Summary
Wij presenteren een methode nuttig voor grootschalige enzymatische synthese en zuivering van specifieke enantiomeren en regioisomers van epoxiden van arachidonzuur zuur (AA), docosahexaeenzuur zuur (DHA), en Eicosapentaeenzuur zuur (EPA) met het gebruik van een bacteriële cytochroom P450 enzym (BM3).
Abstract
De epoxidized metabolieten van verschillende meervoudig onverzadigde vetzuren (Pufa's), genoemd epoxy vetzuren, hebben een breed scala van rollen in de menselijke fysiologie. Deze metabolieten worden endogene geproduceerd door de cytochroom P450 klasse van enzymen. Vanwege hun uiteenlopende en krachtige biologische effecten, is er veel belang bij het bestuderen van deze metabolieten. Het bepalen van de unieke rollen van deze metabolieten in het lichaam is een moeilijke taak, aangezien de epoxy vetzuren eerst in significante hoeveelheden en met hoge zuiverheid moeten worden verkregen. Het verkrijgen van verbindingen uit natuurlijke bronnen is vaak arbeidsintensief, en oplosbare epoxide hydrolasen (sEH) snel hydroliseer de metabolieten. Aan de andere kant, het verkrijgen van deze metabolieten via chemische reacties is zeer inefficiënt, als gevolg van de moeilijkheid van het verkrijgen van pure regioisomers en enantiomeren, lage opbrengsten, en uitgebreide (en dure) zuivering. Hier presenteren we een efficiënte enzymatische synthese van 19 (s), 20 (r)-en 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic zuren (toezichthouder) van DHA via epoxidatie met BM3, een bacteriële CYP450 enzym geïsoleerd oorspronkelijk uit Bacillus megaterium (dat is gemakkelijk uitgedrukt in Escherichia coli). Karakterisering en bepaling van de zuiverheid wordt uitgevoerd met nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR), high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), en massaspectrometrie (MS). Deze procedure illustreert de voordelen van enzymatische synthese van PUFA epoxy metabolieten, en is van toepassing op de epoxidatie van andere vetzuren, met inbegrip van arachidonzuur zuur (AA) en Eicosapentaeenzuur acid (EPA) voor de productie van de analoge epoxyeicosatrienoic zuren (Eet's) en epoxyeicosatetraenoic zuren (EEQs), respectievelijk.
Introduction
Als belangstelling voor de rol die meervoudig onverzadigde vetzuren (met name omega-3 en omega-6 meervoudig onverzadigde vetzuren) spelen in de menselijke biologie is gegroeid in de afgelopen jaren, hebben onderzoekers kennis genomen van het brede scala van aantrekkelijke voordelen die hun metabolieten Vertonen. In het bijzonder, epoxy vetzuur metabolieten geproduceerd door de cytochroom P450 klasse van enzymen zijn een groot punt van focus. Bijvoorbeeld, spelen vele PUFA epoxiden, met inbegrip van epoxyeicosatrienoic zuren (eet's), epoxydocosapentaenoic zuren (toezichthouder) en epoxyeicosatetraenoic zuren (EEQs), een kritieke rol in regelgeving van bloeddruk en ontsteking1,2 , 3 , 4 , 5. interessant is dat de specifieke enantiomeren en regioisomers van AA en EPA epoxiden is bekend dat verschillende effecten hebben op vasoconstrictie6,7. Terwijl de fysiologische effecten van de enantiomeren en regioisomers van Eet's en EEQs zijn gedocumenteerd, is er weinig bekend over het effect van de analoge epoxydocosapentaenoic zuren (toezichthouder) gevormd uit DHA. Wijdverbreid gebruik van visolie8, die rijk is aan zowel EPA en DHA, heeft ook geroerd belangstelling voor de toezichthouder9. De voordelen van deze supplementen zijn vermoedelijk deels te wijten aan de downstream-DHA metabolieten (16, 17-EDP en 19, 20-EDP is de meest voorkomende), omdat in vivo niveaus van de toezichthouder coördineren zeer goed met de hoeveelheid DHA in de voeding10, 11.
