Summary
Presentamos un método útil para la síntesis enzimática a gran escala y la purificación de enantiómeros y regioiómeros específicos de epóxidos de ácido araquidónico (AA), ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano (AH), ácido docosahexaenoico (DHA), y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano (AA), ácido docosahexaenoico (DHA), y ácido eicosapentaenoico (EPA) con el uso de un citocromo bacteriano Enzima P450 (BM3).
Abstract
Los metabolitos epepoxiizados de varios ácidos grasos poliinsaturados (PUF), llamados ácidos grasos epoxi, tienen una amplia gama de funciones en la fisiología humana. Estos metabolitos son producidos endógenamente por la clase de enzimas del citocromo P450. Debido a sus diversos y potentes efectos biológicos, hay un interés considerable en el estudio de estos metabolitos. Determinar las funciones únicas de estos metabolitos en el cuerpo es una tarea difícil, ya que los ácidos grasos epoxi primero deben obtenerse en cantidades significativas y con alta pureza. La obtención de compuestos de fuentes naturales es a menudo intensiva en mano de obra, y las hidrolasas de epóxido soluble (sEH) hidrolizan rápidamente los metabolitos. Por otro lado, la obtención de estos metabolitos a través de reacciones químicas es muy ineficiente, debido a la dificultad de obtener regioisomers y enantiómeros puros, bajos rendimientos y purificación extensa (y costosa). Aquí, presentamos una síntesis enzimática eficiente de 19(S),20(R)- y 16(S),17(R)-ácidos epoxidocosapentaenoicos (EDP) de DHA a través de epoxidación con BM3, una enzima bacteriana CYP450 aislada originalmente de Bacillus megaterium (que se expresa fácilmente en Escherichia coli). La caracterización y determinación de la pureza se realiza con espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas (MS). Este procedimiento ilustra los beneficios de la síntesis enzimática de metabolitos epoxi PUFA, y es aplicable a la epoxidación de otros ácidos grasos, incluyendo ácido araquidónico (AA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) para producir el epoxieicosatrienoico análogo ácidos (EAT) y ácidos epoxiicosatetraenoicos (EEQ), respectivamente.
Introduction
Como el interés en el papel que juegan los ácidos grasos poliinsaturados (particularmente los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y omega-6) en la biología humana ha crecido en los últimos años, los investigadores han tomado nota de la amplia gama de beneficios atractivos que sus metabolitos Exhiben. En particular, los metabolitos de ácidos grasos epoxi producidos por la clase de enzimas del citocromo P450 han sido un gran punto de enfoque. Por ejemplo, muchos epóxidos de PUFA, incluidos los ácidos epoxiicosatrienoicos (EET), los ácidos epoxidocosapentaenoico (EDP) y los ácidos epoxiicosatetraenoicos (EEQ), desempeñan un papel crítico en la regulación de la presión arterial y la inflamación1,2 , 3 , 4 , 5. Curiosamente, los enantiómeros específicos y regioisomers de aA y EPóxidos EPA son conocidos por tener efectos variables sobre vasoconstricción6,7. Si bien se han documentado los efectos fisiológicos de los enantiómeros y regioisomemeros de los EET y los EEQ, poco se sabe sobre el efecto de los ácidos epoxicosapentaenoicos análogos (EDP) formados a partir de DHA. El uso generalizado del aceite de pescado8, que es rico tanto en EPA como en DHA, también ha despertado interés en los EDP9. Los beneficios de estos suplementos se cree que son en parte debido a los metabolitos DHA aguas abajo (16,17-EDP y 19,20-EDP siendo los más abundantes) porque los niveles in vivo de EDPs se coordinan muy bien con la cantidad de DHA en la dieta10, 11.
