Summary
Transcranial optisk avbildning tillåter wide-fält avbildning av cerebrospinalvätska transport i cortex av levande möss genom en intakt skalle.
Abstract
Cerebrospinalvätska (CSF) flöde i gnagare har till stor del studerats med hjälp av ex vivo kvantifiering av spårämnen. Tekniker som två-Photon mikroskopi och magnetisk resonanstomografi (MRI) har möjliggjort in vivo kvantifiering av CSF flöde men de är begränsade av minskad avbildning volymer och låg rumslig upplösning, respektive. Nyligen arbete har funnit att CSF kommer in i hjärnan parenkymet genom ett nätverk av perivaskulära utrymmen som omger Arvika och penetrerande artärer i gnagare cortex. Detta perivaskulära inträde av CSF är en primär förare av glymphatic systemet, en väg inblandad i clearance av giftiga metaboliska lösta ämnen (t. ex., amyloid-β). Här illustrerar vi en ny makroskopiska Imaging teknik som möjliggör realtid, Mesoskopisk avbildning av fluorescerande CSF spår genom intakt skalle av levande möss. Denna minimalinvasiva metod underlättar en mängd experimentella konstruktioner och möjliggör enkel eller upprepad testning av CSF dynamik. Macroscopes har hög rumslig och temporal beslutsamhet och deras stor portal och arbetande distans tillåta för tänkbar fördriva tiden utför uppgiften på beteende anordningen. Denna avbildning metod har validerats med hjälp av två-Photon Imaging och fluorescens mätningar som erhållits från denna teknik starkt korrelerar med ex vivo fluorescens och kvantifiering av radio-märkta spårämnen. I detta protokoll beskriver vi hur transkraniell makroskopisk avbildning kan användas för att utvärdera glymphatic transport i levande möss, och erbjuder ett tillgängligt alternativ till mer kostsamma avbildningsmetoder.
Introduction
Cerebrospinalvätska (CSF) badar hjärnan och ryggmärgen och är involverad i att upprätthålla homeostas, leverera näringsämnen, och reglera intrakraniellt tryck1. CSF i subaraknoidalrummet går in i hjärnan genom ett nätverk av perivaskulära utrymmen (PVS) omgivande kortikala Arvika artärer och sedan flyter ner längs penetrerande arterioler2. En gång i parenkymet, CSF utbyten med interstitiell vätska (ISF), transporterar skadliga metaboliter såsom amyloid-β (Aβ) och tau protein aggregat ut ur hjärnan genom låg motståndskraft vit materia skrifter och perivenösa utrymmen2,3 . Denna väg är beroende av astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler och har därför kallats den Glial-lymfatiska (glymphatic) system4. Avfallsprodukter av neuropil slutligen rensas från CSF-ISF genom lymfkärl nära kranialnerver och i hjärnhinnorna ut mot livmoderhalsen lymfkörtlar5. Misslyckandet med detta system har varit inblandad i flera neurologiska sjukdomar som Alzheimers sjukdom6,7, traumatisk hjärnskada3, och ischemisk och hemorragisk stroke8.
CSF transport kan visualiseras genom infusion spårämnen i Cisterna magna (cm)9,10 och glymphatic studier i det förflutna har främst utnyttjat två-Photon mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonanstomografi (MRI)14,15,16,17och ex vivo Imaging3,6,11, 18 för att utvärdera spårkinetik. Två-Photon mikroskopi är en lämplig metod för detaljerad avbildning av CSF spårämnen i PVSs och parenkymet på grund av dess höga rumsliga upplösning, men det har ett smalt synfält och kräver en invasiv kranial fönster eller gallring av skallen. Ex vivo Imaging, i kombination med immunohistokemi, möjliggör multinivåanalyser som sträcker sig från enstaka celler upp till hela hjärnan19. Emellertid, processen för perfusion-fixering som krävs för att iaktta post-mortem vävnad producerar djupgående förändringar i CSF flödesriktning och kollapsar PVS, avsevärt ändra fördelningen och placeringen av spårämnen12. Slutligen, medan MRI kan spåra CSF flöde genom hela murin och mänskliga hjärnan, det saknar rumsliga och temporal upplösning av perivaskulära flödet.
