Summary
Vi præsenterer en metode, der er nyttig til storstilet enzymatisk syntese og rensning af specifikke enantiomerer og regioisomerer af Epoxider af arachidonsyre (AA), docosahexaensyre (DHA) og eicosapentaensyre Acid (EPA) med brug af en bakteriel cytokrom P450-enzym (BM3).
Abstract
De epoxidiserede metabolitter af forskellige flerumættede fedtsyrer (PUFAs), såkaldte epoxy fedtsyrer, har en bred vifte af roller i menneskelig fysiologi. Disse metabolitter produceres endogent af cytokrom P450 klassen af enzymer. På grund af deres mangfoldige og potente biologiske virkninger, er der betydelig interesse i at studere disse metabolitter. Bestemmelse af disse metabolitters unikke roller i kroppen er en vanskelig opgave, da epoxy fedtsyrer først skal opnås i betydelige mængder og med høj renhed. Opnåelse af forbindelser fra naturlige kilder er ofte arbejdskraftintensive, og opløselig epoxid hydrolaser (SEH) hydrolyserer hurtigt metabolitterne. På den anden side, at opnå disse metabolitter via kemiske reaktioner er meget ineffektiv, på grund af vanskeligheden ved at opnå rene regioisomerer og enantiomerer, lave udbytter, og omfattende (og dyre) rensning. Her præsenterer vi en effektiv enzymatisk syntese af 19 (s), 20 (r)-og 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic syrer (EDPs) fra DHA via EPOXIDERING med BM3, et bakterielt CYP450-enzym isoleret oprindeligt fra Bacillus megaterium (som let udtrykkes i Escherichia coli). Karakterisering og bestemmelse af renhed udføres med nuklear magnetisk resonansspektroskopi (NMR), højtydende væskekromatografi (HPLC) og massespektrometri (MS). Denne procedure illustrerer fordelene ved enzymatisk syntese af PUFA epoxy metabolitter og gælder for epoxidering af andre fedtsyrer, herunder arachidonsyre (AA) og eicosapentaensyre Acid (EPA) til fremstilling af den analoge epoxyeicosatrienoic henholdsvis EETs og epoxyeicosatetraenoinsyre (EEQs).
Introduction
Som interesse i den rolle, som flerumættede fedtsyrer (især Omega-3 og omega-6 flerumættede fedtsyrer) spiller i menneskets biologi er vokset i de seneste år, forskere har taget notits af den brede vifte af tiltalende fordele, at deres metabolitter Udstille. Især epoxy fedtsyre metabolitter produceret af cytokrom P450 klasse af enzymer har været et stort fokuspunkt. F. eks. spiller mange PUFA Epoxider, herunder epoxyeicosatrienoic syrer (Eets), epoxydocosapentaenoinsyre (EDPs) og epoxyeicosatetraenoinsyre (eeqs), en afgørende rolle i reguleringen af blodtryk og inflammation på1,2 , 3 af , 4 af , 5. interessant, de specifikke enantiomerer og regioisomerer af AA og EPA Epoxider er kendt for at have varierende virkninger på vasokonstriktion6,7. Mens de fysiologiske virkninger af enantiomerer og regioisomerer af EETs og EEQs er dokumenteret, vides der kun lidt om virkningen af de analoge epoxydocosapentaenoinsyre (EDPs) dannet af DHA. Udbredt brug af fiskeolie8, som er rig på både EPA og DHA, har også vakt interesse i EDPs9. Fordelene ved disse kosttilskud menes at være delvis på grund af downstream DHA metabolitter (16, 17-EDP og 19, 20-EDP er den mest rigelige), fordi in vivo niveauer af EDPs koordinerer meget godt med mængden af DHA i kosten10, 11. der er
