधान के साथ दाग. धुंधला करने के बाद, microCT स्कैनिंग, 3 डी पुनर्निर्माण, और विश्लेषण किया जाता है. त्वचा, स्नायुबंधन, और मांसपेशियों को स्पष्ट रूप से इस विधि का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है. नमूना आकार और धुंधला की अवधि विधि की आवश्यक विशेषताएं हैं. उपयुक्त नमूना मोटाई के बारे में था 5-7 मिमी, जिसके ऊपर प्रक्रिया धीमी थी, और इष्टतम अवधि 5-7 दिन थी, जिसके नीचे केंद्रीय क्षेत्र में एक खाली छेद कभी कभी हुआ. काटने के दौरान स्थान और छोटे टुकड़ों की दिशा को बनाए रखने के लिए, प्रत्येक भाग के एक ही क्षेत्र पर सिलाई की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, प्रत्येक टुकड़े को सही ढंग से पहचान करने के लिए शारीरिक संरचना के प्रारंभिक विश्लेषण की आवश्यकता होती है। पैराफिल्म का उपयोग सुखाने को रोकने के लिए किया जा सकता है, लेकिन नमूना विरूपण को रोकने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। हमारे बहुदिशीय अवलोकन से पता चला है कि ORL निरंतर प्लेटों की एक बहुस्तरीय meshwork से बना है, बजाय धागे की तरह फाइबर, के रूप में पहले की सूचना दी. इन परिणामों का सुझाव है कि PTA के साथ microCT स्कैनिंग मानव ऊतक के जटिल संरचनाओं के भीतर विशिष्ट डिब्बों की जांच के लिए उपयोगी है. यह कैंसर के ऊतकों, तंत्रिका ऊतकों, और दिल और जिगर की तरह विभिन्न अंगों के विश्लेषण में सहायक हो सकता है।

Introduction

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मैनुअल विच्छेदन और हिस्टोलॉजिकल अवलोकन आम तौर पर मानव ऊतकों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों के रूप में. हालांकि, मैनुअल विच्छेदन आसानी से नाजुक संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकता है, और हिस्टोलॉजिकल अवलोकन फ्लैट क्रॉस-सेक्शनल सतहों1,2के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करता है। इसलिए, ऊतकों की अधिक सटीक और कुशलता से जांच करने के लिए बेहतर तरीकों की आवश्यकता होती है।

पारंपरिक गणना टोमोग्राफी (सीटी) आम तौर पर नैदानिक अभ्यास में प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह छोटे संरचनाओं2,3भेद करने की क्षमता का अभाव है। माइक्रो एक्स-रे सीटी (माइक्रोसीटी) नमूनों से छोटे संरचनाओं की तीन आयामी (3 डी) जानकारी प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है, उन्हें नष्ट किए बिना। हालांकि, microCT सीमित अनुप्रयोगों है क्योंकि केवल घने ऊतकों स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है; यह नरम ऊतकों में अंतर करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इस सीमा को दूर करने के लिए, धुंधला एजेंटों का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके विपरीत बढ़ाने एजेंटों, फॉस्फोतुंगस्टिक एसिड (पीटीए), फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड, और Lugol आयोडीन की तरह, स्कैनिंग के दौरान नरम ऊतक विपरीत दर में सुधार4,5. इन एजेंटों की तुलना करने वाले अनेक अध्ययनों से पता चलता है कि पीटीए अच्छे निष्पादन को दर्शाता है और6,7,8को संभालना आसान है .

ऑर्बिकुलरिस रख-रखाव स्नायु (ओआरएल) कक्षा के चारों ओर एक नाजुक संरचना है, जो पारंपरिक अवलोकन9के दौरान आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकती है। हम जांच की और सफलतापूर्वक एक विपरीत एजेंट के रूप में पीटीए के साथ microCT का उपयोग कर इस संरचना पर 3 डी जानकारी प्राप्त की। इस विधि को अन्य मानव ऊतकों , जैसे हृदय और यकृत पर अध्ययन करने के लिए उपयुक्त संशोधनोंकेसाथ लागू किया जा सकता है10 ,11,12.

