Summary
Transcranial optisk billeddannelse tillader bred-felt billeddannelse af cerebrospinalvæske transport i cortex af levende mus gennem en intakt kraniet.
Abstract
Cerebrospinalvæske (CSF) flow i gnavere er stort set blevet undersøgt ved hjælp af ex vivo kvantificering af røbestoffer. Teknikker såsom to-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI) har aktiveret in vivo kvantificering af CSF flow, men de er begrænset af reduceret billeddannelse volumen og lav rumlig opløsning, hhv. Nylige arbejde har fundet, at CSF ind i hjernen parenkym gennem et netværk af perivaskulære rum omkring de piale og penetratere arterier af gnaver cortex. Denne perivaskulære indtræden af CSF er en primær drivkraft for det glymphatiske system, en vej, der er impliceret i clearance af giftige metaboliske opløfter (f. eks. amyloid-β). Her illustrerer vi en ny makroskopisk billedbehandlings teknik, der giver mulighed for realtids, mesoskopisk billeddannelse af fluorescerende CSF-røbestoffer gennem det intakte dødningehoved af levende mus. Denne minimalt-invasive metode letter en lang række eksperimentelle designs og muliggør en enkelt eller gentagen testning af CSF dynamik. Macroscopes har høj rumlig og tidsmæssig opløsning, og deres store Gantry og arbejdsdistance giver mulighed for billeddannelse, mens de udfører opgaver på adfærdsmæssige enheder. Denne billeddannelses metode er blevet valideret ved hjælp af to-foton billeddannelse, og fluorescens målinger opnået fra denne teknik er stærkt korrelerer med ex vivo fluorescens og kvantificering af radiomærkede røbestoffer. I denne protokol beskriver vi, hvordan transcranial makroskopisk billeddannelse kan anvendes til at evaluere glyfatisk transport i levende mus, hvilket giver et tilgængeligt alternativ til dyrere billedbehandlings metoder.
Introduction
Cerebrospinalvæske (CSF) bader hjernen og rygmarven og er involveret i at opretholde homøostase, levering af næringsstoffer, og regulere intrakranielt tryk1. CSF i subarachnoid rummet kommer ind i hjernen gennem et netværk af perivaskulære rum (PVS) omgivende kortikale piale arterier og derefter strømmer ned langs penetrering arterioler2. En gang i parentchyma, CSF udvekslinger med interstitiel væske (ISF), transporterer skadelige metabolitter såsom amyloid-β (Aβ) og Tau protein aggregater ud af hjernen gennem lav modstand hvidt stof skrifter og perivenøse rum2,3 . Denne vej er afhængig af astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler og er derfor blevet kaldt glial-lymphatic (glymphatic) system4. Affaldsprodukter af neuropil er i sidste ende ryddet fra CSF-ISF gennem lymfe skibe nær kranielle nerver og i meninges ud mod de cervikale lymfeknuder5. Svigt af dette system har været impliceret i flere neurologiske sygdomme som Alzheimers sygdom6,7, traumatisk hjerneskade3, og iskæmisk og hæmoragisk slagtilfælde8.
CSF transport kan visualiseres ved at inficere røbestoffer i Cisterna Magna (cm)9,10 og glymfatiske undersøgelser i fortiden har hovedsagelig udnyttet to-foton mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonans imaging (MRI) 14,15,16,17og ex vivo Imaging3,6,11, 18 for at evaluere Tracer kinetik. To-foton mikroskopi er en egnet metode til detaljeret billeddannelse af CSF røbestoffer i pvss og parenkym på grund af sin høje rumlige opløsning, men det har et snævert synsfelt og kræver en invasiv kraniel vindue eller udtynding af kraniet. Ex vivo-billeddannelse, i kombination med immun histokemi, muliggør analyser i flere niveauer, som spænder fra enkeltceller op til hele hjernen19. Men processen med perfusion-fiksering, der er nødvendig for at observere post mortem-væv producerer dybtgående ændringer i CSF flowretning og kollapser PVS, betydeligt ændre fordelingen og placeringen af røbestoffer12. Endelig, mens MRI kan spore CSF flow i hele murine og menneskelige hjerne, det mangler rumlig og tidsmæssig opløsning af perivaskulære flow.