En ny teknik, transkraniell makroskopisk avbildning, löser några av dessa begränsningar genom att möjliggöra bred fält avbildning av perivaskulär CSF transport i hela dorsala cortex av levande möss. Denna typ av avbildning görs med ett epifluorescerande makroskop med hjälp av en flerbandsfilterkub, en avstämbar LED-ljuskälla och högeffektiv CMOS-kamera10. Dessa uppställningar har möjlighet att lösa PVSs upp till 1-2 mm under skallytan och kan detektera fluoroforer upp till 5-6 mm under den kortikala ytan och lämnar skallen helt intakt10. Flerbandsfilter och lysdioder som snabbt kan finjustera magnetiseringsvåglängden möjliggör användning av flera fluoroforer som tillåter CSF att märkas med spår av olika molekylvikter och kemiska egenskaper i samma experiment.
Detta förfarande kräver en enkel, minimalt invasiv kirurgi för att exponera skallen och placera en lätt huvud plattan att stabilisera huvudet under fotografering sessionen. Tracers kan levereras in i cm utan att borra i skallen eller tränga in i kortikal vävnad med pipetter eller kanyl9,20. Båda CM kanylerna och huvud plattorna förblir stabila i flera dagar till veckor och underlättar mer komplexa experimentella konstruktioner jämfört med den klassiska slutpunkts visualiseringen. Detta protokoll beskriver hur transkrakala makroskopiska avbildning används för att studera glymphatic system funktion efter akut eller kronisk injektion av fluorescerande CSF Tracer i CM av anestetized/sova eller vakna möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes av universitets kommittén för djur resurser (UCAR, protokoll nr 2011-023) vid University of Rochester och utfördes enligt NIH guide för vård och användning av försöksdjur.
1. beredning av Cisterna magna kanyl, huvud plåt och huvud hållare
- Sterilisera alla kirurgiska instrument och huvudplattor före operationen.
Anmärkning: fluorescerande spårämnen levereras direkt till CSF via en Cisterna magna kanylering. För detaljerade instruktioner om detta förfarande, se Xavier et al9. - Kort, med hjälp av en nål förare, bryta spetsen på en 30G x 12,7 mm (1/2 tum) nål, 3/4 av vägen ner, och placera den trubbiga änden av nålen i ena änden av polyeten 10 (PE10) slangar (ca 45 cm lång). Se till att endast avfasning sticker ut ur kanten av PE10 slangen.
- Bryt av 1/4 i avfasade änden av en annan 30G nål och placera den trubbiga änden av den återstående nålen i andra änden av PE10 slangen, med plast Luer-lås fortfarande bifogas.
- Fyll en 100 μL glasspruta med steril, konstgjord CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2Po4, 2 mm MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mm glukos och 26 mm NaHCO3).
- Fäst sprutan i slutet av linjen och fyll den med aCSF tills den når spetsen på den avfasade nålen. Det är viktigt att sprutan är återfylld med aCSF och inte luft, som en luftspalt är mer benägna att variabla infusionspolymerna.
- För kroniska experiment, lämna linjen fylld med aCSF och hoppa över steg 1,7.
- För akuta experiment, placera sprutan på en infusionspump och dra upp ca 5 mm luft, vilket kommer att förhindra blandning. Efteråt, dra tillbaka den totala volymen av spårämne (s) som önskas för experimentet (20% extra rekommenderas på grund av döda utrymme förluster).
Anmärkning: PE10 slangen ska vara tillräckligt lång så att luftbubblan inte går in i plast manschetten på glassprutan vid lastning av spårämne. För ett typiskt experiment använder protokollet 10 μL bovint serumalbumin konjugerat till Alexa fluor 647 (BSA-647) utspädd i aCSF vid 0,5%. - Kontrollera att huvud plattan passar in i huvud hållaren och att den är rätt storlek för den mus som används. Anatomiska markörer för att säkerställa detta är: den övre kanten av fönstret överensstämmer med den interokulära linjen och den bakre gränsen faller rostralt till occipital krönet.