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Protocol

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इस अध्ययन में उपयोग किए गए सभी शवों को कानूनी तौर पर योनसी विश्वविद्यालय कॉलेज ऑफ मेडिसिन में सर्जिकल एनाटॉमी शिक्षा केंद्र को दान कर दिया गया था।

1. नमूने प्राप्त करना

  1. नमूना कटाई के लिए काटने के क्षेत्र को इंगित करने के लिए एक रंगीन पेंसिल के साथ शव पर एक चीरा लाइन ड्रा। जाँच करें कि चीरा रेखा तैयार एक मध्यस्थ canthus के लिए medialy फैली हुई है, बाद में एक पार्श्व canthus के लिए, बेहतर से कम पलक के एक बेहतर सीमा के लिए, और कक्षीय रिम से रेखा के नीचे 1 सेमी से कम.
    नोट: माइक्रो-सीटी उपकरण ों की अधिकतम स्कैनिंग आकार के आधार पर नमूना आकार पर विचार करें (हमारे उपकरण 7 डिग्री 7 सेमी की अधिकतम वस्तु आयाम के साथ एक छवि प्राप्त कर सकते हैं)। यहाँ, चौड़ाई में लगभग 1 सेमी, लंबाई में 3 सेमी, और 1.25 ग्राम वजन का एक नमूना ओएल क्षेत्र से काटा गया था।
  2. एक ब्लेड के साथ चीरा लाइन के बाद चेहरे के ऊतकों में कटौती. सुनिश्चित करें कि कटौती गहरी ऐसी है कि ब्लेड की नोक हड्डी को छू लेती है। नमूना त्वचा शामिल करना चाहिए, चमड़े के नीचे ऊतक, मांसपेशियों, वसा, और periosteum.
  3. नमूना को तुरंत 10% फॉर्मलिन में ठीक करें और कमरे के तापमान पर 5 से 7 दिनों के लिए इसे संरक्षित रखें (चित्र 1क) ।
    नोट: दोनों embalmed और ताजा शव इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तथापि, शवों के लिए निर्धारण समाधान जैविक प्रयोग में प्रयुक्त विलयन से थोड़ा भिन्न हो सकता है। इसलिए, हम embalmed शवों से नमूना प्राप्त करने के बाद भी फिर से 10% formalin के साथ नमूना फिक्सिंग का सुझाव देते हैं.

2. धुंधला करने के लिए तैयारी

  1. फिक्सिंग के बाद, 3 टुकड़ों में नमूना टुकड़ा (5-7 मोटाई में मिमी). इस प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक टुकड़े के स्थान और दिशा को न खोएं।
    नोट: microCT स्कैनर हम उपयोग की एक अधिकतम आकार को कवर कर सकते हैं 7 cm3, लेकिन पीटीए समाधान नमूना सफलतापूर्वक घुसना नहीं कर सकता अगर यह बहुत मोटी है.
  2. सुई और काले धागे का उपयोग करके प्रत्येक टुकड़े के अधिलोबाघर की ओर सीना इस तरह कि नमूने की दिशा बाद में जाँच की जा सकती है।
  3. 30%, 50%, और 70% इथेनॉल समाधान की एक श्रृंखला में नमूना निर्जलित 1 प्रत्येक के लिए.
  4. धुंधला जब तक 70% इथेनॉल में नमूना रखें.

3. पीटीए की तैयारी

  1. माइक्रोसीटी स्कैनिंग शेड्यूल होने से 1 सप्ताह पहले पीटीए धुंधला प्रक्रिया शुरू करें।
  2. 70% एथेनॉल विलयन के 210 एमएल तैयार कीजिये और इसमें 2.1 ग्राम पीटीए शक्ति का घोल मिलाइए। 55-60 आरपीएम पर एक शेकर का उपयोग कर अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: पीटीए समाधान की एकाग्रता इथेनॉल में 1% होना चाहिए।
  3. प्रत्येक कटा हुआ टुकड़ा के लिए तीन 70 एमएल प्लास्टिक के कंटेनर तैयार करें। पीटीए समाधान के साथ कंटेनर भरें। नमूनों को कंटेनरों में भिगो दें और प्रभावी प्रवेश के लिए उन्हें एक शेकर पर रखें। नमूने 5-7 दिनों के लिए छोड़ दें (चित्र 1ख)
  4. जब धुंधला पूरा हो गया है, 70% इथेनॉल में नमूना स्टोर स्कैनिंग के लिए तैयार करने के लिए.
    नोट: दाग नमूने कई महीनों के लिए बनाए रखा जा सकता है, लेकिन यह सिफारिश की है कि नमूने के रूप में जल्द से जल्द स्कैन करने के लिए पूर्ण धुंधला सुनिश्चित करने के लिए.