En ny teknik, transcranial macroskopisk billeddannelse, løser nogle af disse begrænsninger ved at muliggøre vidfelt Imaging af perivaskulær CSF transport i hele rygbarken af levende mus. Denne type billeddannelse udføres med et epifluorescerende makroskop ved hjælp af en multi bånds filter kube, en tunbar LED-lyskilde og et højeffektivt CMOS-kamera10. Disse set-ups er i stand til at løse PVSs op til 1-2 mm under kraniets overflade og kan detektere fluorophorer op til 5-6 mm under den kortikale overflade, mens de forlader kraniet helt intakt10. Multiband filtre og lysdioder, der hurtigt kan finjustere excitation bølgelængde gør det muligt at bruge flere fluorophorer tillader CSF at blive mærket med røbestoffer af forskellige molekylvægt og kemiske egenskaber i samme eksperiment.
Denne procedure kræver en enkel, minimalt invasiv operation for at udsætte kraniet og placere en letvægts hovedplade for at stabilisere hovedet under billedbehandlings sessionen. Røbestoffer kan leveres i cm uden boring i kraniet eller trænge ind i det kortikale væv med pipetter eller kanyle9,20. Både CM-kanyle og hovedplader forbliver stabile i flere dage til uger og letter mere komplekse eksperimentelle design sammenlignet med den klassiske endepunkts visualisering. Denne protokol beskriver, hvordan transcranial macroskopisk billeddannelse anvendes til at studere glymphatiske systemfunktion efter akut eller kronisk injektion af fluorescerende CSF Tracer i CM af bedøvet/sovende eller vågen mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af universitetets Komité for dyreressourcer (UCAR, protokol nr. 2011-023) ved universitetet i Rochester og udført i henhold til NIH guide for pleje og brug af forsøgsdyr.
1. klargøring af Cisterna Magna-kanyle, hovedplade og hoved holder
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter og hovedplader før operationen.
Bemærk: fluorescerende røbestoffer leveres direkte til CSF via en Cisterna Magna kanyle. For detaljerede anvisninger vedrørende denne procedure henvises til Xavier et al9. - Kortvarigt, ved hjælp af en nål driver, bryde spidsen af en 30G x 12,7 mm (1/2 tommer) nål, 3/4 af vejen ned, og placere den stumme ende af nålen i den ene ende af polyethylen 10 (PE10) slanger (ca. 45 cm lang). Sørg for, at kun facet stikker ud af kanten af PE10 slangen.
- Bryd 1/4 af den skrående af en anden 30G nål og Placer den stumme ende af den resterende nål i den anden ende af PE10 slangen, med plastik luer-Lock stadig fastgjort.
- Fyld en 100 μL glassprøjte med steril, kunstig CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2po4, 2 mm mgso4, 2 mM CaCl2, 10 mm glucose, og 26 mm NaHCO3).
- Fastgør sprøjten til enden af linjen og fyld den med aCSF, indtil den når spidsen af den skrå nål. Det er vigtigt, at sprøjten er tilbage fyldt med aCSF og ikke luft, da en luft søjle er mere tilbøjelig til variable infusions volumener.
- For kroniske eksperimenter, forlade linjen fyldt med aCSF og springe trin 1,7.
- Ved akutte eksperimenter skal du anbringe sprøjten på en infusionspumpe og trække ca. 5 mm luft ud, hvilket vil forhindre blanding. Bagefter trækkes det samlede volumen af røbestoffer, der ønskes til eksperimentet (20% ekstra anbefales på grund af dødt tab af rummet).
Bemærk: PE10 slangen skal være lang nok til, at luftboblen ikke kommer ind i plastik manchetten på glassprøjten, når traceren indlæses. For et typisk eksperiment bruger protokollen 10 μL bovin serumalbumin konjugeret til Alexa fluor 647 (BSA-647) fortyndet i aCSF ved 0,5%. - Bekræft, at hovedpladen passer til hoved holderen, og at den er den rigtige størrelse til, at musen bliver brugt. Anatomiske markører for at sikre dette er: den øverste kant af vinduet flugter med den interokulære linje og den bageste grænse falder rostral Columns til occipital Crest.
