Summary
Transcranial הדמיה אופטית מאפשרת הדמיה בשדה רחב של הובלה נוזל מוחי שדרתי בקליפת עכברים חיים דרך הגולגולת שלם.
Abstract
נוזל מוחי שדרתי (שדרתי) זרימת מכרסמים כבר נחקרו בעיקר באמצעות לשעבר vivo קוונפיקציה של מנותבים. טכניקות כגון מיקרוסקופ 2-פוטון ותהודה מגנטית (MRI) הופעלו בvivo פיקציה של זרימת שדרתי, אבל הם מוגבלים על ידי מופחתת הדמיה של כרכים ורזולוציה מרחבית נמוכה, בהתאמה. העבודה האחרונה מצאה כי שדרתי נכנס את המוח בתוך מכסמה דרך רשת של חללים perivascular סביב העורקים החודר של קליפת מכרסם. זה הזנה וסקולרית של שדרתי הוא הנהג העיקרי של מערכת glymphatic, מסלול מעורב בסיווג של מסיסות מטבולית רעילים (למשל, עמילואיד-β). כאן, אנו ממחישים טכניקת דימות מקרוסקופי חדש המאפשר בזמן אמת, הדמיה מזוסקופית של מעבר שדרתי מפני פלורסנט דרך הגולגולת ללא פגע של עכברים חיים. שיטה מינימלית פולשנית זו מקלה על המון עיצובים ניסיוניים ומאפשרת בדיקה בודדת או חוזרת של דינמיקה של שדרתי. למקלוסקופים יש רזולוציה גבוהה של מרחבי וזמני ומרחק העבודה הגדול שלהם מאפשר דימות בעת ביצוע משימות על מכשירים התנהגותיים. גישה זו הדמיה כבר אומת באמצעות שני פוטונים הדמיה מדידות פלואורסצנטית שהתקבלו מטכניקה זו מאוד לתאם עם vivo לשעבר וכימות של מכשירי רדיו בעלי התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד הדמיה transcranial מאקרוסקופי ניתן להשתמש כדי להעריך את התחבורה הגלימפטית בעכברים חיים, המציעה חלופה נגישה ליותר שיטות הדמיה יקרות יותר.
Introduction
נוזל מוחי שדרתי (שדרתי) מרחץ את המוח ואת חוט השדרה והוא מעורב בשמירה על הומאוסטזיס, אספקת חומרים מזינים, ויסות לחץ תוך-גולגולתי1. מוחי שדרתי במרחב התת-ארכיוניאיד נכנס למוח דרך רשת של חללים פריכריים (PVS) המקיפים את העורקים הקורטיקליים ולאחר מכן זורמים לאורך העורק העורקי2. פעם אחת ב-כימומה, שדרתי החלפת עם נוזל ביניים (הקרן), נושאת מטבוליטים מזיקים כגון עמילואיד-β (Aβ) ו-טאו מצרפים החלבון מתוך המוח באמצעות התנגדות נמוכה החומר הלבן שטחי ומשטחים ורידים2,3 . מסלול זה תלוי בערוצי האסטרוגליאל aquaporin-4 (AQP4) ולכן כינה את מערכת glial-הלימפה (גלימפחטיק)4. פסולת מוצרים של נוירופיל מנוקה בסופו של דבר מתוך שדרתי-הקרן דרך כלי הלימפה ליד עצבי הגולגולת בתוך קרום המוח לעבר בלוטות הלימפה צוואר הרחם5. הכישלון של מערכת זו היה מעורב במספר מחלות נוירולוגיים כגון מחלת אלצהיימר6,7, פגיעה מוחית טראומטית3, והסכמי שבץ מדמם8.
הובלה בלתי מגנטית ניתן לדמיין על ידי החדרת מנותבים לתוך cisterna מגנה (CM)9,10 ומחקרים גלימפהטיים בעבר היו מנוצלים בעיקר 2-פוטון מיקרוסקופ4,11,12, 13, דימות תהודה מגנטית (MRI) 14,15,16,17, ו vivo ex הדמיה3,6,11, 18 להערכת קינטיקה מעקב. 2-פוטון מיקרוסקופ היא שיטה מתאימה עבור הדמיה מפורטת של מעקב שדרתי ב PVSs ואת הסרכימה בשל הרזולוציה המרחבית גבוהה שלה, עם זאת, יש שדה צר של השקפה והוא דורש חלון הגולגולת פולשני או דליל של הגולגולת. Vivo Ex הדמיה, בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, מאפשר ניתוחים מדורגת החל מתאים בודדים עד המוח כולו19. עם זאת, תהליך הפרזיה-קיבעון הנדרש להתבונן ברקמה שלאחר המוות, מייצר שינויים עמוקים בכיוון הזרימה השדרתי ומכווץ את ה-PVS, משנה באופן משמעותי את ההפצה ואת המיקום של המשדרים12. לבסוף, בעוד שהאמ-אר-איי יכול לעקוב אחר זרימת המוח המוחית לאורך כל הגוף האנושי ומכל האדם, היא חסרה ברזולוציה מרחבית וזמנית של זרימה פרימורית.