El estudio de los mecanismos y objetivos de estos ácidos grasos epoxi por metabolómica, biología química y otros métodos ha resultado desafiante, en parte porque existen como mezclas de isómeros regio y estéreo, y un método para obtener cantidades puras de la enantiómeros y regioisomers. Los medios convencionales para sintetizar químicamente estos compuestos han demostrado ser ineficaces. El uso de peroxyacids como el ácido meta-cloroperoxybenzoic para la epoxidación tiene muchos inconvenientes, en particular la falta de selectividad de la emiratoje, que requiere una purificación costosa y meticulosa de los regioiómeros y enantiómeros individuales. La síntesis total de los metabolitos DHA y EPA es posible, pero también sufre de inconvenientes que lo hacen poco práctico para la síntesis a gran escala como altos costos y bajos rendimientos12,13. La producción global eficiente se puede lograr con síntesis enzimática, ya que las reacciones enzimáticas son regio- y estereoselectiva14. Los estudios demuestran que la epoxidación enzimática de AA y EPA (con BM3) es a la vez regioselectiva y enantioselectiva15,16,17,18, pero este procedimiento no ha sido probado con DHA, o en un gran Escala. El objetivo general de nuestro método era escalar y optimizar esta epoxidación quimioenzimática para producir rápidamente cantidades significativas de ácidos grasos epoxi puros como sus enantiómeros individuales. Utilizando el método presentado aquí, los investigadores tienen acceso a una estrategia simple y rentable para la síntesis de EDPs y otros metabolitos epoxi PUFA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ADVERTENCIA: Consulte todas las fichas de datos de seguridad de materiales (MSDS) pertinentes antes de utilizar los productos químicos enumerados.
1. Expresión de bm3 de tipo salvaje
- Inoculación pBS-BM3 transfectó DH5 e. coli (una generosa donación del Dr. F. Ann Walker) en 5 ml de caldo lb estéril con 0,5 mg de ampicilina añadida en un tubo de cultivo de 20 ml.
- Incubar el cultivo celular en una coctelera a 37oC durante 24 h a 200 rpm. Añadir el cultivo de arranque durante la noche (5 ml) y 100 mg de ampicilina a 1 L de caldo estéril LB en un matraz Fernbach o Erlenmeyer. Agitar a 37oC durante 6 h a 200 rpm, luego a 30oC durante 18 h a 200 rpm.
- Recoger y centrifugar el cultivo celular a 4 oC durante 10 min a 1.000 x g. Deseche el sobrenadante y almacene el pellet celular a -78 oC hasta la purificación de enzimas.
NOTA: El sobrenadante puede ser esterilizado químicamente por el tratamiento con lejía o esterilizado usando un autoclave y luego vertido por el drenaje.
2. Purificación de BM3.
-
Lisis celular
- Descongelar el pellet celular sobre hielo y resuspender en 40 ml de tampón de solubilización helada (4oC) (10 mM Tris, 0,01 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
ADVERTENCIA: PMSF es tóxico por contacto. - Mientras que en el hielo, sonicar las células durante 1 min con un homogeneizador ultrasónico (ajuste de potencia de salida 10, deber 100%), seguido de una rotura de 1 min en el hielo con el fin de atisiar las células. Repita este procedimiento 6 veces. Centrifugar el lisado celular a 4 oC durante 30 minutos a 11.000 x g a los desechos de células de pellets.
- Descongelar el pellet celular sobre hielo y resuspender en 40 ml de tampón de solubilización helada (4oC) (10 mM Tris, 0,01 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
-
Cromatografía de afinidad
- Preparar una columna de cromatografía de intercambio de aniones fuerte (ver Tabla de Materiales;diámetro: 2,8 cm x 6 cm, volumen de columna: 37 mL) lavando con 5 volúmenes de columna (CV) del tampón A (10 mM Tris, pH 7,8) a 4 oC.
- Agregue los lysates de celda a la columna equilibrada y lave la columna con 3 CV de búfer frío A. Elute el BM3 lavando la columna con tampón frío B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Recoger la fracción eluyente de color marrón rojizo. Si la proteína no se utiliza inmediatamente, mezcle con un volumen igual de glicerol y congelación de flash con nitrógeno líquido. Almacene la solución congelada a -78 oC.