Bemærk: rustfri stål hovedplader kan steriliseres og genbruges. De fleste cyanoacrylatblandinger kan fjernes med en acetone opløsning.
2. kirurgisk indgreb
- Veje og bedøve musen (f. eks ketamin/xylazine; 100 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine; IP).
- Når musen ikke længere reagerer på en tå knivspids, fugte halsen og hovedet med sterilt vand og barbering ved hjælp af Clippers. Når området er barberet, tørre området med en spritserviet igen for at fjerne eventuelle resterende hår.
Bemærk: fugtning af pels før klipning dramatisk reducerer mængden af hår i billedbehandlings vinduet efter indsnittet. - Placer musen i en Stereotaktisk ramme på toppen af en temperaturkontrolleret pad og anvende råolie oftalmologiske salve til musens øjne for at sikre, at de ikke tørrer ud.
- Rengør den udsatte hud med en chlorhexidin-vatpind. Efter 2 min., Fjern chlorhexidin med en spritserviet. Endelig anvende en jod opløsning, som kan overlades til tørre.
- Injicer subkutant analgesi (0,25% bupivacaine HCL) til toppen af kraniet og halsen.
- Start på den del af halsen, der dækker occipital Crest, lav en midterlinje skåret i den overliggende hud og Fortsæt rostrally mod interorbital linjen. Incise sideværts til grænsen, hvor den tidsmæssige muskel indsætter i kraniet. Fjerne alle huden af fusiform indsnit at udsætte både frontal og parietal knogler.
Forsigtig: den retroorbital sinus ligger caudal til øjnene og store grene af den bageste facial vene ligger rostral Columns til Pinna. Vær forsigtig, når du foretager indsnit til at skåne disse strukturer. Hvis dette sker, stoppe blødning ved at opretholde hæmostase med en steril vatpind i flere minutter og fortsætte. - Skyl kraniet med sterilt saltvand og Rengør overfladen ved hjælp af vatpinde, så den er fri for snavs og hår, da disse vil forstyrre billedkvaliteten. Kraniets gennemsigtighed er bedst bevaret ved at forlade periosteum og overliggende fascia intakt.
Bemærk: Hvis disse strukturer ved et uheld fjernes, kan kraniet blive tørt og uigennemsigtigt over tid. Re-fugte med aCSF eller bruge en blanding af paraffinolie og glycerol til at reducere kraniet reflektans i akutte eksperimenter21. - Fortsæt med at indsætte Cisterna Magna kanyle-for kirurgiske detaljer i denne procedure, se Xavier et al9.
- Efter indsættelse af CM kanyle, anvende en blanding af dental cement med cyanoacrylat lim til den ventrale side af hovedpladen omkring grænsen og placere den på kraniet, således at den forreste kant af hovedpladen flugter med den bageste spidsen af næse benet og po sterior kant flugter med det forreste aspekt af interparietalknoglen knogle, at sikre, at sagittale sutur (midterlinjen) er centreret og lige i forhold til vinduet (figur 1b).
- Fastgør positionen af hovedpladen ved hjælp af et par dråber lim Accelerator. Fyld eventuelle resterende huller med cement blandingen og helbrede den med Accelerator.
Forsigtig: Sørg for, at cyanoacrylatet ikke kommer i kontakt med musens øjne eller blokerer billedvinduet. - Lim CM kanyle til hovedpladen for at sikre, at disse ikke bliver løsrevet under transporten, eller når musen vågner.
- Ved akutte eksperimenter skal du springe til trin 2,16.
- For kroniske eksperimenter, anvende et tyndt lag af klar-tørring cyanoacrylat lim til det udsatte kraniet, at være omhyggelig med ikke at skabe bobler, da disse vil forstyrre billeddannelse. Limen giver beskyttelse af kraniet og vil ikke forstyrre billeddannelse. Sørg for, at limen dækker de udsatte kraniet hele vejen til huden ved indsnit grænsen.
- Brug en hemostat clamp til at holde aCSF-fyldte PE10 slanger 2-3 cm fra CM og skær linjen med en høj temperatur Cautery spids. Når den er separeret, skal du flade den smeltede PE10 slange for at forsegle kanylen.