טכניקה חדשה, הדמיה transcranial מאקרוסקופי, פותרת חלק ממגבלות אלה על ידי הפעלת הדמיה של שדה רחב של הובלה שדרתי הפריסקולרית בקליפת המוח כולה של עכברים חיים. סוג זה של דימות מתבצע עם מאקרוסקופ פלורסנטי באמצעות קוביית מסנן multiband, מקור אור LED מהיר ויעילות גבוהה מצלמת CMOS10. אלה להגדיר קופצים מסוגלים לפתור PVSs עד 1-2 מ"מ מתחת למשטח הגולגולת והוא יכול לזהות fluorophores עד 5-6 מ"מ מתחת לפני השטח קליפת המוח תוך השארת הגולגולת לגמרי שלמים10. מסננים multiband ו נוריות שיכולות לכוונן במהירות את אורך הגל מאפשר השימוש fluorophores מרובים ומאפשר שימוש בחומרים מסוימים של שדרתי להיות מתויג עם מסומנים של משקולות מולקולרית שונים תכונות כימיות באותו ניסוי.
הליך זה דורש ניתוח פשוט, מינימלית פולשנית כדי לחשוף את הגולגולת ולמקם צלחת ראש במשקל קל כדי לייצב את הראש במהלך הפעלת ההדמיה. ניתן להעביר את המשדרים לתוך ס מ ללא קידוח לתוך הגולגולת או לחדור לרקמת קליפת המוח באמצעות פיפטות או באמצעות צינורית9,20. שתי הצינורית ולוחיות הראש של ה-CM נשארות יציבות במשך מספר ימים עד שבועות ומקלות את העיצובים הניסיוניים המורכבים יותר בהשוואה להדמיה הקלאסית של נקודת הסיום. פרוטוקול זה מתאר כיצד הדמיה transcranial מאקרוסקופי משמש לחקר פונקציית מערכת גלימפהטית בעקבות הזרקה חריפה או כרונית של מעקב שדרתי הפלורסנט לתוך CM של מורדם/שינה או לישון עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה על משאבי בעלי חיים (UCAR, פרוטוקול No. 2011-023) באוניברסיטת רוצ'סטר וביצע על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת הצינורית הcisterna גנה, צלחת הראש ומחזיק הראש
- לחטא את כל כלי הניתוח ואת לוחיות הראש לפני הניתוח.
הערה: מנותבים פלורסנט מועברים ישירות לתוך שדרתי באמצעות צינורית cisterna מגנה. לקבלת הוראות מפורטות על הליך זה, עיין חאווייר et al9. - בקצרה, באמצעות הנהג מחט, לשבור את הקצה של 30G x 12.7 mm (1/2 אינץ ') מחט, 3/4 של הדרך למטה, ומניחים את הקצה קהה של המחט לקצה אחד של פוליאתילן 10 (PE10) אבובים (כ 45 ס מ ארוך). ודא שרק השיקוע בולט מחוץ לגבול של אבובים PE10.
- לשבור את 1/4 של סוף משופע של המחט 30G אחר ולמקם את קצהו קהה של המחט שנותרה לקצה השני של אבובים PE10, עם פלסטיק Luer-lock עדיין מחובר.
- מילוי מזרק זכוכית 100 μL עם סטרילי, שדרתי מלאכותית (aCSF: 126 mM הנאקל, 2.5 mM KCl, 1.25 mM נה2פו4, 2 מ ' mgso4, 2 מ מ"מ cacl2, 10 מ"מ גלוקוז, ו 26 מ"מ נחקו3).
- חברו את המזרק לסוף הקו ומלאו אותו ב-aCSF עד שהוא מגיע לקצה המחט השופעת. חשוב כי המזרק הוא חזרה ממולא aCSF ולא אוויר, כמו עמודה האוויר נוטה יותר משתנה עירוי אינפוזיה.
- עבור ניסויים כרוניים, להשאיר את הקו מלא aCSF ולדלג על שלב 1.7.
- לניסויים חריפים, הניחו את המזרק על משאבת אינפוזיה ומשיכת כ-5 מ"מ אוויר, אשר תמנע ערבוב. לאחר מכן, למשוך את הנפח הכולל של מעקב (ים) הרצוי עבור הניסוי (20% תוספת מומלצת בשל הפסדים מקום מת).
הערה: אבובים PE10 צריך להיות ארוך מספיק כדי בועת האוויר לא להיכנס את השרוול פלסטיק של מזרק זכוכית בעת טעינת מכשיר המעקב. לניסוי אופייני, הפרוטוקול משתמש 10 μL של סרום שור האלבומין מצומנת ל אלקסה Fluor 647 (BSA-647) מדולל aCSF ב 0.5%. - ודא כי לוחית הראש מתאים למחזיק הראש וכי הוא בגודל הנכון עבור העכבר בשימוש. סמנים אנטומיים כדי להבטיח כי הם: הגבול העליון של החלון מתיישר עם הקו הבין-עינית והגבול האחורי נופל rostral לסמל העורף.