Märk: rostfria huvudplåtar kan steriliseras och återanvändas. De flesta cyanoakrylatblandningar kan avlägsnas med en acetonlösning.
2. kirurgiskt ingrepp
- Väga och bedra musen (t. ex. ketamin/xylazin, 100 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazin; i.p.).
- När musen inte längre reagerar på en tå nypa, fukta halsen och huvudet med sterilt vatten och raka med hjälp av Clippers. När området är rakat, torka området med en alkoholservett igen för att ta bort eventuella kvarvarande hår.
Anmärkning: Fukta pälsen innan klippning dramatiskt minskar mängden hår i bildfönstret efter snittet. - Placera musen i en stereotaktisk ram ovanpå en temperaturkontrollerad pad och tillämpa Petroleum oftalmologiska salva till musens ögon för att se till att de inte torkar ut.
- Rengör den exponerade huden med en klorhexidinswab. Efter 2 min, ta bort klorhexidin med en alkohol torka. Slutligen, applicera en jodlösning som kan lämnas att torka.
- Injicera subkutant analgesi (0,25% Bupivacaine HCl) till toppen av skallen och halsen.
- Med början på den del av halsen som täcker occipital Crest, göra en mittlinjen skära i den överliggande huden och fortsätta rostrally mot den ögonlinjen. Incise sidled till gränsen där den temporala muskeln infogar i skallen. Ta bort alla huden på spolformade snittet för att exponera både frontal-och parietalbenen.
FÖRSIKTIGHET: den retroorbital sinus ligger caudal till ögonen och stora grenar av den bakre ansikts venen ligger rostralt till Pinna. Var försiktig när du gör snittet att skona dessa strukturer. Om detta inträffar, stoppa blödning genom att upprätthålla hemostas med en steril bomullstuss i flera minuter och fortsätta. - Vattna skallen med steril saltlösning och rengör ytan med bomullsvabb så att den är fri från skräp och hår eftersom dessa kommer att störa bildkvaliteten. Skull öppenhet bevaras bäst genom att lämna periostet och överliggande fascia intakt.
Obs: om dessa strukturer oavsiktligt avlägsnas, kan skallen bli torr och ogenomskinlig över tiden. Re-moisten med aCSF eller använda en blandning av paraffinolja och glycerol för att minska skalle reflektans i akuta experiment21. - Fortsätt att sätta in Cisterna magna kanyl-för kirurgiska detaljer i denna procedur, se Xavier et al9.
- Efter insättning av CM kanyl, tillämpa en blandning av tandcement med cyanoakrylat lim till den ventrala sidan av huvudet plattan runt gränsen och placera den på skallen så att den främre gränsen av huvud plattan överensstämmer med den bakre spetsen av näsans ben och Po sterior gränsen överensstämmer med den främre aspekten av interparietala benet, att se till att sagittal suturen (mittlinjen) är centrerad och rak i förhållande till fönstret (figur 1b).
- Fäst positionen för huvud plattan med ett par droppar lim Accelerator. Fyll eventuella kvarvarande luckor med cement blandningen och bota den med Accelerator.
Varning: se till att cyanoakrylaten inte kommer i kontakt med musens ögon eller blockerar bildfönstret. - Limma CM kanyl på huvud plattan för att säkerställa att dessa inte lossnar under transporten eller när musen vaknar.
- För akuta experiment, gå vidare till steg 2,16.
- För kroniska experiment, applicera ett tunt lager av klartorkande cyanoakrylatlim till den exponerade skallen, att vara noga med att inte skapa bubblor eftersom dessa kommer att störa Imaging. Limmet ger skydd för skallen och kommer inte att störa bildbehandling. Se till att limmet täcker den exponerade skallen hela vägen till huden vid snittet gränsen.
- Använd en hemostat klämma för att hålla acsf-fyllda PE10 slangar 2-3 cm från cm och skär linjen med en hög temperatur diatermi spets. När den är separerad, platta smält PE10 slangar för att täta kanyl.
