Summary
Las imágenes ópticas transcraneales permiten imágenes de campo amplio del transporte de líquido cefalorraquídeo en la corteza de ratones vivos a través de un cráneo intacto.
Abstract
El flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en roedores se ha estudiado en gran medida utilizando la cuantificación ex vivo de los trazadores. Técnicas como la microscopía de dos fotones y la resonancia magnética (RM) han permitido la cuantificación in vivo del flujo de LSN, pero están limitadas por la reducción de los volúmenes de imágenes y la baja resolución espacial, respectivamente. Trabajos recientes han encontrado que el LCH entra en el parénquima cerebral a través de una red de espacios perivasculares que rodean las arterias pial y penetrantes de la corteza de roedores. Esta entrada perivascular del LIF es un factor principal del sistema ginfotico, una vía implicada en el aclaramiento de solutos metabólicos tóxicos (p. ej., amiloide). Aquí, ilustramos una nueva técnica de imagen macroscópica que permite imágenes mesoscópicas en tiempo real de trazadores fluorescentes de CSF a través del cráneo intacto de ratones vivos. Este método mínimamente invasivo facilita una multitud de diseños experimentales y permite realizar pruebas únicas o repetidas de la dinámica del CSF. Los macroscopios tienen una alta resolución espacial y temporal y su gran pórtico y distancia de trabajo permiten la creación de imágenes mientras realizan tareas en dispositivos de comportamiento. Este enfoque de imagen ha sido validado utilizando mediciones de imágenes y fluorescencia de dos fotones obtenidas a partir de esta técnica se correlacionan fuertemente con la fluorescencia ex vivo y la cuantificación de trazadores radiomarcados. En este protocolo, describimos cómo se pueden utilizar imágenes macroscópicas transcraneales para evaluar el transporte ginfogático en ratones vivos, ofreciendo una alternativa accesible a las modalidades de imagen más costosas.
Introduction
El líquido cefalorraquídeo (LCR) baña el cerebro y la médula espinal y participa en el mantenimiento de la homeostasis, el suministro de nutrientes y la regulación de la presión intracraneal1. El LESO en el espacio subaracnoideo entra en el cerebro a través de una red de espacios perivasculares (PVS) que rodean las arterias cortales corticales y luego fluye a lo largo de las arterias penetrantes2. Una vez en el parénquima, el Líquido Cefalrea (CSF) intercambia con fluido intersticial (ISF), llevando metabolitos nocivos como el amiloide y los agregados de proteína tau del cerebro a través de vías de materia blanca de baja resistencia y espacios peligrosos2,3 . Esta vía depende de los canales astrogliales de la aquaporina-4 (AQP4) y, por lo tanto, se ha llamado el sistema glial-linfático (ginfotico)4. Los productos de desecho del neuropil se eliminan en última instancia del LIF-ISF a través de vasos linfáticos cerca de los nervios craneales y en las meninges hacia los ganglios linfáticos cervicales5. El fallo de este sistema ha estado implicado en varias enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer6,7, lesión cerebral traumática3,y accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico8.
El transporte del LSCa se puede visualizar infundiendo marcadores en la cisterna magna (CM)9,10 y estudios glinfoticos en el pasado han utilizado principalmente la microscopía de dos fotones4,11,12, 13, imágenes por resonancia magnética (RM)14,15,16,17y imágenes ex vivo3,6,11, 18 para evaluar la cinética del trazador. La microscopía de dos fotones es un método adecuado para la toma de imágenes detalladas de los trazadores de LSN en pvSpres y el parénquima debido a su alta resolución espacial, sin embargo, tiene un campo de visión estrecho y requiere una ventana craneal invasiva o adelgazamiento del cráneo. La imagen ex vivo, en combinación con la inmunohistoquímica, permite análisis multinivel que van desde células individuales hasta todo el cerebro19. Sin embargo, el proceso de fijación de perfusión que se requiere para observar el tejido post mortem produce cambios profundos en la dirección del flujo de LSN y colapsa el PVS, alterando significativamente la distribución y la ubicación de los trazadores12. Finalmente, mientras que la RMN puede rastrear el flujo de LSF a través de todo el cerebro murino y humano, carece de resolución espacial y temporal del flujo perivascular.