הערה: נירוסטה לוחות הראש יכול להיות מעוקר ולעשות שימוש חוזר. ניתן להסיר את רוב תערובות הציאנואקריאקרילי בתמיסה של אצטון.
2. הליך כירורגי
- שוקלים ומכהים את העכבר (למשל קטמין/xylazine; 100 mg/ק"ג, 10 מ"ג/ק"ג).
- ברגע העכבר לא מגיב עוד לצבוט הבוהן, מויסטן את הצוואר ואת הראש עם מים סטריליים לגלח באמצעות קוצץ. לאחר האזור הוא מגולח, לנגב את האזור עם מסיר אלכוהול שוב כדי להסיר שיער שיורית.
הערה: מויזת הפרווה לפני החיתוך מפחיתה באופן דרמטי את כמות השיער בחלון ההדמיה לאחר החיתוך. - מניחים את העכבר במסגרת סטריאוטקטיקה על גבי משטח שבשליטת טמפרטורה ולהחיל משחה אופטלמולוגית לעיניים של העכבר כדי להבטיח שהם לא להתייבש.
- נקו את העור החשוף בעזרת דגימה של כלורהקאידין. לאחר 2 דקות, להסיר את הכלקסאידין עם מחיקת אלכוהול. לבסוף, להחיל פתרון יוד אשר ניתן להשאיר להתייבש.
- הכנס כאבים תת-עוריות (0.25% בוטטין HCl) לראש הגולגולת ולצוואר.
- החל מהחלק של הצוואר המכסה את הרכס העורף, הפוך את קו האמצע לחתוך בעור המעלה והמשך באופן מפותח לכיוון קו האינטרביטל. היכן שהשריר הזמני. מכניס לתוך הגולגולת להסיר את כל העור של החתך ככישור לחשוף את העצמות הקדמית והקודקודית.
התראה: הסינוס הרטרוקאני נמצא בתוך העיניים וענפים גדולים של הווריד הפנים האחורי שוכב rostral לפינה. היזהר בעת ביצוע החתך כדי לחוס על מבנים אלה. אם זה קורה, להפסיק דימום על ידי שמירה על הומוסטאזיס עם ספוגית כותנה סטרילי למשך כמה דקות ולהמשיך. - לשטוף את הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילי ולנקות את פני השטח באמצעות מטליות כותנה כך שהוא חופשי של פסולת ושיער מאז אלה יפריעו איכות התמונה. שקיפות הגולגולת נשמרת בדרך הטובה ביותר על ידי עזיבת הקרום והfascia.
הערה: אם מבנים אלה יוסרו בטעות, הגולגולת יכול להיות יבש ואטום לאורך זמן. Re-מויסטן עם aCSF או להשתמש תערובת של שמן פרפין וגליצרול כדי להפחית את השתקפות הגולגולת בניסויים חריפים21. - המשך להוסיף את הצינורית cisterna מגנה-עבור פרטים כירורגיים של הליך זה, עיין חאווייר et al9.
- לאחר החדרת צינורית ס מ, להחיל תערובת של מלט שיניים עם דבק ציאנואקרילט בצד הגחוני של לוחית הראש סביב הגבול ומניחים אותו על הגולגולת כך הגבול הקדמי של צלחת הראש מיישר עם קצה האחורי של עצם האף ואת sterior הגבול מיישר עם ההיבט הקדמי של העצם הבין-קודקודית, ומוודאים שתפר המשונן (קו אמצע) ממורכז וישר יחסית לחלון (איור 1B).
- לתקן את המיקום של צלחת הראש באמצעות כמה טיפות של מאיץ דבק. מלא את הפערים הנותרים עם תערובת הבטון ולרפא אותו עם מאיץ.
התראה: ודא כי הציאנואקריאקרילי אינו בא במגע עם עיני העכבר או חוסם את חלון ההדמיה. - הדבק את צינורית ה-CM לצלחת הראש כדי להבטיח שאלה לא ינותקו במהלך ההובלה או כאשר העכבר יתעורר.
- לניסויים חריפים, דלג לשלב 2.16.
- לניסויים כרוניים, יש להחיל שכבה דקה של דבק ציאנואקריאקרילי ברור לגולגולת חשופה, להיזהר לא ליצור בועות כמו אלה יפריעו הדמיה. הדבק מספק הגנה לגולגולת ולא יפריע להדמיה. ודא כי הדבק מכסה את הגולגולת חשוף כל הדרך אל העור בגבול החתך.
- השתמש מהדק הומוסטט להחזיק את PE10-מלא של הצינורות 2-3 ס מ ס מ ס"מ ולחתוך את הקו עם טיפ בטמפרטורה גבוהה נמנעתי. ברגע שזה מופרד, לשטח את צינורות PE10 נמס לאטום את הצינורית.
