Summary
Nous présentons une méthode utile pour la synthèse et la purification enzymatiques à grande échelle des enantiomers et des regioisomers spécifiques des époxydes de l'acide arachidonique (AA), de l'acide docosahexaénoïque (DHA), et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) avec l'utilisation d'un cytochrome bactérien P450 enzyme (BM3).
Abstract
Les métabolites époxidés de divers acides gras polyinsaturés (PUFAs), appelés acides gras époxy, ont un large éventail de rôles dans la physiologie humaine. Ces métabolites sont produits endogènement par la classe cytochrome P450 d'enzymes. En raison de leurs effets biologiques divers et puissants, il y a un intérêt considérable dans l'étude de ces métabolites. Déterminer les rôles uniques de ces métabolites dans le corps est une tâche difficile, car les acides gras époxy doivent d'abord être obtenus en quantités significatives et avec une grande pureté. L'obtention de composés à partir de sources naturelles est souvent laborieuse, et les hydrolases solubles d'époxyde (sEH) hydrolysent rapidement les métabolites. D'autre part, l'obtention de ces métabolites par des réactions chimiques est très inefficace, en raison de la difficulté d'obtenir des regioisomers purs et des enantiomères, de faibles rendements, et la purification étendue (et coûteuse). Ici, nous présentons une synthèse enzymatique efficace de 19(S), 20(R)- et 16(S), 17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDP) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus mégaterium (qui s'exprime facilement dans Escherichia coli). La caractérisation et la détermination de la pureté sont effectuées avec la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse (MS). Cette procédure illustre les avantages de la synthèse enzymatique des métabolites époxy PUFA, et s'applique à l'époxidation d'autres acides gras, y compris l'acide arachidonique (AA) et l'acide eicosapentaenoic (EPA) pour produire l'époxyeicosatrienoic analogue acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), respectivement.
Introduction
Comme l'intérêt pour le rôle que les acides gras polyinsaturés (en particulier les acides gras oméga-3 et oméga-6 gras polyinsaturés) jouent dans la biologie humaine a augmenté ces dernières années, les chercheurs ont pris connaissance de la large gamme d'avantages attrayants que leurs métabolites pièce. En particulier, les métabolites d'acide gras époxy produits par la classe cytochrome P450 d'enzymes ont été un grand point de discussion. Par exemple, de nombreux époxydes PUFA, y compris les acides époxyeicosatrienoic (EET), les acides époxydocosapentaenoic (EDP) et les acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), jouent un rôle critique dans la régulation de la tension artérielle et de l'inflammation1,2 , 3 (en) , 4 ( en plus) , 5. Fait intéressant, les enantiomères spécifiques et les regioisomers des époxydes AA et EPA sont connus pour avoir des effets variables sur la vasoconstriction6,7. Tandis que les effets physiologiques des enantiomers et des regioisomers des EET et des EEQs ont été documentés, peu est connu au sujet de l'effet des acides éoxydocoentaénoïques analogues (EDP) formés à partir de DHA. L'utilisation généralisée de l'huile de poisson8, qui est riche en EPA et En DHA, a également suscité l'intérêt pour les PDE9. Les avantages de ces suppléments sont censés être en partie dus aux métabolites en aval de DHA (16,17-EDP et 19,20-EDP étant les plus abondants) parce que les niveaux in vivo des EDP coordonnent très bien avec la quantité de DHA dans le régime10,, 11.