Undersøgelse af mekanismerne og målene for disse epoxy fedtsyrer ved metabolomics, kemisk biologi og andre metoder har vist sig udfordrende, til dels fordi de findes som blandinger af regio-og stereo-isomerer, og en metode til at opnå rene mængder af der er behov for enantiomerer og regioisomerer. Konventionelle midler til kemisk syntese af disse forbindelser har vist sig ineffektive. Anvendelse af peroxysyrer som meta-chloroperoxybensyre til epoxidering har mange ulemper, især manglen på epoxidation selektivitet, som nødvendiggør dyre og omhyggelige rensning af individuelle regioisomerer og enantiomerer. Total syntese af DHA og EPA metabolitter er muligt, men også lider af ulemper, der gør det upraktisk for storstilet syntese såsom høje omkostninger og lave udbytter12,13. Effektiv samlet produktion kan opnås med enzymatisk syntese, da enzymatiske reaktioner er Regio-og stereo selektive14. Undersøgelser viser, at enzymatisk epoxidering af AA og EPA (med BM3) er både regioselective og enantioselektiv15,16,17,18, men denne procedure er ikke blevet testet med DHA, eller på en stor Skala. Det overordnede mål med vores metode var at opskalere og optimere denne kemo enzymatiske epoxidering for hurtigt at producere betydelige mængder af rene epoxy fedtsyrer som deres individuelle enantiomerer. Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, har forskerne adgang til en enkel og omkostningseffektiv strategi for syntese af EDPs og andre PUFA epoxy metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Se alle relevante sikkerhedsdatablade (MSDS), før du bruger de anførte kemikalier.
1. udtryk for vildtype BM3
- Inokulere pBS-BM3 transficeret DH5α E. coli (en generøs donation fra Dr. F. Ann Walker) i 5 ml steril lb bouillon med 0,5 mg ampicillin tilsættes til en 20 ml kulturrør.
- Cellekulturen inkuleeres i en shaker ved 37 °C i 24 timer ved 200 rpm. Tilsæt den nattende start kultur (5 mL) og 100 mg ampicillin til 1 L steril LB-bouillon i en Fernbach-eller Erlenmeyer-kolbe. Ryst ved 37 °C i 6 timer ved 200 rpm, derefter ved 30 °C i 18 timer ved 200 rpm.
- Cellekulturen opsamles og centrifugeres ved 4 °C i 10 minutter ved 1.000 x g. Supernatanten kasseres, og celle pillen opbevares ved-78 °C indtil enzym oprensning.
Bemærk: supernatanten kan enten blive kemisk steriliseret ved behandling med blegemiddel eller steriliseret ved hjælp af autoklaven og derefter hældes ned i afløbet.
2. rensning af BM3.
-
Celle lysis
- Optø celle pellet på is og resuspension i 40 mL iskold (4 °C) solubiliserings buffer (10 mM Tris, 0,01 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
Forsigtig: PMSF er giftig ved kontakt. - Mens på is, sonicere cellerne i 1 min med en ultrasonisk homogenisator (udgangseffekt indstilling 10, afgift 100%), efterfulgt af en 1 minut pause på is for at lysere cellerne. Gentag denne procedure 6 gange. Cellelysatet centrifugeres ved 4 °C i 30 minutter ved 11.000 x g til pellet cellerester.
- Optø celle pellet på is og resuspension i 40 mL iskold (4 °C) solubiliserings buffer (10 mM Tris, 0,01 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
-
Affinitet kromatografi
- Forbered en stærk anion bytnings kromatografikolonne (Se tabel over materialer; diameter: 2,8 cm x 6 cm, kolonne volumen: 37 ml) ved vask med 5 kolonne VOLUMENER (CV) af buffer a (10 mm Tris, pH 7,8) ved 4 °c.
- Tilsæt celle lysaterne til ækvilibreret kolonne og vask kolonnen med 3 CV af kold buffer A. eluere BM3 ved at vaske kolonnen med kold buffer B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Saml den rødbrune elueringsvæske fraktion. Hvis proteinet ikke anvendes med det samme, blandes det med en tilsvarende mængde glycerol og flash fryse med flydende nitrogen. Opbevar den frosne opløsning ved-78 °C.