Forsigtig: Sørg for ikke at frigøre klemmen, før kanylen er forseglet, og Bekræft, at der ikke er lækager i slangen for at forhindre en CSF fistel. - Giv carprofen (5 mg/kg hver 24 h i 3 dage; IP eller s.c.) og returner musen til et temperaturkontrolleret, enkelt anbragt bur og lad den komme sig i mindst 24 timer før billeddannelse. Efterlad ikke musen uden opsyn, indtil den genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbency. Intakte craniale Vinduer forbliver stabile i flere uger.
Bemærk: det kroniske eksperiment kan sættes på pause her.
Forsigtig: nogle postoperative komplikationer er: cephalohematoma/subgaleal hæmatomer, CSF fistula, og infektion. - For akutte eksperimenter, placere musen i hoved holderen ved hjælp af hovedpladen, så kraniet er i en fast position. Sørg for at kontrollere anæstesiniveau og placere en varmepude under musen. Musen er nu klar til at blive taget til makroskopet.
Forsigtig: transporter forsigtigt musen sammen med infusionspumpen på en vogn. Hvis CM-kanylen bliver opløst, vil det medføre et fald i det intrakranielle tryk, og eventuelle CSF-lækager vil ændre de eksperimentelle resultater.
3. klargøring af musen til billeddannelse
Bemærk: protokollen varierer afhængigt af, om billedbehandlings eksperimentet vil blive udført på en bedøvelse (start ved trin 3,1) eller vågen (start ved trin 3,2) mus.
- Bedøvet mus
- Placer hoved holderen på makroskopets stadium, og sørg for, at der ikke er knæk i linjen fra sprøjtepumpen til CM kanylen, og at den ikke er stram, da dette kan påvirke Tracer-infusionen.
- Observere respiratorisk hastighed og pink farvning af slimhinderne, hvilket indikerer god iltning. Injicer subkutant for at sikre hydrerings niveauet, hvis det er nødvendigt. Kontroller, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet og igen dosis, hvis det er nødvendigt.
- Tænd for Macro Scope-kameraet og LED, og start LIVE-tilstand.
- Bekræft forstørrelsen af billedfeltet, så den nasofrontal sutur øverst på marken og lambdoid sutur i bunden klart kan visualiseres, med sagittale sutur parallelt og centreret til midten af billedet (figur 1c). En gang på plads, fastgør hoved holderen til Macro Scope scenen med tape.
- Fokuser makroskopet på det udsatte dødningehoved. På trods af makroskoper med en relativt stor dybde af felt, krumning af musens kraniet kun giver mulighed for et bestemt område at være i fokus. De bedste resultater opnås, når brændplanet er placeret på side siderne af parietal knogler posterior til de koronale suturer.
Bemærk: Dette er placeringen af de midterste cerebral arterier (MCA), hvor de fleste CSF tilstrømning forekommer (figur 1d, E)10.
- Vågne mus
- Før billedbehandlings sessionen, lad dyrene komme sig i mindst 24 timer fra hoved pladens operation. Længere restitutionsperioder (5-7 dage) anbefales også. I løbet af denne tid, træne musen til at være hoved fastgjort på scenen i fastholdelses røret for 0.5-1 h per dag for varigheden af restitutionsperioden.
Bemærk: Habituation tillader musen at være fastgjort til hoved holderen uden anæstesi og reducerer stress og angst under selve eksperimentet. Hvis dette ikke er muligt, og anæstesi ikke forstyrrer forsøget, kan en induktionsdosis af en inhaleret bedøvelse (f. eks isofluran 2% ved 1-2 L/min O2 flowhastighed) bruges til hurtigt at fastgøre musen til hovedscenen. - Når musen er fastgjort til hoved holderen og i fastholdelses røret, skal du følge trin 3.1.1-3.1.5.
- Før billedbehandlings sessionen, lad dyrene komme sig i mindst 24 timer fra hoved pladens operation. Længere restitutionsperioder (5-7 dage) anbefales også. I løbet af denne tid, træne musen til at være hoved fastgjort på scenen i fastholdelses røret for 0.5-1 h per dag for varigheden af restitutionsperioden.
