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Chemistry

डोकोसाएक्सेनोइक, ईकोसेपेन्टाइनोइक, और अराचिडोनिक एसिड के एपॉक्सिडाइज्ड मेटाबोलाइट्स का एंजाइमी संश्लेषण

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/59770
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

Summary

हम बड़े पैमाने पर एंजाइमी संश्लेषण और विशिष्ट enantiomers और arachidonic एसिड (एए), docosahexaenoic एसिड (DHA), और eicosapentaenoic एसिड (ईपीए) के epoxides के regioisomers की शुद्धि के लिए उपयोगी एक विधि प्रस्तुत एक जीवाणु साइटोक्रोम के उपयोग के साथ P450 एंजाइम (BM3).

Abstract

विभिन्न पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड (PUFAs) के epoxidized चयापचयों, epoxy फैटी एसिड कहा जाता है, मानव शरीर क्रिया विज्ञान में भूमिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला है. इन चयापचयों एंजाइमों के cytochrome P450 वर्ग द्वारा अंतर्जात रूप से उत्पादित कर रहे हैं. उनके विविध और शक्तिशाली जैविक प्रभाव के कारण, इन चयापचयों का अध्ययन करने में काफी रुचि है। शरीर में इन चयापचयों की अद्वितीय भूमिकाओं का निर्धारण एक मुश्किल काम है, के रूप में epoxy फैटी एसिड पहले महत्वपूर्ण मात्रा में और उच्च शुद्धता के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए. प्राकृतिक स्रोतों से यौगिकों प्राप्त अक्सर श्रम गहन है, और घुलनशील epoxide hydrolases (sEH) तेजी से चयापचयों hydrolyze. दूसरी ओर, रासायनिक प्रतिक्रियाओं के माध्यम से इन चयापचयों प्राप्त करने बहुत अक्षम है, शुद्ध regioisomers और enantiomers प्राप्त करने की कठिनाई के कारण, कम पैदावार, और व्यापक (और महंगी) शुद्धि. यहाँ, हम एक कुशल एंजाइमी संश्लेषण प्रस्तुत 19 (एस),20 (आर )- और 16 (एस ), 17(आर)-epoxydocosapentaenoic एसिड (EDPs) बीएम 3 के साथ epoxidation के माध्यम से, एक जीवाणु CYP450 एंजाइम मूल रूप से Bacillus से अलग मेगेटरियम (जो आसानी से एस्चेरीचिया कोलीमें व्यक्त किया जाता है )। विशेषता और शुद्धता का निर्धारण परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर), उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC), और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ किया जाता है। इस प्रक्रिया PUFA epoxy चयापचयों के एंजाइमी संश्लेषण के लाभों को दिखाता है, और अन्य फैटी एसिड के epoxidation के लिए लागू है, arachidonic एसिड सहित (एए) और eicosapentaenoic एसिड (ईपीए) अनुरूप epoxyeicosatrienoic का उत्पादन करने के लिए अम्ल (EETs) और epoxyicosatetraenoic एसिड (EEQs), क्रमशः.

Introduction

भूमिका में रुचि के रूप में है कि polyunsaturated फैटी एसिड (विशेष रूप से ओमेगा -3 और ओमेगा -6 polyunsaturated फैटी एसिड) मानव जीव विज्ञान में खेलने हाल के वर्षों में वृद्धि हुई है, शोधकर्ताओं ने अपील लाभ की विस्तृत श्रृंखला का ध्यान रखा है कि उनके चयापचयों प्रदर्शन. विशेष रूप से, एंजाइमों के साइटोक्रोम P450 वर्ग द्वारा उत्पादित एपॉक्सी फैटी एसिड चयापचयों ध्यान का एक बड़ा बिंदु रहा है. उदाहरण के लिए, कई PUFA epoxides, epoxyeicosatrienoic एसिड सहित (EETs), epoxydocosapentaenoic एसिड (EDPs) और epoxyicosatenoic एसिड (EEQs), रक्तचाप और सूजनकेविनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1 ,2 , 3 , 4 , 5. दिलचस्प बात यह है कि ए.ए. और ईपीए एपॉक्साइड्स के विशिष्ट एन्टिओमर्स और रीजियोइमेजर्स को वासोकॉन्स्ट्रक्शन6,7पर अलग-अलग प्रभाव होते हैं . जबकि enantiomers और EETs और EEQs के regioisomers के शारीरिक प्रभाव प्रलेखित किया गया है, थोड़ा अनुरूप epoxydocosapentaenoic एसिड के प्रभाव के बारे में जाना जाता है DHA से गठन किया. मछली के तेल8के व्यापक उपयोग , जो ईपीए और डीएचए दोनों में समृद्ध है , ने भी ईडी पी9में रुचि दिखाई है . इन पूरकों के लाभ आंशिक रूप से बहाव DHA चयापचयों के कारण माना जाता है (16,17-EDP और 19,20-EDP सबसे प्रचुर मात्रा में किया जा रहा है) क्योंकि EDPs के vivo स्तर में बहुत अच्छी तरह से आहार में DHA की मात्रा के साथ समन्वय10, 11|