Het bestuderen van de mechanismen en doelstellingen van deze epoxy vetzuren door metabolomics, chemische biologie, en andere methoden heeft bewezen uitdagend, deels omdat ze bestaan als mengsels van regio-en stereo-isomeren, en een methode voor het verkrijgen van zuivere hoeveelheden van de enantiomeren en regioisomers is vereist. Conventionele middelen voor het chemisch synthetiseren van deze verbindingen zijn ondoeltreffend gebleken. Het gebruik van peroxyzuren zoals META-Chloorperoxybenzoëzuur zuur voor epoxidatie heeft vele nadelen, in het bijzonder het gebrek aan epoxidatie selectiviteit, die dure en nauwgezette reiniging van individuele regioisomers en enantiomeren noodzakelijk maakt. Totale synthese van DHA en EPA metabolieten is mogelijk, maar ook lijdt aan nadelen die het onpraktisch maken voor grootschalige synthese, zoals hoge kosten en lage opbrengsten12,13. De efficiënte algemene productie kan met enzymatische synthese worden bereikt, aangezien de enzymatische reacties regio-en Stereoselectieve14zijn. Studies tonen aan dat enzymatische epoxidatie van AA en EPA (met BM3) is zowel regioselective en enantioselectieve15,16,17,18, maar deze procedure is niet getest met DHA, of op een grote Schaal. Het algemene doel van onze methode was om deze chemoenzymatic epoxidatie te schalen en te optimaliseren om snel significante hoeveelheden zuivere epoxy vetzuren als hun individuele enantiomeren te produceren. Met behulp van de hier gepresenteerde methode, onderzoekers hebben toegang tot een eenvoudige en kosteneffectieve strategie voor de synthese van de toezichthouder en andere PUFA epoxy metabolieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voordat u de vermelde chemicaliën gebruikt.
1. expressie van wild-type BM3
- Inoculeren pBS-BM3 transfected DH5α E. coli (een gulle donatie van Dr. F. Ann Walker) in 5 ml steriele lb bouillon met 0,5 mg AMPICILLIN toegevoegd in een 20 ml cultuur buis.
- Incubeer de cel cultuur in een shaker op 37 ˚ C voor 24 uur bij 200 rpm. Voeg de nachtelijke starter cultuur (5 mL) en 100 mg AMPICILLIN toe aan 1 L steriele LB Bouillon in een Fernbach of erlenmeyer kolf. Schud bij 37 ˚ C voor 6 u bij 200 rpm, dan bij 30 ˚ C voor 18 h bij 200 rpm.
- Verzamel en centrifugeer de cultuur van de cel bij 4 ˚ C voor 10 min bij 1.000 x g. Gooi de bovendrijvende en bewaar de cel pellet bij-78 ˚ C tot enzym zuivering.
Opmerking: de bovendrijvende kan worden ofwel chemisch gesteriliseerd door de behandeling met bleekmiddel of gesteriliseerd met behulp van een autoclaaf en vervolgens goot de afvoer.
2. zuivering van BM3.
-
Cel Lysis
- Ontdooi de cel pellet op ijs en opnieuw op te schorten in 40 mL ijskoude (4 ˚ C) oplosbaar maken buffer (10 mM Tris, 0,01 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
Let op: PMSF is giftig door contact. - Terwijl op ijs, bewerk de cellen voor 1 min met een ultrasone homogeniseer (uitgangsvermogen instelling 10, duty 100%), gevolgd door een 1 min pauze op ijs om de cellen te lyse. Herhaal deze procedure 6 keer. Centrifugeer de cel lysate bij 4 ˚ C voor 30 min bij 11.000 x g aan pellet cel puin.
- Ontdooi de cel pellet op ijs en opnieuw op te schorten in 40 mL ijskoude (4 ˚ C) oplosbaar maken buffer (10 mM Tris, 0,01 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
-
Affiniteitchromatografie
- Bereid een sterke anionen uitwisselings Chromatografiekolom (Zie lijst van materialen; diameter: 2,8 cm x 6 cm, kolom volume: 37 ml) door het wassen met 5 kolom VOLUMES (CV) van buffer a (10 mm tris, pH 7,8) bij 4 ˚ C.
- Voeg de cel lysaten aan geëquilibreerd kolom en was de kolom met 3 CV van koude buffer A. elueer de BM3 door het wassen van de kolom met koude buffer B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Verzamel de roodbruine eluens Fractie. Als het eiwit niet onmiddellijk wordt gebruikt, meng het met een gelijk volume van glycerol en flits bevriezen met vloeibare stikstof. Bewaar de bevroren oplossing bij-78 ˚ C.