4. infusion af fluorescerende CSF røbestoffer
-
Akut CM-kanyle
- Da traceren allerede var indlæst i kanylen, inden den blev anbragt i Cisterna Magna i trin 1,6, skal infusionspumpen indstilles til den ønskede hastighed og volumen. Infusions paradigmer, der rutinemæssigt anvendes, er 5-10 μL ved 1-2 μL/min, men disse parametre kan justeres afhængigt af det pågældende eksperiment eller dyrets størrelse og alder.
-
Kronisk CM kanyle
- Før du påbegynder billedbehandlings sessionen, skal du følge trin 1.2-1.7 for akutte eksperimenter for at forberede infusions ledningen til at levere tracerne.
- Når linjen er forberedt, ved hjælp af en hemostat klemme skære den forseglede ende af den kroniske CM kanyle. Tag nålen fra den linje, der er fremstillet i trin 4.2.1, og Indsæt den forsigtigt i kanylen. Frigør klemmen og brug sprøjtepumpen, før CSF Tracer til den ønskede infusionshastighed (f. eks. 2 μL/min) for eksperimentet, indtil traceren når den implanterede nål i CM.
Forsigtig: Hvis nålen gennemborer igennem slangen, når du tilslutter linjen, skal du fjerne nålen, klippe gennemboret segment og gentage dette trin. Enhver tåre i PE10 slangen vil forårsage en lækage og påvirke resultaterne af forsøget.
5. opsætning af Imaging session
- Baseret på den fluorescerende Tracer, der infunderet, bestemme excitation bølgelængde og eksponeringstid for hver kanal. Vælg den korteste eksponeringstid, som er nødvendig for at visualisere traceren for at maksimere den tidsmæssige opløsning af tidsforskudt billeddannelse. Denne eksponeringstid vil blive anvendt til alle efterfølgende eksperimenter, der har til formål at sammenligne CSF transport mellem forskellige dyr.
Bemærk: et tip er at bruge Tracer i CM-linjen til at justere eksponeringstiden. Selv om dette er en nyttig første tilgang, bør dette optimeres over tid. - Vælg varigheden af eksperimentet og de intervaller, hvormed billederne vil blive erhvervet. Eksperimenter normalt vare mellem 30-60 min afhængigt af, hvilken fase af glymfatiske transport er af interesse. Frame rater på 1 frame/min og hurtigere er tilstrækkelige til de fleste eksperimenter.
- Angiv filnavnet og gemme mappen.
- Hvis billeddannelse vil blive indsamlet ud over samtidig erhvervelse af andre variabler (f. eks. elektrokardiogram, arteriel blodtryk, Elektrofysiologi), kan makroskopet og pumpen programmeres til at blive udløst med dataindsamlingen software. Kontrollér, at udløser funktionen på makro området er korrekt, før du går videre til næste trin.
6. test af optisk billeddannelse i transcranial
- Start Tracer infusion og Imaging på samme tid.
- Kontrollér rutinemæssigt CM-kanylen og PE10-slangen for tegn på en lækage. Hvis der er nogen spor lækage ved CM, skal resultaterne fra dette eksperiment udelukkes.
Bemærk: Hvis Tracer begynder at akkumulere i cerebellum og ikke rejse den glymfatiske pathway af MCA, er det sandsynligt, at cm kanyle blev sprøjtet ind i cerebellum. Disse data bør ikke medtages. - For akutte eksperimenter, efter afslutningen af forsøget, fjerne musen fra mikroskopet og kontrollere, at det stadig er tilstrækkeligt bedøvet. Hurtigt halshug musen og høste hjernevæv. Fordybelse-Fastgør hjernen i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) natten over ved 4 °C.
- For kroniske eksperimenter, når billeddannelse er afsluttet, fjerne CM linje fra kanyle, flush med steril aCSF og forsegle CM kanyle med en høj temperatur Cautery spids. Fjern musen fra hovedet stativ og returnere den til sit bur. Gentag denne proces, indtil yderligere Imaging ikke er påkrævet, og følg derefter trin 6,3.
7. data analyse
Bemærk: MATLAB-baserede analyser, såsom CSF front-tracking kan udtrække store mængder af kvantitative data fra Tracer fronter i disse Imaging datasæt10,22. Men, disse filtyper kan også nemt importeres og analyseres i open-source billedanalyse software som Fiji23.