4. माइक्रोसीटी स्कैनिंग

  1. सुखाने को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ नमूना लपेटें। नमूने बहुत तंग लपेटो नहीं है, के रूप में है कि विरूपण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  2. स्कैनर खोलें और नमूना ट्रे पर रखें (चित्र 2) .
  3. स्कैनिंग पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: स्रोत वोल्टेज (kV) $ 70, स्रोत वर्तमान (जेडए) $ 114, अल फिल्टर $ 0.5 मिमी, छवि पिक्सेल आकार ($m2) $ 20, पिक्सेल ] 2240 $ 2240, जोखिम (ms) $ 500, रोटेशन चरण (deg) ] 0.3.
    नोट: पैरामीटर नमूने और /या स्कैनर के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
  4. स्कैनिंग शुरू करो.
    नोट: स्कैनिंग इरादा संकल्प और स्कैनर की गति के आधार पर 30 से 60 मिनट लेता है।

5. पुनर्निर्माण और डेटा का अनुकूलन

  1. पुनर्निर्माण सॉफ़्टवेयर चलाएँ। स्कैन की गई फ़ाइलों को लॉन्च करने के लिए कार्रवाई मेनू पर डेटासेट खोलें का चयन करें.
  2. पुनर्रचना विंडो पर सेटिंग्स टैब का चयन करें. इस प्रकार के रूप में पैरामीटर सेट करें: अंगूठी कलाकृतियों में कमी - 7, बीम सख्त सुधार (%) $ 40.
    नोट: पैरामीटर नमूने के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
  3. प्रारंभ टैब पर प्रारंभ करें का चयन करके पुनर्निर्माण प्रारंभ करें. अंतिम डेटा निर्दिष्ट फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जाएगा.
  4. फ़ाइल का आकार बदलने वाले सॉफ़्टवेयर चलाएँ. पुनर्निर्माण फ़ाइलों को लॉन्च करने के लिए स्रोत डेटा सेट का चयन करें.
  5. गंतव्य डेटा सेट टैब पर जेपीजी का चयन करें.
  6. कोई प्रक्षेप (तेजी) की गुणवत्ता विकल्प के साथ 1/
  7. छवि संपीड़न टैब में स्लाइड पट्टी को 100 (उच्चतम) में समायोजित करें. कनवर्ट करना प्रारंभ करें.
    नोट: आकार बदलने विकल्प 3 डी गाया जब कंप्यूटर की गति को धीमा से बचने के लिए है; हालांकि, यह कम संकल्प में परिणाम जब बड़े पैमाने पर आकार दिया जा सकता है. हम बेहतर हैंडलिंग के साथ स्वीकार्य संकल्प के लिए आधे में आकार बदलने का सुझाव देते हैं।

6. 3 डी पुनर्निर्माण

  1. 3D वॉल्यूम रेंडरिंग सॉफ़्टवेयर चलाएँ।
  2. डेटासेट लॉन्च करने के लिए क्रियाएँ और वॉल्यूम डेटा लोड करें का चयन करें.
  3. स्थानांतरण फ़ंक्शन संपादक टैब में हिस्टोग्राम में आकृति स्थानांतरण फ़ंक्शन को संशोधित करके चमक और कंट्रास्ट स्तर समायोजित करें.
  4. विकल्प का चयन करें ] प्रकाश|
  5. छाया और सतह प्रकाश चिह्न का चयन करें. ये प्रभाव एक यथार्थवादी मॉडलिंग टोन प्रदान करते हैं.
  6. (( क्लिक करें और खींचें),घूर्णन(राइट-क्लिक करें और खींचें),और में या बाहर zooming (स्क्रॉल) मॉडल द्वारा सबसे अच्छा दृश्य का पता लगाएं।
  7. अनुभागीय छवियों को दिखाने के लिए विमान(बदलाव + क्लिक करें और भीतरी दिशा में खींचें) स्लाइड ( चित्र3)।
  8. लाइट आइकन चालू करें. प्रकाश संकेत पट्टी समायोजित करें और देखने के लिए सबसे अच्छा प्रकाश व्यवस्था पाते हैं। फिर, चिह्न बंद करें और लाइटिंग टैब बंद करें.
  9. अंतिम छवि के लिए बॉक्स को छुपाने के लिए विकल्प का चयन करें और दिखाएँ ] क्लिपिंग बॉक्स.
  10. छवि संग्रहीत करने के लिए क्रियाएँ और छवि सहेजें का चयन करें.