3. epoxidatie van DHA door BM3
- Bereid de reactie voor door 0,308 g (0,940 mmol) van DHA in 18,8 mL dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan 2 L roer reactiebuffer (0,12 M kaliumfosfaat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) samen met 20 nm van het ontdooide BM3 enzym. De enzym concentratie kan door de koolstofmonoxide/dithionite spectrale analysemethode19worden bepaald.
- Terwijl de oplossing is roeren, beginnen met de reactie door toevoeging van 1 equivalent van NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat verlaagd, Tetra natriumzout, 0,808 g, 0,940 mmol) opgelost in reactiebuffer. Roer de reactie voor 30 min, terwijl borrelende lucht door de reactiemengsel met een lucht gevulde ballon aan een spuit en naald.
- Met behulp van een spectrofotometer (Zie tabel van materialen), controleer dan de absorptie van het reactiemengsel op 340 nm om te bepalen of NADPH is uitgeput. Als er geen resterende absorptie is die het verbruik van NADPH aangeeft, is de reactie compleet.
Nota: typisch, is de reactie volledig na 30 min. - Lest de reactiemengsel door langzaam toe te voegen 1 M oxaalzuur zuur, dropwise, totdat de pH van de oplossing bereikt 4.
4. extractie van de toezichthouder
- Extract de gebluste Bufferoplossing met 2 L van diethyl ether (watervrij, peroxide-vrij) 3 keer. Verzamel de ether laag (6 L) en droog met watervrij magnesiumsulfaat (MgSO4).
- Filtreer de MgSO4 van de oplossing en concentreer de gedroogde ether laag op een roterende verdamper om het ruwe informatica residu op te leveren.
- Zuiver het residu door Flash Kolomchromatografie (een 40 g silica cartridge is voldoende). Begin bij 10% ethylacetaat (EtOAc) in hexaan en helling tot 60% EtOAc in hexaan meer dan 22 min.
Nota: drie belangrijke pieken worden verkregen en worden verzameld, eluting in de orde van 1. ongereageerd DHA; 2. mengsel van EDP-isomeren; en 3. di-epoxide (normale over-oxidatieproducten (Zie Figuur 1)). - Combineer de fracties en concentreer ze op de roterende verdamper. Van dit voorbeeld, 0,074 g, (24%) van ongereageerde DHA, 0,151 g (47%) van de EDP-isomeren, en 0,076 g, (22%) van di-epoxide werden verkregen.
5. verestering van de toezichthouder, scheiding van 16 (en), 17 (r)-en 19 (s), 20 (r)-EDP, en verzeping van esters
Let op: Trimethylsilyldiazomethane (TMS-Diazomethaan) is zeer giftig door zowel contact en inhalatie. Gebruik alleen in een rook kap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Verdun de epoxiden (0,151 g, 0,435 mmol) in een kolf met ronde bodem of een kleine flacon met 2 mL watervrij methanol (MeOH) en 3 mL vrij tolueen; Voeg een roerstaaf toe, en voeg TMS-Diazomethaan (1,2 Molar equivalenten, of 0,26 mL van een oplossing van 2 M in hexaan) toe onder argon.
- Wacht 10 min en voeg extra TMS-Diazomethaan (0,050 mL) toe tot een bleke gele kleur blijft.
- Na 30 minuten, zorgvuldig concentreren het mengsel met behulp van de roterende verdamper en zuiveren het residu door Flash Kolomchromatografie. Elueer met 4% EtOAc in hexaan (met behulp van een 40 g silica gel kolom of patroon) voor 22 min. In dit voorbeeld, 19, 20-EDP methylester (0,116 g, 74%) en 16, 17-EDP methylester (0,029 g, 19%), werden verkregen als duidelijke oliën (totale opbrengst, 93%).
- Verzamel de fracties met de gezuiverde EDP methylester regioisomers. 19 (s), 20 (r)-EDP methylester elutes eerst, gevolgd door 16 (s), 17 (r)-EDP methylester.
- Indien er gemengde fracties blijven (met beide isomeren; kan worden beoordeeld door Thin-layer chromatografie (TLC) in 8:1 hexaan/EtOAc en gekleurd met kalium kaliumpermanganaat (KMnO4)), re-chromatografie ze met hetzelfde oplosmiddel systeem als voorheen.
- Concentreer de fracties met de individuele regioisomers.