Una nueva técnica, la imagen macroscópica transcraneal, resuelve algunas de estas limitaciones al permitir imágenes de campo amplio del transporte de LSC perivascular en toda la corteza dorsal de ratones vivos. Este tipo de imágenes se realiza con un macroscopio epifluorescente utilizando un cubo de filtro multibanda, una fuente de luz LED ajustable y una cámara CMOS de alta eficiencia10. Estas configuraciones son capaces de resolver PVS hasta 1-2 mm por debajo de la superficie del cráneo y pueden detectar fluoróforos de hasta 5-6 mm por debajo de la superficie cortical mientras dejan el cráneo completamente intacto10. Los filtros multibanda y los LED que pueden ajustar rápidamente la longitud de onda de excitación permiten el uso de múltiples fluoróforos, lo que permite etiquetar el LSC con marcadores de diferentes pesos moleculares y propiedades químicas en el mismo experimento.
Este procedimiento requiere una cirugía simple y mínimamente invasiva para exponer el cráneo y colocar una placa de cabeza ligera para estabilizar la cabeza durante la sesión de diagnóstico por imágenes. Los trazadores se pueden entregar en el CM sin perforar el cráneoo penetrar el tejido cortical con pipetas o cánulas 9,20. Tanto las cánulas CM como las placas de cabeza permanecen estables durante varios días a semanas y facilitan diseños experimentales más complejos en comparación con la visualización clásica de punto final. Este protocolo describe cómo se utilizan imágenes macroscópicas transcraneales para estudiar la función del sistema ginfogático después de la inyección aguda o crónica de un marcador fluorescente de LSN fluorescente en el CM de ratones anestesiados/dormidos o despiertos.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales (UCAR, Protocolo No. 2011-023) en la Universidad de Rochester y realizados de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de la cánula cisterna magna, la placa de la cabeza y el soporte para la cabeza
- Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y placas de cabeza antes de la cirugía.
NOTA: Los trazadores fluorescentes se entregan directamente en el CSF a través de una cannulación cisterna magna. Para obtener instrucciones detalladas sobre este procedimiento, consulte Xavier et al9. - Brevemente, usando un controlador de aguja, rompa la punta de una aguja de 30G x 12.7 mm (1/2 pulgada), 3/4 del camino hacia abajo, y coloque el extremo romo de la aguja en un extremo de la tubería de polietileno 10 (PE10) (alrededor de 45 cm de largo). Asegúrese de que sólo el bisel sobresale de la frontera del tubo PE10.
- Romper 1/4 del extremo biselado de otra aguja de 30G y colocar el extremo romo de la aguja restante en el otro extremo del tubo PE10, con el luer-bloqueo de plástico todavía unido.
- Llenar una jeringa de vidrio de 100 ml con LCP artificial estéril (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM de glucosa y 26 mM NaHCO3).
- Coloque la jeringa al final de la línea y llénela con aCSF hasta que llegue a la punta de la aguja biselada. Es importante que la jeringa esté rellena da aCSF y no con aire, ya que una columna de aire es más propensa a volúmenes de perfusión variables.
- Para experimentos crónicos, deje la línea llena de aCSF y omita el paso 1.7.
- Para experimentos agudos, coloque la jeringa en una bomba de perfusión y retire aproximadamente 5 mm de aire, lo que evitará la mezcla. Después, retire el volumen total de trazadores que se desea para el experimento (se recomienda un 20% adicional debido a pérdidas de espacio muerto).
NOTA: El tubo PE10 debe ser lo suficientemente largo para que la burbuja de aire no entre en el manguito de plástico de la jeringa de vidrio al cargar el trazador. Para un experimento típico, el protocolo utiliza 10 l de albúmina sérica bovina conjugada con Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluida en aCSF al 0,5%. - Confirme que la placa de la cabeza encaja en el soporte de la cabeza y que tiene el tamaño adecuado para el ratón que se está utilizando. Marcadores anatómicos para asegurarse de que esto son: el borde superior de la ventana se alinea con la línea interocular y el borde posterior cae rostral a la cresta occipital.
NOTA: Las placas de cabeza de acero inoxidable se pueden esterilizar y reutilizar. La mayoría de las mezclas de cianoacrilato se pueden eliminar con una solución de acetona.
2. Procedimiento quirúrgico
- Pesar y anestesiar el ratón (por ejemplo, ketamina/xilazina; 100 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilazina; i.p.).
