Summary
אנו מציגים שיטה מועילה לסינתזה אנזימטית וטיהור של אנאנטימרים ספציפיים ובעלי מגוון רחב של חומצה ארכידונית (AA), חומצה docosahexaenoic (DHA), וחומצה eicosapentaenoic (EPA) עם שימוש של ציטוכרום בקטריאלי אנזים P450 (BM3).
Abstract
האפוקסי מטבוליטים של חומצות שומן רב בלתי רוויות שונות (PUFAs), הנקראת חומצות שומן אפוקסי, יש מגוון רחב של תפקידים בפיזיולוגיה של האדם. אלה מטבוליטים מיוצרים באופן שורש על ידי מחלקת P450 ציטוכרום של אנזימים. בגלל השפעות ביולוגיות מגוונות וחזקות שלהם, יש עניין רב בלמידה אלה מטבוליטים. קביעת התפקידים הייחודיים של מטבוליטים אלה בגוף היא משימה קשה, כמו חומצות שומן אפוקסי יש לקבל תחילה בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוהה. קבלת תרכובות ממקורות טבעיים היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, ו לייף hydrolases מסיסים הידרו במהירות את מטבוליטים. מצד שני, קבלת אלה מטבוליטים באמצעות תגובות כימיות הוא מאוד לא יעיל, בשל הקושי של קבלת regisomers טהור, enantiomers, תשואות נמוכות, ונרחב (ויקר) טיהור. כאן, אנו מציגים סינתזה אנזימטית יעיל של 19 (s), 20 (r)-ו-16 (s), 17 (r)-האפוקסי חומצות (edps) מ-DHA באמצעות אפוקסי עם BM3, אנזים CYP450 חיידקי מבודד במקור ממלוס מקרתגו megaterium (המתבטא בקלות באסאנכיה קולי). אפיון וקביעת טוהר מתבצעים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וספקטרומטר מסה (MS). הליך זה ממחיש את היתרונות של סינתזה אנזימטית של PUFA אפוקסי מטבוליטים, והוא חל על האפוקסי של חומצות שומן אחרות, כולל חומצה ארכידונית (AA) וחומצה eאיסאופנטקאנומית (EPA) כדי לייצר את האפוקסי האנלוגי חומצות (EETs) ומוצרי אפוקסי (EEQs), בהתאמה.
Introduction
כעניין התפקיד כי חומצות שומן רב בלתי רווי (במיוחד אומגה 3 ו אומגה 6 חומצות שומן רב בלתי רווי) לשחק בביולוגיה אנושית גדל בשנים האחרונות, החוקרים הבחינו של מגוון רחב של הטבות מושך כי מטבוליטים שלהם תערוכה. במיוחד, שומן אפוקסי חומצת מטבוליטים המיוצר על ידי מחלקה P450 ציטוכרום של אנזימים היו נקודת גדול של מיקוד. לדוגמה, באפופא רבים, כולל חומצות שונות (eets), חומצות שמנת (edps) וחומצות אפוקסי (eeqs), משחקים תפקיד קריטי בוויסות לחץ הדם ודלקת1,2 ....... , מיכל שלוש , ד , 5. מעניין, enantiomers ספציפיים ו regioisomers של AA ו-EPA ואפוקסידס ידועים יש השפעות שונות על הצומת6,7. בעוד ההשפעות הפיזיולוגיות של enantiomers ו regioisomers של EETs ו-EEQs תועדו, מעט ידוע על ההשפעה של חומצות האפוקסי מקבילה ביותר (EDPs) נוצר מ DHA. שימוש נרחב של שמן דגים8, אשר עשיר הן EPA ו-DHA, גם עוררה עניין ב-edps9. היתרונות של תוספי מזון אלה הם האמינו בחלקו בשל הזרם מטבוליטים DHA (16, 17-EDP ו 19, 20-EDP להיות הנפוץ ביותר) כי ברמות vivo של הקואורדינטות Edp טוב מאוד עם כמות של DHA בדיאטה10, . בסדר, 11