Nota: op dit punt, kunnen de identiteit en de zuiverheid door NMR (gebruikend CDCl3 als oplosmiddel worden beoordeeld; Zie de legenda voor Figuur 2). - Om individuele EDP methylester regioisomers aan hun zure vormen om te zetten, Verdun de EDP Ester in THF: water (ongeveer 0,7 mL/0.1 mmol van Ester). Voeg 2 M waterige LiOH (3 molaren equivalenten) en roer 's nachts.
Opmerking: volledigheid van de reactie kan worden beoordeeld door TLC, met behulp van 3:1 hexaan/EtOAc, kleuring met KMnO4; het product heeft een retentie factor van ~ 0,3. - Doven de reactie langzaam met vorm zuur, totdat de pH van het mengsel bereikt 3-4. Voeg water en ethylacetaat (1-2 mL/0.100 mmol van Ester) en scheid de lagen. Haal de water laag met EtOAc (3 x 5 mL), was met verzadigde pekel (NaCl) oplossing, en droog de EtOAc laag over watervrij natriumsulfaat (na2so4).
- Concentreer de ethylacetaat oplossing gebruikend een roterende verdamper, voeg hexaan (10 mL) toe en concentreer me opnieuw. Herhaal dit tweemaal tot azeotropically verwijderen residuele vorm zuur. Zuiver het residu door de Kolomchromatografie van de flits, eluting met 10-30% EtOAc meer dan 15 min.
- Concentreer de gewenste fracties en droog in vacuüm om het gezuiverde zuur te veroorloven.
Opmerking: in dit stadium, enantiomeric zuiverheid kan worden beoordeeld (door chirale HPLC, zie de legendes voor Figuur 3 - Figuur 4 voor kolom en voorwaarden). Chemische zuiverheid kan worden beoordeeld door C18 (achiral) HPLC (Zie tabel van materialen en referentie 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De flitser kolom chromatogram (uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde flits zuivering systeem zoals hieronder beschreven) verkregen na zuivering van het ruwe mengsel van enzymatische epoxidatie is weergegeven in Figuur 1. Na verestering en scheiding van regioisomers, zuivere 16 (s), 17 (r)-EDP en 19 (s), 20 (r)-EDP methylesters werden verkregen. Typisch, zijn zij aanwezig in een benaderende 1:4 aan 1:5 verhouding, met het belangrijkste product dat 19 (S), 20 (R)-EDP is. Geen andere EDP-regioisomers (bijv. 13, 14-of 10, 11-EDP) worden verkregen. De 1H-NMR spectra van 16 (s), 17 (r)-EDP (Figuur 2a) en 19 (s), 20 (r)-EDP (Figuur 2b) methylesters samen met hun structuren worden hieronder weergegeven, met vermelding van de hoge zuiverheid van deze verbindingen C18 (achiral) HPLC van de zure vormen vermeldde ook zuiverheid > 98%. Hun identiteit werd verder bevestigd door hoge-resolutie massaspectroscopie (zowel van het zuur en Ester vormen), die massa/lasten verhoudingen en fragmentatie patronen in overeenstemming met de geïdentificeerde toezichthouder opleverde. Enantiomeric zuiverheid werd bepaald met behulp van chirale HPLC, in vergelijking met authentieke enantiopure en gemengde normen van de toezichthouder (in hun zure vorm, Figuur 3a en figuur 4a). Zoals kan worden waargenomen in Figuur 3b en figuur 4b, zijn beide toezichthouder verkregen door enzymatische epoxidatie zeer enantiopure na verzeping (> 99% een enantiomer). De identiteit van deze enantiomeren werd eerder gerapporteerd als 16 (s), 17 (r)-en 19 (s), 20 (r)-EDP18.
