Summary
يسمح التصوير البصري عبر الجمجمة بالتصوير الواسع النطاق لنقل السوائل الدماغية الشوكية في قشرة الفئران الحية من خلال جمجمة سليمة.
Abstract
وقد تم دراسة تدفق السائل الدماغي الشوكي (CSF) في القوارض إلى حد كبير باستخدام القياس الكمي الجسم يُذكر. وقد مكنت تقنيات مثل التصوير المجهري باثنين من الفوتون اتّصال بالرنين المغناطيسي (MRI) في التحديد الكمي للسير في الجسم الحي لتدفق الـ CSF، ولكنها محدودة بانخفاض أحجام التصوير وانخفاض الاستبانة المكانية، على التوالي. وقد وجدت الأعمال الأخيرة أن CSF يدخل parenchyma الدماغ من خلال شبكة من المساحات المحيطة بالأوعية الدموية المحيطة الشرايين pial واختراق قشرة القوارض. هذا الدخول في الأوعية الدموية من CSF هو المحرك الرئيسي للنظام اللمفي، وهو مسار متورط في إزالة solutes الأيضية السامة (على سبيل المثال، الأميلويد بيتا). هنا، نقوم بتوضيح تقنية التصوير العيانية الجديدة التي تسمح في الوقت الحقيقي، والتصوير التنظيري من تتبع CSF الفلورسنت من خلال الجمجمة سليمة من الفئران الحية. هذه الطريقة طفيفة التوغل تسهل العديد من التصاميم التجريبية وتمكن من اختبار واحد أو متكرر لديناميات CSF. تحتوي النطاقات الكبيرة على دقة مكانية وزمنية عالية، كما تسمح العملاقة الكبيرة ومسافة العمل بالتصوير أثناء أداء المهام على الأجهزة السلوكية. وقد تم التحقق من صحة هذا النهج التصوير باستخدام التصوير بالفوتونوتين وقياسات الفلورة التي تم الحصول عليها من هذه التقنية ترتبط ارتباطا ً قوياً بالفلورة في الجسم الحي السابق والتحديد الكمي للتتبعات التي تحمل علامة راديوية. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف كيف يمكن استخدام التصوير العياني عبر الجمجمة لتقييم النقل اللمفي في الفئران الحية، مما يوفر بديلاً يسهل الوصول إليه لطرائق التصوير الأكثر تكلفة.
Introduction
السائل الدماغي الشوكي (CSF) يستحم الدماغ والحبل الشوكي ويشارك في الحفاظ على التوازن، وتوفير المواد الغذائية،وتنظيم الضغط داخل الجمجمة 1. يدخل CSF في الفضاء تحت العنكبوتية الدماغ من خلال شبكة من المساحات المحيطة بالأوعية الدموية (PVS) المحيطة الشرايين القشرية ثم يتدفق على طول اختراق arterioles2. مرة واحدة في parenchyma، وCSF التبادلات مع السائل الخلالي (ISF)، تحمل الأيض الضارة مثل الأميلويد بيتا (Aβ) والبروتين تاو المجاميع من الدماغ من خلال انخفاض مقاومة المسالك المادة البيضاء والمساحات perivenous2،3 . يعتمد هذا المسار على قنوات aquaporin-4 (AQP4) الفلكية، وبالتالي أطلق عليه نظام اللمفية الغلية (اللمفوتيك)4. يتم في نهاية المطاف تطهير النفايات من neuropil من CSF-ISF من خلال الأوعية اللمفاوية بالقربمن الأعصاب القحفية وفي السحايا نحو العقد الليمفاوية عنق الرحم 5. وقد تورط فشل هذا النظام في العديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر6،7، وإصابات الدماغ الصادمة3، والسكتة الدماغية الإقفارية والنزفية8.
يمكن تصور نقل CSF عن طريق غرس التتبع في التريج (CM)9و10 والدراسات اللمفية في الماضي استخدمت أساسا اثنين من الفوتون المجهري4،11،12، 13، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)14،15،16،17، وتصوير الجسم الحي السابق3،6،11، 18 لتقييم حركية التتبع. اثنين من الفوتون المجهري هو وسيلة مناسبة للتصوير المفصل للتتبع CSF في PVSs وparenchyma بسبب الدقة المكانية العالية، ومع ذلك، لديها مجال ضيق من الرؤية ويتطلب نافذة الجمجمة الغازية أو ترقق الجمجمة. التصوير الجسم الحي السابق، جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية، تمكن من تحليلات متعددة المستويات تتراوح بين خلايا واحدة تصل إلى الدماغ كله19. ومع ذلك، فإن عملية تثبيت التسريب المطلوبة لمراقبة أنسجة ما بعد الوفاة تنتج تغييرات عميقة في اتجاه تدفق CSF وينهار PVS، مما يغير بشكل كبير توزيع وموقع التتبع12. وأخيرا، في حين أن التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن تتبع تدفق CSF في جميع أنحاء المورين كامل والدماغ البشري، فإنه يفتقر إلى الدقة المكانية والزمنية للتدفق حول الأوعية الدموية.