לימוד המנגנונים והיעדים של חומצות שומן אפוקסי אלה על ידי טבולומיקס, ביולוגיה כימית, ושיטות אחרות הוכיחו מאתגרת, בין השאר כי הם קיימים כתערובות של regio-ו-מערכת סטריאו, ושיטה להשיג כמויות טהורות של המלון מחויב ליחידים ולמבודדים. אמצעים קונבנציונליים לסינתזה תרכובות אלה הוכחו ללא יעילים. שימוש בחומצות הפראוקסיטציה כמו חומצה מטה-כלורמטומית לאפוקסי בעלי חסרונות רבים, ובראשם העדר סלקטיביות, הדורשת טיהור יקר ומדקדק של המוני ואנאנטינים בודדים. סינתזה הכולל של DHA ו-EPA מטבוליטים אפשרי, אבל גם סובל מחסרונות שעושים את זה מעשי סינתזה בקנה מידה גדול כגון עלויות גבוהות תשואה נמוכה12,13. הייצור הכולל יעיל ניתן להשיג עם סינתזה אנזימטית, כמו תגובות אנזימטיות הם regio-ו סטריאוסלקטיבית14. מחקרים מראים כי מגוון אנזימטית של AA ו-EPA (עם BM3) הוא שניהם regioselective ו enantioselective15,16,17,18, אבל הליך זה לא נבדק עם DHA, או על גדול ידה. המטרה הכללית של השיטה שלנו היתה לשנות את היקף ולייעל את האפוקסי כימוזציה זו כדי לייצר במהירות כמויות משמעותיות של חומצות שומן באפוקסי טהור כמו enantiomers הפרט שלהם. באמצעות השיטה המוצגת כאן, החוקרים יש גישה אסטרטגיה פשוטה וחסכונית לסינתזה של EDPs ו-PUFA אחרים אפוקסי מטבוליטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים המפורטים.
1. ביטוי מסוג פראי BM3
- איחסן pBS-BM3 מDH5α E. coli (תרומה נדיבה של ד ר פ. אן ווקר) ב 5 מ ל של מרק LB סטרילי עם 0.5 מ"ג של אמפיצילין נוסף לתוך שפופרת תרבות 20 מ ל.
- מודטה את תרבות התא בשייקר ב 37 ° c עבור 24 שעות ב 200 rpm. להוסיף את התרבות לילה המתנע (5 מ ל) ו 100 mg של אמפיצילין L של מרק ליברות סטרילי בבקבוקון פרנבאך או Erlenmeyer אייר. נענעי ב 37 ° צ' עבור 6 h ב 200 סל"ד, ואז ב 30 ° c עבור 18 h ב 200 rpm.
- איסוף וצנטריפוגה את תרבות התא ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ב 1,000 x g. השמט את הסופרנטנט ואחסן את הגלולה בתא-78 ° צ' עד לטיהור אנזימים.
הערה: supernatant יכול להיות מעוקר כימית על ידי טיפול עם אקונומיקה או מעוקר באמצעות החיטוי ולאחר מכן נשפך לטמיון.
2. טיהור של BM3.
-
פירוק תאים
- הפשרת את הגלולה הסלולרית על הקרח והשעיית מחדש ב-40 מ ל של מאגר מסיסות (4 ° c) של קרח קר (ארבע מעלות צלזיוס) (10 מ"מ טריס, 0.01 מ"מ פנילמתיל פלופקסיל (PMSF;), 0.01 מ"מ EDTA; pH 7.8).
התראה: PMSF הוא רעיל על ידי מגע. - בעוד בקרח, sonicate את התאים עבור 1 דקות עם הומוגניצר אולטרה סאונד (פלט כוח הגדרת 10, חובת 100%), ואחריו הפסקה 1 דקות על הקרח על מנת lyse את התאים. חזור על הליך זה 6 פעמים. צנטריפוגה את התא ליפוסט ב 4 ° צ' עבור 30 דקות ב 11,000 x g כדי לכלוך תא גלולה.
- הפשרת את הגלולה הסלולרית על הקרח והשעיית מחדש ב-40 מ ל של מאגר מסיסות (4 ° c) של קרח קר (ארבע מעלות צלזיוס) (10 מ"מ טריס, 0.01 מ"מ פנילמתיל פלופקסיל (PMSF;), 0.01 מ"מ EDTA; pH 7.8).