3. Epoxidación de DHA por BM3
- Preparar la reacción añadiendo 0.308 g (0.940 mmol) de DHA en 18,8 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 2 Lde tampón de reacción de agitación (0,12 M de fosfato de potasio, 5 mM MgCl 2, pH 7.4) junto con 20 nM de la enzima desmoldeada BM3. La concentración enzimática puede determinarse por el método de ensayo espectral de monóxido/ditonita de carbono19.
- Mientras la solución se agita, comience la reacción añadiendo 1 equivalente de NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido, sal de tetrasodio, 0.808 g, 0.940 mmol) disuelto en tampón de reacción. Revuelva la reacción durante 30 minutos mientras burbujean el aire a través de la mezcla de reacción con un globo lleno de aire unido a una jeringa y una aguja.
- Utilizando un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales),compruebe la absorbancia de la mezcla de reacción a 340 nm para determinar si NADPH está agotada. Si no queda ninguna absorbancia que indique el consumo de NADPH, la reacción se ha completado.
NOTA: Por lo general, la reacción se completa después de 30 min. - Quena la mezcla de reacción añadiendo lentamente 1 M de ácido oxálico, en sentido de gota, hasta que el pH de la solución alcance 4.
4. Extracción de EDPs
- Extraiga la solución tampón apamié con 2 L de éter dietílico (anhidro, libre de peróxido) 3 veces. Recoger la capa de éter (6 L) y secar con sulfato de magnesio anhidro (MgSO4).
- Filtre el MgSO4 de la solución y concentre la capa de éter seco en un evaporador rotativo para producir el residuo de EDP crudo.
- Purificar el residuo mediante cromatografía de columna flash (un cartucho de sílice de 40 g es suficiente). Comience con 10% de acetato de etilo (EtOAc) en hexanos y rampa de hasta 60% EtOAc en hexanos de más de 22 min.
NOTA: Se obtienen y recogen tres picos principales, eluyéndose en el orden de 1. DHA no reaccionado; 2. mezcla de isómeros EDP; y 3. diepoxido (productos normales de sobreoxidación (ver Figura 1)). - Combine las fracciones y concéntrelas en el evaporador rotatorio. A partir de este ejemplo, 0,074 g, (24%) de DHA no reaccionado, 0,151 g (47%) isómeros EDP, y 0,076 g, (22%) de di-epoxide.
5. Esterificación de los EDP, separación de 16(S),17(R)- y 19(S),20(R)-EDP, y saponificación de ésteres
ADVERTENCIA: El trimetilsilyldiazometano (TMS-diazometano) es muy tóxico tanto por contacto como por inhalación. Utilícelo únicamente en una campana de humos con el equipo de protección personal adecuado.
- Diluir los epóxidos (0,151 g, 0,435 mmol) en un matraz de fondo redondo o vial pequeño con 2 ml de metanol anhidro (MeOH) y 3 ml de tolueno anhidro, añadir una barra de agitación, y añadir TMS-diazometano (1,2 equivalentes molares, o 0,26 ml de una solución de 2 M en hexánicos) bajo argón.
- Espere 10 min y agregue TMS-diazometano adicional (0.050 mL) hasta que permanezca un color amarillo pálido.
- Después de 30 min, concentre cuidadosamente la mezcla utilizando el evaporador rotativo y purifique el residuo mediante cromatografía de columna flash. Eluir con 4% EtOAc en hexanos (usando una columna o cartucho de gel de sílice de 40 g) durante 22 min. En este ejemplo, 19,20-EDP éster metílico (0,116 g, 74%) y 16,17-EDP éster metílico (0,029 g, 19%), se obtuvieron como aceites claros (rendimiento total, 93%).
- Recoger las fracciones que contienen los regioisomemeros de éster metílico EDP purificado. 19(S),20(R)-EDP metil éster elutes primero, seguido por 16(S),17(R)-EDP éster metílico.
- Si quedan fracciones mixtas (que contienen ambos isómeros; se pueden evaluar mediante cromatografía de capa delgada (TLC) en 8:1 hexano/EtOAc y se tiñen con permanganato de potasio (KMnO4)), recromatógrafo con el mismo sistema de disolvente que antes.