metabolomics, रासायनिक जीव विज्ञान, और अन्य तरीकों से इन epoxy फैटी एसिड के तंत्र और लक्ष्यों का अध्ययन चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है, भाग में, क्योंकि वे regio के मिश्रण के रूप में मौजूद- और स्टीरियो-आइसोमर्स, और शुद्ध मात्रा प्राप्त करने की एक विधि enantiomers और regioisomers की आवश्यकता है. रासायनिक synthesizing इन यौगिकों के लिए पारंपरिक साधन अप्रभावी साबित कर दिया है. एपॉक्साइड के लिए मेटा-क्लोरोपेरॉक्सीबेनज़ोइक एसिड जैसे पेरॉक्सीएसिड का उपयोग कई कमियां हैं, विशेष रूप से एपॉक्सिडेशन चयनात्मकता की कमी, जो व्यक्तिगत regiosomers और enantiomers के महंगे और परिश्रमी शुद्धि की आवश्यकता होती है। DHA और EPA चयापचयों की कुल संश्लेषण संभव है, लेकिन यह भी कमियां है कि यह इस तरह के उच्च लागत और कम पैदावार के रूप में बड़े पैमाने पर संश्लेषण के लिए अव्यावहारिक बनाने से ग्रस्त12,13. कुशल समग्र उत्पादन एंजाइमी संश्लेषण के साथ प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं regio- और स्टीरियोचयनात्मक14कर रहे हैं. अध्ययनों से पता चलता है कि ए.ए. और EPA के enzymatic epoxidation (BM3 के साथ) दोनों regioselective और enantioselective15,16,17,18, लेकिन इस प्रक्रिया DHA के साथ परीक्षण नहीं किया गया है, या एक बड़े पर स्केल. हमारी विधि के समग्र लक्ष्य को पैमाने पर और तेजी से अपने व्यक्तिगत enantiomers के रूप में शुद्ध epoxy फैटी एसिड की महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन करने के लिए इस chemoenzymatic epoxidation का अनुकूलन किया गया. यहाँ प्रस्तुत विधि का उपयोग करना, शोधकर्ताओं EDPs और अन्य PUFA epoxy चयापचयों के संश्लेषण के लिए एक सरल और लागत प्रभावी रणनीति के लिए उपयोग किया है.

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Protocol

चेतावनी: सूचीबद्ध रसायनों का उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) से परामर्श करें।

1. जंगली प्रकार BM3 की अभिव्यक्ति

  1. Inoculate pBS-BM3 transfected DH5 ] ई. कोलाई (डॉ. एफ एन वाकर से एक उदार दान) बाँझ LB शोरबा के 5 एमएल में 0.5 मिलीग्राम एम्पिसिलिन के साथ एक 20 एमएल संस्कृति ट्यूब में जोड़ा.
  2. 200 आरपीएम पर 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर में सेल संस्कृति को इनक्यूबेट करें। एक Fernbach या Erlenmeyer फ्लास्क में बाँझ LB शोरबा के 1 एल करने के लिए रात भर स्टार्टर संस्कृति (5 एमएल) और 100 मिलीग्राम एम्पीसिलिन जोड़ें। 200 आरपीएम पर 6 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाओ, फिर 200 आरपीएम पर 18 डिग्री के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. कोशिका संवर्धन को 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए 10 000 x ग्रामपर ले लीजिए और अपकेंद्रण करें . सुपरनेंट को छोड़ दें और सेल गोली को -78 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम शुद्धिन तक स्टोर करें।
    नोट: supernatant या तो रासायनिक ब्लीच के साथ उपचार द्वारा बाँझ या एक autoclave का उपयोग कर बाँझ और फिर नाली नीचे डाला जा सकता है.

2. BM3 की शुद्धि.

  1. सेल lysis
    1. बर्फ पर सेल गोली thaw और बर्फ ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) solubilization बफर (10 एम एम Tris, 0.01 मीटर फेनिलमेथिलसल्फफोनिल फ्लोराइड (PMSF;), 0.01 एम एम EDTA; पीएच 7.8) के 40 एमएल में फिर से निलंबित।
      चेतावनी: PMSF संपर्क से विषाक्त है.
    2. जबकि बर्फ पर, एक अल्ट्रासोनिक homogenizer के साथ 1 मिनट के लिए कोशिकाओं sonicate (आउटपुट बिजली सेटिंग 10, कर्तव्य 100%), कोशिकाओं lyse करने के लिए बर्फ पर एक 1 मिनट तोड़ने के बाद। इस प्रक्रिया को 6 बार दोहराएँ. गोली सेल मलबे के लिए 11,000 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल lysate सेंट्रीफ्यूज।
  2. एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी
    1. एक मजबूत आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी कॉलम तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें; व्यास: 2.8 सेमी x 6 सेमी, कॉलम वॉल्यूम: 37 एमएल) बफर ए (10 एम एम ट्रास, पीएच 7.8) के 5 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ धोने से 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. सेल lysates को समतुल्य कॉलम में जोड़ें और कॉलम को 3 सीवी के साथ ठंडे बफर ए ए ल्यूट के साथ कॉलम को ठंडे बफर बी (10 एमएम ट्राइस, 600 एमएम नैकल, 6 सीवी) के साथ धोकर BM3 को धो लें।
    3. लाल-भूरे रंग के एलावेन्ट अंश को एकत्र करें। यदि प्रोटीन तुरंत इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है, यह ग्लिसरोल के एक बराबर मात्रा और तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश फ्रीज के साथ मिश्रण. जमे हुए समाधान को -78 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।