3. epoxidering af DHA ved BM3
- Reaktionen forberedes ved tilsætning af 0,308 g (0,940 mmol) DHA i 18,8 mL dimethylsulfoxid (DMSO) til 2 L af omrørings reaktions bufferen (0,12 M kaliumphosphat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) sammen med 20 Nm af det OPTØEDE BM3 enzym. Enzym koncentrationen kan bestemmes af carbonmonoxid/dithionit spektral assay-metoden19.
- Mens opløsningen omrøring, begynde reaktionen ved at tilføje 1 ækvivalent af NADPH (nicotinamid adenin dinucleotid fosfat reduceret, tetranatriumethylendiamintetraacetat salt, 0,808 g, 0,940 mmol) opløst i reaktionsbuffer. Reaktionen omrøres i 30 minutter, mens der boblende luft gennem reaktionsblandingen med en luftfyldt ballon, der er fastgjort til en sprøjte og nål.
- Ved hjælp af et spektrofotometer (Se tabel over materialer) kontrolleres reaktions blandingens absorbans ved 340 nm for at bestemme, om NADPH er opbrugt. Hvis der ikke er nogen tilbageværende absorbans, der indikerer indtagelse af NADPH, er reaktionen fuldført.
Bemærk: reaktionen er typisk færdig efter 30 minutter. - Reaktionsblandingen slukkes ved langsomt at tilsætte 1 M oxalsyre, dropwise, indtil opløsningens pH-værdi når 4.
4. udvinding af EDPs
- Den afkørede bufferopløsning ekstrahere med 2 L diethylether (vandfri, peroxid frit) 3 gange. Etherlaget (6 L) opsamles og tørres med vandfri magnesiumsulfat (MgSO4).
- MgSO4 filtreres fra opløsningen, og det tørrede etherlag koncentreres på en rotationsfordamper for at give den rå EDP-rest.
- Remanensen renses ved Flash kolonne kromatografi (en 40 g silicagel er tilstrækkelig). Start med 10% ethylacetat (EtOAc) i hexaner og rampe op til 60% EtOAc i hexaner over 22 min.
Bemærk: der opnås og opsamles tre hovedtoppe, som eluterer i rækkefølgen 1. ureageret DHA; 2. blanding af EDP-isomerer og 3. di-epoxid (normalt over oxidationsmidler (Se figur 1)). - Kombiner brøkdele og koncentrer dem på rotationsfordamper. Fra dette eksempel, 0,074 g, (24%) af ureageret DHA, 0,151 g (47%) af EDP-isomerer og 0,076 g, (22%) af di-epoxid blev opnået.
5. esterificering af EDPs, adskillelse af 16 (s), 17 (r)-og 19 (s), 20 (R)-EDP og forsæbning af estere
Forsigtig: Trimethylsilyldiazomethan (TMS-diazomethan) er meget giftigt ved både kontakt og indånding. Brug kun i en stinkhætte med det rigtige personlige værnemidler.
- Epoxiderne fortyndes (0,151 g, 0,435 mmol) i en rundbundet kolbe eller et lille hætteglas med 2 mL vandfri methanol (MeOH) og 3 mL vandfri toluen, tilsæt en røre-bar og tilsæt TMS-diazomethan (1,2 molære ækvivalenter eller 0,26 mL af en 2 M opløsning i hexaner) under argon.
- Vent 10 minutter, og tilsæt yderligere TMS-diazomethan (0,050 mL), indtil der er en lysegul farve tilbage.
- Efter 30 minutter skal blandingen forsigtigt koncentreres ved hjælp af rotationsfordamper, og Remanensen skal renses med blitz kolonne kromatografi. Elute med 4% EtOAc i hexaner (med en 40 g silicagel-kolonne eller cylinderampul) i 22 min. I dette eksempel er 19, 20-EDP methylester (0,116 g, 74%) og 16, 17-EDP methylester (0,029 g, 19%), blev fremstillet som klare olier (samlet udbytte, 93%).
- De fraktioner, der indeholder de rensede EDP-methylester-regioisomerer, opsamles. 19 (s), 20 (R)-EDP-methylester eluerer først, efterfulgt af 16 (s), 17 (R)-EDP-methylester.