L'étude des mécanismes et des cibles de ces acides gras époxy par la métabolomique, la biologie chimique, et d'autres méthodes s'est avérée provocante, en partie parce qu'elles existent en tant que mélanges de regio- et de stéréo-isomers, et une méthode d'obtenir des quantités pures de la enantiomers et regioisomers est nécessaire. Les moyens conventionnels pour synthétiser chimiquement ces composés se sont avérés inefficaces. L'utilisation de peroxyacids comme l'acide méta-chloroperoxybenzoïque pour l'époxidation présente de nombreux inconvénients, notamment le manque de sélectivité de l'époxidation, qui nécessite une purification coûteuse et minutieuse des regioisomers et des enantiomères individuels. La synthèse totale des métabolites de DHA et d'EPA est possible, mais souffre également des inconvénients qui le rendent peu pratique pour la synthèse à grande échelle telle que les coûts élevés et les rendements bas12,13. Une production globale efficace peut être réalisée avec la synthèse enzymatique, car les réactions enzymatiques sont regio- et stéréosélective14. Les études montrent que l'époxidation enzymatique de l'AA et de l'EPA (avec BM3) est à la fois regioselective et enantioselective15,16,17,18, mais cette procédure n'a pas été testée avec DHA, ou sur un grand échelle. L'objectif global de notre méthode était d'augmenter et d'optimiser cette époxidation chimioenzymatique pour produire rapidement des quantités significatives d'acides gras époxy purs comme leurs enantiomères individuels. En utilisant la méthode présentée ici, les chercheurs ont accès à une stratégie simple et rentable pour la synthèse des PDE et d'autres métabolites époxy PUFA.
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Protocol
CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'utiliser les produits chimiques énumérés.
1. Expression de type sauvage BM3
- Inoculer le pBS-BM3 transfecté DH5MD E. coli (un don généreux du Dr F. Ann Walker) dans 5 ml de bouillon lb stérile avec 0,5 mg d'ampicilline ajouté dans un tube de culture de 20 ml.
- Incuber la culture cellulaire dans un shaker à 37 oC pour 24 h à 200 tr/min. Ajouter la culture de démarrage de nuit (5 ml) et 100 mg d'ampicilline à 1 L de bouillon stérile DE LB dans un flacon Fernbach ou Erlenmeyer. Secouer à 37 oC pendant 6 h à 200 tr/min, puis à 30 oC pour 18 h à 200 tr/min.
- Recueillir et centrifuger la culture cellulaire à 4 oC pendant 10 min à 1 000 xg. Jeter le supernatant et stocker le granule de cellules à -78 oC jusqu'à ce que la purification enzymatique.
REMARQUE : Le supernatant peut être soit chimiquement stérilisé par traitement à l'eau de Javel ou stérilisé à l'aide d'un autoclave, puis versé dans le drain.
2. Purification de BM3.
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Lyse cellulaire
- Décongeler le granule de cellules sur la glace et le resuspendre dans 40 ml de tampon de solubilisation glacé (4 oC) (10 mM Tris, 0,01 mM de fluorure de phénylmethylsulfonyle (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
CAUTION: PMSF est toxique par contact. - Sur la glace, sonicate les cellules pendant 1 min avec un homogénéisateur à ultrasons (réglage de puissance de sortie 10, service 100%), suivi d'une pause de 1 min sur la glace afin de lyser les cellules. Répétez cette procédure 6 fois. Centrifuger la cellule lysais à 4 oC pendant 30 min à 11 000 x g de débris de cellules à granulés.
- Décongeler le granule de cellules sur la glace et le resuspendre dans 40 ml de tampon de solubilisation glacé (4 oC) (10 mM Tris, 0,01 mM de fluorure de phénylmethylsulfonyle (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
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Chromatographie d'affinité
- Préparer une forte colonne de chromatographie d'échange d'anion (voir Tableau des matériaux; diamètre : 2,8 cm x 6 cm, volume de colonne : 37 ml) en lavant avec 5 volumes de colonnes (CV) de tampon A (10 mM Tris, pH 7,8) à 4 oC.
- Ajouter les lysates cellulaires à la colonne libéetée et laver la colonne avec 3 CV de tampon froid A. Elute le BM3 en lavant la colonne avec tampon froid B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Recueillir la fraction d'élude brun-rougeâtre. Si la protéine n'est pas utilisée immédiatement, mélangez-la avec un volume égal de glycérol et de gel éclair avec de l'azote liquide. Conserver la solution congelée à -78 oC.
3. Epoxidation de DHA par BM3
- Préparer la réaction en ajoutant 0,308 g (0,940 mmol) de DHA en 18,8 ml de diméthylsulfoxide (DMSO) à 2 L de tampon de réaction en remuant (0,12 M de phosphate de potassium, 5 mM MgCl2, pH 7,4) avec 20 nM de l'enzyme BM3 décongelée. La concentration enzymatique peut être déterminée par la méthode d'analyse spectrale du monoxyde de carbone/dithionite19.