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Representative Results

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ओ आर एल का विस्तृत पुनर्निर्माण पीटीए तैयारी के साथ माइक्रोसीटी द्वारा प्राप्त किया गया था (चित्र 4) । डर्मस और पेरिओस्टेम के बीच तिरछी रूप से विस्तारित स्नायुीय फाइब्रोमस्क्युलर संरचना को स्पष्ट रूप से देखा गया था (चित्र 4क) कोरोनल दृश्य में (चित्र 4B), फाइबर की मात्रा और जटिलता बाद में वृद्धि हुई. क्षैतिज दृश्य (चित्र 4C) में , एक वृक्षीकृत गठन के साथ एक विस्तृत जाल का काम देखा गया था। हम एक सतत प्लेटों की विशेषता आकार मनाया, बजाय धागे की तरह फाइबर, के रूप में पहले की सूचना दी. धनु र्ं र्ंर्ं 4Dमें ओआरएल रेशों की मोटाई में अधः कमी आई थी. कुल मिलाकर, इस बहुदिश अवलोकन साबित कर दिया कि ORL स्थान के आधार पर संख्या और मोटाई में भिन्नता के साथ निरंतर प्लेटों की एक बहुस्तरीय meshwork से बना है.

Figure 1
चित्र 1. नमूने काटा गया और फिर पीटीए समाधान के साथ दाग.
(क)फसल कटाई के बाद 10% फॉर्मलिन में नमूने निर्धारित किए गए थे। (बी)नमूनों को प्रवेश बढ़ाने के लिए पतले टुकड़ों में काटा गया और फिर पीटीए समाधान में रखा गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. माइक्रोसीटी स्कैनर।
तीर उस ट्रे को इंगित करता है जहां नमूना रखा गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. 3 डी पुनर्निर्माण.
अंदर अनुभागीय छवियों को देखने के लिए आंतरिक दिशा में विमान स्लाइड. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. ORL के 3 डी छवियों.
(ए)ओएल की समग्र छवि। (बी). कोरोनल देखें। (C)क्षैतिज दृश्य. (डी).सगीता दृश्य। एस, बेहतर; ए, पूर्ववर्ती; L, पार्श्व; पी, पीछे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. ओएल की संरचनाओं का विश्लेषण किया।
पीला, लाल, और हरे रंग क्रमशः त्वचा, मांसपेशियों, और स्नायुबंधन का संकेत मिलता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1. 3D और 2D चित्रों के बीच तुलना. (A)खंड 3 D छवि प्रदान की गई. (बी)क्रॉस अनुभागीय 2 डी छवि. स्केल बार - 1 मिमी. कृपया आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2. पैराफिल्म के लपेटन और फिक्सिंग। (ए)बाहर सुखाने को रोकने के लिए पूरे नमूने पर पैराफिल्म लपेटकर. (बी)पैराफिल्म स्कैनर पर मजबूती से नमूने को ठीक करने में मदद करता है। (सी)पैराफिल्म माइक्रोसीटी स्कैनिंग पर दिखाई नहीं देती है और इसे आसानी से घटाया जा सकता है। कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए.

पूरक चित्र 3. पीटीए का अपर्याप्त धुंधला। केंद्र में एक खोखले स्थान से पता चलता है जहां पीटीए समाधान पर्याप्त रूप से प्रवेश नहीं किया है। (A)खंड 3 D छवि प्रदान की गई. (बी)क्रॉस अनुभागीय 2 डी छवि. स्केल बार - 1 मिमी. कृपया आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 4. ताजा और embalmed शवों के बीच तुलना. प्रोटोकॉल लागू करने के लिए नए और उभरे शवों के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया। चित्र एक और सुविधा के रूप में अच्छी तरह से एक ही विधि से लिया जा सकता है दिखाता है. (ए)एक ताजा शव से प्राप्त ORL. (बी)एक एम्बेल्ड शव से प्राप्त नासोलैबियल क्रीज। कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए.

