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Biology

फ्लोरेसेंस लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा मिट्रोटिक और मीओटिक फिसेशन खमीर न्यूक्लियर डायनामिक्स की परीक्षा

Published: June 24, 2019 doi: 10.3791/59822
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Program in Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 2Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

Summary

यहाँ, हम लाइव-सेल इमेजिंग जो एक गैर विषैले माइक्रोस्कोपी विधि है कि शोधकर्ताओं mitosis और आयसिस के दौरान विखंडन खमीर कोशिकाओं रहने में प्रोटीन व्यवहार और परमाणु गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देता है मौजूद है.

Abstract

लाइव-सेल इमेजिंग एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है जिसका उपयोग जीवित कोशिकाओं में कोशिका और प्रोटीन गतिशीलता की जांच करने के लिए किया जाता है। इस इमेजिंग विधि विषाक्त नहीं है, आम तौर पर सेल शरीर क्रिया विज्ञान के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, और कम से कम प्रयोगात्मक हैंडलिंग की आवश्यकता है. तकनीकी हस्तक्षेप के निम्न स्तर शोधकर्ताओं mitosis के कई चक्रों में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए और शुरू से अंत तक आयतासन का निरीक्षण करने के लिए सक्षम. ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) जैसे फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करना, शोधकर्ताओं ने विभिन्न कारकों जिसका कार्य प्रतिलेखन, डीएनए प्रतिकृति, सामंजस्य, और अलगाव जैसी प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं विश्लेषण कर सकते हैं. फिजी (एक नि: शुल्क, अनुकूलित ImageJ संस्करण) का उपयोग कर डेटा विश्लेषण के साथ युग्मित, लाइव सेल इमेजिंग प्रोटीन आंदोलन, स्थानीयकरण, स्थिरता, और समय, साथ ही परमाणु गतिशीलता और गुणसूत्र अलगाव का आकलन करने के विभिन्न तरीके प्रदान करता है। हालांकि, के रूप में अन्य माइक्रोस्कोपी तरीकों के साथ मामला है, लाइव सेल इमेजिंग प्रकाश के आंतरिक गुणों द्वारा सीमित है, जो उच्च आवर्धन पर संकल्प शक्ति के लिए एक सीमा डाल दिया है, और यह भी उच्च तरंगदैर्ध्य में photobleaching या phototoxicity के प्रति संवेदनशील है आवृत्तियों. हालांकि, कुछ देखभाल के साथ, जांचकर्ताओं ध्यान से सही स्थितियों, उपभेदों, और फ्लोरोसेंट मार्करों का चयन करने के लिए mitotic और meiotic घटनाओं के उचित दृश्य के लिए अनुमति देने के द्वारा इन शारीरिक सीमाओं बाईपास कर सकते हैं.

Introduction

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं विखंडन खमीर कोशिकाओं को मारने के बिना परमाणु गतिशीलता की जांच करने के लिए अनुमति देता है और घातक fixatives और दाग के लिए की जरूरत समाप्त. यह स्थिरता, आंदोलन, स्थानीयकरण, और फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन है कि गुणसूत्र प्रतिकृति, पुनर्संयोजन, और अलगाव के रूप में महत्वपूर्ण घटनाओं में शामिल हैं के समय का निरीक्षण करने के लिए संभव है, झिल्ली और cytoskeletal के अलावा आंदोलनों. सेल व्यवहार्यता और गैर विषैले संकेत का पता लगाने को बनाए रखने के द्वारा, वहाँ कम से कम शारीरिक घुसपैठ है. जब ठीक से प्रदर्शन किया, इस माइक्रोस्कोपी विधि confounding प्रभाव है कि विस्तारित तकनीकी हैंडलिंग से या नकली रासायनिक प्रतिक्रिया से उत्पन्न कम कर सकते हैं. इसके अलावा, एक प्रयोग के दौरान, शोधकर्ताओं विखंडन खमीर पोषण और तनाव राज्यों के उचित अवलोकन कर सकते हैं, proliferative दक्षता, और apoptotic स्थिति है कि अनुचित इमेजिंग पैरामीटर या असामान्य सेल शरीर क्रिया विज्ञान 1 संकेत ,2,3.