- Una vez que el ratón ya no responde a un pellizco del dedo del dedo del sol, humedezca el cuello y la cabeza con agua estéril y afitúe con cortadoras. Una vez que el área esté asenada, limpie el área con un hisopo de alcohol de nuevo para eliminar cualquier vello residual.
NOTA: Humedecer el pelaje antes de recortar reduce drásticamente la cantidad de cabello en la ventana de imágenes después de la incisión. - Coloque el ratón en un marco estereotáctico encima de una almohadilla de temperatura controlada y aplique pomada oftálmica de petróleo a los ojos del ratón para asegurarse de que no se sequen.
- Limpie la piel expuesta con un hisopo de clorhexidina. Después de 2 min, retire la clorhexidina con una toallita con alcohol. Por último, aplicar una solución de yodo que se puede dejar secar.
- Inyectar analgesia subcutánea (0,25% Bupivacaína HCl) en la parte superior del cráneo y el cuello.
- Comenzando en la parte del cuello que cubre la cresta occipital, haga un corte de línea media en la piel superpuesta y continúe rostrally hacia la línea interorbital. Incise lateralmente al borde donde el músculo temporal se inserta en el cráneo. Retire toda la piel de la incisión fusiforme para exponer los huesos frontales y parietales.
ADVERTENCIA: El seno retroorbital se encuentra caudal a los ojos y grandes ramas de la vena facial posterior se encuentran rostral a la pinna. Tenga cuidado al hacer la incisión para evitar estas estructuras. Si esto ocurre, deje de sangrar manteniendo la hemostasis con un hisopo de algodón estéril durante varios minutos y continúe. - Irrigar el cráneo con solución salina estéril y limpiar la superficie con hisopos de algodón para que esté libre de escombros y cabello, ya que estos interferirán con la calidad de la imagen. La transparencia del cráneo se conserva mejor dejando intacto el periosteo y la fascia superpuesta.
NOTA: Si estas estructuras se retiran accidentalmente, el cráneo puede volverse seco y opaco con el tiempo. Rehumedezca con aCSF o utilice una mezcla de aceite de parafina y glicerol para reducir la reflectancia del cráneo en experimentos agudos21. - Proceder a la inserción de la cisterna magna cánula - para los detalles quirúrgicos de este procedimiento, consulte Xavier et al9.
- Después de insertar la cánula CM, aplicar una mezcla de cemento dental con pegamento de cianoacrilato en el lado ventral de la placa de la cabeza alrededor del borde y colocarlo en el cráneo para que el borde anterior de la placa de la cabeza se alinee con la punta posterior del hueso nasal y el po borde del esterilizador se alinea con el aspecto anterior del hueso interparietal, asegurándose de que la sutura sagital (línea media) esté centrada y recta en relación con la ventana (Figura1B).
- Fije la posición de la placa de la cabeza usando un par de gotas de acelerador de pegamento. Llene los huecos restantes con la mezcla de cemento y cúsala con el acelerador.
ADVERTENCIA: Asegúrese de que el cianoacrilato no entre en contacto con los ojos del ratón ni bloquee la ventana de imágenes. - Pegue la cánula CM a la placa de la cabeza para asegurarse de que no se desenrosquen durante el transporte o cuando el ratón se despierte.
- Para experimentos agudos, vaya al paso 2.16.
- Para experimentos crónicos, aplique una fina capa de pegamento de cianoacrilato de secado claro al cráneo expuesto, teniendo cuidado de no crear burbujas ya que estas interferirán con la imagen. El pegamento proporciona protección para el cráneo y no interferirá con la imagen. Asegúrese de que el pegamento cubra el cráneo expuesto hasta la piel en el borde de la incisión.
- Utilice una abrazadera hemostat para sujetar el tubo PE10 lleno de aCSF a 2-3 cm del CM y corte la línea con una punta de cauterión de alta temperatura. Una vez separado, aplanar el tubo PE10 derretido para sellar la cánula.