تقنية جديدة، التصوير العياني عبر الجمجمة، يحل بعض هذه القيود عن طريق تمكين التصوير واسعة المجال من نقل CSF حول الأوعية الدموية في القشرة الظهرية بأكملها من الفئران الحية. ويتم هذا النوع من التصوير مع ماكروسكوب epifluorescent باستخدام مكعب فلتر متعدد النطاقات، ومصدر ضوء LED قابل للضبط، وكاميرا CMOS عالية الكفاءة10. هذه الماكياج قادرة على حل PVSs تصل إلى 1-2 ملم تحت سطح الجمجمة، ويمكن الكشف عن الفلوروفوريصلات تصل إلى 5-6 ملم تحت سطح القشرية مع ترك الجمجمة سليمة تماما10. المرشحات متعددة النطاقات والمصابيح التي يمكن أن تصليق بسرعة الطول الموجي الإثارة تمكين استخدام الفلوروفورمتعددة مما يسمح CSF أن توصف مع التتبع من مختلف الأوزان الجزيئية والخصائص الكيميائية في نفس التجربة.
يتطلب هذا الإجراء إجراء جراحة بسيطة وطفيفة التوغل لفضح الجمجمة ووضع لوحة رأس خفيفة الوزن لتثبيت الرأس أثناء جلسة التصوير. يمكن تسليم التتبع اتّصال إلى CM دون حفر في الجمجمة أواختراق الأنسجة القشرية مع الماصات أو القنانية 9،20. كل من قنية CM ولوحات الرأس تبقى مستقرة لعدة أيام إلى أسابيع وتسهيل التصاميم التجريبية أكثر تعقيدا بالمقارنة مع التصور نقطة النهاية الكلاسيكية. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام التصوير العياني عبر الجمجمة لدراسة وظيفة النظام اللمفاوي بعد الحقن الحاد أو المزمن لمتتبع CSF الفلورسنت في سم الفئران مخدر / النوم أو مستيقظا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجنة الجامعية للموارد الحيوانية (UCAR، البروتوكول رقم 2011-023) في جامعة روتشستر وأجريت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. إعداد cisterna ماجنا قنية، لوحة الرأس، وحامل الرأس
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية ولوحات الرأس قبل الجراحة.
ملاحظة: يتم تسليم تتبع الفلورسنت مباشرة إلى CSF عن طريق تغنالة الصهريج. للحصول على تعليمات مفصلة حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى Xavier وآخرون9. - باختصار، باستخدام سائق إبرة، وكسر غيض من إبرة 30G × 12.7 ملم (1/2 بوصة)، 3/4 من الطريق إلى أسفل، ووضع نهاية حادة من الإبرة في نهاية واحدة من البولي ايثيلين 10 (PE10) أنابيب (حوالي 45 سم طويلة). تأكد من أن شطبة فقط هو جاحظ للخروج من الحدود من الأنابيب PE10.
- كسر 1/4 من نهاية مجدول آخر إبرة 30G ووضع نهاية حادة من الإبرة المتبقية في الطرف الآخر من الأنابيب PE10، مع البلاستيك Luer قفل لا تزال تعلق.
- ملء حقنة زجاجية 100 درجة مئوية مع معقمة، CSF الاصطناعية (aCSF: 126 مل كلان،2.5 مليون متر قدم ككل، 1.25 مليون متر نسمة 2 PO4،2 MM MgSO4،2 MM CaCl2،10 مل الجلوكوز، و 26 مل NaHCO3).
- إرفاق الحقنة إلى نهاية الخط وملء مع aCSF حتى تصل إلى غيض من إبرة مجدول. من المهم أن يتم ملء المحاقن مع aCSF وليس الهواء، كما عمود الهواء هو أكثر عرضة لأحجام التسريب المتغيرة.
- بالنسبة للتجارب المزمنة، اترك الخط المليء بـ aCSF وتخطي الخطوة 1.7.
- بالنسبة للتجارب الحادة، ضع الحقنة على مضخة ضخ واسحب حوالي 5 مم من الهواء، مما سيمنع الخلط. بعد ذلك، سحب الحجم الإجمالي للتتبع (التتبع) المطلوب للتجربة (20٪ إضافية ينصح بسبب فقدان الفضاء الميت).
ملاحظة: يجب أن تكون الأنابيب PE10 طويلة بما فيه الكفاية بحيث فقاعة الهواء لا يدخل الكفة البلاستيكية من حقنة الزجاج عند تحميل التتبع. لتجربة نموذجية، يستخدم البروتوكول 10 ميكرولتر من الزلال المصل البقري المترافق مع Alexa Fluor 647 (BSA-647) المخففة في aCSF بنسبة 0.5٪. - تأكد من أن لوحة الرأس تناسبها مع حامل الرأس وأنه هو الحجم المناسب للماوس المستخدمة. علامات تشريحية لضمان هذا هي: الحدود العليا للنافذة محاذاة مع خط بين العين والحدود الخلفية يسقط rostral إلى قمة القذالي.