Mitosis और अर्धसूत्री विभाजन परमाणु और सेलुलर विभाजन की विशेषता है. अर्धसूत्री विज्ञान में, मिटोसिस के विपरीत, आनुवंशिक सामग्री आधी हो जाती है क्योंकि मूल कोशिकाएं बेटी कोशिकाओं को जन्म देतीहैं 4। क्योंकि लाइव सेल इमेजिंग स्थानिक संबंध के अलावा एक लौकिक आयाम प्रदान करता है, कोशिकाओं की बड़ी संख्या वास्तविक समय में जांच की जा सकती है. लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी ने शोधकर्ताओं को हिटोन्स5, कोहेसिन उपइकाइयों6, माइक्रोट्युब्यूल्स7, सेन्ट्रोमेर्स8, किनेटोकोरस9के घटकों के लिए फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग करके परमाणु विभाजन की गतिशीलता की जांच करने में सक्षम बनाया है धुरी पोल शरीर (एसपीबी)10, और गुणसूत्र यात्री परिसर (सीपीसी)11के उन . गुणसूत्र पृथक्करण तंत्र के बाहर, लाइव-सेल इमेजिंग ने आवश्यक प्रोटीन के व्यवहार पर भी कब्जा कर लिया है, लेकिन गुणसूत्र पृथक्करण में सीधे शामिल नहीं है। इन प्रोटीनों के कार्य को माइक्रोट्युब्यूल्स12,13,14के प्रति प्रतिकृति, गुणसूत्र पुनर्संयोजन, नाभिकीय गति तथा गुणसूत्र लगाव को प्रभावित करने के लिए दर्शाया गया है . इन प्रेक्षणों ने सेलुलर घटनाओं की बेहतर समझ में योगदान दिया है जिनके कार्यात्मक घटक जैव रासायनिक या आनुवंशिक परीक्षा के लिए अनुकूल नहीं थे। माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में नए अग्रिमों के साथ, इस तरह के गरीब संकल्प, photobleaching, phototoxicity, और ध्यान केंद्रित स्थिरता के रूप में सीमाओं को कम होगा, जिससे mitotic और meiotic परमाणु गतिशीलता1के बेहतर वास्तविक समय टिप्पणियों की सुविधा, 2,3. Meiosis विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह एक टर्मिनल भेदभाव मार्ग है कि समय के करीब ध्यान देने की आवश्यकता है.

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य mitosis और meiosis में वास्तविक समय विखंडन खमीर परमाणु गतिशीलता की जांच के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि पेश करने के लिए है. यह पूरा करने के लिए, यह कोशिकाओं है कि पर्यावरण तनाव के संपर्क में नहीं किया गया है का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, agarose पैड है कि लंबे समय तक इमेजिंग का सामना कर सकते हैं तैयार करते हैं, और घनत्व है कि एकल सेल गतिशीलता के दृश्य की सुविधा पर कोशिकाओं माउंट. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन है कि परमाणु गतिकी के लिए उपयोगी मार्करों के रूप में सेवा ले कोशिकाओं का उपयोग करता है (Hht1-mRFP या Hht1-GFP), गुणसूत्र अलगाव (Sad1-DsRed), cytoskeleton गतिशीलता (Atb2-mRFP), प्रतिलेखन G1/S (Tos4-GFP) में सक्रियण, और अर्धासन में सामंजस्य स्थिरता (Rec8-GFP). इस विधि में अतिरिक्त परमाणु और साइटोसोलिक मार्कर (तालिका I) का भी परिचय दिया गया है, जिनका उपयोग विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में प्रश्नों का समाधान करने के लिए विभिन्न संयोजनों में किया जा सकता है। इसके अलावा, बुनियादी फिजी उपकरण शोधकर्ताओं लाइव सेल छवियों की प्रक्रिया और डेटा के विभिन्न प्रकार का विश्लेषण करने में मदद करने के लिए चित्रित कर रहे हैं। इस दृष्टिकोण की ताकत प्रोटीन गतिशीलता के वास्तविक समय टिप्पणियों के उपयोग से उपजी है, समय, और स्थिरता प्रक्रियाओं है कि mitosis और meiosis के उचित निष्पादन के लिए अभिन्न हैं का वर्णन करने के लिए.