3. BM3 द्वारा DHA के Epoxidation

  1. डीएचए के 0.308 ग्राम (0ण्940 एममोल) को 18.8 एमएल डाइमेथिलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 2 ल् में उत्तेजक प्रतिक्रिया बफर(0ण्12 एम पोटेशियम फॉस्फेट, 5 एमएम एमजीसीएल 2, पीएच 7.4) को जोड़कर प्रतिक्रिया तैयार की। एंजाइम सांद्रता कार्बन मोनोऑक्साइड/डाइथियोनाइट स्पेक्ट्रमी परख विधि19द्वारा निर्धारित की जा सकती है।
  2. जबकि समाधान सरगर्मी है, NADPH के 1 बराबर जोड़कर प्रतिक्रिया शुरू (Nicotinamide adenine dinucleotide फॉस्फेट कम, टेट्रासोडियम नमक, 0.808 ग्राम, 0.940 mmol) प्रतिक्रिया बफर में भंग. एक सिरिंज और सुई से जुड़ी हवा से भरे गुब्बारे के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण के माध्यम से हवा bubbling जबकि 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया हिलाओ।
  3. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर काउपयोग करना (सामग्री की तालिका देखें), NADPH समाप्त हो गया है, तो यह निर्धारित करने के लिए 340 एनएम पर प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण की जाँच करें। यदि कोई शेष अवशोषण NADPH की खपत का संकेत है, प्रतिक्रिया पूरा हो गया है.
    नोट: आमतौर पर, प्रतिक्रिया 30 मिनट के बाद पूरा हो गया है.
  4. धीरे-धीरे 1 एम ऑक्सैलिक एसिड, ड्रॉपवार जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण को कंचें, जब तक कि समाधान का पीएच 4 तक न पहुंच जाए।

4. EDPs का निष्कर्षण

  1. diethyl ईथर के 2 एल के साथ मज्जशीतित बफर समाधान निकालें (anhydrous, पेरोक्साइड मुक्त) 3 बार. ईथर परत (6 एल) लीजिए और एनहाइड्रोस मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4) के साथ सूखी।
  2. विलयन से MgSO4 को छानकर कच्चे ईडीपी अवशेषों को उत्पन्न करने के लिए रोटरी वाष्पित्र पर सूखे ईथर परत को संकेन्द्रित करें।
  3. फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी (एक 40 ग्राम सिलिका कारतूस पर्याप्त है) द्वारा अवशेषों को शुद्ध करें। हेक्सान्स में 10% एथिल एसीटेट (EtOAc) पर शुरू करें और 22 मिनट से अधिक हेक्सान्स में 60% EtOAc तक रैंप करें।
    नोट: तीन प्रमुख चोटियों प्राप्त कर रहे हैं और एकत्र, 1 के क्रम में eluting. अनप्रतिक्रियाडी डीएचए; 2. ईडीपी आइसोमर्स का मिश्रण; और 3. द्वि-एपॉक्साइड (सामान्य अति ऑक्सीकरण उत्पाद (चित्र 1)) देखें।
  4. भिन्नों का मिश्रण है और उन्हें रोटरी वाष्पित्र पर ध्यान केंद्रित. इस उदाहरण से, 0.074 g, (24%) की unreacted DHA, 0.151 जी (47%) EDP isomers की, और 0.076 ग्राम, (22%) डाइ-एपॉक्साइड प्राप्त किया गया।

5. EDPs के एस्टरीकरण, 16 (एस), 17(आर)- और 19(एस ), 20(आर)-EDP, और एस्टर के saponification

चेतावनी: Trimethylsilyldiazomethane (टीएमएस-डायजोमेथेन) दोनों संपर्क और साँस लेना द्वारा बहुत विषाक्त है. उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक धूआं हुड में ही प्रयोग करें।