- Hvis der stadig er blandede fraktioner (der indeholder begge isomerer, kan de vurderes ved tyndtlagskromatografi (TLC) i 8:1 hexan/EtOAc og farves med kaliumpermanganat (KMnO4)), re-kromatografere dem med samme opløsningsmiddel som før.
- Koncentrer de fraktioner, der indeholder de enkelte regioisomerer.
Bemærk: på dette tidspunkt, identitet og renhed kan vurderes af NMR (ved hjælp af CDCl3 som opløsningsmiddel; Se legenden for figur 2). - For at omdanne individuelle EDP-methylester-regioisomerer til deres syre former, fortyndes EDP-ester i THF: Water (ca. 0,7 mL/0,1 mmol ester). Tilsæt 2 M vandig LiOH (3 molære ækvivalenter) og rør natten over.
Bemærk: fuldstændigheden af reaktionen kan vurderes af TLC ved hjælp af 3:1 hexanes/EtOAc, farvning med KMnO4; produktet har en opbevarings faktor på ~ 0,3. - Reaktionen dæmps langsomt med myresyre, indtil blandingens pH-værdi når 3-4. Tilsæt vand og ethylacetat (1-2 mL/0.100 mmol ester), og Adskil lagene. Udpak vandlaget med EtOAc (3 x 5 mL), vask med mættet saltlage (NaCl-opløsning), og tør EtOAc-laget over vandfri natriumsulfat (na2so4).
- Koncentrer ethylacetat opløsningen ved hjælp af en rotationsfordamper, tilsæt hexaner (10 mL), og Koncentrer dig igen. Gentag to gange for azeotropisk fjernelse af rest myresyre. Resterne renses ved hjælp af blitz kolonne kromatografi, der eluterer med 10-30% EtOAc over 15 min.
- Koncentrer de ønskede fraktioner og tør i vakuum for at give den rensede syre.
Bemærk: på dette stadium kan enantiomerisk renhed vurderes (ved chiral HPLC, se legender for figur 3 - figur 4 for kolonne og betingelser). Kemisk renhed kan vurderes ved C18 (achiral) HPLC (Se tabel over materialer og reference 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flash kolonne kromatogrammet (udført ved hjælp af et automatiseret flash rensningssystem som beskrevet nedenfor) fremkommet ved rensning af den rå blanding fra enzymatisk epoxidering er vist i figur 1. Efter esterificering og adskillelse af regioisomererne blev der opnået rene 16 (s), 17 (r)-EDP og 19 (s), 20 (r)-EDP-methylestere. Typisk, de er til stede i en omtrentlig 1:4 til 1:5 ratio, med det vigtigste produkt er 19 (S), 20 (R)-EDP. Der opnås ingen andre EDP-regioisomerer (f. eks. 13, 14 eller 10, 11-EDP). De 1H-NMR spektre af 16 (s), 17 (r)-EDP (figur 2a) og 19 (s), 20 (r)-EDP (figur 2b) methylestere sammen med deres strukturer er vist nedenfor, hvilket indikerer den høje renhed af disse forbindelser C18 (achiral) HPLC af syre formerne også angivet renheder > 98%. Deres identitet blev yderligere bekræftet ved højopløsnings massespektroskopi (både af syre-og ester formerne), som gav masse/Charge-nøgletal og fragmenterings mønstre i overensstemmelse med den identificerede EDPs. Enantiomerisk renhed blev bestemt ved anvendelse af chiral HPLC i forhold til den tilsynsførendes autentiske enantiopure og blandede standarder (i deres syre form, figur 3a og figur 4a). Som det kan ses i figur 3B og figur 4b, er begge EDPs fremstillet ved enzymatisk epoxidering meget enantiopure efter forsæbning (> 99% enantiomer). Identiteten af disse enantiomerer blev tidligere rapporteret at være 16 (s), 17 (r)-og 19 (s), 20 (r)-EDP18.