ملاحظة: لوحات الرأس الفولاذ المقاوم للصدأ يمكن تعقيمها وإعادة استخدامها. يمكن إزالة معظم خلائط السيانوكريلات مع محلول الأسيتون.
2. العمليات الجراحية
- وزن والتخدير الماوس (مثل الكيتامين / إكسلازين؛ 100 ملغ / كغ الكيتامين، 10 ملغ / كغ xylazine؛ i.p.).
- بمجرد أن لا يستجيب الماوس لقرصة اصبع القدم، يبلل الرقبة والرأس بالماء المعقم والحلاقة باستخدام كليبرز. بمجرد حلق المنطقة، امسح المنطقة بمسحة كحول ية مرة أخرى لإزالة أي شعر متبق.
ملاحظة: ترطيب الفراء قبل قص يقلل بشكل كبير من كمية الشعر في نافذة التصوير بعد الشق. - ضع الماوس في إطار مجسم على قمة لوحة يتم التحكم في درجة حرارتها وتطبيق مرهم العيون البترولي على عيون الماوس لضمان عدم جفافها.
- تنظيف الجلد المعرض ة مع مسحة الكلورهيكسيدين. بعد دقيقتين، قم بإزالة الكلورهيكسيدين مع مسح الكحول. وأخيرا، تطبيق محلول اليود التي يمكن أن تترك لتجف.
- حقن التسكين تحت الجلد (0.25٪ Bupivacaine حمض الهيدروكلوريك) إلى الجزء العلوي من الجمجمة والرقبة.
- بدءا من جزء من الرقبة التي تغطي قمة القذالي، وجعل قطع خط الوسط في الجلد فوق ومواصلة rostrally نحو الخط بين المدار. يُقلّب أفقياً إلى الحدود حيث تدخل العضلات الزمنية إلى الجمجمة. إزالة كل من الجلد من شق fusiform لفضح كل من العظام الأمامية والجدارية.
تحذير: الجيوب الأنفية الرجعية تقع مُقَدِّمة في العينين وفروع كبيرة من الوريد الخلفي للوجه تكمن في الرسترال إلى البينا. كن حذرا عند إجراء شق لتجنيب هذه الهياكل. إذا حدث ذلك، توقف عن النزيف عن طريق الحفاظ على الهيموستاسي مع مسحة قطنية معقمة لعدة دقائق واستمر. - ري الجمجمة مع المالحة المعقمة وتنظيف السطح باستخدام مسحات القطن بحيث تكون خالية من الحطام والشعر لأن هذه سوف تتداخل مع جودة الصورة. أفضل الحفاظ على شفافية الجمجمة عن طريق ترك اللفافة المحيطة وفوق هالكة.
ملاحظة: إذا تمت إزالة هذه الهياكل بطريق الخطأ، يمكن أن تصبح الجمجمة جافة وغير شفافة مع مرور الوقت. إعادة ترطيب مع aCSF أو استخدام خليط من زيت البارافين والجلسرين للحد من انعكاس الجمجمة في التجارب الحادة21. - المضي قدما في إدخال cisterna magna قنية - للحصول على التفاصيل الجراحية لهذا الإجراء، والرجوع إلى Xavier وآخرون9.
- بعد إدخال قنية CM، وتطبيق خليط من الاسمنت الأسنان مع الغراء سيانوكريلات على الجانب البطني من لوحة الرأس حول الحدود ووضعها على الجمجمة بحيث الحدود الأمامية للوحة الرأس محاذاة مع الطرف الخلفي من العظام الأنفية وبو الحدود المعستر ة تتماشى مع الجانب الأمامي من العظام بين الباريات، والتأكد من أن خياطة sagittal (خط الوسط) تتمحور ومستقيمة بالنسبة للنافذة (الشكل1B).
- إصلاح موقف لوحة الرأس باستخدام بضع قطرات من مسرع الغراء. ملء أي ثغرات المتبقية مع خليط الاسمنت وعلاجه مع المسرع.
تحذير: تأكد من أن السيانوكريلات لا يأتي في اتصال مع عيون الماوس أو منع نافذة التصوير. - الغراء قنية CM إلى لوحة الرأس لضمان أن هذه لا تصبح منفصلة أثناء النقل أو عندما يستيقظ الماوس.
- للتجارب الحادة، انتقل إلى الخطوة 2.16.
- للتجارب المزمنة، وتطبيق طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلات واضحة التجفيف على الجمجمة المكشوفة، والحرص على عدم خلق فقاعات لأن هذه سوف تتداخل مع التصوير. الغراء يوفر الحماية للجمجمة ولن تتداخل مع التصوير. تأكد من أن الغراء يغطي الجمجمة المكشوفة على طول الطريق إلى الجلد عند حدود الشق.
- استخدام المشبك hemostat لعقد الأنابيب PE10 مليئة aCSF 2-3 سم من سم وقطع الخط مع طرف الكي درجة حرارة عالية. بمجرد فصلها، تسطيح الأنابيب PE10 ذاب لختم قنية.