  1. एक गोल तली हुई फ्लास्क या एनहाइड्रोस मेथनॉल (MeOH) के 2 एमएल और एनहाइड्रोस टॉलूईन के 3 एमएल के साथ एक गोल-नीचे फ्लास्क या छोटे शीशी में ईपॉक्साइड (0.151 ग्राम), और एक हलचल-बार जोड़ें, और टीएमएस-डायजोमेथेन (1.2 मोलर समकक्ष, या 0.2 एमएल के तहत एक 2 एमएक्स एस के तहत) एक एल।
  2. 10 मिनट प्रतीक्षा करें और अतिरिक्त टीएमएस-डायजोमेथेन (0.050 एमएल) जोड़ें जब तक कि एक पीला पीला रंग न बना रहेगा।
  3. 30 मिनट के बाद, ध्यान से रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर मिश्रण ध्यान केंद्रित करने और फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों को शुद्ध। हेक्सान्स में 4% EtOAc के साथ Elute (एक 40 ग्राम सिलिका जेल कॉलम या कारतूस का उपयोग करके) 22 मिनट के लिए. इस उदाहरण में, 19,20-EDP मिथाइल एस्टर (0.116 ग्राम, 74%) और 16,17-EDP मिथाइल एस्टर (0.029 ग्राम, 19%), स्पष्ट तेलों (कुल उपज, 93%) के रूप में प्राप्त किए गए थे।
  4. शुद्ध EDP मिथाइल एस्टर regioisomers युक्त अंश ले लीजिए. 19(एस),20(आर)-EDP मिथाइल एस्टर पहले, उसके बाद 16(एस),17(आर )-EDP मिथाइल एस्टर।
  5. यदि कोई मिश्रित अंश रहता है (जिसमें दोनों समावयक होते हैं; पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा 8:1 हेक्सेन/ईटीओसी में मूल्यांकन किया जा सकता है और पोटेशियम परमैंगनेट (केएमएनओ4) के साथ दाग दिया जाता है, तो उन्हें पहले की तरह एक ही विलायक प्रणाली के साथ फिर से वर्णामहोता किया जा सकता है।
  6. व्यक्तिगत regioisomers युक्त अंशों ध्यान लगाओ.
    नोट: इस बिंदु पर, पहचान और शुद्धता NMR द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (विलायक के रूप में CDCl3 का उपयोग करके; चित्र 2के लिए कथा देखें).
  7. अलग-अलग EDP मिथाइल एस्टर regioisomers उनके एसिड रूपों में परिवर्तित करने के लिए, THF में EDP एस्टर पतला: पानी (लगभग 0.7 एमएल / 2 एम जलीय LiOH (3 मोलर समकक्ष) जोड़ें और रात भर हलचल.
    नोट: प्रतिक्रिया की पूर्णता टीएलसी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, 3:1 हेक्सोन/ उत्पाद का एक प्रतिधारण कारक है $0.3.
  8. Formic एसिड के साथ धीरे धीरे प्रतिक्रिया को बुझाने, जब तक मिश्रण के पीएच 3-4 तक पहुँचता है. पानी और एथिल ऐसीटेट जोड़ें (1-2 एमएल/0.100 एस्टर के mmol) और परतों को अलग. EtOAc (3 x 5 एमएल) के साथ पानी की परत निकालें, संतृप्त नमकीन (NaCl) समाधान के साथ धोने, और anhydrous सोडियम सल्फेट पर EtOAc परत सूखी (Na2SO4).
  9. एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर एथिल एसीटेट समाधान ध्यान केंद्रित, हेक्सानेन्स (10 एमएल) जोड़ें और फिर से ध्यान केंद्रित। दो बार दोहराएँ करने के लिए azeotropically अवशिष्ट formic एसिड को हटा दें. फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों को शुद्ध करें, 15 मिनट से अधिक 10-30% EtOAc के साथ eluting।
  10. शुद्ध एसिड वहन करने के लिए वांछित अंशों को ध्यान में रखने और धानी में सूखी ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: इस स्तर पर, enantiomeric शुद्धता का मूल्यांकन किया जा सकता है (चिरल HPLC द्वारा, चित्र 3 के लिए किंवदंतियों देखें - स्तंभ और शर्तों के लिए चित्र 4). रासायनिक शुद्धता C18 (अकील) HPLC द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (सामग्री और संदर्भ 14 की तालिका देखें).

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Representative Results

फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राम (नीचे वर्णित के रूप में एक स्वचालित फ़्लैश शोधन प्रणाली का उपयोग करप्रदर्शन) एंजाइमी epoxidation से कच्चे मिश्रण की शुद्धि पर प्राप्त चित्र 1में दिखाया गया है। रीजियोआइसोमर्स के एस्टरीकरण और पृथक्करणके बाद, शुद्ध 16 (एस), 17(आर )-EDP और 19(एस), 20 (आर )-EDP मिथाइल एस्टर प्राप्त किए गए थे। आमतौर पर, वे एक अनुमानित 1:4 से 1:5 अनुपात में मौजूद हैं, प्रमुखउत्पाद जा रहा है के साथ 19((एस),20 (आर )-EDP. कोई अन्य EDP regioisomers (उदा., 13,14- या 10,11-EDP) प्राप्त कर रहे हैं. 16(एस), 17 (आर)-EDP ( चित्र2A) और 19(S), 20(R)-EDP ( चित्र2B) मिथाइल एस्टर ्स्स के साथ-साथ मिथाइल एस्टर नीचे दिखाए गए हैं, जो इनकी उच्च शुद्धता को दर्शाते हैं यौगिकों; एसिड रूपों के C18 (आकील) HPLC भी शुद्धता का संकेत दिया और 98%. उनकी पहचान आगे उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसिड और एस्टर रूपों दोनों) द्वारा पुष्टि की गई थी, जो बड़े पैमाने पर / प्रभारी अनुपात और खंडित पैटर्न की पहचान EDPs के साथ संगत उपज. Enantiomeric शुद्धता chiral HPLC का उपयोग कर निर्धारित किया गया था, प्रामाणिक enantiopure और EDPs के मिश्रित मानकों की तुलना में (उनके एसिड रूप में, चित्र 3A और चित्र 4A). जैसा कि चित्र 3ख और चित्र 4खमें देखा जा सकता है , एन्जाइमेटिक एपोक्सिडेशन द्वारा प्राप्त दोनों ई.पी.पी. इन enantiomers की पहचान पहले 16 (एस), 17(आर)- और 19 (एस ), 20 (आर)-EDP18होने की सूचना दी गई थी .