התראה: הקפד לא לשחרר את התפס עד לאחר שהצינורית אטומה ולאשר שאין דליפות בצינורות כדי למנוע פיסטולה שדרתי. - ניהול carprofen (5 מ"ג/ק"ג כל 24 h עבור 3 ימים; כתוב או ספורטינג ראגה) ולהחזיר את העכבר לתוך מבוקרת טמפרטורה, יחיד שוכנו כלוב ולאפשר לו להתאושש לפחות 24 שעות לפני הדמיה. אל תשאירו את העכבר ללא השגחה עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה. חלונות הגולגולת שלמים. יישארו יציבים במשך מספר שבועות
הערה: ניתן להשהות כאן את הניסוי הכרוני.
התראה: כמה סיבוכים שלאחר הניתוח הם: צפלושטף המטמות/תת שדרתי, פיסטולה וזיהום. - עבור ניסויים חריפים, למקם את העכבר לתוך מחזיק הראש באמצעות צלחת הראש כך הגולגולת נמצאת במצב קבוע. הקפד לבדוק את רמת ההרדמה ולמקם משטח חימום מתחת לעכבר. העכבר מוכן כעת להילקח אל המקלוסקופ.
התראה: בזהירות להעביר את העכבר יחד עם משאבת האינפוזיה על עגלה. אם הצינורית ס מ הופכת להיות מחוצה, היא תגרום לירידה בלחץ בתוך התוך התוך-גולגולתי, וכל דליפות שדרתי את התוצאות הנסיוניות.
3. הכנת העכבר להדמיה
הערה: הפרוטוקול משתנה בהתאם לשאלה האם ניסוי הדימות יבוצע על מורדם (התחל בשלב 3.1) או ער (התחל בשלב 3.2) עכבר.
- עכברים שעברו הוראות
- מניחים את בעל הראש על הבמה של המקלוסקופ, ומוודאים שאין סטיות בקו ממשאבת המזרק לצינורית ס מ ושהיא לא מתוח מכיוון שזה יכול להשפיע על עירוי המעקב.
- שימו לב לקצב נשימתי וצבע ורוד של קרום הריריות, המעיד על חמצון טוב. הכנס תת-עורי תמיסת מלח כדי לאבטח את רמת העירוי במידת הצורך. בדוק כדי לוודא שהחיה מורדם במידה מספקת ומינון מחדש במידת הצורך.
- הפעל את מצלמת המקרו-טווח ו-LED והתחל במצב LIVE.
- לאשר את ההגדלה של השדה הדמיה כך תפר החזיתית בחלק העליון של השדה ואת התפר כבשה בתחתית יכול בבירור להיות דמיינו, עם תפר משונן מקביל ממורכז לאמצע התמונה (איור 1C). במקום כלשהו, אבטח את בעל הראש לשלב המקלוסקופ בקלטת.
- מקד את המקלוסקופ. על הגולגולת החשופה למרות מאקרוסקופים שיש לו עומק שדה גדול יחסית, העקמומיות של הגולגולת של העכבר רק מאפשר לאזור מסוים להיות בפוקוס. התוצאות הטובות ביותר מתקבלים כאשר מטוס המוקד ממוקם על הצדדים לרוחב של עצמות הקודקוד האחורי של תפרים ילתית.
הערה: זהו המיקום של העורקים המוחית האמצעית (MCA), שבו מתרחשת מרבית התזרים השדרתי (איור 1d, E)10.
- עכברים ערים
- לפני המפגש ההדמיה, תן לחיות להתאושש לפחות 24 שעות מניתוח לוחית הראש. תקופות שחזור ארוכות יותר (5-7 ימים) מומלצות גם כן. במהלך תקופה זו, הרכבת את העכבר כדי להיות ראש קבוע על הבמה בצינור האיפוק עבור 0.5-1 h ליום למשך תקופת ההחלמה.
הערה: הרגלה מאפשר לעכבר להיות מחובר למחזיק הראש ללא הרדמה ומפחית מתח וחרדה במהלך הניסוי בפועל. אם זה לא אפשרי הרדמה אינה מפריעה לניסוי, מנה אינדוקציה של הרדמה שאפה (g., isofלינה 2% ב 1-2 L/min O2 שיעור זרימה) ניתן להשתמש כדי לצרף במהירות את העכבר לשלב הראש. - ברגע שהעכבר מתוקן למחזיק הראש ובצינור הריסון, בצע את השלבים 3.1.1-3.1.5.
- לפני המפגש ההדמיה, תן לחיות להתאושש לפחות 24 שעות מניתוח לוחית הראש. תקופות שחזור ארוכות יותר (5-7 ימים) מומלצות גם כן. במהלך תקופה זו, הרכבת את העכבר כדי להיות ראש קבוע על הבמה בצינור האיפוק עבור 0.5-1 h ליום למשך תקופת ההחלמה.