- Importer billedet stakke til Fiji ved hjælp af bio-formater import værktøj. Denne funktion bevarer filens metadata, som indeholder tids-og pixel opløsningen. Gem billed stakken som en. TIFF-fil.
- Tegn manuelt et område af interesse (ROI) omkring kraniet eller interesseområdet ved hjælp af polygon markeringsværktøjet. For eksempel, i figur 1G en ROI blev trukket separat for ipsilaterale og for den kontralaterale halvkugle efter en traumatisk hjerneskade. Sørg for at føje INVESTERINGSAFKASTET til ROI Manager (Analysér ≫ værktøjer > ROI Manager), og Gem det.
Bemærk: CSF transport kan kvantificeres på to hovedmåder: 1) gennemsnitlig fluorescens intensitet over tid eller 2) tilstrømning område udtrykt som en procentdel af ROI eller samlede areal (mm2) efter at have anvendt en tærskel. Den sidstnævnte metode (figur 1H) vil blive beskrevet i de næste trin. - Indstil tærsklen på rammen med maksimal fluorescens (Vælg billede ≫ juster ≫ tærskel...). Automatiserede tærskel metoder som Otsu er normalt gode til at detektere CSF Tracer. Anvende tærsklen.
- Før du går videre, skal du sørge for, at indstillingerne område og område fraktion er valgt i Analysér > indstillede mål . Vælg derefter mere ≫ multi målingi ROI Manager.
- Konverter % område værdien til mm2 ved hjælp af område værdien af ROI fra outputtet. % Område værdierne afspejler procentdelen af den dorsale kortikale overflade med CSF Tracer.
- Plot CSF Tracer tilstrømning i mm2 som en funktion af tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CSF tilstrømning er afbildet på et epifluorescerende makroskop (figur 1a), som giver mulighed for mesoskopisk billeddannelse af CSF Tracer transport i murine cortex. Hele kraniets hovedplade tillader visualisering af de rostrale næse knogler, både frontal-og parietal knogler i midten, og den rostrale del af interparietalknoglen knogle caudally (figur 1b). Under billeddannelse kan der let identificeres nasofrontal, sagittal, koronal og lambdoid suturer (figur 1c). Når infusionen af CSF Tracer ind i CM begynder (figur 1d), er Tracer fluorescens først set i store puljer af subarachnoid CSF på basal cisternen, olfactofrontal Cistern, og quadrigeminal Cistern nær pinealkirtlen fordybning (figur 1E , venstre). CSF røbestoffer derefter ind i hjernen langs perivaskulære rum af de kortikale piale grene af den midterste cerebral arterie (MCA) (figur 1E, højre).
Transcranial optisk billeddannelse kan bruges til at studere glymfatiske funktion efter traumatisk hjerneskade (TBI)3. Mus fik en moderat TBI og umiddelbart efter blev en fluorescerende CSF Tracer (BSA-647) sprøjtet ind i CM24. CSF transport blev afbildet for 60 min efter TBI (figur 1f). Makroskopisk billeddannelse viser, at Tracer først ses på olfactofrontal cisternen, men glymphatisk tilstrømning langs kortikale Pvs'er er helt afskaffet på siden af TBI (figur 1G, supp. Movie 1). Tbi's hæmmende virkning på glymfatiske-funktionen er blevet påvist ved hjælp af flere andre metoder til kvantificering af Tracer og kan ligge til grund for forholdet mellem TBI og akkumulering af Aβ og Tau, der er set efter skade3. Kvantitativ analyse af in vivo -billeder viser, at det ipsilaterale tilstrømsområde er faldet næsten en tredjedel i forhold til den kontralaterale halvkugle (figur 1H).