Varning: se till att inte lossa klämman förrän kanyeln har förseglats och bekräfta att det inte finns några läckor i slangen för att förhindra en CSF fistel. - Administrera karprofen (5 mg/kg var 24: e timme i 3 dagar, i.p. eller s.c.) och returnera musen till en temperaturkontrollerad, enkelhyst bur och låt den återhämta sig i minst 24 timmar före avbildning. Lämna inte musen obevakad tills den återfår tillräckligt medvetande för att bibehålla sternala recumbency. Intakt kraniala fönster förblir stabila i flera veckor.
Obs: det kroniska experimentet kan pausas här.
Varning: vissa postoperativa komplikationer är: cefalohematom/subgaleal hematom, CSF fistel, och infektion. - För akuta experiment, Placera musen i huvud hållaren med hjälp av huvud plattan så att skallen är i ett fast läge. Se till att kontrollera anestesi nivå och placera en värmedyna under musen. Musen är nu redo att tas till makroskopet.
Varning: transportera försiktigt musen tillsammans med infusionspumpen på en vagn. Om CM kanylering blir rubba, det kommer att orsaka en droppe i intrakraniellt tryck och alla CSF läckor kommer att förändra de experimentella resultaten.
3. förbereda musen för avbildning
Obs: protokollet varierar beroende på om Imaging experimentet kommer att utföras på en sövda (börja vid steg 3,1) eller vaken (börja vid steg 3,2) mus.
- Anestetiserade möss
- Placera huvudet hållaren på scenen av makroskopet, se till att det inte finns några veck i linjen från sprutpumpen till CM kanyl och att det inte är spänd eftersom detta kan påverka spår infusion.
- Observera andningsfrekvens och rosa färgning av slemhinnor, vilket indikerar god syresättning. Injicera saltlösning subkutant för att säkra vätskenivån vid behov. Kontrollera att djuret är tillräckligt sövda och re-dos om det behövs.
- Slå på makroskop-kameran och LED och starta live-läget.
- Bekräfta förstoringen av imaging fältet så att nasofrontal suturen på toppen av fältet och lambdoid suturen längst ner kan tydligt visualiseras, med sagittal suturen parallellt och centrerad till mitten av bilden (figur 1c). Väl på plats, säkra huvud hållaren till makroskop scenen med tejp.
- Fokusera makroskopet på den exponerade skallen. Trots att makroskop har ett relativt stort skärpedjup, tillåter krökningen av musens skalle endast ett specifikt område att vara i fokus. Bästa resultat erhålls när fokalplanet ligger på den laterala sidan av parietalbenen posteriort om koronala suturer.
Notera: Detta är placeringen av mellersta cerebrala artärer (MCA), där de flesta CSF inflöde sker (figur 1d, E)10.
- Vakna möss
- Före bildsessionen, låt djuren återhämta sig i minst 24 h från huvudet plattan kirurgi. Längre återhämtnings perioder (5-7 dagar) rekommenderas också. Under denna tid, träna musen för att huvudet fast på scenen i fasthållnings röret för 0.5-1 h per dag under hela återhämtningsperioden.
Obs: Habituation gör att musen kan fästas på huvud hållaren utan bedövning och minskar stress och ångest under själva experimentet. Om detta inte är möjligt och anestesi inte stör experimentet, en induktionsdos av ett inhalerat bedövningsmedel (t. ex., isofluran 2% vid 1-2 L/min O2 flödeshastighet) kan användas för att snabbt fästa musen på huvudet scenen. - När musen är fast på huvud hållaren och i fasthållnings röret, Följ stegen 3.1.1-3.1.5.
- Före bildsessionen, låt djuren återhämta sig i minst 24 h från huvudet plattan kirurgi. Längre återhämtnings perioder (5-7 dagar) rekommenderas också. Under denna tid, träna musen för att huvudet fast på scenen i fasthållnings röret för 0.5-1 h per dag under hela återhämtningsperioden.