4. אינפוזיה של ממדי שדרתי
-
צינורית ס מ חריפה
- מאז הנותב כבר נטען לתוך הצינורית לפני שהוא הוצב cisterna מגנה בשלב 1.6, להגדיר את משאבת האינפוזיה לקצב ונפח הרצוי. תבניות אינפוזיה המשמשות באופן שגרתי הן 5-10 μL ב-1-2 μL/min, אך ניתן לכוונן פרמטרים אלה בהתאם לניסוי המסוים, או לגודל ולגיל של בעל החיים.
-
צינורית ס מ כרונית
- לפני תחילת הפעלת ההדמיה, בצע את שלבים 1.2-1.7 עבור ניסויים חריפים כדי להכין את קו העירוי כדי לספק את המשדרים.
- ברגע שהקו מוכן, השימוש בתפס מלחציים חותך את הקצה האטום של צינורית ה-CM הכרונית. קחו את המחט מהקו שהוכן בשלב 4.2.1 והכניסו אותו בעדינות לצינורית. שחררו את המלחציים ושימוש במשאבת המזרק, התקדמו את מעקב השדרתי בשיעור העירוי הרצוי (לדוגמה, 2 μL/min) לניסוי עד שהמעקב יגיע למחט המושתלת ב-CM.
התראה: אם המחט מפלח את הצינורות בעת חיבור הקו, להסיר את המחט, לחתוך את קטע פירסינג ולחזור על שלב זה. כל קרע באבובים PE10 יגרום לדליפה וישפיע על תוצאות הניסוי.
5. הגדרת מושב ההדמיה
- בהתבסס על מעקב הפלורסנט החדרת, לקבוע את אורך הגל ואת זמן החשיפה עבור כל ערוץ. לבחור את זמן החשיפה הקצר ביותר הדרוש כדי להמחיש את מכשיר המעקב כדי למקסם את הרזולוציה הטמפורלית של הדמיה הזמן לשגות. זמן חשיפה זה ישמש עבור כל הניסויים הבאים במטרה להשוות הובלה שדרתי בין חיות שונות.
הערה: עצה אחת היא להשתמש בנותב בשורה CM כדי לכוונן את זמן החשיפה. למרות שזוהי גישה ראשונה שימושית, זה צריך להיות ממוטב לאורך זמן. - בחר את משך הניסוי ואת המרווחים שבהם התמונות יירכשו. ניסויים האחרונים בדרך כלל בין 30-60 דקות בהתאם לאיזה שלב של התחבורה של גלימפחטיק הוא עניין. שערי מסגרת של 1 מסגרת/דקה ומהר יותר מספיקים עבור רוב הניסויים.
- הגדר את שם הקובץ ואת ספריית השמירה.
- אם ההדמיה ייאספו בנוסף לרכישה בו של משתנים אחרים (לדוגמה, אלקטרוליקט, לחץ דם עורקי, אלקטרופיזיולוגיה), ניתן לתכנת את המקלוסקופ ואת המשאבה כך שתופעל עם תוכנת רכישת הנתונים. בדוק שפונקציית המפעיל במקלוסקופ נכונה לפני המעבר לשלב הבא.
6. ניסוי הדמיה אופטית Transcranial
- הפעל את עירוי המעקב ואת ההדמיה באותו זמן.
- בדוק באופן שגרתי את צינורית CM ואת אבובים PE10 עבור כל סימן של דליפה. אם יש מעקב דולף ב-CM, התוצאות מהניסוי הזה חייבות להיות מושמטים.
הערה: אם מעקב מתחיל להצטבר המוח החצי ולא לנסוע מסלול גלימפהטיק של MCA, סביר להניח כי צינורית ס מ הוזרק לתוך המוח התוך. אין לכלול נתונים אלה. - עבור ניסויים חריפים, לאחר סיום הניסוי, להסיר את העכבר מן המיקרוסקופ ולבדוק כי הוא עדיין מורדם כראוי. במהירות לערוף את ראשו של העכבר ולקצור את רקמת המוח. הטבילה-לתקן את המוח ב 4% פאראפורמלדהיד (בשיא) לילה ב 4 ° c.
- לניסויים כרוניים, לאחר השלמת ההדמיה, הסירו את קו ס מ מהצינורית, שוטפים בעזרת aCSF סטרילי ומreseal את צינורית ה-CM עם טיפ בטמפרטורה גבוהה. להסיר את העכבר ממעמד הראש ולהחזיר אותו לכלוב שלו. חזור על תהליך זה עד שהדמיה נוספת לא תידרש ולאחר מכן בצע את שלב 6.3.
7. ניתוח נתונים
הערה: ניתוחים מבוססי Matlab, כגון מעקב מוחי מוחי קדמי יכולים לחלץ כמויות גדולות של נתונים כמותיים מחזיתות המעקב בנתונים אלה של הדמיה מסוג10,22. עם זאת, סוגי קבצים אלה יכולים גם להיות מיובאים בקלות ומנותח בתוכנה קוד פתוח לניתוח תמונות כמו פיג'י23.