Figur 1 . Kromatogram fra rensning af rå blanding opnået ved enzymatisk epoxidering af DHA (sammen med relevante strukturer). Den midterste top (monoepoxid) indeholder den ønskede EDPs. Rensning blev udført ved hjælp af et automatiseret flash rensningssystem (Se tabel over materialer). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Eksempel 1H-NMR spektre af Pure 16 (s), 17 (R)-EDP methyl ester (2a) og 19 (s), 20 (r)-EDP methylester (2b). Spectra blev indspillet ved 500 MHz i CDCl3 (opløsningsmiddel er synligt ved 7,26 ppm og restvand ved 1,6 ppm). De kemiske forskydninger er som følger: 16 (S), 17 (R)-EDP methylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.57-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 h), 2.99-2.95 (m, 2 h), 2.87-2.83 (m, 6 h), 2.47-2.37 (m, 6 h), 2.29-2.21 (m, 2 h), 2.11-2.05 (m, 2 h), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, 3 h); 19 (S), 20 (R)-EDP-methylester: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.54-5.35 (m, 10 h), 3,68 (s, 3 H), 2,97 (td, j = 6,4, 4,2 hz, 1 h), 2,91 (td, J = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2.85-2.82 (m, 8 h), 2.44-2.36 (m, 5 h), 2.27-2.21 (m, 1 h), 1,65-1.51 (m, 3 h), 1,06 (t, J = 7,5 Hz , 3 H). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Chiral HPLC, der indikerer enantiopurity af 16, 17-EDP (syre form) produceret af BM3. Figur 3a viser et chiral HPLC-kromatogram af "racemisk" 16, 17-EDP (en kunstig blanding af autentiske standarder af begge enantiomerer14), mens figur 3b viser et chiralt HPLC-kromatogram af Enantiopure 16 (S), 17 (R )-EDP fremstillet ved epoxidering af DHA med BM3, vurderet som > 99% S, R isomer. Kolonnen er cellulosebaseret (se tabel over materialer, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 1.000 Å) eluering med isokratisk 45% 50 mM ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) i methanol (30 min) med en prøvekoncentration på 0,5 mm og en strømningshastighed på 1 ml/min. venligst Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Chiral HPLC indikerer enantiopurity af 19, 20-EDP (syre form) produceret af BM3. Figur 4a viser et chiral HPLC-kromatogram af "racemisk" 19, 20-EDP (en kunstig blanding af autentiske standarder af begge enantiomerer14), mens figur 4b viser et chiral HPLC-kromatogram af Enantiopure 19 (S), 20 (R)-EDP produceret ved epoxidering af DHA med BM3, vurderet som > 99% S,R isomer (metode som beskrevet for figur 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Samlet enzymatisk epoxidation reaktionsordning og relevante strukturer af AA, EPA, EETs og EEQs produceret ved denne metode Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Chiral HPLC, der indikerer enantiopurity af 17, 18-EEQ (syre form) produceret af BM3. Figur 6a viser et CHIRAL HPLC-kromatogram af "racemisk" 17, 18-EEQ (en kunstig blanding af autentiske standarder af begge enantiomerer14), hvorimod figur 6b viser et chiral HPLC-kromatogram af Enantiopure 17 (S), 18 (R )-EEQ fremstillet ved epoxidering af EPA med BM3, vurderet som > 99% S,R isomer (metode som beskrevet for figur 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en driftsmæssigt enkel og omkostningseffektiv metode til at forberede de to mest rigelige epoxy metabolitter af DHA-19, 20 og 16, 17-EDP. Disse epoxy fedtsyrer kan tilberedes i meget enantiopure (som deres S, R-isomerer) form ved hjælp af Wild-type BM3 enzym. Flere kritiske punkter, som kan anvendes til fejlfinding, og udvidelse af vores metode til at forberede enantiopure epoxy metabolitter af AA og EPA, er beskrevet nedenfor.
BM3 retningslinjer for opbevaring
Opbevaring af det rensede BM3 enzym er muligt ved at blande protein opløsningen med samme mængde glycerol og flash frysning med flydende nitrogen før opbevaring i a-78 °C fryser. Når enzymet er frosset, kan det opbevares i op til et år. Enzymet kan kun optøet én gang, skal optøet på is, og kan kun forblive på is i 4 timer. frysning igen, og tillader enzymet at tø uden et isbad vil deaktivere enzymet.