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Discussion

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हम मानव नरम ऊतकों की परीक्षा में पीटीए तैयारी के साथ microCT लागू किया. संक्षेप में, नमूनों काटा और कुछ दिनों के लिए औपचारिक रूप में तय कर रहे हैं, सीरियल इथेनॉल समाधान में निर्जलीकरण के बाद. औपचारिक निर्धारण के बाद सीधे पीटीए समाधान में नमूना रखने से तेजी से निर्जलीकरण के कारण कुछ ऊतक खुर हो सकते हैं। इसलिए, पीटीए धुंधला करने से पहले सीरियल निर्जलीकरण की आवश्यकता होती है। अगले, नमूने के बारे में एक सप्ताह के लिए पीटीए समाधान का उपयोग दाग रहे हैं. MicroCT स्कैनिंग, 3 डी पुनर्निर्माण, और विश्लेषण तो किया जा सकता है. हमारा लक्ष्य इस विधि का उपयोग कर के ORL और आसन्न संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। हम सफलतापूर्वक एक 3 डी मॉडल के रूप में ऊतक प्रस्तुत किया. त्वचा, स्नायुबंधन, और मांसपेशियों को स्पष्ट रूप से कल्पना की गई थी (चित्र 5)।

नमूनों को संसाधित करते समय कई बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। एक नमूने का आकार और धुंधला की अवधि प्रमुख चिंताओं रहे हैं. कई प्रायोगिक अध्ययनों के बाद, हमने पाया कि एक नमूने की उचित मोटाई के बारे में 5-7 मिमी है और धुंधला की उचित अवधि 5-7 दिन है. इन स्थितियों में, पीटीए विलयन लगभग 1 मिमी/दिन की दर से नमूना में प्रवेश करता है। मोटाई 7 मिमी से अधिक है, तो प्रसंस्करण समय बढ़ जाती है। जब दाग की अवधि एक नमूना की मात्रा की तुलना में अपर्याप्त है, अंतिम छवि नमूना के केंद्रीय क्षेत्र में एक खाली छेद शामिल हो सकते हैं. यह अक्सर होता है, विशेष रूप से त्वचा के स्तर पर, और अनावश्यक त्वचा को हटाने धुंधला दक्षता में सुधार कर सकते हैं. जब अवधि बहुत लंबी होती है, तो पूरे नमूने को ओवरstained कर दिया जाएगा, जिससे प्रत्येक डिब्बे की पहचान करना मुश्किल हो जाएगा। बड़े नमूनों को धुंधला करने के लिए इष्टतम अवधि पर आगे का अध्ययन उपयोगी साबित हो सकता है।

आमतौर पर, नमूना टुकड़ों में विभाजित है प्रवेश बढ़ाने के लिए; यह स्थान और इस प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक नमूने की दिशा याद करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस जानकारी को बनाए रखने के लिए, प्रत्येक भाग के एक ही क्षेत्र पर सिलाई की सिफारिश की है. थ्रेड अंतिम छवि में देखा जाएगा, और थ्रेड मुख्य क्षेत्र के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है कि सावधान रहना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रत्येक टुकड़े के superolateral क्षेत्र पर सिलाई सहायक हो सकता है. इसके अतिरिक्त, एक शारीरिक संरचना के प्रारंभिक विश्लेषण उनकी जटिलता के कारण प्रत्येक ऊतक भाग पहचान करने के लिए आवश्यक हैं।

नमूनों को सुखाने से रोकने के लिए पैराफिल्म और अन्य सामग्री का उपयोग किया जाता है। हालांकि, नमूनों लपेटकर मामूली विकृति हो सकती है। यह संभव सबसे बड़ी हद तक मूल आकार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. कभी-कभी पैराफिल्म के बजाय तरल ट्यूब का उपयोग किया जाता है। हालांकि, यहां तक कि एक मशीन की थोड़ी सी भी कांप स्कैनिंग के दौरान ट्यूब को प्रभावित करने की क्षमता है और अंतिम छवि की स्पष्टता को कम हो सकता है.