- יבא את ערימות התמונות לתוך פיג'י באמצעות כלי הייבוא של תבניות ביו-פורמטים. פונקציה זו תשמור על מטא-נתונים של הקובץ הכוללים את הזמן ורזולוציית הפיקסל. שמור את מחסנית התמונה כקובץ. tiff.
- צייר באופן ידני אזור מעניין (ROI) סביב הגולגולת או על אזור העניין באמצעות כלי בחירת המצולע. לדוגמה, באיור 1G ההחזר היה מצויר בנפרד לקבלת צלעות ולחצי הכדור הצלעות לאחר פגיעה מוחית טראומטית. הקפד להוסיף את ה-ROI לתוך מנהל ROI (לנתח ≫ כלים > ROI manager) ולשמור אותו.
הערה: ניתן לכמת את ההובלה בשתי דרכים עיקריות: 1) משמעות העוצמה הפלואורסצנטית לאורך זמן או 2) שטח זרם המבוטא כאחוז של התשואה או האזור הכולל (mm2) לאחר החלת הסף. השיטה האחרונה (איור 1H) יתואר בשלבים הבאים. - הגדר את הסף על המסגרת עם הזריחה המקסימלית (בחר תמונה > התאם ≫ הסף...). שיטות הסף האוטומטיות כגון Otsu הם בדרך כלל טוב בזיהוי מעקב שדרתי. החל את הסף.
- לפני התקדמות, ודא שבניתוח ≫ קביעת מדידות, אזור האפשרויות והחלק באזור נבחרים. לאחר מכן , במנהל הROI, בחר יותר > מידה מרובה.
- המר את הערך % Area ל-mm2 באמצעות ערך האזור של ה-ROI מהפלט. הערכים של % Area משקפים את אחוז המשטח הקורטימתי עם מעקב שדרתי.
- העלילה שדרתי מעקב זרם mm2 כפונקציה של זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרם מוחי שדרתי מופעל על גבי מקרוסקופ אפיאוסקופי (איור 1A), המאפשר הדמיה מזוסקופית של הובלת מעקב שדרתי בקליפת מורטין. צלחת ראש הגולגולת כולה מאפשרת ויזואליזציה של עצמות האף rostral, הן העצמות הקדמית הקודקודית במרכז, ואת החלק הrostral של העצם הבין הקודקודית (איור 1B). במהלך הדמיה, התפרים החזיתית, משונן, coronal, והתפר למדוגאיד ניתן לזהות בקלות (איור 1C). לאחר העירוי של מנותב שדרתי לתוך ס מ מתחיל (איור 1D), מעקב פלואורסצנטית הוא ראה לראשונה בריכות גדולות של שדרתי תת מימדית על בור המים הבזליים, בבור המצח הפרונטלי, ואת בור הארבע הקדמי ליד הפסקה האצטרובית (איור 1d , משמאל). ולאחר מכן להיכנס המוח לאורך מרחבי החלל הפריקל של הענפים הקורטיפיאל של העורקים התיכונה של עורק המוח האמצעי (MCA) (איור 1E, ימין).
Transcranial הדמיה אופטית ניתן להשתמש כדי ללמוד פונקציה גלימפחטיק לאחר פגיעה מוחית טראומטית (TBI)3. עכברים קיבלו TBI מתון ומיד לאחר מכן מעקב הניאון שדרתי (BSA-647) הוזרק לתוך ה-CM24. הובלת שדרתי היתה תמונה עבור 60 דקות לאחר TBI (איור 1F). הדמיה macroscopic מראה כי מעקב נראה לראשונה בבור הקדמי olfactofrontal אבל הזרימה גלימפהטיק לאורך PVSs הקליפת בוטלה לחלוטין בצד של TBI (איור 1G, Supp. סרט 1). השפעת העיכוב של TBI על הפונקציה גלימפחטיק הוצגה באמצעות מספר שיטות מעקב אחר מנותב ויכול לשכב את הקשר בין TBI לבין הצטברות של Aβ והטאו ראה לאחר פציעה3. ניתוח כמותי של תמונות vivo מראים כי האזור הזרם מגיע לירידה כמעט שליש בהשוואה לחצי הכדור הצלעות (איור 1h).