Figure 1
चित्र 1 . डीएचए (संबंधित संरचनाओं के साथ) के एंजाइमी एपॉक्सिडेशन से प्राप्त कच्चे मिश्रण की शुद्धि से क्रोमैटोग्राम। मध्य शिखर (मोनोपॉक्साइड) में वांछित EDPs होता है। शुद्धि एक स्वचालित फ्लैश शोधन प्रणाली का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . उदाहरण 1H-NMR स्पेक्ट्रम शुद्ध 16(एस), 17(आर)-EDP मिथाइल एस्टर (2A) और 19(एस),20(आर)-EDP मिथाइल एस्टर (2B)। स्पेक्ट्रा सीडीसीएल3 में 500 मेगाहर्ट्ज पर दर्ज किया गया (समाधान 7.26 पीपीएम पर और अवशिष्ट पानी 1.6 पीपीएम पर दिखाई देता है)। रासायनिक बदलाव इस प्रकार हैं: 16(एस ),17(आर )-EDP मिथाइल एस्टर: 1एच-एनएमआर (500 मेगाहर्ट्ज; सीडीसीएल3: 5.57-5.35 (m, 10 एच), 3.68 (एस, 3 एच), 2.99-2.95 (एम, 2 एच), 2.87-2.83 (एम, 6 एच), 2.47-2.37 (एम, 6 एच), 2.29-2.21 (एम, 2 एच), 2.11-2.05 (एम, 2 एच), 0.9 9 $ 19(एस),20(आर )-EDP मिथाइल एस्टर: 1H-NMR (500 मेगाहर्ट्ज; सीसीएल3): $ 5.54-5.35 (m, 10 H), 3.68 (s, 3 H), 2.97 (td, J ] 6.4, 4.2 हर्ट्ज, 1 एच), 2.91 (टीडी, जे जेड 6.3, 4.2 हर्ट्ज, 1 एच), 2.85-2.82 (एम, 8 एच), 2.44-2.36 (m, 5 एच), 2.27-2.21 (एम, 1 एच), 1.65-1.51 (एम, 3 एच), 1.06 , 7 , 3 एच). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3| Chiral HPLC BM3 द्वारा उत्पादित 16,17-EDP (एसिड रूप) की एन्टीओपुरिटी का संकेत है। चित्र 3क "रेसमिक" 16,17-EDP (दोनों enantiomers14के प्रामाणिक मानकों का एक कृत्रिम मिश्रण) की एक chiral HPLC क्रोमैटोग्राम से पता चलता है, जबकि चित्र ासाकीय HPLC क्रोमैटोग्राम के एक chiral HPLC क्रोमैटोग्राम से पता चलता है enantiopure 16(S),17(R. )-EDP BM3 के साथ DHA के epoxidation द्वारा उत्पादित, के रूप में मूल्यांकन किया गया ;99% एस, आर isomer. कॉलम सेलूलोज़-आधारित है (सामग्री की तालिका देखें, 250 x 4.6 मिमी, 5 $m, 1,000 ]) समस्थानिक 45% 50 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट (एनएच4एचसीओ3) मेथनॉल (30 मिनट) की एकाग्रता के नमूने और 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के साथ। इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4| Chiral HPLC BM3 द्वारा उत्पादित 19,20-EDP (एसिड रूप) की एन्टीओपुरिटी का संकेत है। चित्र 4A "रेस्मिक" 19,20-EDP (दोनों enantiomers14के प्रामाणिक मानकों का एक कृत्रिम मिश्रण) के एक chiral HPLC क्रोमैटोग्राम से पता चलताहै, जबकि चित्रा 4B enantiopure 19 (एस ), 20(आर)-EDP उत्पादित की एक chiral HPLC क्रोमैटोग्राम से पता चलता है बी.एम.3 के साथ DHA के epoxidation द्वारा, के रूप में मूल्यांकन किया गया ;99% S,R समकारक (विधि के रूप में चित्र 3के लिए वर्णित ) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . कुल मिलाकर एंजाइमी epoxidation प्रतिक्रिया योजना और ए.ए., EPA, EETs के प्रासंगिक संरचनाओं, और EEQs इस विधि द्वारा उत्पादित कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 6
चित्र 6 . Chiral HPLC BM3 द्वारा उत्पादित 17,18-EEQ (एसिड रूप) की एन्टीओपर्सिटी का संकेत. चित्र 6A "रेसमिक" 17,18-EEQ (दोनों enantiomers14के प्रामाणिक मानकों का एक कृत्रिम मिश्रण) के एक chiral HPLC क्रोमैटोग्राम से पता चलता है, जबकि चित्र 6B enantiopure के एक chiral HPLC क्रोमैटोग्राम से पता चलता है 17 (एस),18(आर )-EEQ BM3 के साथ EPA के epoxidation द्वारा उत्पादित, के रूप में मूल्यांकन किया गया ;gt; 99% S,R isomer (विधि के रूप में चित्र 3के लिए वर्णित ). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम यहाँ प्रस्तुत DHA के दो सबसे प्रचुर मात्रा में epoxy चयापचयों की तैयारी के लिए एक परिचालन सरल और लागत प्रभावी विधि - 19,20 और 16,17-EDP. इन epoxy फैटी एसिड अत्यधिक enantiopure में तैयार किया जा सकता है (के रूप में उनके एस, आर-isomers) जंगली प्रकार BM3 एंजाइम का उपयोग कर फार्म. कई महत्वपूर्ण बिंदु जो समस्या निवारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और ए.ए. और EPA के enantiopure epoxy चयापचयों की तैयारी करने के लिए हमारी विधि का विस्तार, नीचे वर्णित हैं.