इस दृष्टिकोण के लिए कई सीमाएं हैं. सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल एक जीवित वस्तु के साथ नहीं किया जा सकता है. इसके अलावा, नमूना आकार microCT स्कैनर की अधिकतम स्कैनिंग आकार द्वारा प्रतिबंधित है. नग्न आंखों से प्रदान की गई छवि का विश्लेषण करते समय त्रुटियाँ हो सकती हैं; इसलिए, निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त हिस्टोलॉजिकल प्रयोगों की आवश्यकता हो सकती है। तैयारी के दौरान मामूली आयामी विरूपण हो सकता है; हालांकि, हम मानते हैं कि यह काफी अध्ययन के परिणाम को प्रभावित नहीं करता है.

पीटीए की तैयारी के साथ माइक्रोसीटी स्कैनिंग एक जटिल संरचना के भीतर विशिष्ट डिब्बों की जांच के लिए फायदेमंद है। इस अध्ययन पीटीए तैयारी का उपयोग कर विपरीत दर को बढ़ाने के लिए एक विधि के विकास पर ध्यान केंद्रित किया, और स्कैनिंग और पुनर्निर्माण प्रक्रियाओं की तरह अन्य सुविधाओं, संक्षेप में संकेत दिया गया. हालांकि, पाठकों को एक ही परिणाम प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए अगर वे धुंधला प्रक्रिया के बाद समकालीन microCT स्कैनर और छवि विश्लेषण कार्यक्रमों का उपयोग करें. यह विधि कैंसर के ऊतकों और संरचनाओं के विश्लेषण में सहायक साबित हो सकती है, विशिष्ट क्षेत्रों में तंत्रिका योगदान, और अंगों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन शारीरिक संरचनाओं, जैसे हृदय और यकृत13,14,15.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन Yonsei विश्वविद्यालय कॉलेज ऑफ मेडिसिन (6-2018-0099) के एक संकाय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. लेखक लोग हैं, जो बहुत उदारता से Yonsei विश्वविद्यालय चिकित्सा कॉलेज के लिए अपने शरीर दान धन्यवाद. हम जून हो किम और जोंग हो बैंग उनके तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं (Yonsei विश्वविद्यालय कॉलेज ऑफ मेडिसिन में सर्जिकल एनाटॉमी शिक्षा केंद्र में स्टाफ के सदस्यों). हम भी इस शोध में इस्तेमाल उच्च गुणवत्ता microCT स्कैनिंग प्रणाली के लिए Genoss कं, लिमिटेड के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate
Phosphotungstic acid
Junsei 84220-0410 PTA powder
CTvox Bruker ver 2.7 3D recon software
Nrecon Bruker ver 1.7.0.4 Reconstruction software
Skyscan Bruker 1173 MicroCT scanner
Tconv Bruker ver 2.0 File resizing software

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References

  1. Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338, (7), 425-433 (2015).
  2. Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92, (2), 299-303 (2017).
  3. Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11, (3), 1-11 (2016).
  4. Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133, (1), 67-83 (1979).
  5. Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91, (4), 283-289 (1989).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, (11), (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, (3), 632-640 (2009).
  8. Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23, (9), 1613-1621 (2015).
  9. Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8, (1), 17042 (2018).
  10. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12, (2), e0170597 (2017).
  11. Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13, (2), 1-12 (2018).
  12. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10, (11), e0142974 (2015).
  13. Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26, (8), 1118-1126 (2018).
  14. Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276, (9), 1025-1046 (2015).
  15. Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
मानव फाइब्रोमस्क्युलर ऊतक कल्पना करने के लिए फॉस्फोटंगस्टिक एसिड तैयारी के साथ माइक्रो एक्स-रे कम्प्यूटेड टॉमोग्राफी का उपयोग
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O, J., Kwon, H. J., Kim, S. H., Cho, T. H., Yang, H. M. Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue. J. Vis. Exp. (151), e59752, doi:10.3791/59752 (2019).More

O, J., Kwon, H. J., Kim, S. H., Cho, T. H., Yang, H. M. Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue. J. Vis. Exp. (151), e59752, doi:10.3791/59752 (2019).

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