Figuur 1 . Chromatogram van zuivering van ruw mengsel dat uit enzymatische epoxidatie van DHA (samen met relevante structuren) wordt verkregen. De middelste piek (monoepoxide) bevat de gewenste toezichthouder. De reiniging werd uitgevoerd gebruikend een geautomatiseerd systeem van de flits reiniging (Zie lijst van materialen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Voor Beeld 1H-NMR spectra van zuivere 16 (s), 17 (r)-EDP methylester (2a) en 19 (s), 20 (r)-EDP methylester (2b). Spectra werden opgenomen op 500 MHz in CDCl3 (oplosmiddel is zichtbaar op 7,26 ppm en residuele water op 1,6 ppm). De chemische verschuivingen zijn als volgt: 16 (S), 17 (R)-EDP methylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.57-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2,99-2.95 (m, 2 h), 2.87-2.83 (m, 6 h), 2.47-2.37 (m, 6 h), 2.29-2.21 (m, 2 h), 2.11-2.05 (m, 2 h), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, 3 h); 19 (S), 20 (R)-EDP methylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.54-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2,97 (td, J = 6,4, 4,2 Hz, 1 h), 2,91 (td, j = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2.85-2.82 (m, 8 h), 2.44-2.36 (m, 5 h), 2.27-2.21 (m, 1 h), 1.65-1.51 (m, 3 h), 1,06 (t, J = 7,5 Hz , 3 uur). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. CHIRALE HPLC die op enantiopurity van 16, 17-EDP (zure vorm) wijst die door BM3 wordt veroorzaakt. Figuur 3a toont een chirale HPLC-chromatogram van "racemisch" 16, 17-EDP (een kunstmatig mengsel van authentieke normen van beide enantiomeren14), terwijl Figuur 3b een chirale HPLC-chromatogram van enantiopure 16 (S), 17 (R )-EDP geproduceerd door epoxidatie van DHA met BM3, beoordeeld als > 99% S, R isomer. De kolom is cellulose-gebaseerd (zie lijst van materialen, 250 x 4,6 mm, 5 µm, 1.000 Å) eluting met isocratic 45% 50 mM Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3) in methanol (30 min), met een steekproef concentratie van 0,5 mm en debiet van 1 ml/min. gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. CHIRALE HPLC die op enantiopurity van 19, 20-EDP (zure vorm) wijst die door BM3 wordt veroorzaakt. Figuur 4a toont een chirale HPLC-chromatogram van "racemisch" 19, 20-EDP (een kunstmatig mengsel van authentieke normen van beide enantiomeren14), terwijl figuur 4b een chirale HPLC-chromatogram van enantiopure 19 (S), 20 (R)-EDP produceert door epoxidatie van DHA met BM3, beoordeeld als > 99% S,R -isomer (methode zoals beschreven voor Figuur 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 . Algemene enzymatische epoxidatie reactie regeling en relevante structuren van AA, EPA, Eet's, en EEQs geproduceerd door deze methode Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 . Chirale HPLC die enantiopurity van EEQ (zure vorm) aanduidt die door BM3 wordt veroorzaakt. Figuur 6a toont een chirale HPLC-chromatogram van "racemisch" 17, 18-EEQ (een kunstmatig mengsel van authentieke normen van beide enantiomeren14), terwijl Figuur 6b een chirale HPLC-chromatogram van enantiopure 17 (S), 18 (R )-EEQ geproduceerd door epoxidatie van EPA met BM3, beoordeeld als > 99% S,R isomer (methode zoals beschreven voor Figuur 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren hier een operationeel eenvoudige en kosteneffectieve methode voor de voorbereiding van de twee meest voorkomende epoxy metabolieten van DHA-19, 20 en 16, 17-EDP. Deze epoxy vetzuren kunnen worden bereid in zeer enantiopure (als hun S, R-isomeren) vorm met behulp van wild-type BM3 enzym. Hieronder vindt u een aantal kritieke punten die kunnen worden gebruikt voor het oplossen van problemen, en de uitbreiding van onze methode tot de voorbereiding van enantiopure epoxy metabolieten van AA en EPA.
BM3 opslag richtlijnen
Het opslaan van het gezuiverde BM3 enzym is mogelijk door de eiwitoplossing met gelijk volume van glycerol en Flits het bevriezen met vloeibare stikstof vóór opslag in a-78 ˚ C diepvriezer te mengen. Zodra het enzym is bevroren, kan het worden opgeslagen voor maximaal een jaar. Het enzym kan slechts eenmaal worden ontdooid, moet worden ontdooid op ijs, en kan alleen worden overgelaten aan ijs voor 4 h. bevriezing weer, en waardoor het enzym te ontdooien zonder een ijsje zal deactiveren van het enzym.
Richtlijnen voor chemische opslag
Veel van de verbindingen die nodig zijn voor de procedure zijn lucht-gevoelig. Deze omvatten DHA en andere Pufa's, toezichthouder en andere epoxy metabolieten, en NADPH. Om te voorkomen dat peroxidatie (en andere oxidatieve processen) van deze verbindingen, altijd spoelen de containers waarin ze zijn opgeslagen met argon of stikstof en op te slaan op-78 ˚ C.