4. infusion av fluorescerande CSF spårämnen
-
Akut CM kanylering
- Eftersom spårämnet redan var lastat in i kanylen innan det placerades i Cisterna magna i steg 1,6, Ställ in infusionspumpen till önskad hastighet och volym. Infusionparadigmer som rutinmässigt används är 5-10 μL vid 1-2 μL/min, men dessa parametrar kan justeras beroende på det särskilda experimentet, eller djurets storlek och ålder.
-
Kronisk CM kanylering
- Innan du påbörjar bildbehandlings-sessionen, Följ steg 1.2-1.7 för akuta experiment för att förbereda infusionsslang för att leverera tracers.
- När linjen är beredd, med hjälp av en hemostat klämma skära den förseglade änden av kronisk CM kanyl. Ta nålen från linjen beredd i steg 4.2.1 och försiktigt in den i kanyl. Lossa klämman och Använd sprutpumpen, för in CSF Tracer med önskad infusionshastighet (t. ex. 2 μL/min) för experimentet tills spårämne når den implanterade nålen i CM.
FÖRSIKTIGHET: om nålen genomtränger genom slangen när du ansluter linjen, ta bort nålen, skär piercade segmentet och upprepa detta steg. Varje tår i PE10 slangen kommer att orsaka en läcka och påverka resultatet av experimentet.
5. ställa in Bildsessionen
- Baserat på den fluorescerande spårämne som infunderas, bestämma excitation våglängd och exponeringstiden för varje kanal. Välj den kortaste exponeringstid som krävs för att visualisera spårämne för att maximera den temporala upplösningen av tids fördröjnings avbildning. Denna exponeringstid kommer att användas för alla efterföljande experiment som syftar till att jämföra CSF-transporter mellan olika djur.
Anmärkning: ett tips är att använda spårämne i CM-linjen för att justera exponeringstiden. Även om detta är ett användbart första tillvägagångssätt, bör detta optimeras över tiden. - Välj experimentets varaktighet och intervallen där bilderna ska hämtas. Experiment normalt varar mellan 30-60 min beroende på vilken fas av glymphatic transport är av intresse. Bildfrekvenser på 1 bildruta/min och snabbare räcker för de flesta experiment.
- Ange filnamnet och spara katalog.
- Om avbildning kommer att samlas in utöver samtidig förvärv av andra variabler (t. ex. elektrokardiogram, arteriellt blodtryck, elektrofysiologi), makroskopet och pumpen kan programmeras att utlösas med datainsamlingsprogram. Kontrollera att utlösarfunktionen på makroskopet är korrekt innan du går vidare till nästa steg.
6. transcranial optisk imaging experiment
- Starta spårningsinfusion och bildtagning på samma gång.
- Kontrollera rutinmässigt CM kanyl och PE10 slangar för eventuella tecken på en läcka. Om det finns någon spårämne som läcker vid CM, måste resultaten från detta experiment uteslutas.
Anmärkning: om Tracer börjar ackumuleras i lillhjärnan och inte färdas glymphatic väg MCA, är det troligt att CM kanyl injicerades i lillhjärnan. Dessa data bör inte inkluderas. - För akuta experiment, efter avslutad experimentet, ta bort musen från mikroskopet och kontrollera att det fortfarande är tillräckligt sövda. Snabbt halshugga musen och skörda hjärnvävnaden. Immersion-fixera hjärnan i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) över natten vid 4 ° c.
- För kroniska experiment, när bildbehandling är klar, ta bort cm linjen från kanyl, spola med steril acsf och återfördra cm kanyl med en hög temperatur diatermi spets. Ta bort musen från huvudet stå och returnera den till sin bur. Upprepa den här processen tills ytterligare avbildning inte krävs och följ sedan steg 6,3.
7. analys av data
MATLAB-baserade analyser, till exempel CSF front-Tracking kan extrahera stora mängder kvantitativa data från spår fronter i dessa Imaging dataset10,22. Men dessa filtyper kan också enkelt importeras och analyseras i öppen källkod bildanalysprogram vara som Fiji23.