Figur 1. Transcranial makroskopisk billeddannelse. A) skematisk af den makroskopiske billeddannelse, der er oprettet. B) dorsale syn på hoved pladens position på kraniet. Den interparietalknoglen knogle og næse, frontal, og parietal knogler er alle synlige. (C) et eksponeret muse kranium under billeddannelse, før CSF Tracer har optrådt, tydeligt viser alle kranie suturer af det intakte kraniet. Skala bjælke: 1 mm (D) skematisk af en lateral visning af CSF Tracer ind i Cisterna Magna (cm) og rejser fra basal cisternen langs glymfatiske pathway. (E, venstre panel) Makroskopisk billeddannelse af glymphatisk tilstrømning i en ketamin-xylazin bedøvet dværg mus ved 20 minutter post cm injektion (BSA-647; 10 μl ved 2 μl/min). CSF Tracer ses i olfactofrontal cisterne omkring den rostrale rhinal vene under nasofrontal sutur, langs nogle dele af den overlegne sagittale sinus under sagittale sutur, og i pinealkirtlen fordybning omkring tværgående sinus under lambdoid Sutur. (E, højre panel) Digital forstørrelse af billedet til venstre viser den høje rumlige opløsning opnået med disse mikroskoper. CSF Tracer rejser inden for perivaskulære rum i mellemhjernearterien (MCA)10. Skala bjælke: 0,5 mm (F) eksperimentel tidslinje. En bedøvet dværg mus fik en moderat traumatisk hjerneskade (TBI)24 og umiddelbart efter en cm injektion (BSA-647; 10 μl ved 2 μl/min), efterfulgt af 60 min af makroskopisk billeddannelse. (G) tidsforskudt billeder af CSF Tracer transport efter TBI (stiplede linje). Scale bar: 1 mm (H) tilstrømning område (mm2) over hver halvkugle i løbet af 60-min eksperiment, kvantificeret fra Rois i (G), den halvkugle, der modtog TBI (ipsilateral) og den halvkugle, der ikke (kontralateral). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1. Blueprint af Custom hovedplade. (A, B) nøjagtige målinger (i mm) af den brugerdefinerede hovedplade, der anvendes i transcranial makroskopisk billeddannelses protokol. 3D skematik af en udhulet hovedplade (C) og en hel hovedplade (D). Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film 1. Time-lapse billeddannelse af CSF transport efter moderat traumatisk hjerneskade til venstre parietal knogle. Varighed: 60 min. skala bjælke: 1 mm Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en detaljeret protokol til udførelse af transcranial CSF Imaging i levende mus ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende makroskoper og Tracers. Denne teknik er enkel og minimalt-invasiv, men kvantitativ. In vivo Imaging korrelerer godt med følsomme metoder såsom flydende scintillationstælling af radiomærkede røbestoffer, herunder 3H-dextran og 14C-inulinsirup efter cm levering, og med ex vivo koronalsektion Section kvantificering10, 18. Validering med to-foton mikroskopi viser, at CSF røbestoffer set langs kortikale blodkar under makroskopet er primært placeret inden for perivaskulære rum af MCA og dens filialer10. Disse indfatningsveje er en kritisk bestanddel af det glymphatiske system19. Selv om disse set-ups ikke er omfattet af denne protokol, kan de også bruges til at billed CSF clearance veje såsom meningeal og cervikal lymphatics25,26.
Forbedringer i hovedpladen design muliggør kronisk, stabil, Wide-felt billeddannelse af den samme mus over tid. Hoved pladens form, størrelse og vægt kan skræddersys til hver specifik applikation. Med fremskridt inden for laserskæring og 3D-udskrivning, er der få begrænsninger med hensyn til specifikationerne. Hoved plating giver også mulighed for langsgående billeddannelse af enten bedøvet eller vågen dyr og evnen til at billedet gennem en intakt kraniet undgår neuroinflammation og ødem forbundet med placeringen af kraniel eller tyndt kraniet Windows27, 28 , 29. Dette er en vigtig fordel, da stereotaxisk levering af fluorescerende røbestoffer gennem cortex i striatum eller laterale ventrikler ved hjælp af et kranielt Burr hul i høj grad reducere glymfatiske funktion20,26. De store Gantry og arbejdsafstande på de fleste kommercielle makroskoper gør det muligt for mus at blive fastgjort til scenen i forskellige konfigurationer, herunder løbehjul eller flydende labyrinter. Mus kan trænes og vænnede sig til at være hoved fastgjort til mikroskop scenen i løbet af 5-7-dages restitutionsperioden for at lette vågen billeddannelse30.