- Concentrar las fracciones que contienen los regioisomers individuales.
NOTA: En este punto, la RMN puede evaluar la identidad y la pureza (utilizando CDCl3 como disolvente; véase la leyenda de la Figura2). - Para convertir regioisomers de éster metílico EDP individuales a sus formas ácidas, diluir el éster EDP en THF:agua (aproximadamente 0,7 mL/0,1 mmol de éster). Añadir 2 M liOH acuoso (3 equivalentes molares) y remover durante la noche.
NOTA: La integridad de la reacción puede ser evaluada por TLC, usando 3:1 hexanos/EtOAc, manchando con KMnO4; el producto tiene un factor de retención de 0,3. - Atemple la reacción lentamente con ácido fórmico, hasta que el pH de la mezcla alcance 3-4. Añadir agua y acetato de etilo (1-2 mL/0.100 mmol de éster) y separar las capas. Extraiga la capa de agua con EtOAc (3 x 5 ml), lave con solución de salmuera saturada (NaCl) y seque la capa EtOAc sobre sulfato sódico anhidro (Na2SO4).
- Concentrar la solución de acetato de etilo con un evaporador rotativo, añadir hexanos (10 ml) y concentrar de nuevo. Repita dos veces para eliminar azeotropicalmente el ácido fórmico residual. Purificar el residuo mediante cromatografía de columna flash, eluyente con 10-30% EtOAc durante 15 min.
- Concentrar las fracciones deseadas y secar en vacuo para permitir el ácido purificado.
NOTA: En esta etapa, se puede evaluar la pureza enantiomérica (por HPLC quiral, vea las leyendas de la Figura 3 - Figura 4 para la columna y las condiciones). La pureza química puede ser evaluada por C18 (achiral) HPLC (ver Tabla de Materiales y referencia 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El cromatograma de la columna flash (realizado utilizando un sistema automatizado de purificación de flash como se describe a continuación) obtenido tras la purificación de la mezcla bruta a partir de la epoxidación enzimática se muestra en la Figura1. Tras la esterificación y separación de los regioisomers, se obtuvieron ésteres metílicos puros de 16( S),17(R)-EDP y 19(S),20(R)-EDP. Típicamente, están presentes en una proporción aproximada de 1:4 a 1:5, con el producto principal siendo 19(S),20(R)-EDP. No se obtienen otros regioisomas EDP (por ejemplo, 13,14- o 10,11-EDP). Los 1espectros de MRH de 16(S),17(R)-EDP (Figura 2A) y 19(S),20(R)-EDP (Figura 2B) ésteres metílicos junto con sus estructuras se muestran a continuación, lo que indica la alta pureza de estos compuestos; C18 (achiral) HPLC de las formas ácidas también indicó purezas >98%. Su identidad se confirmó aún más mediante espectroscopia de masas de alta resolución (tanto de las formas de ácido como de éster), que produjo relaciones masa/carga y patrones de fragmentación consistentes con los EDP identificados. La pureza enantiomérica se determinó utilizando HPLC quiral, en comparación con los estándares auténticos de enantiopure y mixtos de los EDPs (en su forma ácida, Figura 3A y Figura 4A). Como se puede observar en la Figura 3B y la Figura 4B, ambos EDP obtenidos por epoxidación enzimática son altamente enantiopure después de la saponificación (>99% un enantiómero). Las identidades de estos enantiómeros se habían informado previamente de 16(S),17(R)- y 19(S), 20(R)-EDP18.