- Importera bildstaplar till Fiji med hjälp av verktyget bio-format import. Denna funktion kommer att bevara filens metadata som inkluderar tid och Pixel upplösning. Spara bildstapeln som en TIFF-fil.
- Rita manuellt en intresse region (ROI) runt skallen eller området av intresse med hjälp av polygon markeringsverktyget. Till exempel, i figur 1G en ROI drogs separat för ipsilaterala och för kontralaterala halvklotet efter en traumatisk hjärnskada. Se till att lägga till ROI i ROI manager (analysera > Verktyg > ROI Manager) och spara den.
Anmärkning: CSF transport kan kvantifieras på två huvudsakliga sätt: 1) medelfluorescensintensitet över tid eller 2) inflödet uttryckt i procent av avkastningen eller Totalarealen (mm2) efter att ha tillämpat ett tröskelvärde. Den senare metoden (figur 1H) kommer att beskrivas i nästa steg. - Ställ in tröskeln på ramen med maximal fluorescens (Välj bild ≫ justera ≫ tröskel...). Automatiserade tröskel metoder såsom Otsu är normalt bra på att upptäcka CSF Tracer. Tillämpa tröskelvärdet.
- Innan du går vidare, se till att i analysera ≫ ange mått, alternativ område och område fraktion väljs. Välj sedan mer ≫ flera måtti ROI - hanteraren.
- Omvandla värdet i %-området till mm2 med hjälp av värdet för ROI från utdata. Värdena i %-området återspeglar procent av den dorsala kortikala ytan med CSF Tracer.
- Plot CSF inflöde i mm2 som en funktion av tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CSF tillströmning är avbildad på ett epifluorescerande makroskop (figur 1a), vilket möjliggör Mesoskopisk avbildning av CSF spår transport i murina cortex. Hela-skalle huvud plattan tillåter visualisering av rostralt näsans ben, både frontal-och parietalben i mitten, och rostrala delen av interparietala benet caudally (figur 1b). Vid bildtagning kan nasofrontala, sagittal, koronala och lambdoida suturer lätt identifieras (figur 1c). När infusionen av CSF Tracer i CM börjar (figur 1d), spårfluorescens ses först i stora pooler av subaraknoidal CSF vid basala cisternen, olfactofrontal Cistern, och quadrigeminal cisternen nära tallkottkörteln fördjupningen (figur 1e , vänster). CSF spårämnen sedan in i hjärnan längs perivaskulära utrymmen av kortikala Arvika grenar av mitten cerebral artär (MCA) (figur 1e, höger).
Transcranial optisk avbildning kan användas för att studera glymphatic funktion efter traumatisk hjärnskada (TBI)3. Möss fick en måttlig TBI och omedelbart därefter en fluorescerande CSF Tracer (BSA-647) injicerades i CM24. CSF transport var avbildad för 60 min efter TBI (figur 1f). Macroscopic Imaging visar att Tracer först ses på olfactofrontal Cistern men glymphatic tillströmningen längs kortikala PVSs är helt avskaffas på sidan av TBI (figur 1G, Supp. film 1). Den hämmande effekten av TBI på glymphatic funktion har visats med hjälp av flera andra metoder för att kvantifiera spår och kan ligga till grund för sambandet mellan TBI och ackumulering av Aβ och Tau sett efter skada3. Kvantitativ analys av in vivo bilder visar att ipsilaterala tillströmning område minskas nästan en tredjedel jämfört med kontralaterala halvklotet (figur 1H).