-
כרומטוגרפיה של אהדה
- הכנת עמודה חזקה של חילופי כרומטוגרפיה (ראה טבלת חומרים; קוטר: 2.8 ס"מ x 6 ס"מ, נפח עמודה: 37 mL) על ידי כביסה עם 5 כרכים של עמודות (CV) של מאגר a (10 מ"מ טריס, pH 7.8) ב 4 ° c.
- הוסף את התאים הניידים לעמודה מעורפלת ושטוף את העמודה עם 3 קורות חיים של מאגר קר A. Elute the BM3 על ידי שטיפת הטור עם מאגר קר B (10 מ"מ טריס, 600 mM הנאקל, 6 קורות חיים).
- לאסוף את שבר משחרלי חום אדמדם. אם החלבון אינו משמש באופן מיידי, ערבב אותו עם נפח שווה של גליצרול והקפאת הבזק עם חנקן נוזלי. אחסן את הפתרון הקפוא ב-78 ° c.
3. אפוקסי של DHA על ידי BM3
- להכין את התגובה על ידי הוספת 0.308 g (0.940 mmol) של DHA ב 18.8 mL של dimethylsulfoxide (DMSO) כדי 2 L של מאגר התגובה זע (0.12 M אשלגן פוספט, 5 מ"מ MgCl2, pH 7.4) יחד עם 20 ננומטר של האנזים BM3 הופדיל. ריכוז האנזים ניתן לקבוע על ידי שיטת הדו חד תחמוצת הפחמן/דיתיוונייט19.
- בעוד הפתרון הוא זע, להתחיל את התגובה על ידי הוספת 1 שווה ערך ל-NADPH (מופחת בדרך-אגב, מופחתת מלח הטטרנתרן, 0.808 g, 0.940 mmol) הומס מאגר התגובה. מערבבים את התגובה עבור 30 דקות תוך מבעבע אוויר דרך תערובת התגובה עם בלון מלא אוויר מוצמד מזרק מחט.
- באמצעות ספקטרוסקופיה (ראה טבלת חומרים), בדוק את ספיגת תערובת התגובה ב 340 nm כדי לקבוע אם nadph מתרוקן. אם אין ספיגה נוספת המציינת את הצריכה של NADPH, התגובה תושלם.
הערה: בדרך כלל, התגובה הושלמה לאחר 30 דקות. - להרוות את תערובת התגובה על ידי הוספת לאט חומצה אוקסלית 1 M, dropwise, עד pH של הפתרון מגיע 4.
4. הפקת האדפס
- לחלץ את הפתרון מאגר הקרה עם 2 L של דיאתיל אתר (anהידרוous, ללא תחמוצת) 3 פעמים. לאסוף את שכבת האתר (6 L) ויבש עם מגנזיום אנמים סולפט (MgSO4).
- מסננים את MgSO4 מן הפתרון ולרכז את שכבת האתר מיובש על מאייד רוטרי להניב שאריות edp גסה.
- לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה עמודה פלאש (מחסנית 40 g סיליקה מספיקה). התחל ב 10% אתיל אצטט (אטואק) ב הקסנס ואת הרמפה עד 60% אטואק ב הקסאנס מעל 22 דקות.
הערה: שלוש פסגות גדולות מתקבלות ונאספות, משחררי בסדר של 1. לא הגיב DHA; 2. תערובת של איזופ איפולימרים; ו-3. di-לייף (מוצרים נורמליים על חמצון (ראה איור 1)). - לשלב את השברים ולמקד אותם על המאדה רוטרי. מדוגמה זו, 0.074 g, (24%) של DHA בלתי מגיב, 0.151 g (47%) של EDP איזוers, ו 0.076 g, (22%) של di-לייף הושגו.
5. הריפיקציה של EDPs, הפרדה של 16 (s), 17 (r)-ו-19 (s), 20 (r)-edps, ו סאפפיקציה של אסטרים
התראה: טרימתיל סיללדימתאן (TMS-diazomane) הוא רעיל מאוד על ידי מגע ואינהלציה. השתמש רק בתוך מכסה עם ציוד הגנה אישי תקין.