- Pendant que la solution est en remuant, commencer la réaction en ajoutant 1 équivalent de NADPH (nicotinamide adénine dinuccléotide phosphate réduit, sel tétrasodium, 0,808 g, 0,940 mmol) dissous dans le tampon de réaction. Remuer la réaction pendant 30 min tout en bouillonnant l'air à travers le mélange de réaction avec un ballon rempli d'air attaché à une seringue et une aiguille.
- À l'aide d'un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux),vérifiez l'absorption du mélange de réaction à 340 nm pour déterminer si le NADPH est épuisé. S'il n'y a pas d'absorption restante indiquant la consommation de NADPH, la réaction est complète.
REMARQUE: Typiquement, la réaction est complète après 30 min. - Étancher le mélange de réaction en ajoutant lentement 1 M d'acide oxalique, goutte à goutte, jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 4.
4. Extraction de PDE
- Extraire la solution tampon étanchée avec 2 L d'éther diéthyle (anhyde, sans peroxyde) 3 fois. Recueillir la couche d'éther (6 L) et sécher avec du sulfate de magnésium anhydre (MgSO4).
- Filtrer le MgSO4 de la solution et concentrer la couche d'éther séchée sur un évaporateur rotatif pour produire les résidus bruts edP.
- Purifier les résidus par chromatographie à colonne flash (une cartouche de silice de 40 g suffit). Commencez à 10% d'acétate d'éthyle (EtOAc) en hexanes et rampe jusqu'à 60% EtOAc en hexanes de plus de 22 min.
REMARQUE : Trois pics majeurs sont obtenus et collectés, élichant de l'ordre de 1. DHA non réagis; 2. mélange d'isores EDP; et 3. di-époxyde (produits normaux de suroxydation (voir figure 1)). - Mélanger les fractions et les concentrer sur l'évaporateur rotatif. De cet exemple, 0,074 g, (24 %) de DHA non réagi, 0,151 g (47%) des isoreurs EDP, et 0,076 g, (22%) de di-époxide ont été obtenus.
5. Estérification des PDE, séparation de 16(S), 17(R)- et 19(S), 20(R)-EDP, et saponification des esters
CAUTION : Le trimethylsilyldiazométhane (TMS-diazométhane) est très toxique par contact et par inhalation. Utilisez seulement dans une hotte de fumée avec l'équipement de protection individuelle approprié.
- Diluer les époxydes (0,151 g, 0,435 mmol) dans un flacon à fond rond ou une petite fiole avec 2 ml de méthanol anhydre (MeOH) et 3 ml de toluène anhydre, ajouter une barre à remous, et ajouter TMS-diazométhane (1,2 équivalent molaire, ou 0,26 ml d'une solution de 2 Ml en hexanes) sous l'argon.
- Attendez 10 min et ajoutez du TMS-diazométhane supplémentaire (0,050 ml) jusqu'à ce qu'il reste une couleur jaune pâle.
- Après 30 min, concentrer soigneusement le mélange à l'aide de l'évaporateur rotatif et purifier les résidus par chromatographie à colonne flash. Elute avec 4% EtOAc en hexanes (à l'aide d'une colonne ou d'une cartouche de gel de silice de 40 g) pendant 22 min. Dans cet exemple, 19,20-EDP ester méthyle (0,116 g, 74%) et 16,17-EDP ester méthyle (0,029 g, 19%), ont été obtenus comme huiles claires (rendement total, 93%).
- Recueillir les fractions contenant les regioisomers purifiés EDP ester ester. 19(S), 20(R)-EDP ester elutes first, followed by 16(S),17(R)-EDP methyl ester.
- S'il reste des fractions mixtes (contenant les deux isomères; peuvent être évaluées par chromatographie à couches minces (TLC) en 8:1 hexane/EtOAc et tachées de permanganate de potassium (KMnO 4)), les re-chromatographe avec le même système de solvants qu'auparavant.
- Concentrez les fractions contenant les regioisomers individuels.