BM3 भंडारण दिशानिर्देश

शुद्ध BM3 एंजाइम भंडारण ग्लिसरोल के बराबर मात्रा के साथ प्रोटीन समाधान मिश्रण और एक -78 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में भंडारण से पहले तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश ठंड द्वारा संभव है. एक बार एंजाइम जमे हुए है, यह एक वर्ष के लिए संग्रहीत किया जा सकता है. एंजाइम केवल एक बार thawed किया जा सकता है, बर्फ पर thawed किया जाना चाहिए, और केवल 4 ज के लिए बर्फ पर छोड़ दिया जा सकता है फिर से बर्फ़ीली, और एंजाइम एक बर्फ स्नान के बिना thaw करने की अनुमति एंजाइम निष्क्रिय कर देगा.

रासायनिक भंडारण दिशानिर्देश

प्रक्रिया के लिए आवश्यक यौगिकों में से कई वायु-संवेदी होते हैं। इनमें डीएचए और अन्य पीयूए, ईडीपी और अन्य एपॉक्सी चयापचयऔर और एनएडीएच शामिल हैं। इन यौगिकों के peroxidation (और अन्य ऑक्सीडेटिव प्रक्रियाओं) को रोकने के लिए, हमेशा कंटेनर जिसमें वे argon या नाइट्रोजन और स्टोर के साथ जमा हो जाती है फ्लश -78 डिग्री सेल्सियस पर.

एक अन्य महत्वपूर्ण नोट समाधान है जिसमें DHA संग्रहीत किया जाता है। हालांकि DHA DMSO में बहुत स्थिर नहीं है, BM3 इथेनॉल और मेथनॉल के साथ असंगत है, इसलिए DMSO इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अपनी कम स्थिरता प्रतिक्रिया करने के लिए, DHA मिश्रण ताजा epoxidation के रूप में एक ही दिन तैयार किया जाना चाहिए. प्रतिक्रिया मिश्रण में कुल DMSO प्रतिशत के तहत रखा जाना चाहिए 1% एंजाइम deactivating से बचने के लिए. इसके अतिरिक्त, क्योंकि NADPH एक छोटी शेल्फ जीवन है, एकाग्रता प्रतिक्रिया के लिए इसके अलावा करने से पहले स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ जाँच की जानी चाहिए. यह सुनिश्चित करता है कि NADPH के 1 बराबर हमेशा प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए जोड़ा जाता है.

एपोक्सिडेशन प्रतिक्रिया दिशानिर्देश

प्रतिक्रिया मिश्रण में गुब्बारे से वायुप्रवाह को बनाए रखना चाहिए ताकि प्रतिक्रिया को ऑक्सीजनयुक्त रखा जा सके क्योंकि एपॉक्सिडेशन के लिए ऑक्सीजन आवश्यक है। मिश्रण भी तेजी से हिलाया जाना चाहिए, के बाद से PUFAs पानी में बहुत घुलनशील नहीं हैं (DHA की घुलनशीलता प्रतिक्रिया बफर में $ 125 है). प्रतिक्रिया ऑक्सैलिक एसिड के साथ denature प्रोटीन के लिए बुझा दिया जाता है (के रूप में यह धातु chelates और cofactors को हटा) और एसिड DHA अपने तटस्थ रूप है, जो diethyl ईथर निष्कर्षण के लिए आवश्यक है रहता है. प्रतिक्रिया मिश्रण की शमन धीरे धीरे किया जाना चाहिए करने के लिए EDPs के एसिड उत्प्रेरक hydrolysis से बचने के.

EDP निष्कर्षण और शोधन दिशानिर्देश

ईथर कई कारणों के लिए निष्कर्षण विलायक के रूप में विशेष रूप से चुना गया था। डाइक्लोरोमेथेन समाधान से प्रोटीन को बाहर निकाल सकता है, जो निष्कर्षण को जटिल बनाता है। EtOAc glycerol अर्क (एंजाइम स्टॉक समाधान के साथ जोड़ा), जो दूर करने के लिए मुश्किल है और फ्लैश क्रोमैटोग्राफी के साथ हस्तक्षेप.

उनके मुक्त एसिड राज्य में EDP regioisomers आसानी से separable नहीं कर रहे हैं, यही वजह है कि regioisomers पहले फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी में एक चोटी में मिश्रित कर रहे हैं. एक बार जब वे मिथाइल एस्टर में परिवर्तित हो जाते हैं, तो रीजियोआइसोमर आसानी से पृथक हो जाते हैं। इसके अतिरिक्त, एस्टर आम तौर पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए इसी एसिड की तुलना में अधिक स्थिर हैं अगर एसिड फार्म तुरंत जरूरत नहीं है.