Een andere belangrijke opmerking is de oplossing waarin de DHA wordt opgeslagen. Hoewel DHA is niet erg stabiel in DMSO, BM3 is onverenigbaar met ethanol en methanol, dus DMSO moet worden gebruikt. Om zijn lage stabiliteit tegen te gaan, moet het DHA-mengsel vers worden bereid op dezelfde dag als de epoxidatie. Het totale DMSO percentage in het reactiemengsel moet worden bewaard onder 1% om te voorkomen dat het enzym wordt gedeactiveerd. Bovendien, omdat NADPH heeft een korte houdbaarheid, moet de concentratie worden gecontroleerd met de spectrofotometer voorafgaand aan de reactie. Dit zorgt ervoor dat 1 equivalent van de NADPH altijd aan het reactiemengsel wordt toegevoegd.
Epoxidatie reactie richtlijnen
De luchtstroom van de ballon in reactiemengsel moet worden gehandhaafd om de reactie te houden zuurstofrijk aangezien de zuurstof voor epoxidatie noodzakelijk is. Het mengsel moet ook snel worden geroerd, omdat Pufa's zijn niet erg oplosbaar in water (de oplosbaarheid van DHA is ≤ 125 µ M in de reactiebuffer). De reactie wordt geblust met oxaalzuur zuur om eiwit (zoals het chelaten metaal en verwijdert cofactoren) en zuur houdt DHA zijn neutrale vorm, die nodig is voor diethyl ether extractie. Het blussen van het reactiemengsel moet langzaam worden gedaan om zuur-gekatalysete hydrolyse van de toezichthouder te vermijden.
EDP-extractie-en reinigings richtlijnen
Ether werd gekozen specifiek als extractie oplosmiddel om veelvoudige redenen. Dichloormethaan kan het eiwit uit oplossing storten, wat de extractie bemoeilijkt. EtOAc uittreksels glycerol (toegevoegd met de oplossing van het enzym voorraad), die moeilijk is te verwijderen en interfereert met de flits chromatografie.
EDP regioisomers in hun vrije zure staat is niet gemakkelijk scheidbaar, wat is waarom de regioisomers in één enkele piek in de eerste Kolomchromatografie van de Flits worden gemengd. Zodra ze worden omgezet in de methylesters, de regioisomers zijn gemakkelijk te scheiden. Bovendien, zijn de esters over het algemeen stabieler dan de overeenkomstige zuren voor opslag op lange termijn als de zure vorm niet onmiddellijk nodig is.
Betekenis van de methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden
Onze methode biedt een eenvoudige en effectieve methode voor het verkrijgen van enantiopure toezichthouder, die vele voordelen ten opzichte van bestaande en alternatieve methoden heeft. Ten eerste, chemische epoxidatie van DHA en andere Pufa's en hun derivaten is noch regioselective of enantioselectieve, en ingewikkelde mengsels worden vaak verkregen. De veelvoudige kolommen van de flits chromatografie en voorbereidende HPLC, met inbegrip van chirale voorbereidende HPLC, zijn daarom noodzakelijk om enantiopure epoxy vetzuren van deze mengsels te zuiveren, die arbeidsintensief zijn en slechts zeer kleine hoeveelheden van de gewenste kunnen produceren Metabolieten. Totale synthese kan ook worden gebruikt om epoxy vetzuren te produceren, maar het is rigoureus, tijdrovend, vereist meerdere stappen, en geeft een lage totale opbrengst, terwijl de BM3 enzym is gemakkelijk te uiten en te zuiveren, en de epoxidatie is voltooid binnen een korte periode van Tijd. Onze methode is ook kostenbesparend: een commerciële bron20 biedt momenteel 16, 17-en 19, 20-EDP (als hun racemates) voor 528 usd/0,5 mg. 1 g van NADPH kan ook worden gekocht voor ~ 500-800 USD, en kan worden gebruikt voor de productie van meer dan 200 keer het bedrag van 19, 20- EDP (en ongeveer 50 keer het bedrag van 16, 17-EDP) commercieel aangeboden voor een gelijkaardige prijs-en in enantiopure vormen, die momenteel niet commercieel beschikbaar zijn.