- דלל את האפוקסידות (0.151 g, 0.435 manm) בבקבוקון עם תחתית עגול או בקבוקון קטן עם 2 מ ל של anמתנול ous (MeOH) ו-3 מ ל של אנידראן טולואן, מוסיפים בר-מהומה, ומוסיפים TMS-diazomane (1.2 מקבילות, או 0.26 mL של 2 M פתרון ב hexanes) תחת ארגון.
- המתן 10 דקות והוסף תוספת TMS-diazomane (0.050 mL) עד שיישאר צבע צהוב חיוור.
- לאחר 30 דקות, לרכז בזהירות את התערובת באמצעות מאייד רוטרי ולטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש. אליוט עם 4% אטואק בהקסנס (באמצעות טור או מחסנית סיליקה ג'ל 40 g) במשך 22 דקות. בדוגמה זו, 19, 20-EDP מתיל אסתר (0.116 g, 74%) ו 16, 17-EDP מתיל אסתר (0.029 g, 19%), התקבלו כשמנים ברורים (תשואה כוללת, 93%).
- אספו את השברים המכילים את המוני מתיל EDP מטוהרים. 19 (ים), 20 (ה)-edp מתיל אסתר לראשונה, ואחריו 16 (ים), 17 (r)-edp מתיל אסתר.
- אם יישארו שברים מעורבים (המכילים גם איזוers; ניתן להעריך על-ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (ועוד) ב-8:1 הקסאן/אטואק ומוכתמת באשלגן פרמנגנט (KMnO4)), מחדש כרומאטוגרף אותם עם מערכת ממיסים זהה לפני.
- רכזו את השברים המכילים את היחידות הבודדות.
הערה: בשלב זה, הזהות והטוהר עשויים להיות מוערך על ידי NMR (באמצעות CDCl3 כמו הממס; ראה את האגדה עבור איור 2). - כדי להמיר בודדים EDP מתיל אסתר regiאוינים כדי צורות החומצה שלהם, לדלל את אסתר EDP ב THF: מים (כ 0.7 mL/0.1 mmol של אסתר). להוסיף 2 מימית ליהוי (3 מקבילות טוחנת) ומערבבים בן לילה.
הערה: שלמות התגובה יכולה להיות מוערך על-ידי השימוש ב-3:1 הקסאנס/אטואק, כתמים עם KMnO4; למוצר יש גורם שמירה של ~ 0.3. - להרוות את התגובה לאט עם חומצה פורמית, עד pH של התערובת מגיע 3-4. הוסף מים ו אתיל אצטט (1-2 mL/0.100 mmol של אסתר) ולהפריד את השכבות. לחלץ את שכבת המים עם אטואק (3 x 5 מ ל), לשטוף עם תמיסת מלח רווי ("נמול"), ולייבש את שכבת אטואק מעל נתרן סולפט (Na2SO4).
- רכז את תמיסת אתיל אצטט באמצעות מאייד רוטרי, להוסיף הבעיה (10 mL) ולהתרכז שוב. חזרו פעמיים כדי להסיר את החומצה המיאוטרופית השיורית. לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש, משחררי עם 10-30% אטואק מעל 15 דקות.
- רכזו את השברים הרצויים ויבשו בתוך הריק כדי לממן את החומצה הטהורה.