REMARQUE : À ce stade, l'identité et la pureté peuvent être évaluées par la RMN (en utilisant cDCl3 comme solvant; voir la légende de la figure 2). - Pour convertir les regioisomers d'ester de méthyle d'EDP individuels à leurs formes acides, diluer l'ester d'EDP dans THF:water (approximativement 0.7 mL/0.1 mmol d'ester). Ajouter 2 M liOH aqueux (3 équivalents molaires) et remuer toute la nuit.
REMARQUE: L'exhaustivité de la réaction peut être évaluée par TLC, en utilisant 3:1 hexanes/EtOAc, coloration avec KMnO4; le produit a un facteur de rétention de 0,3. - Étancher la réaction lentement avec de l'acide formique, jusqu'à ce que le pH du mélange atteigne 3-4. Ajouter l'eau et l'acétate d'éthyle (1-2 mL/0,100 mmol d'ester) et séparer les couches. Extraire la couche d'eau avec EtOAc (3 x 5 ml), laver avec la solution de saumure saturée (NaCl) et sécher la couche EtOAc sur le sulfate de sodium anhydre (Na2SO4).
- Concentrer la solution d'acétate d'éthyle à l'aide d'un évaporateur rotatif, ajouter les hexanes (10 ml) et se concentrer à nouveau. Répéter deux fois pour enlever l'acide formique résiduel. Purifie le résidu par chromatographie de colonne flash, eluting avec 10-30% EtOAc plus de 15 min.
- Concentrez les fractions désirées et séchez dans le vacuo pour se permettre l'acide purifié.
REMARQUE : À ce stade, la pureté enantiomérique peut être évaluée (par Chiraquien HPLC, voir les légendes de la figure 3 - Figure 4 pour les colonnes et les conditions). La pureté chimique peut être évaluée par C18 (achiral) HPLC (voir Tableau des matériaux et référence 14).
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Representative Results
Le chromatogramme de colonne flash (exécuté à l'aide d'un système automatisé de purification flash tel que décrit ci-dessous) obtenu lors de la purification du mélange brut de l'époxidation enzymatique est montré dans la figure 1. Après l'estérification et la séparation des regioisomers, des esters purs 16(S), 17(R)-EDP et 19(S), 20(R)-EDP esters méthylaux ont été obtenus. Typiquement, ils sont présents dans un rapport approximatif de 1:4 à 1:5, le produit principal étant 19(S), 20(R)-EDP. Aucun autre regioisomers EDP (par exemple, 13,14- ou 10,11-EDP) ne sont obtenus. Les spectres 1H-NMR de 16(S), 17(R)-EDP (Figure 2A) et 19(S), 20(R)-EDP (Figure 2B) esters méthyles avec leurs structures sont montrés ci-dessous, indiquant la grande pureté de ces composés; C18 (achiral) HPLC des formes acides a également indiqué des puretés -gt;98%. Leur identité a été confirmée par la spectroscopie de masse à haute résolution (à la fois des formes acides et ester), qui a donné des rapports masse/charge et des modèles de fragmentation compatibles avec les PDE identifiés. La pureté enantiomérique a été déterminée à l'aide de HPLC chiral, par rapport aux normes authentiques enantiopure et mixtes des PDE (sous leur forme acide, figure 3A et figure 4A). Comme on peut l'observer dans la figure 3B et la figure 4B, les deux PDE obtenus par époxidation enzymatique sont très enantiopures après la saboification (en anglais seulement 99 % un enantiomer). L'identité de ces enantiomers était précédemment rapportée à 16 (S), 17(R) - et 19(S), 20(R)-EDP18.