تحذير: تأكد من عدم إطلاق المشبك حتى بعد أن يتم ختم قنية والتأكد من عدم وجود تسرب في الأنابيب لمنع ناسور CSF. - إدارة كاربروفين (5 ملغ /كغ كل 24 ساعة لمدة 3 أيام؛ أي ص أو s.c.) وإعادة الماوس إلى قفص واحد تسيطر عليها درجة الحرارة، والسماح لها لاسترداد لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير. لا تترك الماوس دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على تراكم القص. تبقى النوافذ القحفية سليمة مستقرة لعدة أسابيع.
ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة المزمنة مؤقتاً هنا.
تحذير: بعض المضاعفات بعد العملية الجراحية هي: ورم الرأس/ورم دموي تحت الجافية، ناسور CSF، والعدوى. - بالنسبة للتجارب الحادة، ضع الماوس في حامل الرأس باستخدام لوحة الرأس بحيث تكون الجمجمة في وضع ثابت. تأكد من التحقق من مستوى التخدير ووضع وسادة التدفئة تحت الماوس. الماوس الآن جاهز ليتم نقله إلى منظار الماكرو.
تحذير: نقل الماوس بعناية جنبا إلى جنب مع مضخة التسريب على عربة. إذا تم إزالة قنية CM، فإنه سوف يسبب انخفاض في الضغط داخل الجمجمة وأي تسرب CSF سوف يغير النتائج التجريبية.
3. إعداد الماوس للتصوير
ملاحظة: يختلف البروتوكول استناداً إلى ما إذا كان سيتم إجراء تجربة التصوير على الماوس (بدء في الخطوة 3.1) أو مستيقظاً (ابدأ في الخطوة 3.2) الماوس.
- الفئران التخدير
- وضع حامل الرأس على خشبة المسرح من منظار الماكرو، والتأكد من عدم وجود العوائق في الخط من مضخة حقنة إلى قنية CM وأنه ليس مشدود لأن هذا يمكن أن تؤثر على ضخ التتبع.
- مراقبة معدل الجهاز التنفسي والتلوين الوردي للأغشية المخاطية، مما يدل على الأكسجين جيدة. حقن ملحي تحت الجلد لتأمين مستوى الترطيب إذا لزم الأمر. تحقق للتأكد من أن الحيوان هو التخدير بما فيه الكفاية وإعادة جرعة إذا لزم الأمر.
- قم بتشغيل كاميرا ماكروسكوب وLED وابدأ تشغيل الوضع LIVE.
- تأكيد تكبير حقل التصوير بحيث يمكن تصور خياطة الأنسوفرونتفية في الجزء العلوي من الحقل وخياطة اللامبويد في الجزء السفلي بوضوح، مع خياطة المترهل ة موازية وتوسيط هادىت إلى منتصف الصورة (الشكل1C). مرة واحدة في مكان، وتأمين حامل الرأس إلى مرحلة ماكروسكوب مع الشريط.
- تركيز الماكروسكوب على الجمجمة المكشوفة. على الرغم من أن النطاقات الكبيرة لها عمق كبير نسبيا من المجال، فإن انحناء جمجمة الماوس يسمح فقط لمنطقة محددة لتكون في التركيز. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يكون المستوى البؤري يقع على الجانبين الجانبي للعظام الجدارية الخلفية للغرز الإكليلية.
ملاحظة: هذا هو موقع الشرايين الدماغية الوسطى (MCA)، حيث يحدث معظم تدفق CSF (الشكل1D،E)10.
- الفئران مستيقظا
- قبل جلسة التصوير، دع الحيوانات تتعافى لمدة 24 ساعة على الأقل من جراحة لوحة الرأس. ويوصى أيضا ً بفترات تعافي أطول (5-7 أيام). خلال هذا الوقت، وتدريب الماوس لتكون ثابتة على خشبة المسرح في أنبوب ضبط النفس لمدة 0.5-1 ساعة يوميا لمدة فترة الانتعاش.
ملاحظة: يسمح التعاش للماوس بإرفاقحامل الرأس دون تخدير ويقلل من التوتر والقلق أثناء التجربة الفعلية. إذا كان هذا غير ممكن والتخدير لا تتداخل مع التجربة، يمكن استخدام جرعة تحريضية من مخدر استنشاق (على سبيل المثال، isoflurane 2٪ في 1-2 L / دقيقة O2 معدل التدفق) لإرفاق الماوس بسرعة إلى مرحلة الرأس. - بمجرد إصلاح الماوس إلى حامل الرأس وفي أنبوب ضبط النفس، اتبع الخطوات 3.1.1-3.1.5.
- قبل جلسة التصوير، دع الحيوانات تتعافى لمدة 24 ساعة على الأقل من جراحة لوحة الرأس. ويوصى أيضا ً بفترات تعافي أطول (5-7 أيام). خلال هذا الوقت، وتدريب الماوس لتكون ثابتة على خشبة المسرح في أنبوب ضبط النفس لمدة 0.5-1 ساعة يوميا لمدة فترة الانتعاش.