Figur 1. Transkrakal makroskopisk avbildning. A) schematiskt för den makroskopiska bild uppsättningen. B) dorsala syn på huvud plattans position på skallen. Den interparietala benet och nasal, frontal, och parietalben är alla synliga. (C) en exponerad mus skalle under avbildning innan CSF Tracer har dykt upp, tydligt visar alla kraniala suturer av intakt skalle. Skalbar: 1 mm (D) Schematisk av en lateral bild av CSF Tracer in i Cisterna magna (cm) och reser från basala cisternen längs glymphatic vägen. (E, vänster panel) Makroskopisk avbildning av glymphatic tillströmning i en ketamin-xylazin sövda vild typ mus på 20 minuter efter cm injektion (BSA-647; 10 μl vid 2 μl/min). CSF Tracer ses i olfactofrontal Cistern runt rostralt rhinal ven under nasofrontal suturen, längs vissa delar av den överlägsna sagittal sinus under sagittal suturen, och i tallkottkörteln fördjupningen omger tvärgående sinus under lambdoid Sutur. (E, höger panel) Den digitala förstoringen av bilden till vänster visar den höga rumsliga upplösningen som erhålls med dessa Mikroskop. CSF Tracer färdas inom perivaskulära utrymmen i mitten cerebral artär (MCA)10. Skalbar: 0,5 mm (F) experimentell tidslinje. En sövda vild typ mus fick en måttlig traumatisk hjärnskada (TBI)24 och omedelbart efter en cm injektion (BSA-647; 10 μl vid 2 μl/min), följt av 60 min av makroskopisk avbildning. Gtids fördröjnings bilder av CSF-spårningstransport efter TBI (streckad linje). Skalbar: 1 mm (H) inflöde område (mm2) över varje halvklot under 60-min experiment, kvantifierad från Rois i (G), halvklotet som fick TBI (ipsilaterala) och halvklotet som inte (kontralateral). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Ritning av anpassad huvud plåt. (A, B) exakta mätningar (i mm) av den anpassade huvud plattan som används i det transkrala makroskopiska Imaging-protokollet. 3D scheman av en ihåliga ut huvud plattan (C) och en hel huvud plattan (D). Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande film 1. Time-lapse Imaging av CSF transport efter måttlig traumatisk hjärnskada till vänster parietalbenet. Längd: 60 min. Scale bar: 1 mm vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett detaljerat protokoll för att utföra transkraniell CSF avbildning hos levande möss med hjälp av kommersiellt tillgängliga fluorescerande makroskop och tracers. Denna teknik är enkel och minimalt invasiva, men ändå kvantitativ. In vivo-avbildning korrelerar väl med känsliga metoder såsom vätske scintillationskontroller av radiostyrda spårämnen inklusive 3H-dextran och 14C-inulin efter cm leverans, samt med kvantifiering för ex vivo-sektion10, 18. Validering med två-Photon mikroskopi visar att CSF spår som setts längs kortikala blodkärl under makroskopet är främst belägna inom perivaskulära utrymmen av MCA och dess grenar10. Dessa inflödes vägar i CSF är en kritisk komponent i glymphatic-systemet19. Även om de inte omfattas av detta protokoll, dessa uppställningar kan också användas för att avbilda CSF clearance vägar såsom meningeal och cervikal lymhatics25,26.
Förbättringar av utformningen av huvud plattan möjliggör en kronisk, stabil, bredbilds avbildning av samma mus över tiden. Huvud plattans form, storlek och vikt kan skräddarsys för varje specifik applikation. Med framsteg inom laserskärning och 3D-utskrifter finns det få begränsningar vad gäller specifikationerna. Head plätering möjliggör också longitudinell avbildning av antingen sövda eller vaken djur och förmågan att bilden genom en intakt skalle undviker neuroinflammation och ödem i samband med placeringen av kranial eller tunna skalle fönster27, 28 , 29. Detta är en viktig fördel eftersom stereotaxic leverans av fluorescerande spår genom cortex i striatum eller laterala ventriklarna med hjälp av en kranial Burr hål kraftigt minska glymphatic funktion20,26. De stora Portal-och arbets sträckorna för de flesta kommersiella makroskoper gör det möjligt för möss att fixeras på scenen i olika konfigurationer, inklusive löphjul eller flytande labyrinter. Möss kan utbildas och vana till att huvudet fast i mikroskopet skede under 5-7-dagars återhämtningsperioden för att underlätta vaken Imaging30.