Figura 1 . Cromatografía a partir de la purificación de la mezcla bruta obtenida a partir de la eoxidación enzimática de DHA (junto con las estructuras pertinentes). El pico medio (monoepoxida) contiene los EDP deseados. La purificación se realizó utilizando un sistema automatizado de purificación de flash (ver Tabla de Materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Ejemplo 1espectros H-NMR deéster metílico puro 16(S),17(R)-EDP (2A) y 19(S),20(R)-EDP metil éster (2B). Los espectros se registraron a 500 MHz en CDCl3 (el disolvente es visible a 7,26 ppm y el agua residual a 1,6 ppm). Los cambios químicos son los siguientes: 16(S),17(R)-EDP ester metil: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,57-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,99-2,95 (m, 2 H), 2,87-2,83 (m, 6 H), 2,47-2,37 (m, 6 H), 2,29-2,21 (m, 2 H), 2,11-2,05 (m, 2 H), 0,99 (t, J a 7,5 Hz); 19(S),20(R)-EDP éster metílico: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,54-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,97 (td, J a 6,4, 4,2 Hz, 1 H), 2,91 (td, J a 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2,85-2,82 (m, 8 H), 2,44-2,36 (m, 5 H), 2,27-2,21 (m, 1 H), 1,65-1,51 (m, 3 H), 1,06 (t, J, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, 7,5, , 3 H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. HPLC quiral que indica enantiopurity de 16,17-EDP (forma ácida) producida por BM3. La Figura 3A muestra un cromatograma HPLC quiral de "racemic" 16,17-EDP (una mezcla artificial de estándares auténticos de ambos enantiómeros14),mientras que la Figura 3B muestra un cromatograma HPLC quiral de enantiopure 16(S),17(R )-EDP producido por eferción de DHA con BM3, evaluado como >99% S,R isómero. La columna se basa en la celulosa (ver Tabla de Materiales, 250 x 4,6 mm, 5 m, 1.000 o) eluyéndose con bicarbonato de amonio isocrático 45% 50 mM (NH4HCO3) en metanol (30 min), con una concentración de muestra de 0,5 mM y caudal de 1 mL/min Por favor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. HPLC quiral que indica enantiopurity de 19,20-EDP (forma ácida) producida por BM3. Figura 4A muestra un cromatograma HPLC quiral de "racemic" 19,20-EDP (una mezcla artificial de estándares auténticos de ambos enantiómeros14), mientras que la Figura 4B muestra un cromatograma HPLC quiral de enantiopure 19(S),20(R)-EDP producido por epoxidación de DHA con BM3, evaluado como >99% S, IsómeroR (método descrito en la Figura3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Esquema general de reacción de epoxidación enzimática y estructuras relevantes de AA, EPA, EETs y EEQproducidos por este método Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . HPLC quiral que indica la enantiopurity de 17,18-EEQ (forma ácida) producida por BM3. La Figura 6A muestra un cromatograma HPLC quiral de "racemic" 17,18-EEQ (una mezcla artificial de estándares auténticos de ambos enantiómeros14), mientras que la Figura 6B muestra un cromatograma HPLC quiral de enantiopure 17(S),18(R )-EEQ producido por epoxidación de EPA con BM3, evaluado como >99% S,R isómero (método descrito en la Figura3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presentamos aquí un método operativo simple y rentable para preparar los dos metabolitos epoxi más abundantes de DHA - 19,20 y 16,17-EDP. Estos ácidos grasos epoxi se pueden preparar en forma altamente enantiopure (como sus isómeros S,R)utilizando enzima BM3 de tipo salvaje. A continuación se describen varios puntos críticos que se pueden utilizar para la solución de problemas y la extensión de nuestro método para preparar metabolitos epoxi enantiopuros de AA y EPA.
Directrices de almacenamiento de BM3
Almacenar la enzima BM3 purificada es posible mezclando la solución proteica con el mismo volumen de glicerol y congelación flash con nitrógeno líquido antes de su almacenamiento en un congelador de -78 oC. Una vez que la enzima está congelada, se puede almacenar hasta por un año. La enzima sólo se puede descongelar una vez, debe descongelarse sobre hielo, y sólo se puede dejar en hielo durante 4 h. Congelación de nuevo, y permitiendo que la enzima se descongele sin un baño de hielo desactivará la enzima.