הערה: בשלב זה ניתן להעריך את טוהר enantiomeric (על-ידי כימיית מערכות, עיין באגדות לאיור 3 - איור 4 לעמודה ולתנאים). טוהר כימי יכול להיות מוערך על ידי סי18 (achiral) כרומטוגרפיה (ראה לוח חומרים והתייחסות 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כרומאטוגרמה הבזק (מבוצע באמצעות מערכת טיהור פלאש אוטומטית כפי שמתואר להלן) שהושג על ידי טיהור התערובת הגולמי מתוך מראה של אפוקסי אנזימטי מוצג באיור 1. לאחר הפרדת המוני והפרדה של האריאוינים הטהורים 16 (s), 17 (r)-Edp ו -19 (s), 20 (r)-אסטרים של מתיל edp הושגו. בדרך כלל, הם נמצאים 1:4 בקירוב ליחס 1:5, עם המוצר העיקרי להיות 19 (S), 20 (R)-edp. לא מתקבלים עוד מגזרי EDP (לדוגמה, 13, 14 או 10, 11-EDP). 1H-nmr ספקטרום של 16 (s), 17 (r)-edp (איור 2a) ו 19 (s), 20 (r)-edp (איור 2a) מתיל לאורך עם המבנים שלהם מוצגים להלן, המציין את הטוהר הגבוה של אלה תרכובות סי18 (achiral) האיקרמות של טופסי חומצה הצביעו גם purities > 98%. זהותם אושרה עוד יותר על ידי ספקטרוסקופיית מסה ברזולוציה גבוהה (הן של החומצה והן הצורות של אסתר), אשר הניב יחס מסה/חיוב ודפוסי פיצול התואמים ל-EDPs המזוהה. טוהר enantiomeric נקבע באמצעות כיול, על ידי השוואה enantiomeric אותנטי וסטנדרטים מעורבים של EDPs (בצורת חומצה שלהם, איור 3a ואיור 4a). כפי שניתן לצפות באיור 3b ואיור 4B, הן edps שהתקבלו על ידי מוצרי אפוקסי אנזימטיות הינן מאוד enantiopure בעקבות סיפיקציה (> 99% אחד enantiיומר). הזהויות של enantiomers אלה דווחו בעבר להיות 16 (s), 17 (r) ו-19 (s), 20 (r)-edp18.
איור 1 . כרומאטוגרמה מטיהור תערובת גסה המתקבלת מ-DHA (יחד עם מבנים רלוונטיים). הפסגה האמצעית (monoepoxide) מכילה את ה-EDPs הרצוי. טיהור בוצע באמצעות מערכת טיהור פלאש אוטומטית (ראה טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 . דוגמה 1H-nmr ספקטרום של 16 (s), 17 (r)-edp מתיל אסתר (2a) ו 19 (s), 20 (r)-edp מתיל אסתר (2a). ספקטרה נרשמו ב 500 MHz ב CDCl3 (הממס הוא גלוי ב 7.26 ppm ו שיורית מים ב 1.6 ppm). השינויים הכימיים הם כדלקמן: 16 (S), 17 (R)-edp מתיל אסתר: 1H-nmr (500 MHz; CDCl3): δ 5.57-5.35 (ז, 10 H), 3.68 (s, 3 h), 2.99-2.95 (m, 2 H), 2.87-2.83 (m, 6 h), 2.47-2.37 (m, 6 h), 2.29-2.21 (m, 2 h), 2.11-2.05 (m, 2 h), 0.99 (t, J = 7.5 Hz, 3 ח); 19 (S), 20 (R)-edp מתיל אסתר: 1H-Nmr (500 מגה-הרץ; CDCl3): δ 5.54-5.35 (m, 10 h), 3.68 (s, 3 h), 2.97 (td, J = 6.4, 4.2 Hz, 1 h), 2.91 (td, J = 6.3, 4.2 Hz, 1 H), 2.85-2.82 (m, 8 h), 2.44-2.36 (m, 5 H), 2.27-2.21 (m, 1 h), 1.65-1.51 (m, 3 h), 1.06 (t, J = 7.5 Hz , 3 ה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. הenantiopurity באמצעות כימורית של 16, 17-EDP (חומצה בצורת) המיוצר על ידי BM3. איור 3A מראה כרומטוגרפי כרומאטוגרם של "רצמית" 16, 17-edp (תערובת מלאכותית של סטנדרטים אותנטי של שני enantiomers14), בעוד איור 3a מראה כרומטוגרם כרומאטוגרמה של Enantiomers 16 (S), 17 (R )-Edp המיוצר על ידי שרות של DHA עם