Figure 1 . Chromatogramme de la purification du mélange brut obtenu à partir de l'époxidation enzymatique de DHA (avec les structures pertinentes). Le pic moyen (monoepoxide) contient les PDE souhaités. La purification a été effectuée à l'aide d'un système automatisé de purification flash (voir Tableau des matériaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 . Exemple 1spectres H-NMR de pur 16(S), 17(R)-EDP ester méthyle (2A) et 19(S), 20(R)-EDP ester méthyle (2B). Les spectres ont été enregistrés à 500 MHz en CDCl3 (le solvant est visible à 7,26 ppm et l'eau résiduelle à 1,6 ppm). Les changements chimiques sont les suivants: 16(S), 17(R)-EDP ester méthyle: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3) : 5,57-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,99-2,95 (m, 2 H), 2,87-2,83 (m, 6 H), 2,47-2,37 (m, 6 H), 2,29-2,21 (m, 2 H), 2,11-2,05 (m, 2 H), 0,99 (t, J 7,5 Hz, H); 19(S), 20(R)-EDP ester méthyle: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3) : 5,54-5,35 (m, 10 H), 3,68 (s, 3 H), 2,97 (td, J - 6,4, 4.2 Hz, 1 H), 2.91 (td, J '6.3, 4.2 Hz, 1 H), 2.85-2.82 (m, 8 H), 2.44-2.36 (m, 5 H), 2.27-2.21 (m, 1 H), 1.65-1.51 (m, 3 H), 1.06 (t, J '7.Hz , 3 H). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Chiral HPLC indiquant l'enantiopurity de 16,17-EDP (forme acide) produite par BM3. Figure 3A montre un chromatogramme chiraquien HPLC de "racemic" 16,17-EDP (un mélange artificiel de normes authentiques des deux enantiomers14), tandis que la figure 3B montre un chromatogramme chiraquien HPLC de l'enantiopure 16(S), 17(R )-EDP produit par l'époxidation de DHA avec BM3, évalué comme 'gt;99% S,R isomer. La colonne est à base de cellulose (voir Tableau des matériaux, 250 x 4,6 mm, 5 m, 1 000 m) éliant avec isocratique 45 % 50 mM de bicarbonate d'ammonium (NH4HCO3) en méthanol (30 min), avec une concentration d'échantillon de 0,5 mm et un débit de 1 ml/min. cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Chiral HPLC indiquant l'enantiopurity de 19,20-EDP (forme acide) produite par BM3. Figure 4A montre un chromatogramme Chusquence HPLC de "racemic" 19,20-EDP (un mélange artificiel de normes authentiques des deux enantiomers14), tandis que la figure 4B montre un chromatogramme chiral HPLC de l'enantiopure 19(S), 20(R)-EDP produit par l'époxidation de DHA avec BM3, évalué comme 'gt;99% S,R isomer (méthode décrite pour la figure 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 . Dans l'ensemble, le schéma de réaction d'époxidation enzymatique et les structures pertinentes des AA, de l'EPA, des EET et des EEQ produits par cette méthode s'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
Figure 6 . Chiral HPLC indiquant l'enantiopurity de 17,18-EEQ (forme acide) produite par BM3. Figure 6A montre un chromatogramme chiraquien HPLC de "racemic" 17,18-EEQ (un mélange artificiel de normes authentiques des deux enantiomers14), tandis que la figure 6B montre un chromatogramme chiraquien HPLC de l'enantiopure 17(S), 18(R )-EEQ produit par l'époxidation de l'EPA avec BM3, évalué comme 'gt;99% S,R isomer (méthode décrite pour la figure 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous présentons ici une méthode opérationnellement simple et rentable pour préparer les deux métabolites époxy les plus abondants de DHA - 19,20 et 16,17-EDP. Ces acides gras époxy peuvent être préparés en très enantiopure (comme leur S,R-isomers) forme en utilisant l'enzyme de type sauvage BM3. Plusieurs points critiques qui peuvent être utilisés pour le dépannage, et l'extension de notre méthode à la préparation des métabolites époxy éantiopure de AA et EPA, sont décrits ci-dessous.
Directives de stockage BM3
Le stockage de l'enzyme BM3 purifiée est possible en mélangeant la solution protéique avec un volume égal de glycérol et de congélation éclair avec de l'azote liquide avant d'être entreposé dans un congélateur de -78 oC. Une fois l'enzyme congelée, elle peut être stockée jusqu'à un an. L'enzyme ne peut être décongelée qu'une seule fois, doit être décongelée sur la glace et ne peut être laissée sur la glace que pendant 4 h. La congélation à nouveau, et le fait de laisser l'enzyme dégeler sans bain de glace désactivera l'enzyme.