Directrices de almacenamiento de productos químicos
Muchos de los compuestos necesarios para el procedimiento son sensibles al aire. Estos incluyen DHA y otros PUFA, EDPs y otros metabolitos epoxi, y NADPH. Para prevenir la peroxidación (y otros procesos oxidativos) de estos compuestos, enjuague siempre los recipientes en los que se almacenan con argón o nitrógeno y almacene a -78 oC.
Otra nota importante es la solución en la que se almacena el DHA. Aunque DHA no es muy estable en DMSO, BM3 es incompatible con etanol y metanol, por lo que DMSO debe utilizarse. Para contrarrestar su baja estabilidad, la mezcla de DHA debe prepararse recién el mismo día que la epoxidación. El porcentaje total de DMSO en la mezcla de reacción debe mantenerse por debajo del 1% para evitar desactivar la enzima. Además, debido a que NADPH tiene una vida útil corta, la concentración debe comprobarse con el espectrofotómetro antes de la adición a la reacción. Esto garantiza que siempre se añada 1 equivalente de la NADPH a la mezcla de reacción.
Pautas de reacción de epoxidación
El flujo de aire del globo a la mezcla de reacción debe mantenerse para mantener la reacción oxigenada, ya que el oxígeno es necesario para la epoxidación. La mezcla también debe agitarse rápidamente, ya que los PUF a no son muy solubles en agua (la solubilidad de DHA es de 125 m en el búfer de reacción). La reacción se acalmte con ácido oxálico a la proteína de desnaturalación (ya que quela el metal y elimina los cofactores) y el ácido mantiene DHA su forma neutra, que es necesaria para la extracción de éter dietílico. El enfriamiento de la mezcla de reacción debe realizarse lentamente para evitar la hidrólisis catalizada por ácido de los EDP.
Pautas de extracción y purificación de EDP
El éter fue elegido específicamente como disolvente de extracción por múltiples razones. El diclorometano puede precipitar la proteína fuera de la solución, lo que complica la extracción. EtOAc extrae glicerol (añadido con la solución enzimática), que es difícil de eliminar e interfiere con la cromatografía flash.
Los regioiómeros EDP en su estado de ácido libre no son fácilmente separables, razón por la cual los regioisomers se mezclan en un solo pico en la primera cromatografía de columna flash. Una vez que se convierten en los ésteres metilo, los regioisomers son fácilmente separables. Además, los ésteres son generalmente más estables que los ácidos correspondientes para el almacenamiento a largo plazo si la forma de ácido no es necesaria inmediatamente.
Importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos
Nuestro método proporciona un método simple y eficaz para obtener EDPs enantiopure, que tiene muchas ventajas sobre los métodos existentes y alternativos. En primer lugar, la epoxidación química de DHA y otros PUFAs y sus derivados no es regioselectiva o enantioselectiva, y a menudo se obtienen mezclas complicadas. Múltiples columnas de cromatografía flash y HPLC preparativo, incluyendo HPLC preparativo quiral, son por lo tanto necesarios para purificar los ácidos grasos epoxi enantiopure de estas mezclas, que son intensivos en mano de obra y pueden producir sólo cantidades muy pequeñas de los deseados Metabolitos. La síntesis total también se puede emplear para producir ácidos grasos epoxi, pero es rigurosa, requiere mucho tiempo, requiere múltiples pasos, y da un bajo rendimiento general, mientras que la enzima BM3 es fácil de expresar y purificar, y la epoxidación se completa dentro de un corto período de hora. Nuestro método también es rentable: una fuente comercial20 ofrece actualmente 16,17- y 19,20-EDP (como sus compañeros de carrera) por 528 USD /0.5 mg. 1 g de NADPH también se puede comprar por 500-800 USD, y se puede utilizar para producir más de doscientas veces la cantidad de 19,20- EDP (y aproximadamente cincuenta veces la cantidad de 16,17-EDP) ofrecido comercialmente por un precio similar - y en formas enantiopure, que actualmente no están disponibles comercialmente.