BM3, הוערך כמו > 99% S, R איזוer. העמודה היא תאית מבוססת (ראה טבלת חומרים, 250 x 4.6 מ"מ, 5 μm, 1,000 Å) משחררי עם isocratic 45% 50 mM אמוניום ביקרבונט (NH4hco3) ב מתנול (30 דקות), עם ריכוז מדגם של 0.5 מ"מ ושיעור זרימה של 1 ML/min. בבקשה לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. הenantiopurity באמצעות כימורית של 19, 20-EDP (חומצה בצורת) המיוצר על ידי BM3. איור 4A מראה כרומטוגרפיה של האיקנזה של "רצמית" 19, 20-EDP (תערובת מלאכותית של תקנים אותנטיים של שני enantiomers14), בעוד איור 4b מראה כרומטוגרם כרומוטוגרפיה של enantiomers 19 (S), 20 (R)-edp המיוצר על ידי אפוקסי על ידי DHA עם BM3, הוערך כמו > 99% S,R איזוer (שיטה כמתואר עבור איור 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 . באופן כללי התגובה אנזימטית ומבנים רלוונטיים של AA, EPA, EETs, ו-EEQs המיוצר על ידי שיטה זו נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 . כירכי הenantiopurity של 17, 18-EEQ (חומצה בצורת) המיוצר על ידי BM3. איור 6A מראה כרומטוגרפיה של "ראמית" 17, 18-eeq (תערובת מלאכותית של תקנים אותנטיים של שני אנאנטימרים14), בעוד שאיור 6a מראה כרומטוגרם כרומוטוגרפיה של Enantiomers 17 (S), 18 (R )-Eeq המיוצר על ידי מוצרי איכות של EPA עם BM3, הוערך כמו > 99% S,R איזוer (שיטה כמתואר לאיור 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים כאן שיטה פשוטה וחסכונית עבור הכנת שני מטבוליטים אפוקסי השפע ביותר של DHA-19, 20 ו 16, 17-EDP. חומצות שומן אפוקסי אלה ניתן להכין ב enantiopure מאוד (כמו S שלהם , R-איזוers) טופס באמצעות האנזים BM3 סוג פראי. כמה נקודות קריטיות שניתן להשתמש בהם לפתרון בעיות, ואת השלוחה של השיטה שלנו להכנת אפוקסי אנאנטיפורה מטבוליטים של AA ו-EPA, מתוארים להלן.
BM3 הנחיות לאחסון
אחסון האנזים BM3 מטוהרים אפשרי על ידי ערבוב תמיסת חלבון עם נפח שווה של גליצרול והקפאת הבזק עם חנקן נוזלי לפני האחסון במקפיא-78 ° c. , ברגע שהאנזים מוקפא. ניתן לאחסן אותו במשך שנה ניתן להפשיר את האנזים רק פעם אחת, חייב להיות מופקר על הקרח, והוא יכול להיות רק להשאיר על הקרח 4 h. הקפאת שוב, והתרת האנזים להפשיר ללא אמבט קרח תבטל את האנזים.
הנחיות לאחסון כימיקלים
רבים מהתרכובות הנדרשות להליך הן תלויות-אוויר. אלה כוללים DHA ו PUFAs אחרים, EDPs ומטבוליטים אחרים אפוקסי, ו-NADPH. כדי למנוע הפרחמצון (ותהליכים חמצוניים אחרים) של תרכובות אלה, יש לרוקן תמיד את המכלים שבהם הם מאוחסנים עם ארגון או חנקן וחנות ב-78 ° c.
הערה חשובה נוספת היא הפתרון שבו מאוחסן ה-DHA. למרות DHA אינו יציב מאוד ב DMSO, BM3 אינו תואם עם אתנול ו מתנול, כך DMSO חייב להיות בשימוש. כדי לנטרל את היציבות הנמוכה שלה, התערובת DHA חייב להיות מוכן טרי באותו יום כמו האפוקסי. סה כ אחוז DMSO בתערובת התגובה יש לשמור מתחת 1% כדי למנוע הפסקת האנזים. בנוסף, מכיוון שלnadph יש חיי מדף קצרים, יש לבדוק את הריכוז בעזרת הספקטרוסקופיה לפני בנוסף לתגובה. זה מבטיח כי 1 שווה ערך של NADPH מתווסף תמיד לתערובת התגובה.