Directives de stockage de produits chimiques
Bon nombre des composés requis pour la procédure sont sensibles à l'air. Il s'agit notamment de DHA et d'autres PUFA, EDPs et autres métabolites époxy, et NADPH. Pour éviter la peroxydation (et d'autres processus oxydatifs) de ces composés, toujours rincer les récipients dans lesquels ils sont stockés avec de l'argon ou de l'azote et les stocker à -78 oC.
Une autre note importante est la solution dans laquelle le DHA est stocké. Bien que le DHA ne soit pas très stable dans le DMSO, le BM3 est incompatible avec l'éthanol et le méthanol, de sorte que le DMSO doit être utilisé. Pour contrer sa faible stabilité, le mélange DHA doit être préparé fraîchement le même jour que l'époxidation. Le pourcentage total de DMSO dans le mélange de réaction doit être maintenu en dessous de 1% pour éviter de désactiver l'enzyme. En outre, parce que NADPH a une courte durée de conservation, la concentration doit être vérifiée avec le spectrophotomètre avant l'ajout à la réaction. Cela garantit qu'un équivalent de l'NADPH est toujours ajouté au mélange de réaction.
Lignes directrices sur la réaction à l'époxidation
Le flux d'air du ballon dans le mélange de réaction doit être maintenu afin de maintenir la réaction oxygénée car l'oxygène est nécessaire pour l'époxidation. Le mélange doit également être agité rapidement, puisque les PUFA ne sont pas très solubles dans l'eau (la solubilité du DHA est de 125 m dans le tampon de réaction). La réaction est étanchéité avec de l'acide oxalique pour dénaturer les protéines (comme il chélates métal et enlève les cofacteurs) et l'acide maintient DHA sa forme neutre, qui est nécessaire pour l'extraction de l'éther diéthyle. L'étanchéité du mélange de réaction doit être faite lentement pour éviter l'hydrolyse acide-catalysée des EDP.
Directives d'extraction et de purification du PDE
L'éther a été choisi spécifiquement comme solvant d'extraction pour de multiples raisons. Le dichlorométhane peut précipiter la protéine hors de la solution, ce qui complique l'extraction. EtOAc extrait le glycérol (ajouté avec la solution de stock d'enzymes), qui est difficile à enlever et interfère avec la chromatographie flash.
Les regioisomers d'EDP dans leur état acide libre ne sont pas facilement séparables, c'est pourquoi les regioisomers sont mélangés dans un seul pic dans la chromatographie première colonne de flash. Une fois qu'ils sont convertis en esters méthyle, les regioisomers sont facilement séparés. En outre, les esters sont généralement plus stables que les acides correspondants pour le stockage à long terme si la forme acide n'est pas nécessaire immédiatement.
Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes/alternatives
Notre méthode fournit une méthode simple et efficace pour obtenir des PDE enantiopure, qui a de nombreux avantages par rapport aux méthodes existantes et alternatives. Tout d'abord, l'époxidation chimique de DHA et d'autres PUFA et leurs dérivés n'est ni regioselective ou enantioselective, et des mélanges compliqués sont souvent obtenus. Les colonnes de chromatographie flash multiples et hPLC préparatifs, y compris hPLC preparatif chiral, sont donc nécessaires pour purifier les acides gras époxy enantiopure de ces mélanges, qui sont laborieux et peuvent produire seulement de très petites quantités de la désirée Métabolites. La synthèse totale peut également être utilisée pour produire des acides gras époxy, mais elle est rigoureuse, longue, nécessite plusieurs étapes, et donne un faible rendement global, tandis que l'enzyme BM3 est facile à exprimer et à purifier, et l'époxidation est complète dans un court laps de temps de temps. Notre méthode est également rentable : une source commerciale20 offre actuellement 16,17 et 19,20-EDP (comme leurs compagnons de course) pour 528 USD /0.5 mg. 1 g de NADPH peut également être acheté pour 500-800 USD, et peut être employé pour produire plus de deux cents fois la quantité de 19,20- EDP (et environ cinquante fois le montant de 16,17-EDP) offert commercialement pour un prix similaire - et sous des formes enantiopure, qui ne sont actuellement pas disponibles dans le commerce.