ADVERTENCIA: Asegúrese de no soltar la abrazadera hasta después de que la cánula haya sido sellada y confirme que no hay fugas en el tubo para evitar una fístula del líquido de seguridad. - Administrar carprofeno (5 mg/kg cada 24 h durante 3 días; es decir, es decir, s.c.) y devolver el ratón a una jaula de una sola casa con control de temperatura y permitir que se recupere durante al menos 24 horas antes de la toma de imágenes. No deje el ratón desatendido hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal. Las ventanas craneales intactas permanecen estables durante varias semanas.
NOTA: El experimento crónico se puede pausar aquí.
ADVERTENCIA: Algunas complicaciones postoperatorias son: cefalohematoma/hematomas subgaleales, fístula de csfólico e infección. - Para experimentos agudos, coloque el ratón en el soporte de la cabeza usando la placa de la cabeza para que el cráneo esté en una posición fija. Asegúrese de revisar el nivel de anestesia y colocar una almohadilla de calentamiento debajo del ratón. El ratón ya está listo para ser llevado al macroscopio.
ADVERTENCIA: Transporte cuidadosamente el ratón junto con la bomba de perfusión en un carro. Si la cannulación de CM se desaloja, causará una caída en la presión intracraneal y cualquier fuga de líquido cefalorraquídeo alterará los resultados experimentales.
3. Preparación del ratón para la toma de imágenes
NOTA: El protocolo varía en función de si el experimento de imágenes se realizará en un ratón anestesiado (comienza en el paso 3.1) o se despierta (comienza en el paso 3.2).
- Ratones anestesiados
- Coloque el soporte de cabeza en el escenario del macróscopo, asegurándose de que no haya torceduras en la línea desde la bomba de la jeringa hasta la cánula CM y que no esté tensa ya que esto podría afectar a la perfusión del trazador.
- Observar la frecuencia respiratoria y la coloración rosa de las membranas mucosas, lo que indica una buena oxigenación. Inyecte salina por vía subcutánea para asegurar el nivel de hidratación si es necesario. Compruebe que el animal esté suficientemente anestesiado y redosifique si es necesario.
- Encienda la cámara del macroscopio y el LED e inicie el modo LIVE.
- Confirmar la ampliación del campo de imágenes para que la sutura nasofrontal en la parte superior del campo y la sutura lambdoid en la parte inferior se pueda visualizar claramente, con la sutura sagital paralela y centrada en el centro de la imagen (Figura 1C). Una vez en su lugar, fije el soporte de la cabeza a la etapa del macroscopio con cinta adhesiva.
- Enfoque el macroscopio en el cráneo expuesto. A pesar de que los macroscopios tienen una profundidad de campo relativamente grande, la curvatura del cráneo del ratón sólo permite que un área específica esté enfocada. Los mejores resultados se obtienen cuando el plano focal se encuentra en los lados laterales de los huesos parietales posteriores a las suturas coronales.
NOTA: Esta es la ubicación de las arterias cerebrales medias (MCA), donde se produce la mayor entrada de LIF (Figura1D,E)10.
- Ratones Despiertos
- Antes de la sesión de diagnóstico por imágenes, deje que los animales se recuperen durante al menos 24 horas de la cirugía de la placa de cabecera. También se recomiendan períodos de recuperación más largos (5-7 días). Durante este tiempo, entrenar el ratón para ser cabeza fija en el escenario en el tubo de sujeción para 0.5-1 h por día durante el período de recuperación.
NOTA: La habituación permite que el ratón se adhiera al soporte del cabezal sin anestesia y reduce el estrés y la ansiedad durante el experimento real. Si esto no es factible y la anestesia no interfiere con el experimento, se puede utilizar una dosis de inducción de un anestésico inhalado (por ejemplo, isoflurano 2% a 1-2 L/min O2 caudal) para conectar rápidamente el ratón a la etapa de la cabeza. - Una vez que el ratón esté fijado al soporte del cabezal y en el tubo de sujeción, siga los pasos 3.1.1-3.1.5.
- Antes de la sesión de diagnóstico por imágenes, deje que los animales se recuperen durante al menos 24 horas de la cirugía de la placa de cabecera. También se recomiendan períodos de recuperación más largos (5-7 días). Durante este tiempo, entrenar el ratón para ser cabeza fija en el escenario en el tubo de sujeción para 0.5-1 h por día durante el período de recuperación.