Protocol

1. मीडिया तैयारी15,16

  1. स्टॉक समाधान
    1. 52.5 ह एमजीसीएल2$6एच20, 0.735 ह केसीएल2ब्2 ह 2 ब्ब्2 ब्ब्2 ब्ब्ल, 50 ह केसीएल, और 2 ह ना2स04 को एक बोतल में 1 एल आसुत जल युक्त जोड़कर 50x नमक स्टॉक समाधान तैयार करें। घोल को अच्छी तरह मिलाएं और निस्पंदन द्वारा बाँझ करें। दीर्घकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. 1 ग्राम पैन्टोथेनिक एसिड, 10 ग्राम निकोटिनिक एसिड, 10 ग्राम इनोसिटॉल, और 10 मिलीग्राम बायोटिन को 1 एल आसुत पानी वाली बोतल में मिलाकर 1,000x विटामिन स्टॉक घोल बनाएं। घोल को अच्छी तरह मिलाएं और निस्पंदन द्वारा बाँझ करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. 5 ग्राम बोरिक अम्ल, 4 ग्राम के MnSO 4, 4 ग्राम nSO4$7H2O, 2 ग्राम फेक्2 $6H2O, 1 g KI, 0.4 ग्राम मॉलिब्डिक एसिड, 0.4 ग्राम क्यूसो4$5H20 को जोड़कर 10,000x खनिज स्टॉक समाधान तैयार करें। , और एक बोतल में 10 ग्राम साइट्रिक एसिड जिसमें आसुत जल का 1 ल होता है। घोल को अच्छी तरह मिलाएं और निस्पंदन द्वारा बाँझ करें। दीर्घकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. डिस्टिल्ड पानी के 1 एल युक्त एक बोतल में या तो एडेनिन, ल्यूसिन, हिस्टिडाइन या लाइसिन के 7.5 ग्राम जोड़कर व्यक्तिगत पोषक स्टॉक समाधान करें। यूरेसिल समाधान बनाने के लिए केवल 3.75 ग्राम का उपयोग करें। ऑटोक्लेवद्वारा समाधानों को स्टरलाइज़ करें.
      नोट: समय के साथ, यूरेसिल समाधान से बाहर हो जाता है। घोल को फिर से लाने के लिए, माइक्रोवेव में 10 की दर से 60% बिजली पर गर्म करें या 20 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। गर्म समाधान को तब तक घुमाएं जब तक कि सभी यूरेसिल क्लंप्स गायब न हो जाएं।
  2. खमीर निकालने प्लस की खुराक (हाँ)
    1. एक 2 एल फ्लास्क में, 1 एल आसुत जल, 5 ग्राम खमीर निकालने का आधार, 30 ग्राम ग्लूकोज, और 225 मिलीग्राम एडेनिन, यूरेसिल, एल-हिस्टिडाइन, एल-ल्यूसिन, और एल-लाइसिन जोड़ें। ठोस माध्यम बनाने के लिए 20 ग्राम आगर डालें।
    2. पूरी तरह से समाधान में सामग्री भंग करने के लिए एक चुंबकीय हलचल पट्टी का प्रयोग करें. आगर माध्यम autoclaving द्वारा बाँझ है के बाद पिघल जाएगा.
      नोट: सुविधा के लिए, तैयार करने के लिए उपयोग हाँ पाउडर भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है.
  3. एडिनबर्ग न्यूनतम मध्यम (EMM) और पोम्बे ग्लूटामेट मध्यम (पीएमजी)
    1. 2 एल फ्लास्क में, आसुत जल का 1 ल भाग 3 ग्राम पोटेशियम हाइड्रोजन थैलेट, 2.2 ग्राम ना2एचपीओ4,एनएच4सीएल का 5 ग्राम, 20 ग्राम ग्लूकोज, 20 एमएल नमक स्टॉक समाधान, 1 एमएल स्टॉक विटामिन विलयन के साथ मिलाएं। , और खनिज स्टॉक समाधान के 0.1 एमएल. एनएच4सीएल को पीएमजी तैयार करने के लिए 2.2 ग्राम एल-ग्लूटामिक एसिड मोनोसोडियम नमक के साथ बदलें। ठोस माध्यम बनाने के लिए, 20 ग्राम आगर डालें।
    2. एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग करना, सामग्री को अच्छी तरह से भंग. आगर माध्यम autoclaving द्वारा बाँझ है के बाद पिघल जाएगा. उपयोग करने से पहले, आवश्यक के रूप में पोषक तत्व ों समाधान जोड़ें. मध्यम के हर 1 एल के लिए, 15 एमएल प्रत्येक एडेनिन, ल्यूसिन, हिसिडीन, और लाइसिन जोड़ें। यूरेसिल के लिए 30 एमएल का उपयोग करें, क्योंकि यह अन्य पोषक तत्वों के समाधान ों की तुलना में कम केंद्रित है।
      नोट: सुविधा के लिए, उपयोग के लिए तैयार ईएमएम और पीएमजी पाउडर भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
  4. माल्ट निकालने (एमई)
    1. 30 ग्राम माल्ट निकालने के साथ आसुत जल के 1 L को मिलाने के लिए 2 L फ्लास्क का उपयोग करें और 225 मिलीग्राम प्रत्येक एडेनिन, यूरेसिल, हिस्टिडाइन, और ल्यूकोइन के साथ मिश्रण करें। पीएच को 5.5 तक समायोजित करें. ठोस माध्यम बनाने के लिए 20 ग्राम आगर को शामिल करें।
    2. एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग कर समाधान में घटकों को भंग। आगर माध्यम autoclaving द्वारा बाँझ है के बाद पिघल जाएगा.
  5. पूरक आहार के साथ Sporulation agar (SPAS)
    1. 2 एल फ्लास्क में 1 एल आसुत जल, 10 ग्राम ग्लूकोज, 1 ग्राम केएच2पीओ4,1 एमएल विटामिन स्टॉक, 45 मिलीग्राम एडेनिन, यूरेसिल, हिस्टिडीन, ल्यूकोइन और लाइसिन हाइड्रोक्लोराइड डालें। ठोस माध्यम बनाने के लिए 20 ग्राम आगर डालें।
    2. अच्छी तरह से सामग्री गठबंधन करने के लिए एक चुंबकीय हलचल पट्टी का प्रयोग करें. आगर माध्यम autoclaving द्वारा बाँझ है के बाद पिघल जाएगा.