Beperkingen van de methode
Aangezien dit enzym bij voorkeur de laatste dubbele band van DHA epoxidizes, is het belangrijkste product 19, 20-EDP (hoewel 16, 17-EDP ook wordt geproduceerd). Daarom kunnen andere DHA regioisomers die kunnen worden gewenst (bijv. 13, 14-EDP, 10, 11-EDP) niet worden geproduceerd door enzymatische epoxidatie met wild-type BM3. Ook, aangezien alleen de SR-enantiomeren worden geproduceerd door BM3, de RS-enantiomeren zijn ontoegankelijk, hoewel onze eerder gepubliceerde chemische inversie methode14 kan worden gebruikt om ze te synthetiseren. Bovendien, wegens de lage oplosbaarheid van lipophilic Pufa's in de reactiebuffer, zouden de zeer grote hoeveelheden buffer voor grootschalige productie (ca. 500-1000 mg) van toezichthouder noodzakelijk zijn, die potentieel extractie tijdrovend of onbetaalbaar zou kunnen maken.
Andere toepassingen van de methode
Aangenaam, dit enzymatische epoxidatie protocol is ook van toepassing op EPA en AA (relevante structuren worden weergegeven in Figuur 5). De concentraties, buffer, en reactietijd die nodig is voor epoxidatie van alle drie de vetzuren is hetzelfde. Voor de EPA, de wild-type BM3 enzym wordt ook gebruikt, en de EEQ fractie verkregen uit EPA (56% opbrengst van monoepoxide), na verestering is ~ 14:1 17, 18-EEQ: 14, 15-EEQ. Gelijkaardig aan de observaties die voor toezichthouder worden gemaakt, is 17, 18-EEQ verkregen hoogst enantiopure (> 99% 17 (S), 18 (R)-EEQ, Zie Figuur 6) zoals die door chirale HPLC wordt beoordeeld (Zie Figuur 3 legende en lijst van materialen). Identiteit van enantiomeren werd eerder gemeld17. Voor AA, echter, de F87V BM3 Mutant moet worden gebruikt in plaats als wild-type BM3 is een hydroxylase voor AA21. Expressie en zuivering van deze Mutant maakt ook gebruik van het bovenstaande protocol, en epoxidatie wordt uitgevoerd op een analoge manier. Met deze methode wordt 14, 15-EET als enige regioisomer verkregen. Als 14, 15-EET vrij zuur is onafscheidelijk van niet gereageerd AA na de epoxidatie, verestering is noodzakelijk; 14, 15-EET methylester wordt verkregen in 52% opbrengst van AA. Chirale HPLC (Zie Figuur 3 legende en lijst van materialen) van het zuur wijst op hoogst enantiopure (> 99%) 14 (S), 15 (R)-eet (zoals eerder gemeld)15. De chemische verschuivingen voor deze EPA en de metabolieten van AA zijn als volgt: 17 (S), 18 (R)-EEQ methylester:1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 h), 3,67 (s, 3 h), 2,96 (TD, J = 6,4, 4,2 Hz, 1 h), 2,90 (td, j = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2.85-2.79 (m, 6 h), 2.44-2.38 (m, 1 h), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 h), 2.26-2.20 (m, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,7 Hz, 2 h), 1,71 (kwintet, j = 7,4 Hz, 2 h), 1.66-1.50 (m, 2 h), 1,05 (t, j = 7,5 Hz, 3 h); 14 (S), 15 (R)-eet methylester: 1 H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 h), 3,67 (s, 3 h), 2.95-2.92 (m, 2 h), 2,81 (DT, j = 17,8, 5,8 Hz, 4 H), 2,40 (dt, j = 14,1, 6,8 hz, 1 h), 2,32 (t, j = 7,5 Hz, 2 h), 2,23 (DT, j = 14,1, 6,8 Hz, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,8 Hz, 2 h), 1,71 (kwintet, j = 7,4 Hz, 2 h), 1.56-1.41 (m, 4 h), 1.38-1.30 (m, 4 h), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3 h).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door R00 ES024806 (nationale instituten van gezondheid), DMS-1761320 (de nationale stichting van de wetenschap) en de fondsen van het opstarten van de Universiteit van de staat van Michigan. De auteurs willen Dr. jun Yang (Universiteit van Californië bij Davis) en Leonora Karchalla (de Universiteit van de staat van Michigan) voor hulp met optimalisering van de enzymatische reactie, en Dr. Tony Schilmiller (MSU massaspectrometrie en metabolomics faciliteit) bedanken voor hulp bij HRMS data acquisitie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