Limites de la méthode
Comme cette enzyme époxide de préférence la dernière liaison double de DHA, le produit principal est 19,20-EDP (bien que 16,17-EDP est également produite). Par conséquent, d'autres regioisomers de DHA qui pourraient être désirés (par exemple, 13,14-EDP, 10,11-EDP) ne peuvent pas être produits par l'époxidation enzymatique avec le BM3 sauvage-type. En outre, comme seuls les SR-enantiomers sont produits par BM3, les RS-enantiomerssont inaccessibles, bien que notre méthode d'inversion chimique précédemment publiée14 peut être utilisée pour les synthétiser. De plus, en raison de la faible solubilité des PUFA lipophiles dans le tampon de réaction, de très grandes quantités de tampon seraient nécessaires pour la production à grande échelle (environ 500-1 000 mg) de PDE, ce qui pourrait rendre l'extraction longue ou prohibitive.
Autres applications de la méthode
Agréablement, ce protocole d'époxidation enzymatique s'applique également à l'EPA et aux AA (les structures pertinentes sont indiquées à la figure 5). Les concentrations, le tampon et le temps de réaction requis pour l'époxidation des trois acides gras sont les mêmes. Pour l'EPA, l'enzyme BM3 de type sauvage est également utilisée, et la fraction EEQ obtenue à partir de l'EPA (56% de rendement du monoepoxide), après l'estérification est de 14:1 17,18-EEQ:14,15-EEQ. À l'instar des observations faites pour les PDE, les 17,18-EEQ obtenus sont très enantiopures (99 % 17(S), 18(R)-EEQ, voir Figure 6) évaluée par le HPLC chiral (voir la légende de la figure 3 et le Tableau des matériaux). L'identité des enantiomers a été précédemment rapportée17. Pour AA, cependant, le mutant F87V BM3 doit être utilisé à la place comme sauvage de type BM3 est une hydroxylase pour AA21. L'expression et la purification de ce mutant utilise également le protocole ci-dessus, et l'époxidation est effectuée d'une manière analogue. Par cette méthode, 14,15-EET est obtenu comme seul regioisomer. Comme l'acide libre 14,15-EET est inséparable de l'AA non réagi après l'époxidation, l'estérification est nécessaire; 14,15-EET ester méthyl est obtenu dans le rendement de 52% de AA. Chiral HPLC (voir Figure 3 légende et Tableau des matériaux) de l'acide indique très enantiopure (-gt;99%) 14(S), 15(R)-EET (tel qu'indiqué précédemment)15. Les changements chimiques pour ces métabolites EPA et AA sont les suivants: 17(S), 18(R)-EEQ ester méthyle:1H-NMR (500 MHz; CDCl3) : 5,53-5,34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 H), 2,96 (td, J - 6,4, 4,2 Hz, 1 H), 2,90 (td, J 6,3, 4,2 Hz, 1 H), 2,85-2,79 (m, 6 H), 2,44-2,38 (m, 1 H), 2,32 (t, J 7,5 Hz, 2 H), 2,26-2,20 (m, 1 H) , 2,11 (q, J 6,7 Hz, 2 H), 1,71 (quintette, J 7,4 Hz, 2 H), 1,66-1,50 (m, 2 H), 1,05 (t, J 7,5 Hz, 3 H); 14(S), 15(R)-EET ester méthyle: 1 Fois H-NMR (500 MHz; CDCl3) : 5,53-5,33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 H), 2,95-2,92 (m, 2 H), 2,81 (dt, J - 17,8, 5,8 Hz, 4 H), 2,40 (dt, J - 14,1, 6,8 Hz, 1 H), 2,32 (t, J 7,5 Hz, 2 H), 2,23 (dt, J - 14,1, 6,8 Hz, 1 H) , 2,11 (q, J 6,8 Hz, 2 H), 1,71 (quintette, J 7,4 Hz, 2 H), 1,56-1,41 (m, 4 H), 1,38-1,30 (m, 4 H), 0,90 (t, J - 7,1 Hz, 3 H).
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux sont financés par R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) et des fonds de démarrage de l'Université d'État du Michigan. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jun Yang (Université de Californie à Davis) et Lalitha Karchalla (Michigan State University) pour leur aide dans l'optimisation de la réaction enzymatique, et le Dr Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) pour l'aide à l'acquisition de données DU SMR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
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