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व

हमारी विधि enantiopure EDPs प्राप्त करने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि प्रदान करता है, जो मौजूदा और वैकल्पिक तरीकों से अधिक कई फायदे हैं. सबसे पहले, DHA और अन्य PUFAs और उनके डेरिवेटिव के रासायनिक epoxidation न तो regioselective या enantioselective है, और जटिल मिश्रण अक्सर प्राप्त कर रहे हैं. एकाधिक फ़्लैश क्रोमैटोग्राफी कॉलम और तैयारी HPLC, chiral तैयारी HPLC सहित, इसलिए इन मिश्रण है, जो श्रम गहन कर रहे हैं और वांछित की केवल बहुत छोटी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं से enantiopure epoxy फैटी एसिड को शुद्ध करने के लिए आवश्यक हैं चयापचयों. कुल संश्लेषण भी epoxy फैटी एसिड का उत्पादन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, लेकिन यह कठोर है, समय लेने वाली, कई चरणों की आवश्यकता है, और एक कम समग्र उपज देता है, जबकि BM3 एंजाइम व्यक्त करने के लिए आसान है और शुद्ध, और epoxidation की एक छोटी अवधि के भीतर पूरा हो गया है समय. हमारी विधि भी लागत प्रभावी है: एक वाणिज्यिक स्रोत20 वर्तमान में प्रदान करता है 16,17- और 19,20-EDP (उनके racemates के रूप में) के लिए 528 USD /0.5 mg. 1 g NADPH के लिए भी खरीदा जा सकता है $500-800 USD, और दो सौ से अधिक बार की राशि का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 19,20- EDP (और लगभग पचास गुना की राशि 16,17-EDP) एक समान मूल्य के लिए व्यावसायिक रूप से की पेशकश की - और enantiopure रूपों में, जो वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं.

विधि की सीमाएं

इस एंजाइम के रूप में वरीयता से DHA के अंतिम डबल बांड epoxidizes, प्रमुख उत्पाद है 19,20-EDP (हालांकि 16,17-EDP भी उत्पादन किया है). इसलिए, वांछित हो सकता है कि अन्य DHA regioisomers (उदा., 13,14-EDP, 10,11-EDP) जंगली प्रकार BM3 के साथ एंजाइमी epoxidation द्वारा उत्पादित नहीं किया जा सकता है. इसके अलावा, के रूप में केवल SR-enantiomers BM3 द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, रुपये-enantiomers दुर्गम हैं, हालांकि हमारे पहले प्रकाशित रासायनिक व्युत्क्रम विधि14 उन्हें संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, प्रतिक्रिया बफर में lipophilic PUFAs की कम घुलनशीलता के कारण, बफर की बहुत बड़ी मात्रा में बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए आवश्यक होगा (ca. 500-1,000 मिलीग्राम) EDPs, जो संभावित निष्कर्षण समय लेने वाली या निषिद्ध कर सकता है.

विधि के अन्य अनुप्रयोगों

सुखद ढंग से, यह एंजाइमी एपॉक्सिडेशन प्रोटोकॉल EPA और AA पर भी लागू होता है (संबंधित संरचनाएं चित्र 5में दर्शाई जाती हैं)। सांद्रता, बफर, और प्रतिक्रिया सभी तीन फैटी एसिड के epoxidation के लिए आवश्यक समय ही है. EPA के लिए, जंगली प्रकार BM3 एंजाइम भी प्रयोग किया जाता है, और EEQ अंश EPA से प्राप्त (56% monoepoxide की उपज), के बाद esterification है $14:1 17,18-EEQ:14,15-EEQ. EDPs के लिए किए गए टिप्पणियों के समान, प्राप्त 17,18-EEQ अत्यधिक enantiopure है (gt; 99% 17 (एस), 18 (आर)-EEQ, चित्रा देखें 6) के रूप में चित्रा 3 कथा और सामग्री की तालिकादेखें). एन्टीओमर की पहचान पहले17की सूचना दी गई थी . ए.ए. के लिए, तथापि, F87V BM3 उत्परिवर्ती बजाय जंगली प्रकार BM3 के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ए.ए.21के लिए एक हाइड्रॉक्सीलेस है. अभिव्यक्ति और इस उत्परिवर्ती की शुद्धि भी ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, और epoxidation एक अनुरूप फैशन में किया जाता है. इस विधि के द्वारा, 14,15-EET एकमात्र regioisomer के रूप में प्राप्त किया जाता है. के रूप में 14,15-EET मुक्त एसिड epoxidation के बाद unreacted ए.ए. से अविभाज्य है, एस्टरीकरण आवश्यक है; 14,15-EET मिथाइल एस्टर ए.ए. से 52% उपज में प्राप्त किया जाता है। Chiral HPLC (देखें चित्र 3 कथा और सामग्री की तालिका) एसिड की अत्यधिक enantiopure इंगित करता है ([99%) 14(एस),15(आर)-EET (जैसा कि पहले बताया गया है)15. इन EPA और ए.ए. चयापचयों के लिए रासायनिक बदलाव इस प्रकार हैं: 17(एस),18 (आर)-EEQ मिथाइल एस्टर:1एच-एनएमआर (500 मेगाहर्ट्ज; सीडीसीएल3): $ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3.67 (s, 3 H), 2.96 (td, जे - 6.4, 4.2 हर्ट्ज, 1 एच), 2.90 (टीडी, जे ] 6.3, 4.2 हर्ट्ज, 1 एच), 2.85-2.79 (m, 6 H), 2.44-2.38 (m, 1 H), 2.32 (t, J ] 7.5 हर्ट्ज, 2 एच), 2.26-2.20 मीटर, एच , 2.11 (ज , जे $ 6.7 हर्ट्ज, 2 एच), 1.71 (क्विनेट, जे ] 7.4 हर्ट्ज, 2 एच), 1.66-1.50 (m, 2 H), 1.05 (t, J $ 7.5 हर्ट्ज, 3 एच); 14(एस),15(R )-EET मिथाइल एस्टर: 1 एच-एनएमआर (500 मेगाहर्ट्ज; सीडीसीएल3: 5.53-5.33 (m, 6 H), 3.67 (s, 3 एच), 2.95-2.92 (m, 2 एच), 2.81 (dt, J ] 17.8, 5.8 हर्ट्ज, 4 एच), 2.40 (dt, J ] 14.1, H), 2.32 (t, J $ 7.5 हर्ट्ज, 2 एच), 2.23 (dt, J ] 14.8, H , 2.11 (ज , जे $ 6.8 हर्ट्ज, 2 एच), 1.71 (क्विनेट, जे ] 7.4 हर्ट्ज, 2 एच), 1.56-1.41 (m, 4 H), 1.38-1.30 (m, 4 H), 0.90 (t, J ] 7.1 हर्ट्ज, 3 एच)।