הנחיות לתגובה באפוקסי
זרימת אוויר מן הבלון לתערובת התגובה חייבת להישמר על מנת לשמור על התגובה החמצון כמו חמצן הוא הכרחי עבור אפוקסי. התערובת חייבת גם להיות מעורבב במהירות, מאז PUFAs הם לא מסיסים מאוד במים (מסיסות של DHA הוא ≤ 125 μM במאגר התגובה). התגובה מאוסרת בחומצה אוקסלית לחלבון (כפי שהוא כולטים מתכת ומסירה קופנים) ו-חומצה מחזיקה DHA הצורה הנייטרלית שלה, אשר הכרחי להפקת האתר דיאתיל. הקונצ'ינג של תערובת התגובה חייב להיעשות באיטיות כדי למנוע הידרוליזה חומצה מזרז של EDPs.
הוצאת EDP והנחיות לטיהור
אתר נבחר במיוחד כממס החילוץ ממספר סיבות. דילורומתאן יכול לזרז את החלבון מהפתרון, אשר מסבך את החילוץ. אטואק תמציות גליצרול (נוסף עם פתרון מלאי האנזים), שקשה להסיר ומפריעה לכרומטוגרפיה הבזק.
EDP regiאוינים במצב החומצה החופשית שלהם הם לא בלתי מבודדים בקלות, ולכן הרישום מעורבב לפסגה אחת הראשונה כרומטוגרפיה העמודה פלאש. ברגע שהם מומרים לאסטרים מתיל, הרישום הם ספרבילי בקלות. בנוסף, אסטרים הם בדרך כלל יציבים יותר מן החומצות המתאימות לאחסון לטווח ארוך אם טופס חומצה אינו נדרש באופן מיידי.
משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
השיטה שלנו מספקת שיטה פשוטה ואפקטיבית להשגת EDPs enantiopure, אשר יש יתרונות רבים על שיטות קיימות וחלופיות. ראשית, אפוקסי כימי של DHA ו PUFAs אחרים ונגזרות שלהם הוא לא בררנית או enantioselective, ותערובות מורכבות מתקבלים לעתים קרובות. מספר רב של עמודים בעלי כרומטוגרפיה וכרומטותרפיה מיוצרים, כולל בדיקות שומן הייצור, הנחוצות לפיכך כדי לטהר את חומצות השומן האפוקסי מתערובות אלה, שהן הינן עתירות עבודה ויכולות להפיק רק כמויות קטנות מאוד של ה טבוליטים. סינתזה הכולל יכול גם להיות מועסק כדי לייצר חומצות שומן אפוקסי, אבל זה קפדני, זמן רב, דורש שלבים מרובים, ונותן תשואה כוללת נמוכה, בעוד האנזים BM3 קל לבטא ולטהר, ואת האפוקסי המלא בתוך תקופה קצרה של זמן. השיטה שלנו היא גם חסכונית: מקור מסחרי20 כיום מציע 16, 17-ו 19, 20-edp (כמו racemates שלהם) עבור 528 USD/0.5 mg. 1 g של nadph ניתן גם לרכוש עבור ~ 500-800 USD, והוא יכול לשמש כדי לייצר מעל 200 פעמים כמות של 19, 20- EDP (ו כ 50 פעמים את כמות 16, 17-EDP) הציע מסחרית עבור מחיר דומה-ו בצורות enantiopure, אשר כרגע לא זמין מסחרית.
מגבלות השיטה
מאחר שהאנזים מעדיף את הקשר הכפול האחרון של DHA, המוצר העיקרי הוא 19, 20-EDP (למרות 16, 17-EDP גם מופק). לכן, אחרים מסוג DHA regiאוינים שעשויים להיות מבוקשת (למשל, 13, 14-EDP, 10, 11-EDP) לא ניתן לייצר על ידי האפוקסי אנזימטיות BM3. כמו כן, כמו רק SR-enantiomers מיוצרים על ידי BM3, RS-enantiomers אינם נגישים, למרות שלנו שפורסם בעבר שיטת היפוך כימית14 ניתן להשתמש כדי לסנתז אותם. בנוסף, בגלל מסיסות נמוכה של ליפופילית PUFAs במאגר התגובה, כמויות גדולות מאוד של מאגר יהיה צורך בייצור בקנה מידה גדול (ca. 500-1000 מ ג) של EDPs, אשר עלול לגרום לחילוץ זמן רב או מונע.