Retningslinjer for kemikalie oplagring
Mange af de forbindelser, der kræves til proceduren er luft-følsomme. Disse omfatter DHA og andre PUFAs, EDPs og andre epoxy metabolitter, og NADPH. For at forhindre peroxidering (og andre oxidativ processer) af disse forbindelser, skyl altid beholderne, hvor de opbevares med argon eller nitrogen og opbevares ved-78 °c.
En anden vigtig bemærkning er den løsning, hvor DHA er lagret. Selv om DHA ikke er særlig stabil i DMSO, er BM3 uforenelig med ethanol og methanol, så DMSO skal anvendes. For at modvirke den lave stabilitet skal DHA-blandingen tilberedes frisk samme dag som epoxidering. Den totale DMSO-procentdel i reaktionsblandingen skal holdes under 1% for at undgå at deaktivere enzymet. Da NADPH desuden har en kort holdbarhed, skal koncentrationen kontrolleres med Spektrofotometer før tilsætning til reaktionen. Dette sikrer, at 1 ækvivalent af NADPH altid tilsættes til reaktionsblandingen.
Retningslinjer for epoxidation-reaktion
Luftstrømmen fra ballonen til reaktionsblandingen skal opretholdes for at holde reaktionen iltet, da ilt er nødvendig for epoxidering. Blandingen skal også omrøres hurtigt, da PUFAs ikke er meget opløseligt i vand (opløseligheden af DHA er ≤ 125 μM i reaktions bufferen). Reaktionen er standset med oxalsyre til denaturering protein (som det chelater metal og fjerner cofactors) og syre holder DHA sin neutrale form, som er nødvendig for diethylether ekstraktion. Dæmpningen af reaktionsblandingen skal ske langsomt for at undgå syre katalyseret hydrolyse af EDPs.
Retningslinjer for udvinding og rensning af EDP
Ether blev valgt specifikt som ekstraktionsmidlet af flere årsager. Dichlormethan kan fremprovokere proteinet ud af opløsningen, hvilket komplicerer ekstraktionen. EtOAc udvinder glycerol (tilsat enzym stamopløsningen), som er svær at fjerne og forstyrrer flash kromatografien.
EDP-regioisomerer i deres frie syre tilstand kan ikke let adskilles, hvilket er grunden til, at regioisomerne blandes i en enkelt top i den første flash kolonne kromatografi. Når de er konverteret til methylestere, de regioisomerer let kan adskilles. Derudover er estere generelt mere stabile end de tilsvarende syrer til langtidsopbevaring, hvis syreformen ikke er nødvendig med det samme.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
Vores metode giver en enkel og effektiv metode til at opnå enantiopure EDPs, som har mange fordele i forhold til eksisterende og alternative metoder. For det første er kemisk epoxidering af DHA og andre PUFAs og derivater heraf hverken regioselective eller enantioselektiv, og komplicerede blandinger opnås ofte. Flere flash kromatografi kolonner og præparativ HPLC, herunder chiral præparativ HPLC, er derfor nødvendige for at rense enantiopure epoxy fedtsyrer fra disse blandinger, som er arbejdskraftintensive og kun kan producere meget små mængder af den ønskede Metabolitter. Total syntese kan også anvendes til at producere epoxy fedtsyrer, men det er stringent, tidskrævende, kræver flere trin, og giver et lavt samlet udbytte, mens BM3 enzymet er let at udtrykke og rense, og epoxidering er komplet inden for en kort periode af Tid. Vores metode er også omkostningseffektiv: en kommerciel kilde20 tilbyder i øjeblikket 16, 17-og 19, 20-EDP (som deres racemates) for 528 usd/0,5 mg. 1 g NADPH kan også købes for ~ 500-800 USD, og kan bruges til at producere over 200 gange mængden af 19, 20- EDP (og ca. 50 gange den mængde på 16, 17-EDP) tilbød kommercielt til en lignende pris-og i enantiopure former, som i øjeblikket ikke er kommercielt tilgængelige.