4. ضخ من الفلورسنت CSF التتبع
-
تعليب سم حاد
- منذ تم تحميل التتبع بالفعل في قنية قبل وضعها في ماجنا cisterna في الخطوة 1.6، تعيين مضخة التسريب إلى المعدل المطلوب وحجم. نماذج التسريب المستخدمة بشكل روتيني هي 5-10 ميكرولتر في 1-2 ميكرولتر / دقيقة، ولكن هذه المعلمات يمكن تعديلها اعتمادا على تجربة معينة، أو حجم وعمر الحيوان.
-
تعليب سم مزمن
- قبل بدء جلسة التصوير، اتبع الخطوات 1.2-1.7 للتجارب الحادة لإعداد خط التسريب لتسليم التتبعات.
- بمجرد إعداد الخط، وذلك باستخدام المشبك hemostat قطع نهاية مختومة من قنية CM المزمنة. خذ الإبرة من الخط المعد في الخطوة 4.2.1 وأدخلها برفق في القنية. الإفراج عن المشبك واستخدام مضخة الحقنة، ودفع التتبع CSF في معدل التسريب المطلوب (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر / دقيقة) للتجربة حتى يصل التتبع إلى الإبرة المزروعة في CM.
تحذير: إذا اخترقت الإبرة من خلال الأنابيب عند ربط الخط، قم بإزالة الإبرة، وقطع الجزء المثقوب وكرر هذه الخطوة. أي تمزق في الأنابيب PE10 سوف يسبب تسرب وتؤثر على نتائج التجربة.
5. إعداد جلسة التصوير
- استناداً إلى التتبع الفلورسنت يجري غرسها، وتحديد الطول الموجي الإثارة ووقت التعرض لكل قناة. اختر أقصر وقت للتعرض اللازم لتصور التتبع من أجل تحقيق أقصى قدر من الدقة الزمنية للتصوير بالفاصل الزمني. وسوف يستخدم وقت التعرض هذا لجميع التجارب اللاحقة التي تهدف إلى مقارنة نقل CSF بين الحيوانات المختلفة.
ملاحظة: تلميح واحد هو استخدام التتبع في سطر CM لضبط وقت التعرض. وعلى الرغم من أن هذا النهج هو نهج أول مفيد، ينبغي تحسينه مع مرور الوقت. - اختر مدة التجربة والفترات الزمنية التي سيتم فيها الحصول على الصور. التجارب عادة ما تستمر بين 30-60 دقيقة اعتمادا على ما هي مرحلة النقل اللمفي ة ذات فائدة. معدلات الإطار من 1 إطار / دقيقة وأسرع كافية لمعظم التجارب.
- تعيين اسم الملف ودليل الحفظ.
- إذا تم جمع التصوير بالإضافة إلى الحصول في وقت واحد على متغيرات أخرى (على سبيل المثال، تخطيط القلب الكهربائي، ضغط الدم الشرياني، الفيزيولوجيا الكهربائية)، يمكن برمجة النطاق الكلي والمضخة ليتم تشغيلها مع برنامج الحصول على البيانات. تحقق من صحة دالة المشغل على الماكروسكوب قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
6- تجربة التصوير البصري عبر الجمجمة
- بدء ضخ التتبع والتصوير في نفس الوقت.
- تحقق بشكل روتيني من قنية CM والأنابيب PE10 لأي علامات تسرب. إذا كان هناك أي متتبع تسرب في CM، يجب استبعاد نتائج هذه التجربة.
ملاحظة: إذا بدأ التتبع يتراكم في المخيخ ولا يسافر في المسار اللمفاوي لMCA، فمن المرجح أن قنية CM تم حقنها في المخيخ. لا ينبغي تضمين هذه البيانات. - بالنسبة للتجارب الحادة، بعد الانتهاء من التجربة، قم بإزالة الماوس من المجهر وتحقق من أنه لا يزال يتم التخدير بشكل كاف. قطع رأس الماوس بسرعة وحصاد أنسجة الدماغ. الغمر إصلاح الدماغ في 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- بالنسبة للتجارب المزمنة، بمجرد الانتهاء من التصوير، قم بإزالة خط CM من القنية، واغسل مع aCSF المعقمة، والمعاد ختم قنية CM بطرف كي عالي الحرارة. إزالة الماوس من موقف الرأس وإعادته إلى قفصه. كرر هذه العملية حتى لا يلزم مزيد من التصوير ثم اتبع الخطوة 6.3.
7 - تحليل البيانات
ملاحظة: يمكن للتحليلات المستندة إلى Matlab، مثل التتبع الأمامي لـ CSF، استخراج كميات كبيرة من البيانات الكمية من واجهات التتبع في مجموعات بيانات التصوير هذه10و22 . ومع ذلك، يمكن بسهولة استيراد أنواع الملفات هذه وتحليلها في برامج تحليل الصور المفتوحة المصدر مثل Fiji23.