יישומים אחרים של השיטה
לרוב, פרוטוקול האפוקסי האנזימטי הזה חל גם על EPA ו-AA (מבנים רלוונטיים מוצגים באיור 5). הריכוזים, המאגר, וזמן התגובה הנדרשים לאפוקסי של כל שלושת חומצות השומן זהה. עבור EPA, מסוג פראי BM3 האנזים משמש גם, ואת שבר EEQ שהתקבל EPA (56% התשואה של monoepoxide), לאחר esterification היא ~ 14:1 17, 18-EEQ: 14, 15-EEQ. בדומה לתצפיות שנעשו עבור EDPs, 17, 18-EEQ המתקבל הוא enantiopure מאוד (> 99% 17 (S), 18 (R)-eeq, ראה איור 6) כפי שמוערך על ידי כיול (ראה איור 3 מקרא וטבלת חומרים). הזהות של אנאנטימרים דווחה בעבר17. עבור AA, עם זאת, המוטציה F87V BM3 חייב לשמש במקום מסוג פראי BM3 הוא הידרוקסילז עבור AA21. ביטוי וטיהור של מוטציה זו משתמש גם בפרוטוקול הנ ל, והאפוקסי מבוצע בצורה מקבילה. על ידי שיטה זו, 14, 15-EET מתקבל כמו הרישום הבלעדי. כמו 14, 15-EET חומצה חופשית הוא בלתי נפרד מאשר הגיב AA בעקבות האפוקסי, האסטפיקציה הוא הכרחי; 14, 15-EET מתיל אסתר מתקבל ב 52% תשואה מ AA. שיראאל (ראה איור 3 מקרא וטבלת חומרים) של החומצה מצביע על הרבה יותר (> 99%) 14 (S), 15 (R)-EET (כפי שדווח קודם לכן)15. המשמרות הכימיות של אלה EPA ו-AA מטבוליטים הם כדלקמן: 17 (S), 18 (R)-EEQ מתיל אסתר:1H-nmr (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3.67 (s, 3 ח), 2.96 (Td, J = 6.4, 4.2 Hz, 1 H), 2.90 (td, J = 6.3, 4.2 Hz, 1 h), 2.85-2.79 (ז, 6 ח), 2.44-2.38 (m, 1 h), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2 ח), 2.26-2.20 (ז, 1 ח) , 2.11 (q, J = 6.7 Hz, 2 h), 1.71 (חמישייה, J = 7.4 hz, 2 H), 1.66-1.50 (m, 2 h), 1.05 (t, J = 7.5 Hz, 3 ח); 14 (S), 15 (R)-EET מתיל אסתר: מיכל בן H-NMR (500 מגה-הרץ; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3.67 (s, 3 ה), 2.95-2.92 (m, 2 h), 2.81 (Dt, J = 17.8, 5.8 Hz, 4 H), 2.40 (dt, j = 14.1, 6.8 hz, 1 h), 2.32 (t, j = 7.5 hz, 2 h), 2.23 (dt, j = 14.1, 6.8 hz, 1 H) , 2.11 (q, j = 6.8 Hz, 2 h), 1.71 (חמישייה, J = 7.4 hz, 2 H), 1.56-1.41 (m, 4 ח), 1.38-1.30 (m, 4 h), 0.90 (t, J = 7.1 Hz, 3 ח).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי R00 ES024806 (המכון הלאומי לבריאות), DMS-1761320 (הקרן הלאומית למדע) וכספי הפעלה מאוניברסיטת מישיגן סטייט. המחברים מבקשים להודות לד ר ג'ון יאנג (אוניברסיטת קליפורניה בדיוויס) ולליתה קראלה (אונ' מישיגן) לסיוע במיטוב התגובה האנזימטית, וד ר טוני שילמילר (MSU טבולומיקס מאסה ספקטרומטר מתקן ומיתקן) לקבלת סיוע ברכישת נתונים HRMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