4. Infusión de trazadores fluorescentes de CSF
-
Canlación aguda de CM
- Dado que el trazador ya estaba cargado en la cánula antes de ser colocado en la cisterna magna en el paso 1.6, ajuste la bomba de perfusión a la velocidad y volumen deseados. Los paradigmas de infusión que se utilizan habitualmente son de 5-10 l a 1-2 l/min, pero estos parámetros se pueden ajustar dependiendo del experimento en particular, o del tamaño y la edad del animal.
-
Canlación crónica de CM
- Antes de comenzar la sesión de diagnóstico por imágenes, siga los pasos 1.2-1.7 para experimentos agudos para preparar la línea de perfusión para entregar los trazadores.
- Una vez preparada la línea, utilizando una abrazadera hemostat cortar el extremo sellado de la cánula CM crónica. Tome la aguja de la línea preparada en el paso 4.2.1 e insértela suavemente en la cánula. Suelte la abrazadera y, utilizando la bomba de la jeringa, avance el trazador de líquido de seguridad digital a la velocidad de perfusión deseada (p. ej., 2 l/min) para el experimento hasta que el trazador alcance la aguja implantada en el CM.
ADVERTENCIA: Si la aguja atraviesa el tubo al conectar la línea, retire la aguja, corte el segmento perforado y repita este paso. Cualquier desgarro en el tubo PE10 causará una fuga y afectará los resultados del experimento.
5. Configuración de la sesión de imágenes
- Basándose en el trazador fluorescente que se está infundiendo, determine la longitud de onda de excitación y el tiempo de exposición para cada canal. Elija el tiempo de exposición más corto necesario para visualizar el trazador con el fin de maximizar la resolución temporal de la imagen de lapso de tiempo. Este tiempo de exposición se utilizará para todos los experimentos posteriores con el objetivo de comparar el transporte de CSF entre diferentes animales.
NOTA: Una punta es utilizar el trazador en la línea CM para ajustar el tiempo de exposición. Aunque este es un primer enfoque útil, esto debe optimizarse con el tiempo. - Elija la duración del experimento y los intervalos en los que se adquirirán las imágenes. Los experimentos normalmente duran entre 30-60 min dependiendo de qué fase del transporte ginfogático es de interés. Las velocidades de fotogramas de 1 fotograma/min y más rápidas son suficientes para la mayoría de los experimentos.
- Establezca el nombre de archivo y el directorio de guardado.
- Si las imágenes se recogen además de la adquisición simultánea de otras variables (por ejemplo, electrocardiograma, presión arterial, electrofisiología), el macroscopio y la bomba se pueden programar para activarse con el software de adquisición de datos. Compruebe que la función de activación del macroscopio es correcta antes de pasar al paso siguiente.
6. Experimento de imágenes ópticas transcraneales
- Inicie la perfusión del trazador y la toma de imágenes al mismo tiempo.
- Revise rutinariamente la cánula CM y el tubo PE10 en busca de cualquier signo de fuga. Si hay alguna fuga de trazador en el CM, se deben excluir los resultados de este experimento.
NOTA: Si el marcador comienza a acumularse en el cerebelo y no viaja por la vía ginfotica del MCA, es probable que la cánula CM se haya inyectado en el cerebelo. Estos datos no deben incluirse. - Para experimentos agudos, después de completar el experimento, retire el ratón del microscopio y compruebe que todavía está adecuadamente anestesiado. Decapita rápidamente el ratón y cosecha el tejido cerebral. Fija el cerebro en 4% paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4oC.
- Para experimentos crónicos, una vez completada la toma de imágenes, retire la línea CM de la cánula, enjuague con aCSF estéril y vuelva a sellar la cánula CM con una punta de cauterización de alta temperatura. Retire el ratón del soporte de la cabeza y devuélvalo a su jaula. Repita este proceso hasta que no se requieran más imágenes y, a continuación, siga el paso 6.3.
7. Análisis de datos
NOTA: Los análisis basados en Matlab, como el seguimiento frontal del LIF, pueden extraer grandes cantidades de datos cuantitativos de los frentes del trazador en estos conjuntos de datos de imágenes10,22. Sin embargo, estos tipos de archivos también se pueden importar y analizar fácilmente en software de análisis de imágenes de código abierto como Fiji23.
- Importe las pilas de imágenes a Fiji con la herramienta de importación de formatos biológicos. Esta función conservará los metadatos del archivo, que incluye la resolución de tiempo y píxeles. Guarde la pila de imágenes como un archivo .tiff.