- استيراد مكدسات الصور إلى فيجي باستخدام أداة استيراد التنسيقات الحيوية. ستحافظ هذه الدالة على بيانات تعريف الملف التي تتضمن دقة الوقت والبكسل. حفظ مكدس الصور كملف .tiff.
- رسم منطقة الاهتمام (ROI) يدوياً حول الجمجمة أو منطقة الاهتمام باستخدام أداة اختيار المضلع. على سبيل المثال، في الشكل 1G تم رسم عائد الاستثمار بشكل منفصل لipsilateral ونصف الكرة الأرضية المقابلة بعد إصابة الدماغ الصادمة. تأكد من إضافة عائد الاستثمار إلى مدير عائد الاستثمار (تحليل>أدوات>مدير عائدالاستثمار) وحفظه.
ملاحظة: يمكن تحديد كمية النقل في صندوق الضمان الاجتماعي بطريقتين رئيسيتين: (1) متوسط شدة الفلورة معمرور الوقت أو 2) منطقة التدفق المعبر عنها كنسبة مئوية من عائد الاستثمار أو المساحة الإجمالية (مم 2) بعد تطبيق عتبة. سيتم وصف الطريقة الأخيرة (الشكل1H)في الخطوات التالية. - تعيين العتبة على الإطار مع الفلورة القصوى (حدد صورة>ضبط>عتبة ...). أساليب عتبة الآلي مثل أوتسو عادة ما تكون جيدة في الكشف عن التتبع CSF. تطبيق العتبة.
- قبل المضي قدماً، تأكد من تحديد المنطقة وأجزاء الخيارات في تحليل>تعيين القياسات. ثم في مدير عائد الاستثمار، حدد المزيد>قياس متعدد.
- تحويل قيمة المنطقة % إلى مم2 باستخدام قيمة منطقة عائد الاستثمار من الإخراج. تعكس قيم المنطقة % النسبة المئوية للسطح القشري الظهري مع متتبع CSF.
- مؤامرة CSF تدفق التتبع في مم2 كدالة للوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تصوير تدفق CSF على منظار ماكروفلورسنت (الشكل1A)،والذي يسمح للتصوير التنظيري من نقل التتبع CSF في قشرة المورين. لوحة الرأس الجمجمة الكاملة تسمح بتصور عظام الأنف الوردية، سواء العظام الأمامية والجدارية في الوسط، والجزء الوردي من العظام بين البارية caudally (الشكل1B). أثناء التصوير، يمكن التعرف بسهولة على الغرز الأنفية، والمترهلة، والإكليلية، واللامبويد (الشكل1C). بمجرد أن يبدأ ضخ جهاز تتبع CSF في CM (الشكل1D)،وينظر لأول مرة الفلورة التتبع في برك كبيرة من تحت العنكبوتية CSF في الصهريج القاعدي، وصهريج olfactofrontal، وصهريج رباعي بالقرب من عطلة الصنوبرية (الشكل1E ، إلىاليسار). ثم يدخل جهاز تتبع CSF الدماغ على طول المساحات المحيطة بالأوعية الدموية من فروع البيال القشرية من الشريان الدماغي الأوسط (MCA) (الشكل1E،يمين).
يمكن استخدام التصوير البصري عبر الجمجمة لدراسة وظيفة اللمفية بعد إصابة الدماغ الصادمة (TBI)3. تلقت الفئران TBI معتدلة وبعد ذلك مباشرة تم حقن الفلورسنت CSF التتبع (BSA-647) في CM24. تم تصوير النقل CSF لمدة 60 دقيقة بعد TBI (الشكل1F). التصوير العياني يظهر أن التتبع ينظر لأول مرة في الصهريج olfactofrontal ولكن يتم إلغاء تدفق اللمفية على طول PVSs القشرية تماما على جانب TBI (الشكل1G،Supp. فيلم 1). وقد تبين تأثير مثبط ة TBI على وظيفة اللمفوتيك باستخدام العديد من الطرق الأخرى التتبع القياس الكمي ويمكن أن تكمن وراء العلاقة بين TBI وتراكم Aβ وتاو ينظر بعد الإصابة3. التحليل الكمي للصور في الجسم الحي تبين أن منطقة تدفق ipsilateral انخفض ما يقرب من ثلث بالمقارنة مع نصف الكرة الأرضية المضادة (الشكل1H).