En af de vigtigste begrænsninger ved denne metode er den lave indtrængningsdybde af makroskopet sammenlignet med to-foton mikroskopi10. Denne enhed er i stand til at løse kun et par millimeter af den kortikale overflade under intakt kraniet. Men selv om dette begrænser billeddannelse af processer, der forekommer dybere ned i vævet, er det generelt ikke et problem for glymphatiske analyser, da de vigtigste indgangsveje primært er placeret omkring de vigtigste arterier i den dorsale kortikale overflade. På trods af at være ude af stand til at løse dybere strukturer, makroskoper med høj effektivitet videnskabelige CMOS-kameraer har stor fluorescens detektion; trods Tracer ikke er placeret på hjernen overflade, samlede fluorescens intensitet korrelerer med mængden af Tracer fundet i hjernen på hvert tidspunkt efter starten af CM injektion10. Disse parametre er forbedret ved brug af fjern røde, nær-infrarøde eller infrarøde røbestoffer, da billeddannelse på disse længere bølgelængder reducerer vævs Auto-fluorescens og spredning af lys, og har et overlegen signal-til-støj-forhold end lavere emission bølgelængde fluorophores. Standard makroskopet muliggør billeddannelse af mere end én Tracer i det samme eksperiment. Afhængigt af konfigurationen af makroskopet skal filter tårnet rotere mellem anskaffelser, hvilket drastisk reducerer den tidsmæssige opløsning, der kan opnås. Dette kan forbedres ved brug af justerbare lysdioder og en Multiband filter kube. På trods af denne forbedring, multikanal Imaging er ikke rigtig samtidige, da der er en forsinkelse i erhvervelsen, mens LED skifter mellem excitation bølgelængder. Det er muligt at opnå samtidige Dual Channel Imaging ved hjælp af billed opdeling optik, der er kompatible med de fleste makroskopiske set-ups; men disse ofre rumlig opløsning ved at dividere den fulde opløsning af CMOS-kameraet (2048 x 2048 pixel) i to synsfelter med halvdelen af opløsningen (1024 x 1024 pixel). Mens CMOS-kameraer er ganske passende til denne udnyttelse, kan brugen af et CCD-kamera også anvendes på denne applikation. En yderligere faktor, der reducerer tidsmæssig opløsning er den eksponeringstid, der kræves for tilstrækkelig excitation af den valgte fluorophore, som normalt spænder mellem 50-1000 ms. Dette kan optimeres yderligere ved at bruge enten 2x2 eller 4x4 pixel Binning, hvilket reducerer eksponeringstid og øger frame rate, på bekostning af rumlig opløsning. På trods af disse begrænsninger, transcranial macroskopisk multikanal Imaging er i stand til at opnå billedhastigheder mellem 10-20 Hz med høj rumlig opløsning.
Nylige eksempler på transcranial macroskopisk billeddannelse har brugt aquaporin-4 (AQP4) knock out-mus10,20 og trombocytafledt vækstfaktor B (PDGF-B) fastholdelses motiv Knockout-mus22 for at demonstrere vigtigheden af AQP4 og PDGF-B i det glymphatiske system. De undersøgelser, der anvendes C57Bl6 Wild type mus til at sammenligne med knockout musen linjer. De transcranially afbildet musene for en varighed på 30 min ved hjælp af fluorescerende røbestoffer og resultaterne konkluderede, at knockout linjer havde dramatisk reduceret CSF tilstrømning sammenlignet med wildtypes.
Disse egenskaber gør transcranial optisk billeddannelse en ideel teknik til at studere CSF transport, især mellem 2 eller flere kohorter af dyr. Det muliggør målinger af intracisternal Tracer kinetik i levende mus ved en micron Scale-opløsning til en brøkdel af omkostningerne ved andre in vivo-billedbehandlings metoder. Denne teknik gør det muligt at studere det glymphatiske system på en fysiologisk, ikke-invasiv måde, og har været nyttigt til at belyse nogle af de faktorer, der regulerer dets funktion i sundhed og sygdom10,20,25 . Men dens mest spændende attribut er dens potentiale til at besvare fremtidige spørgsmål om CSF hydrodynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde og National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 og RF1AG057575 til MN), Fondation Leducq transatlantiske net of Excellence-programmet og EU Horizon 2020-programmet for forskning og innovation (Grant nr. 666881; SVDs @ Target). Vi vil også gerne takke Dan Xue for eksperthjælp med grafiske illustrationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