- Dibuje manualmente una región de interés (ROI) alrededor del cráneo o el área de interés utilizando la herramienta de selección de polígonos. Por ejemplo, en la Figura 1G se dibujó un ROI por separado para el ipsilateral y para el hemisferio contralateral después de una lesión cerebral traumática. Asegúrese de agregar el ROI al ROI Manager (Analyze>Tools>ROI Manager) y guárdelo.
NOTA: El transporte del LSF se puede cuantificar de dos maneras principales: 1) intensidad media de fluorescencia a lo largo del tiempo o 2) área de afluencia expresada como porcentaje del ROI o área total (mm2) después de haber aplicado un umbral. Este último método (Figura1H) se describirá en los pasos siguientes. - Establezca el umbral en el marco con fluorescencia máxima (Seleccionarimagen>Ajustar>Umbral...). Los métodos de umbral automatizados, como Otsu, son normalmente buenos para detectar el trazador de CSF. Aplique el umbral.
- Antes de seguir adelante, asegúrese de que en Analizar>Establecer medidas, las opciones Area y Area Fraction estén seleccionadas. A continuación, en roi manager, seleccione Más>Multimedida.
- Convierta el valor %Area en mm2 utilizando el valor Area del ROI de la salida. Los valores %Area reflejan el porcentaje de la superficie cortical dorsal con el trazador de CSF.
- Trazar la afluencia del trazador CSF en mm2 en función del tiempo.
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Representative Results
La afluencia de LSF se muestra en un macroscopio epifluorescente (Figura1A),que permite la toma de imágenes mesoscópicas del transporte del trazador de LSF en la corteza murina. La placa de cabeza de cráneo entero permite la visualización de los huesos nasales rostrales, tanto los huesos frontales como parietales en el centro, y la porción rostral del hueso interparietal caudalmente (Figura1B). Durante las imágenes, las suturas nasofrontal, sagital, coronal y lambdoid se pueden identificar fácilmente (Figura1C). Una vez que comienza la infusión de trazador de LSF en el CM (Figura1D),la fluorescencia del trazador se ve por primera vez en grandes piscinas de CSC subaracnoideo en la cisterna basal, cisterna olfatofrontal y la cisterna cuatriminal cerca del hueco pineal (Figura1E , a laizquierda). A continuación, los trazadores de LIF entran en el cerebro a lo largo de los espacios perivasculares de las ramas pial corticales de la arteria cerebral media (MCA) (Figura1E,derecha).
Las imágenes ópticas transcraneales se pueden utilizar para estudiar la función ginfotática después de una lesión cerebral traumática (TBI)3. Los ratones recibieron un TBI moderado e inmediatamente después se inyectó un marcador fluorescente de CSF (BSA-647) en el CM24. El transporte CSF se realizó durante 60 minutos después de TBI (Figura1F). Las imágenes macroscópicas muestran que el trazador se ve por primera vez en la cisterna olfatofrontal, pero la afluencia ginfomática a lo largo de los PVS corticales se abolió por completo en el lado del TBI (Figura1G, Película supp. 1). El efecto inhibitorio de la TBI sobre la función ginfofática se ha demostrado utilizando varios otros métodos de cuantificación del trazador y podría subyacen a la relación entre la TBI y la acumulación de A- y tau visto después de la lesión3. El análisis cuantitativo de imágenes in vivo muestra que el área de afluencia ipsilateral se reduce casi un tercio en comparación con el hemisferio contralateral (Figura1H).