Metodens begrænsninger
Da dette enzym fortrinsvis epoxidizes den sidste dobbelte obligation af DHA, er det vigtigste produkt 19, 20-EDP (selv om 16, 17-EDP er også produceret). Derfor kan andre DHA-regioisomerer, der kan være ønskelige (f. eks. 13, 14-EDP, 10, 11-EDP), ikke fremstilles ved enzymatisk epoxidering med vildtype-BM3. Også, da kun SR-enantiomerer er produceret af BM3, RS-enantiomerer er utilgængelige, selv om vores tidligere offentliggjorte kemiske inversion metode14 kan bruges til at syntetisere dem. På grund af den lave Opløselighed af lipofile PUFAs i reaktions bufferen vil der desuden være behov for meget store buffer mængder til storstilet produktion (ca. 500-1.000 mg) af EDPs, hvilket potentielt kan gøre udvinding tidskrævende eller prohibitiv.
Andre anvendelser af metoden
Denne enzymatiske epoxidation-protokol gælder også for EPA og AA (relevante strukturer er vist i figur 5). De koncentrationer, buffer og reaktionstid, der kræves ved epoxidering af alle tre fedtsyrer, er den samme. For EPA, Wild-type BM3 enzym anvendes også, og EEQ fraktion opnået fra EPA (56% udbytte af monoepoxid), efter esterificering er ~ 14:1 17, 18-EEQ: 14, 15-EEQ. I lighed med bemærkningerne til EDPs er de 17, 18-EEQ, der fremstilles, stærkt enantiopure (> 99% 17 (S), 18 (R)-EEQ, se figur 6), vurderet ved chiral HPLC (Se figur 3 -legenden og materiale oversigten). Identiteten af enantiomerer blev tidligere rapporteret17. For AA skal F87V BM3 mutant dog anvendes i stedet for som vildtype BM3 er en hydroxylase til AA21. Ekspression og rensning af denne mutant bruger også ovenstående protokol, og epoxidering udføres på en tilsvarende måde. Ved denne metode opnås 14, 15-EET som den eneste regioisomer. Da 14, 15-EET fri syre er uadskilleligt fra ureageret AA efter epoxidering, er esterificering nødvendig; 14, 15-EET methylester fremstilles i 52% udbytte fra AA. Chiral HPLC (Se figur 3 legende og materiale oversigt) af syren indikerer højenantiopure (> 99%) 14 (S), 15 (R)-eet (som tidligere rapporteret)15. De kemiske forskydninger for disse EPA-og AA-metabolitter er som følger: 17 (S), 18 (R)-EEQ methylester:1t-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3,67 (s, 3 h), 2,96 (TD, j = 6,4, 4,2 Hz, 1 h), 2,90 (td, j = 6,3, 4,2 Hz, 1 h), 2.85-2.79 (m, 6 h), 2.44-2.38 (m, 1 h), 2,32 (t, J = 7,5 Hz, 2 h), 2.26-2.20 (m, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,7 Hz, 2 h), 1,71 (kvintet, j = 7,4 Hz, 2 h), 1,66-1.50 (m, 2 h), 1,05 (t, J = 7,5 Hz, 3 h); 14 (S), 15 (R)-eet methylester: 1 af H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3,67 (s, 3 h), 2.95-2.92 (m, 2 h), 2,81 (DT, j = 17,8, 5,8 Hz, 4 h), 2,40 (dt, j = 14,1, 6,8 hz, 1 h), 2,32 (t, j = 7,5 Hz, 2 h), 2,23 (DT, j = 14,1, 6,8 Hz, 1 h) , 2,11 (q, j = 6,8 Hz, 2 h), 1,71 (kvintet, j = 7,4 Hz, 2 h), 1.56-1.41 (m, 4 h), 1.38-1.30 (m, 4 h), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3 H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af r00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) og opstart midler fra Michigan State University. Forfatterne ønsker at takke Dr. jun Yang (University of California at Davis) og Lalitha Karchalla (Michigan State University) for hjælp med optimering af den enzymatiske reaktion, og Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry og metabolomics Facility) for at få hjælp til indsamling af HRMS-data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