Limitaciones del método
Como esta enzima epoxidiza preferentemente el último doble bono de DHA, el producto principal es 19,20-EDP (aunque también se produce 16,17-EDP). Por lo tanto, otros regioisomers DHA que podrían ser deseados (por ejemplo, 13,14-EDP, 10,11-EDP) no pueden ser producidos por la epoxidación enzimática con BM3 de tipo salvaje. Además, como sólo los SR-enantiómeros son producidos por BM3, los RS-enantiómeros son inaccesibles, aunque nuestro método de inversión química publicado anteriormente14 puede ser utilizado para sintetizarlos. Además, debido a la baja solubilidad de los PUFAs lipofílicos en el búfer de reacción, sería necesarian grandes cantidades de tampón para la producción a gran escala (ca. 500-1,000 mg) de EDPs, lo que potencialmente podría hacer que la extracción consume mucho tiempo o sea prohibitiva.
Otras aplicaciones del método
Agradablemente, este protocolo de epoxidación enzimática también es aplicable a la EPA y AA (las estructuras relevantes se muestran en la Figura5). Las concentraciones, el tampón y el tiempo de reacción necesarios para la epoxidación de los tres ácidos grasos es el mismo. Para la EPA, también se utiliza la enzima BM3 de tipo salvaje, y la fracción EEQ obtenida de epa (56% de rendimiento de monoepoxida), después de la esterificación es de 14:1 17,18-EEQ:14,15-EEQ. Al igual que las observaciones realizadas para los EDP, el 17,18-EEQ obtenido es altamente enantiopure (>99% 17(S),18(R)-EEQ, véase la Figura 6) según lo evaluado por hPLC quiral (véase la figura 3 y la tabla de materiales). La identidad de los enantiómeros fue reportada previamente17. Para AA, sin embargo, el mutante F87V BM3 debe utilizarse en su lugar como tipo salvaje BM3 es una hidroxilasa para AA21. La expresión y purificación de este mutante también utiliza el protocolo anterior, y la epoxidación se realiza de manera análoga. Por este método, 14,15-EET se obtiene como único regioisomer. Como 14,15-EET ácido libre es inseparable de AA no reaccionado después de la epoxidación, esterificación es necesaria; 14,15-EET éster metilo se obtiene en 52% de rendimiento de AA. Chiral HPLC (ver Figura 3 y Tabla de Materiales) del ácido indica altamente enantiopuro (>99%) 14(S),15(R)-EET (como se ha informado anteriormente)15. Los cambios químicos para estos metabolitos EPA y AA son los siguientes: 17(S),18(R)-EEQ metilester:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,53-5,34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 H), 2,96 (td, J a 6,4, 4,2 Hz, 1 H), 2,90 (td, J a 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2,85-2,79 (m, 6 H), 2,44-2,38 (m, 1 H), 2,32 (t, J a 7,5 Hz, 2 H), 2,26-2,20 (m, 1 H) , 2,11 (q, J a 6,7 Hz, 2 H), 1,71 (quinteto, J a 7,4 Hz, 2 H), 1,66-1,50 (m, 2 H), 1,05 (t, J a 7,5 Hz, 3 H); 14(S),15(R)-EET éster metílico: 1 H-NMR (500 MHz; CDCl3): 5,53-5,33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 H), 2,95-2,92 (m, 2 H), 2,81 (dt, J a 17,8, 5,8 Hz, 4 H), 2,40 (dt, J a 14,1, 6,8 Hz, 1 H), 2,32 (t, J a 7,5 Hz, 2 H), 2,23 (dt, J a 14,1, 6,8 Hz, 1,3 8, H) , 2,11 (q, J a 6,8 Hz, 2 H), 1,71 (quinteto, J a 7,4 Hz, 2 H), 1,56-1,41 (m, 4 H), 1,38-1,30 (m, 4 H), 0,90 (t, J a 7,1 Hz, 3 H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo está financiado por R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) y fondos de startups de la Universidad Estatal de Michigan. Los autores desean agradecer al Dr. Jun Yang (Universidad de California en Davis) y la Lalitha Karchalla (Universidad Estatal de Michigan) por su ayuda con la optimización de la reacción enzimática, y al Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) asistencia con la adquisición de datos HRMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