Figura 1. Imágenes macroscópicas transcraneales. (A) Esquema de la configuración de imágenes macroscópicas. (B) Vista dorsal de la posición de la placa de la cabeza en el cráneo. El hueso interparietal y los huesos nasal, frontal y parietal son visibles. (C) Un cráneo de ratón expuesto durante la toma de imágenes antes de que aparezca el trazador del lifano, que muestra claramente todas las suturas craneales del cráneo intacto. Barra de escala: 1 mm (D) Esquema de una vista lateral del trazador CSF que entra en la cisterna magna (CM) y viaja desde la cisterna basal a lo largo de la vía gfática. (E, panel izquierdo) Imágenes macroscópicas de afluencia gfática en un ratón de tipo salvaje anestésico ketamina-xilazina a los 20 minutos después de la inyección de CM (BSA-647; 10 l a 2 l/min). El trazador de LSF se ve en la cisterna olfatofrontal alrededor de la vena rinal rostral debajo de la sutura nasofrontal, a lo largo de algunas partes del seno sagital superior por debajo de la sutura sagital, y en el rebaje pineal que rodea el seno transversal debajo del lambdoide Sutura. (E, panel derecho) El aumento digital de la imagen de la izquierda muestra la alta resolución espacial obtenida con estos microscopios. El trazador de líquido cefalorraquídeo viaja dentro de los espacios perivasculares de la arteria cerebral media (MCA)10. Barra de escala: 0,5 mm (F) Línea de tiempo experimental. Un ratón de tipo salvaje anestesiado recibió una lesión cerebral traumática moderada (TBI)24 e inmediatamente después de una inyección de CM (BSA-647; 10 l a 2 l/min), seguido de 60 minutos de imágenes macroscópicas. (G) Imágenes de lapso de tiempo del transporte del trazador de LSF después de TBI (línea discontinua). Barra de escala: 1 mm (H) área de afluencia (mm2) sobre cada hemisferio durante el experimento de 60 minutos, cuantificado de los IB en (G), el hemisferio que recibió TBI (ipsilateral) y el hemisferio que no lo hizo (contralateral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1. Plano de placa de cabeza personalizada. (A, B) Medidas exactas (en mm) de la placa de cabezal personalizada utilizada en el protocolo de imagen macroscópica transcraneal. Esquemas 3D de una placa decabeza ahuecada (C ) y una placa de cabeza entera (D). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película suplementaria 1. Imágenes de lapso de tiempo del transporte del RIF después de una lesión cerebral traumática moderada en el hueso parietal izquierdo. Duración: 60 min. Barra de escala: 1 mm Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Hemos descrito un protocolo detallado para realizar imágenes transcraneales de LSC en ratones vivos utilizando macroscopios y trazadores fluorescentes disponibles comercialmente. Esta técnica es simple y mínimamente invasiva, pero cuantitativa. La imagen in vivo se correlaciona bien con métodos sensibles como el recuento de centelleo líquido de tracdores radiomarcados, incluidos 3H-dextran y 14C-inulin después de la administración de CM, y con cuantificación de sección coronal ex vivo10, 18. La validación con microscopía de dos fotones demuestra que los trazadores de LSN observados a lo largo de los vasos sanguíneos corticales bajo el macroscopio se encuentran principalmente dentro de los espacios perivasculares de la MCA y sus ramas10. Estas vías de entrada de LSN son un componente crítico del sistema ginfogático19. Aunque no están cubiertos en este protocolo, estas configuraciones también se pueden utilizar para imaginar vías de aclaramiento del LSN, como los linfáticos meningeal y cervical25,26.
Las mejoras en el diseño de la placa de cabeza permiten imágenes crónicas, estables y de campo ancho del mismo ratón a lo largo del tiempo. La forma, el tamaño y el peso de la placa de cabeza se pueden adaptar para cada aplicación específica. Con los avances en el corte por láser y la impresión 3D, hay pocas limitaciones en cuanto a las especificaciones. El revestimiento de la cabeza también permite la toma de imágenes longitudinales de animales anestesiados o despiertos y la capacidad de crear imágenes a través de un cráneo intacto evita la neuroinflamación y el edema asociado con la colocación de ventanas craneales o delgadas del cráneo27, 28 , 29. Esta es una ventaja importante ya que la administración estereotaxcócica de trazadores fluorescentes a través de la corteza en el estriado o ventrículos laterales utilizando un agujero de rebaba craneal reduce en gran medida la función gfálica20,26. El pórtico grande y las distancias de trabajo de la mayoría de los macroscopios comerciales permiten que los ratones se fijen al escenario en varias configuraciones, incluyendo ruedas de carrera o laberintos flotantes. Los ratones pueden ser entrenados y habituados para ser fijados a la cabeza a la etapa del microscopio durante el período de recuperación de 5-7 días para facilitar la imagen despierta30.