איור 1. הדמיה Transcranial מקרוסקופי. (א) סכימטי של הדמיה מאקרוסקופי הוגדרה. (ב) תצוגה מקדימה של מיקום לוחית הראש על הגולגולת. העצם הבין-קודקודית ועצמות האף, הקדמית והקודקודית נראות לעין. (ג) גולגולת העכבר חשוף במהלך הדמיה לפני מעקב שדרתי הופיע, בבירור מראה את כל התפרים הגולגולת של הגולגולת שלם. סרגל בקנה מידה: 1 מ"מ (ד) סכמטי של מבט לרוחב של מעקב שדרתי הזנה הזנת cisterna מגנה (CM) ונסיעה מן בור הבסיס לאורך השביל גלימפחטיק. (E, הלוח השמאלי) הדמיה מקרוסקופי של הזרמת גלימפהטיק בתוך קטמין-xylazine בעכבר בגודל 20 דקות פוסט ס מ הזרקת (BSA-647; 10 μL ב 2 μL/min). מעקב שדרתי הוא נראה בבור המצח הפרונטלי סביב הווריד rostral מתחת לתפר החזיתית, לאורך חלקים מסוימים של הסינוס משונן מעולה מתחת לתפר משונן, ובהפסקות האצטרובל סביב הסינוס הרוחבי מתחת למדואיד תפר. (E, בלוח הימני) הגדלה דיגיטלית של התמונה בצד שמאל מראה את הרזולוציה המרחבית גבוהה שהושג עם אלה מיקרוסקופים. מעקב שדרתי בתוך החללים הפריכריים של עורק המוח האמצעי (MCA)10. סרגל קנה מידה: 0.5 מ"מ (F) ניסיוני ציר זמן. עכבר מסוג wildtype מורדם קיבל פגיעה מוחית טראומטית מתונה (tbi)24 ומיד אחרי הזרקה ס מ (bsa-647; 10 μl ב 2 μl/min), ואחריו 60 דקות של הדמיה מאקרוסקופי. (ז) זמן לשגות בתמונות של העברת מעקב שדרתי לאחר tbi (קו מקווקו). סרגל קנה מידה: 1 mm (H) זרם (mm2) על כל כדור המחצית במהלך הניסוי 60-min, ככמת מן Rois ב (ז), האונה שקיבלה tbi (ipsilateral) ואת החצי הכדור כי לא (הקונאלצלעות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלים איור 1. תוכנית של לוחית. ראש מותאמת אישית (א, ב) מדידות מדויקות (mm) של צלחת הראש מותאם אישית המשמש בפרוטוקול הדימות transcranial מאקרוסקופי. שרטוט תלת מימד של צלחת ראש חלולה (C) ולוחית ראש שלמה (D). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרט משלים 1. זמן הדמיה של הרכב שדרתי לאחר פגיעה מתונה במוח טראומטית לעצם הקודקוד השמאלי. משך: 60 דקות-סרגל שינוי גודל: 1 מ"מ לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו לתאר פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה transcranial שדרתי בעכברים חיים באמצעות מסחרית-זמין מקרוסקופים פלורסנט ו מנותבים. טכניקה זו פשוטה ומינימלית-פולשנית, אך כמותית. בהדמיה vivo מתואם היטב עם שיטות רגישות כגון ספירת מבחנות של מכשירי רדיו המסומנים ב- 3כ-dextran ו -14ג-אינולין לאחר משלוח CM, ועם הvivo הלשעבר של המחלקה הלאומית10, . שמונה עשרה אימות עם שני פוטון מיקרוסקופ ממחיש כי מראות מעבר שדרתי ראה לאורך כלי הדם הקורטיקליים מתחת לmacroscope ממוקמים בעיקר בתוך מרחבים הפריסקולריים של MCA וענפיו10. הם מרכיב קריטי. במערכת הגלימפטית19 למרות שאינם מכוסים בפרוטוקול זה, אלה מערכת האלה יכול לשמש גם כדי התמונה מסלולים בעלי הסיווג העצביים כגון מנטאינאל וצוואר הרחם lymphatics25,26.
שיפורים בעיצוב לוחית הראש מאפשר כרונית, יציבה, הדמיה בשדה רחב של אותו עכבר לאורך זמן. ניתן להתאים את צורת צלחת הראש, גודל ומשקל עבור כל יישום ספציפי. עם ההתקדמות בחיתוך לייזר והדפסה תלת-ממדית, קיימות מספר מגבלות על המפרט. ציפוי הראש גם מאפשר הדמיה האורך של בעלי חיים או מורדם או ער היכולת התמונה באמצעות הגולגולת שלמים נמנע דלקת ובצקת הקשורים עם מיקום של הגולגולת או דק חלונות המוח27, מיכל בן 28 , 29. זהו יתרון חשוב מאז המסירה סטריאוטקטית של מנותבים פלורסנט דרך קליפת לתוך החלל בסטריאטום או החלל הצדדי באמצעות חור גולגולת בור מאוד להפחית את הפונקציה glymphatic20,26. גנטרי גדול ומרחקים עבודה של רוב מאקרוסקופים המסחרי לאפשר לעכברים להיות קבוע לשלב בתצורות שונות, כולל גלגלי ריצה או מבוכים צפים. עכברים יכולים להיות מאומנים ונובעת להיות ראש קבוע לשלב המיקרוסקופ במהלך תקופת ההחלמה 5-7 יום כדי להקל על הדמיה ערה30.