الشكل 1 التصوير العياني عبر الجمجمة. (أ) تخطيطي للتصوير العياني الذي تم إعداده. (ب) عرض الظهري من موقف لوحة الرأس على الجمجمة. العظام بين البارية والعظام الأنفية والأمامية والجدارية كلها مرئية. (C) جمجمة فأر مكشوفة أثناء التصوير قبل ظهور جهاز تتبع CSF، تظهر بوضوح جميع الغرز القحفية للجمجمة سليمة. شريط مقياس: 1مم (D) مخطط من وجهة نظر جانبية من متتبع CSF دخول الصهريج ماجنا (سم) والسفر من الصهريج القاعدي على طول المسار اللمفي. (E، اللوحةاليسرى) التصوير العياني لتدفق اللمفية في فأر الكيتامين-إكسيلازين الذي يُساء التنجيل في حقن CM بعد 20 دقيقة (BSA-647؛ 10 ميكرولتر عند 2 ميكرولتر/دقيقة). وينظر إلى تتبع CSF في الصهريج olfactofrontal حول الوريد الرينال الوردي تحت خياطة الأنسأمامي، على طول بعض أجزاء من الجيوب الأنفية المترهلة متفوقة تحت خياطة sagittal، وفي العطلة الصنوبرية المحيطة الجيوب الأنفية عرضية تحت lambdoid خياطه. (E، اللوحة اليمنى) يظهر التكبير الرقمي للصورة على اليسار الدقة المكانية العالية التي تم الحصول عليها باستخدام هذه المجاهر. تتبع CSF يسافر داخل المساحات المحيطة بالأوعية الدموية من الشريان الدماغي الأوسط (MCA)10. شريط مقياس: 0.5مم (F) الجدول الزمني التجريبي. تلقى فأر من النوع البري المُسَنَعُ إصابة دماغية خفيفة وصادمة (TBI)24 مباشرة بعد حقن CM (BSA-647; 10 μL at 2 μL/min)، تليها 60 دقيقة من التصوير العياني. (G) صور الفاصل الزمني للنقل التتبع CSF بعد TBI (خط متقطع). شريط المقياس: 1مم (H) منطقة التدفق (مم2)على كل نصف الكرة الأرضية خلال التجربة 60 دقيقة، كميا من ROIs في (G)، نصف الكرة الأرضية التي تلقت TBI (ipsilateral) ونصف الكرة الأرضية التي لم (العكس). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1. مخطط لوحة رأس مخصصة. (A,B) القياسات الدقيقة (في مم) من لوحة الرأس المخصصة المستخدمة في بروتوكول التصوير العياني عبر الجمجمة. مخططات ثلاثية الدنابية للوحة رأس مجوفة (C) ولوحة رأس كاملة(D). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية فيلم 1. التصوير بالفاصل الزمني لنقل CSF بعد إصابة الدماغ الصادمة المعتدلة في العظام الجدارية اليسرى. المدة: 60 دقيقة شريط مقياس: 1 مم الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد وصفنا بروتوكول مفصل لأداء التصوير عبر الجمجمة CSF في الفئران الحية باستخدام منظار الماكروالفلورسنت المتاحة تجاريا والتتبع. هذه التقنية بسيطة وطفيفة التوغل، ولكن كمية. في التصوير الحي يرتبط بشكل جيد مع الأساليب الحساسة مثل السائل اللمعة العد من التتبع اتلاف وصفت لاسلكيا بما في ذلك 3H-dextran و 14C-inulin بعد تسليم CM، ومع السابقين فيفو القسم الإكليلي القياس10، 18. التحقق من صحة مع اثنين من الفوتون المجهري يدل على أن تتبع CSF ينظر على طول الأوعية الدموية القشرية تحت منظار الماكرو تقع في المقام الأول داخل المساحات المحيطة بالأوعية الدموية من MCA وفروعها10. هذه المسارات تدفق CSF هي عنصر حاسم من النظام اللمفي19. على الرغم من أن لا تغطي في هذا البروتوكول، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الماكياج لتصوير مسارات إزالة CSF مثل اللمفاويات السحائية وعنق الرحم25،26.
التحسينات في تصميم لوحة الرأس تمكن المزمنة، مستقرة، والتصوير واسعة المجال من نفس الماوس مع مرور الوقت. يمكن تصميم شكل لوحة الرأس والحجم والوزن لكل تطبيق محدد. مع التقدم في القطع بالليزر والطباعة 3D، وهناك عدد قليل من القيود فيما يتعلق بالمواصفات. كما يسمح طلاء الرأس للتصوير الطولي للالحيوانات المؤكسة أو اليقظة والقدرة على الصورة من خلال جمجمة سليمة يتجنب التهاب الأعصاب وذمة المرتبطة بوضع نوافذ الجمجمة القحفية أو رقيقة27، 28 , 29.وهذا هو ميزة هامة منذ تسليم stereotaxic من التتبع الفلورسنت من خلال القشرة في البطين أو البطينين الجانبية باستخدام ثقب لدغ الجمجمة يقلل إلى حد كبير من وظيفة glymphatic20،26. تسمح المسافات الكبيرة ومسافات العمل لمعظم النطاقات الكبيرة للفئران أن تكون ثابتة على المسرح في تكوينات مختلفة، بما في ذلك تشغيل العجلات أو متاهات عائمة. يمكن تدريب الفئران وعاداتها إلى أن تكون ثابتة الرأس إلى مرحلة المجهر خلال فترة الانتعاش 5-7 أيام لتسهيل التصوير مستيقظا30.