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

इस काम R00 ES024806 (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान), DMS-1761320 (राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन) और मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय से स्टार्टअप धन द्वारा वित्त पोषित है. लेखकों को डॉ जून यांग (डेविस में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय) और ललिता Karchalla (Michigan राज्य विश्वविद्यालय) एंजाइमी प्रतिक्रिया के अनुकूलन के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, और डॉ टोनी Schilmiller (MSU मास स्पेक्ट्रोमेट्री और Metabolomics सुविधा) HRMS डेटा अधिग्रहण के साथ सहायता के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Bicarbonate Sigma 9830 NA
Ampicillin GoldBio A30125 NA
Anhydrous magnesium sulfate Fisher Scientific M65-3 NA
Anhydrous methanol Sigma-Aldrich 322515 NA
Anhydrous sodium sulfate Fisher Scientific S421-500 NA
Anhydrous toluene Sigma-Aldrich 244511 NA
Arachidonic Acid (AA) Nu-Chek Prep U-71A Air-sensitive. 
Diethyl Ether Sigma 296082 NA
DMSO (molecular biology grade) Sigma-Aldrich D8418 NA
Docosahexaenoic Acid (DHA) Nu-Chek Prep U-84A Air-sensitive. 
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Invitrogen 15576028 NA
Eicosapentaenoic Acid (EPA) Nu-Chek Prep  U-99A Air-sensitive. 
Ethyl acetate Sigma  34858 NA
Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes Fisher Scientific 145170203, 145154064, 5170200 Alternatively, conventional column chromatography can be used
Formic acid (HPLC Grade) J.T. Baker 0128-01 NA
Glycerol Sigma G7757 NA
Hexanes VWR BDH24575 NA
LB Broth Sigma L3022 NA
Lithium hydroxide Sigma-Aldrich 442410 NA
Magnesium chloride Fisher Scientific 2444-01 NA
Methanol (HPLC grade) Sigma-Aldrich 34860-41-R NA
NADPH Tetrasodium Salt Sigma-Aldrich 481973 Air-sensitive. 
Oxalic acid Sigma-Aldrich 194131 NA
pBS-BM3 transfected DH5α E. coli NA NA NA
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) Sigma P7626 Toxic!
Potassium Permanganate Sigma-Aldrich 223468 For TLC staining. 
Potassium phosphate dibasic Sigma 795496 NA
Potassium phosphate monobasic Sigma 795488 NA
Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) Fisher Scientific 17-0515-01 For anion exchange purification of enzyme
Sodium Chloride Sigma 71376 NA
Tetrahydrofuran, anhydrous Sigma-Aldrich 186562 NA
TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) Sigma-Aldrich 362832 Very toxic. 
Tris-HCl GoldBio T-400 NA
Also necessary:
Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2)  Buchi
C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) Agilent
Centrifuge capable of 10,000 x g
Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) Phenomenex
General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars.
HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector Shimadzu
Nanodrop 2000 Spectrophotometer  Thermo-Fisher Scientific
NMR NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz)
Rotary evaporator Buchi
Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer Cole-Parmer

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References

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रसायन विज्ञान अंक 148 एपॉक्सी पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड लिपिड एंजाइमी संश्लेषण enantioselective संश्लेषण ओमेगा -3 फैटी एसिड eicosanoids
डोकोसाएक्सेनोइक, ईकोसेपेन्टाइनोइक, और अराचिडोनिक एसिड के एपॉक्सिडाइज्ड मेटाबोलाइट्स का एंजाइमी संश्लेषण
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Woodman, J. W., Cinelli, M. A., Scharmen-Burgdolf, A., Lee, K. S. S. Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids. J. Vis. Exp. (148), e59770, doi:10.3791/59770 (2019).

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