Brug af mikro røntgen-computertomografi med Phosphotungstic syre præparat til at visualisere humant Fibromuskulær væv
Summary
Micro X-ray computertomografi er effektiv til at opnå tredimensionelle oplysninger fra ubeskadigede humane prøver, men har begrænset succes med at observere bløde væv. Brugen af wolframphosphorsyre syre kontrastmiddel kan løse dette problem. Vi implementerede denne kontrastmiddel til at undersøge humant delikat fibromuskulære væv (musculus fastholdelse ligament).
Abstract
Manuel dissektion og histologisk observation er almindelige metoder, der anvendes til at undersøge humane væv. Men manuel dissektion kan beskadige sarte strukturer, mens behandling og histologisk observation giver begrænset information gennem tværsnits dannelse. Micro X-ray computertomografi (microCT) er et effektivt værktøj til at opnå tredimensionelle oplysninger uden at beskadige prøver. Det viser imidlertid begrænset effektivitet i differentiering af bløddels dele. Brug af kontrast-styrke agenter, ligesom wolframphosphorsyre syre (PTA), kan løse dette problem ved at forbedre blødt væv kontrast. Vi implementerede microct med PTA til at undersøge den menneskelige musculus fastholdelse ligament (ORL), som er en delikat struktur i kredsløb område. I denne metode er høstet prøver fastgjort i formalin, dehydreret i serielle ethanol løsninger, og farvet med en PTA opløsning. Efter farvning, microCT scanning, 3D rekonstruktion, og analyse udføres. Hud, ledbånd, og muskler kan tydeligt visualiseret ved hjælp af denne metode. Prøvestørrelsen og varigheden af farvning er væsentlige træk ved metoden. Den egnede prøve tykkelse var omkring 5 – 7 mm, over hvilken processen blev bremset, og den optimale varighed var 5 – 7 dage, hvorunder et tomt hul i det centrale område lejlighedsvis opstod. For at bevare placeringen og retningen af små stykker under skæring anbefales det at sy på samme område i hver del. Desuden er der behov for indledende analyser af den anatomiske struktur for at identificere hvert stykke korrekt. Parafilm kan bruges til at forhindre tørring, men der skal udvises forsigtighed for at forhindre præparat forvrængning. Vores multidirectional,, observation viste, at ORL er sammensat af et flerlaget meshwork af kontinuerlige plader, snarere end tråd-lignende fibre, som rapporteret tidligere. Disse resultater tyder på, at microCT scanning med PTA er nyttig til at undersøge specifikke rum inden for komplekse strukturer af humant væv. Det kan være nyttigt i analyserne af kræft væv, nerve væv, og forskellige organer, ligesom hjertet og leveren.
Introduction
Manuel dissektion og histologisk observation anvendes typisk til at undersøge humane væv, såsom muskler og bindevæv. Men manuel dissektion kan nemt beskadige sarte strukturer, og histologisk observation giver begrænset information om flade tværsnits flader1,2. Derfor er der behov for forbedrede metoder til at undersøge væv mere præcist og effektivt.
Konventionel computertomografi (CT) er generelt anvendes i klinisk praksis, men det mangler evnen til at skelne små strukturer2,3. Micro X-ray CT (microCT) er et effektivt værktøj til opnåelse af tredimensionelle (3D) oplysninger om små strukturer fra enheder, uden at ødelægge dem. Men, microCT har begrænsede applikationer, fordi kun tætte væv kan visualiseres klart; Det kan ikke bruges til at differentiere bløde væv. For at overvinde denne begrænsning kan farvnings midler anvendes. Kontrast fremmende stoffer, som wolframphosphorsyre syre (PTA), phosphomolybdic syre, og Lugol jod, forbedre blødt væv kontrast sats under scanning4,5. Flere undersøgelser, der sammenligner disse agenter tyder på, at PTA demonstrerer god ydeevne og er let at håndtere6,7,8.
Musculus fastholdelse ligament (ORL) er en delikat struktur omkring kredsløb, som let kan beskadiges under konventionel observation9. Vi undersøgte og med held hentet 3D-oplysninger om denne struktur ved hjælp af microCT med PTA som et kontrastmiddel. Denne metode kan anvendes til undersøgelser af andre humane væv, såsom hjerte og lever, med passende modifikationer10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi implementerede microCT med PTA forberedelse i undersøgelsen af humant blødt væv. Kort, prøver høstes og fikseret i formalin i et par dage, efterfulgt af dehydrering i serielle ethanolopløsninger. Hvis prøven anbringes i PTA-opløsningen direkte efter formalin fiksation, kan det resultere i revner i væv på grund af hurtig dehydrering. Derfor er seriel dehydrering nødvendig før PTA farvning. Næste, prøverne er plettet ved hjælp af PTA løsning for omkring en uge. Mikroct scanning, 3D rekonstruktion, og ana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af et Fakultets forskningsstipendium fra Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Forfatterne takker de mennesker, der meget generøst doneret deres kroppe til Yonsei University College of Medicine. Vi er taknemmelige for Jun Ho Kim og Jong Ho bang for deres tekniske support (medarbejdere i kirurgisk anatomi Education Centre på Yonsei University College of Medicine). Vi er også taknemmelig for Genoss Co., Ltd. for den høje kvalitet microCT scanning system, der anvendes i denne forskning.
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