واحدة من القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو عمق اختراق منخفض من منظار الماكرو مقارنة مع اثنين من الفوتون المجهري10. هذا الجهاز قادر على حل بضعة ملليمترات فقط من السطح القشري تحت الجمجمة سليمة. ومع ذلك، في حين أن هذا يحد من تصوير العمليات التي تحدث أعمق في الأنسجة، فإنه عموما ليست مشكلة للتحليلات اللملمفية منذ الطرق الرئيسية للدخول تقع في المقام الأول حول الشرايين الرئيسية للسطح القشري الظهري. على الرغم من كونها غير قادرة على حل هياكل أعمق, منظار الماكرو مع كفاءة عالية كاميرات CMOS العلمية لديها الكشف الفلورية كبيرة; على الرغم من عدم وجود التتبع على سطح الدماغ، فإن كثافة الفلورة الإجمالية ترتبط بكمية التتبع الموجودة في الدماغ في كل نقطة زمنية بعد بدء حقن CM10. يتم تحسين هذه المعلمات باستخدام تتبعات الأشعة تحت الحمراء البعيدة أو شبه الأشعة تحت الحمراء، حيث أن التصوير في هذه الأطوال الموجية الأطول يقلل من الفلورة التلقائية للأنسجة وتشتت الضوء، ويكون لها نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى من الانبعاثات المنخفضة الطول الموجي فلوروفورس. يتيح منظار الماكرو القياسي تصوير أكثر من متتبع واحد في نفس التجربة. اعتماداً على تكوين الماكروسكوب، برج عامل التصفية يجب أن تدور بين عمليات الشراء، مما يقلل بشكل كبير من الدقة الزمنية التي يمكن الحصول عليها. ويمكن تحسين ذلك باستخدام المصابيح القابلة للضبط ومكعب فلتر متعدد النطاقات. على الرغم من هذا التحسن، التصوير متعدد القنوات ليست متزامنة حقا، لأن هناك تأخير في الحصول على حين أن الصمام التبديل بين الأطوال الموجية الإثارة. فمن الممكن لتحقيق التصوير في وقت واحد قناة مزدوجة باستخدام البصريات تقسيم الصورة التي تتوافق مع معظم الماكياج العيانية. ومع ذلك، هذه التضحية القرار المكاني عن طريق تقسيم القرار الكامل للكاميرا CMOS (2048 × 2048 بكسل) إلى مجالين من مجالات الرؤية مع نصف القرار (1024 × 1024 بكسل). في حين أن كاميرات CMOS كافية تماما لهذا الاستخدام، يمكن تطبيق استخدام كاميرا CCD على هذا التطبيق أيضا. عامل إضافي يقلل من الدقة الزمنية هو وقت التعرض اللازم للإثارة الكافية للفلوروفور المختار، والتي تتراوح عادة بين 50-1000 مللي ثانية، ويمكن تحسين هذا باستخدام إما 2x2 أو 4x4 بكسل binning، مما يقلل وقت التعرض ويزيد من معدل الإطار، على حساب الدقة المكانية. وعلى الرغم من هذه القيود، فإن التصوير العياني متعدد القنوات عبر الجمجمة قادر على تحقيق معدلات الإطار بين 10-20 هرتز مع دقة مكانية عالية.
وقد استخدمت الأمثلة الحديثة في التصوير العياني عبر الجمجمة aquaporin-4 (AQP4) ضرب الفئران10،20 وعامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية B (PDGF-B) الاحتفاظ عزر الفئران بالضربة القاضية22 لإثبات أهمية AQP4 وPDGF-B في الجهاز اللمفاوي. استخدمت الدراسات الفئران C57Bl6 البرية للمقارنة مع خطوط الماوس بالضربة القاضية. قاموا بتصوير الفئران عبر الجمجمة لمدة 30 دقيقة باستخدام أجهزة تتبع الفلورسنت وخلصت النتائج إلى أن خطوط خروج المغلوب قد خفضت بشكل كبير تدفق CSF مقارنة بالأنواع البرية.
هذه الخصائص تجعل التصوير البصري عبر الجمجمة تقنية مثالية لدراسة نقل CSF، وخاصة بين 2 أو أكثر من مجموعات الحيوانات. وهو يسمح بقياسات حركية التتبع داخل الصهاريج في الفئران الحية بمقياس ميكرون، بجزء صغير من تكلفة أخرى في طرائق التصوير الحي. تسمح هذه التقنية بدراسة الجهاز اللمفي بطريقة فسيولوجية غير غازية، وكانت مفيدة في المساعدة على توضيح بعض العوامل التي تنظم وظيفتها في الصحة والمرض10،20،25 . ومع ذلك، السمة الأكثر إثارة هو قدرتها على الإجابة على الأسئلة المستقبلية حول الديناميات المائية CSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني للشيخوخة (المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة؛ R01NS100366 و RF1AG057575 to MN)، وبرنامج مؤسسة ليدوك لشبكات التميز عبر المحيط الأطلسي، وبرنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 (المنحة رقم 666881؛ SVDs@target). ونود أيضا أن نشكر دان شوي على مساعدة الخبراء في الرسوم التوضيحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