En av de viktigaste begränsningarna med denna metod är det låga penetrationsdjupet i makroskopet jämfört med två-Photon-mikroskopi10. Denna enhet kan lösa endast några millimeter av den kortikala ytan under den intakt skallen. Men även om detta begränsar avbildning av processer som sker djupare ner i vävnaden, är det i allmänhet inte ett problem för glymphatic analyser eftersom de viktigaste vägarna för inresa är främst belägna runt de viktigaste artärerna i den dorsala kortikala ytan. Trots att det inte går att lösa djupare strukturer, makroskop med hög effektivitet vetenskapliga CMOS-kameror har stor fluorescens upptäckt; Trots att Tracer inte ligger på hjärnans yta, korrelerar den totala fluorescensintensiteten med mängden spårämne som finns i hjärnan vid varje tidpunkt efter starten av CM-injektionen10. Dessa parametrar förbättras genom användning av far-röd, nära infraröda eller infraröda spår eftersom Imaging vid dessa längre våglängder minskar vävnad Auto-fluorescens och spridningen av ljus, och har en överlägsen signal-brus-förhållande än lägre utsläpp våglängd fluoroforer. Standarden makroskop möjliggör avbildning av mer än en spårämne i samma experiment. Beroende på konfigurationen av makroskopet, filterrevolvern måste rotera mellan förvärv, drastiskt minska den temporala upplösningen som kan erhållas. Detta kan förbättras genom användning av avstämbara lysdioder och en multibandfilterkub. Trots denna förbättring, Multichannel Imaging är inte riktigt samtidig, eftersom det finns en fördröjning i förvärvet medan LED växlar mellan excitation våglängder. Det är möjligt att uppnå samtidig Dual Channel Imaging med hjälp av bildklyvning optik som är kompatibla med de flesta makroskopiska uppställningar; men dessa offra rumslig upplösning genom att dividera den fulla upplösningen av CMOS-kameran (2048 x 2048 pixel) i två områden med utsikt med halva upplösningen (1024 x 1024 pixel). Medan CMOS-kameror är ganska lämpliga för denna användning, kan användningen av en CCD-kamera tillämpas på denna ansökan också. En ytterligare faktor som minskar temporala upplösningen är den exponeringstid som krävs för adekvat excitation av den valda fluorophore, som normalt varierar mellan 50-1000 MS. Detta kan optimeras ytterligare med 2x2 eller 4x4 pixel Binning, vilket minskar exponeringstiden och ökar bildhastigheten, på bekostnad av rumslig upplösning. Trots dessa begränsningar, transkrala makroskopisk Multichannel Imaging kan uppnå bildfrekvenser mellan 10-20 Hz med hög rumslig upplösning.
Senaste exemplen på transkrakala makroskopiska bilder har använt aquaporin-4 (AQP4) knock out möss10,20 och trombocytderivat tillväxtfaktor b (PDGF-b) retention motiv knockout möss22 för att påvisa vikten av AQP4 och PDGF-B i glymphatic systemet. De studier som används C57Bl6 vildtyp möss att jämföra med knockout mus linjer. De transcranially avbildade möss för en tid av 30 min med hjälp av fluorescerande spårämnen och resultaten slutsatsen att knockout-linjerna hade dramatiskt minskat CSF tillströmning jämfört med wildtypes.
Dessa egenskaper gör transkraniell optisk avbildning en idealisk teknik för att studera CSF transport, särskilt mellan 2 eller fler kohorter av djur. Det medger mätningar av intracisternal Tracer kinetik i levande möss i en mikron skala upplösning, till en bråkdel av kostnaden för andra in vivo avbildning modaliteter. Denna teknik gör det möjligt att studera glymphatic-systemet på ett fysiologiskt, icke-invasiv sätt, och har varit till nytta för att belysa några av de faktorer som reglerar dess funktion i hälsa och sjukdom10,20,25 . Men, dess mest spännande attribut är dess potential att besvara framtida frågor om CSF hydrodynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke och det nationella institutet för åldrande (US National Institutes of Health; R01NS100366 och RF1AG057575 till MN), Fondation Leducq transatlantiska nätverk för excellensprogram och EU: s Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram (Grant nr 666881; SVDs @ Target). Vi vill också tacka Dan Xue för experthjälp med grafiska illustrationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane - Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers - anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita,, S,, et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