Una de las principales limitaciones de este método es la baja profundidad de penetración del macroscopio en comparación con la microscopía de dos fotones10. Este dispositivo es capaz de resolver sólo unos pocos milímetros de la superficie cortical por debajo del cráneo intacto. Sin embargo, si bien esto limita la toma de imágenes de procesos que ocurren más profundamente en el tejido, generalmente no es un problema para los análisis glfáticos ya que las principales vías de entrada se encuentran principalmente alrededor de las arterias principales de la superficie cortical dorsal. A pesar de ser incapaces de resolver estructuras más profundas, los macroscopios con cámaras CMOS científicas de alta eficiencia tienen una gran detección de fluorescencia; a pesar de que el marcador no se encuentra en la superficie del cerebro, la intensidad total de la fluorescencia se correlaciona con la cantidad de trazador que se encuentra en el cerebro en cada momento después del inicio de la inyección de CM10. Estos parámetros se mejoran mediante el uso de trazadores infrarrojos, de infrarrojos o de infrarrojos, de color rojo lejano, de infrarrojos, ya que la toma de imágenes en estas longitudes de onda más largas reduce la autofluorescencia del tejido y la dispersión de la luz, y tienen una relación señal-ruido superior a la de menor emisión que la emisión más baja fluoróforos de longitud de onda. El macroscopio estándar permite la creación de imágenes de más de un trazador en el mismo experimento. Dependiendo de la configuración del macroscopio, la torreta del filtro tiene que girar entre las adquisiciones, reduciendo drásticamente la resolución temporal que se puede obtener. Esto se puede mejorar mediante el uso de LED ajustables y un cubo de filtro multibanda. A pesar de esta mejora, la imagen multicanal no es realmente simultánea, ya que hay un retraso en la adquisición mientras que el LED cambia entre longitudes de onda de excitación. Es posible lograr imágenes simultáneas de doble canal utilizando óptica de división de imágenes que son compatibles con la mayoría de las configuraciones macroscópicas; sin embargo, estos sacrifican la resolución espacial dividiendo la resolución completa de la cámara CMOS (2048 x 2048 píxeles) en dos campos de visión con la mitad de la resolución (1024 x 1024 píxeles). Mientras que las cámaras CMOS son bastante adecuadas para esta utilización, el uso de una cámara CCD se puede aplicar a esta aplicación también. Un factor adicional que reduce la resolución temporal es el tiempo de exposición necesario para la excitación adecuada del fluoróforo elegido, que normalmente oscila entre 50 - 1000 ms. Esto se puede optimizar aún más mediante el uso de binning de 2x2 o 4x4 píxeles, lo que reduce el tiempo de exposición y aumenta la velocidad de fotogramas, a expensas de la resolución espacial. A pesar de estas limitaciones, la imagen multicanal macroscópica transcraneal es capaz de alcanzar velocidades de fotogramas entre 10-20 Hz y alta resolución espacial.
Ejemplos recientes en imágenes macroscópicas transcraneales han utilizado ratones noqueados de aquaporina-4 (AQP4)10,20 y ratones knockout de factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B)22 para demostrar la importancia de AQP4 y PDGF-B en el sistema ginfogático. Los estudios utilizaron ratones de tipo salvaje C57Bl6 para compararcon las líneas de ratón knockout. Ellos imágenes transcranealmente de los ratones para una duración de 30 minutos utilizando marcadores fluorescentes y los resultados concluyeron que las líneas eliminatorias habían reducido drásticamente la afluencia de LRESULT en comparación con los tipos silvestres.
Estas propiedades hacen de la imagen óptica transcraneal una técnica ideal para estudiar el transporte por el CSF, especialmente entre 2 o más cohortes de animales. Permite mediciones de la cinética de trazador intracisternal en ratones vivos a una resolución a escala de micras, a una fracción del costo de otras modalidades de imágenes in vivo. Esta técnica permite el estudio del sistema ginfogático de forma fisiológica, no invasiva, y ha sido útil para ayudar a dilucidar algunos de los factores que regulan su función en salud y enfermedad10,20,25 . Sin embargo, su atributo más emocionante es su potencial para responder a preguntas futuras sobre la hidrodinámica del CSF.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos; R01NS100366 y RF1AG057575 a MN), el Programa de Redes Transatlánticas de Excelencia De la Fundación Leducq y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la UE (concesión no 666881; SVDs-target). También nos gustaría dar las gracias a Dan Xue por la asistencia de expertos con ilustraciones gráficas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
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