אחת המגבלות העיקריות של שיטה זו היא עומק החדירה הנמוך של המקלוסקופ לעומת מיקרוסקופ שני-פוטון10. המכשיר הזה מסוגל לפתור רק כמה מילימטרים של משטח קליפת המוח מתחת לגולגולת ללא פגע. עם זאת, בעוד זה מגביל את הדמיה של תהליכים המתרחשים עמוק יותר ברקמה, זה בדרך כלל לא בעיה לניתוח גלימפטי מאז המסלולים העיקריים של הכניסה ממוקמים בעיקר סביב העורקים העיקריים של המשטח הקורטיקלית התחתית. למרות היותו מסוגל לפתור מבנים עמוקים יותר, מאקרוסקופים עם יעילות גבוהה מצלמות CMOS מדעיים יש זיהוי זריחה גדולה; למרות מעקב לא להיות ממוקם במשטח המוח, עוצמת הקרינה הכוללת התואם את כמות המעקב שנמצאו במוח בכל נקודה לאחר תחילת הזריקה ס מ10. פרמטרים אלה משופרים על ידי שימוש של האדום, הקרוב אינפרא אדום, או אינפרא אדום המשדרים מאז הדמיה באורכי גל ארוכים אלה מפחית את הרקמה באופן אוטומטי הקרינה ואת פיזור האור, ויש להם יחס מעולה של אות אל הרעש מאשר פליטה נמוך אורך גל fluorophores. המקרו-טווח הרגיל מאפשר דימות של יותר מנותב אחד באותו ניסוי. בהתאם לתצורת ה-macroscope, המסנן הצריח צריך להסתובב בין רכישות, ולהקטין באופן דרסטי את הרזולוציה הטמפורלית שניתן להשיג. זה יכול להיות משופר על ידי שימוש של נוריות tunable וקוביית מסנן multiband. למרות שיפור זה, הדמיה רב-ערוצית הוא לא באמת סימולטני, מאז יש עיכוב ברכישה בעוד LED מעביר בין אורכי גל עירור. ניתן להשיג הדמיה בו במקביל ערוץ כפול באמצעות מפצל תמונה אופטיקה התואמים עם רוב המערכת מאקרוסקופי; עם זאת, אלה להקריב רזולוציה מרחבית על ידי חלוקת הרזולוציה המלאה של מצלמת ה-CMOS (2048 x 2048 פיקסל) לשני שדות של תצוגה עם חצי הרזולוציה (1024 x 1024 פיקסל). בעוד מצלמות ה-CMOS די מספיקים עבור ניצול זה, השימוש במצלמת CCD ניתן להחיל על יישום זה גם. גורם נוסף המפחית את הרזולוציה הטמפורלית הוא זמן החשיפה הנדרש עבור עירור הולם של fluorophore אשר בדרך כלל נע בין 50-1000 ms. זה יכול להיות ממוטב נוסף באמצעות שני 2x2 או 4x4 פיקסל binning, אשר מפחית זמן החשיפה ומגדיל את קצב הפריימים, על חשבון הרזולוציה המרחבית. למרות מגבלות אלה, transcranial מאקרוסקופי הדמיה רב-ערוצי מסוגל להשיג שיעורי מסגרת בין 10-20 הרץ עם רזולוציה מרחבית גבוהה.
דוגמאות אחרונות בהדמיה transcranial מאקרוסקופי השתמשו aquפורטל in-4 (AQP4) לנקוש עכברים10,20 ו-מקדם דם נגזר גורם הגידול B (pdgf-B) שמירה מוטיב הסתרת עכברים22 כדי להדגים את החשיבות של AQP4 ו-PDGF-B במערכת הגלימפטית. המחקרים השתמשו בעכברים C57Bl6 type כדי להשוות את קווי העכבר מנוקאאוט. הם מtranscranially את העכברים במשך 30 דקות באמצעות מצטלבים פלורסנט והתוצאות הגיעו למסקנה שקווי הנוקאאוט הפחיתו באופן דרמטי את זרם השדרתי לעומת סוגי הwildtypes
מאפיינים אלה להפוך transcranial אופטי הדמיה טכניקה אידיאלית לחקר הובלה שדרתי, במיוחד בין 2 או יותר הגדודים של בעלי חיים. הוא מתיר מדידות של קינטיקה מעקב תאיים בעכברים חיים ברזולוציה מיקרון בקנה מידה, בכל חלק של העלות של אחרים בvivo הדמיה. טכניקה זו מאפשרת את המחקר של מערכת גלימפהטיק באופן פיזיולוגי, לא פולשני, והיה שימושי לעזור להבהיר חלק מהגורמים המסדירים את תפקידה בבריאות ומחלה10,20,25 . עם זאת, התכונה המרגשת ביותר שלה היא הפוטנציאל שלה לענות על שאלות עתידיות על הידרודינמיקה של שדרתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ המכון הלאומי על הזדקנות (מכוני הבריאות הלאומי של ארה ב; R01NS100366 ו-RF1AG057575 ל-MN), תוכנית מצוינות לרשתות טראנס-אטלנטית, ואופק האיחוד האירופי 2020 תוכנית מחקר וחדשנות (מענק מס ' 666881; היעד של SVDs @). אנחנו גם רוצים להודות לדן Xue לקבלת סיוע מומחה עם איורים גרפיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