2. विखंडन खमीर संस्कृति15,16

  1. क्रायोजेनिक संरक्षण से विखंडन खमीर उपभेदों जागृत करने के लिए हाँ ठोस माध्यम का प्रयोग करें। प्रत्येक तनाव के तापमान आवश्यकताओं के आधार पर, 3-5 दिनों के लिए या तो 25 डिग्री सेल्सियस या 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. जब कालोनियों दिखाई दे रहे हैं, एक स्टार्टर तरल संस्कृति तैयार करते हैं. अलग-अलग कालोनियों से कोशिकाओं उठाओ और उन्हें 3 एमएल हाँ तरल माध्यम युक्त परीक्षण ट्यूबों में टीका। मध्य या देर से लॉग चरण के लिए उचित तापमान पर वृद्धि.
    नोट: उचित वातन के लिए, ट्यूब या मात्रा के साथ फ्लास्क का उपयोग करें कम से कम 5x इरादा तरल संस्कृति की मात्रा से अधिक. 150-220 आरपीएम के बीच हिल गति नियमित संस्कृति के विकास के लिए प्रथागत हैं।
  3. स्टार्टर संस्कृति के 250-500 $L को 50 एमएल फ्लास्क में वितरित करें जिसमें 9.5-9.75 एमएल या तो हाँ, ईएमएम या पीएमजी प्लस उपयुक्त पूरक हैं। कोशिकाओं वांछित घनत्व को विकसित करने के लिए और उचित सेल आकारिकी और पोषण की स्थिति के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच करने के लिए अनुमति दें।
    नोट: एक महीने तक के लिए awken उपभेदों स्टोर करने के लिए, पैराफिन टेप के साथ हाँ प्लेटें सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह है।

3. नमूना तैयारी2

  1. माइक्रोस्कोप स्लाइड सेटअप
    1. एक 500 एमएल बीकर में 2 ग्राम agarose जोड़ें या तो कम से कम मध्यम प्लस की खुराक (mitosis) या तरल SPAS (meiosis) के 100 एमएल युक्त. 10 s वेतन वृद्धि में 60% बिजली पर एक माइक्रोवेव ओवन में agarose समाधान गर्म या 10 मिनट के लिए एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह. कुशल पिघलने सुनिश्चित करने के लिए समाधान घुमाओ. जल्दी पैड तैयार करने और समय से पहले ठोस होने से पिघला हुआ agarose को रोकने के लिए agarose स्लाइड बनाने सेटअप तैयार करें (चित्र 1A)
    2. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए पिघला हुआ agarose की अनुमति दें और विस्तृत बोर पिपेट सुझावों का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 50-100 डिग्री सेल्सियस धब्बे वितरित करें। इससे पहले कि अगारोस ठंडा हो जाए, शीर्ष पर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें ताकि व्यास में लगभग 1.5-2 सेमी का प्रसार पैड उत्पन्न किया जा सके (चित्र 1B-C)। agarose पैड की चौड़ाई आम तौर पर इमेजिंग समय की लंबाई के लिए आनुपातिक है. दूसरे शब्दों में, मोटा पैड लंबे समय तक इमेजिंग अवधि का सामना.
    3. मोटी agarose पैड के साथ स्लाइड की उचित कवरेज सुनिश्चित करने के लिए और coverslip किनारों पर विलायक जोखिम से सेल मौत को रोकने के लिए एक सीलेंट के रूप में एक हाइड्रोकार्बन मिश्रण का प्रयोग करें। 500 एमएल बीकर में पेट्रोलियम जेली, लैनोलिन और पैराफिन के बराबर भागों (डब्ल्यू/डब्ल्यू) मिलाएं। 5 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर गर्मी सामग्री। घटक पिघल के रूप में, ध्यान से उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पिघला हुआ समाधान घूमता है।
  2. नमूना सेटअप
    1. माइटोटिक घटनाओं की परीक्षा के लिए, या तो तरल ईएमएम या पीएमजी प्लस की खुराक में स्टार्टर संस्कृतियों से कोशिकाओं को विकसित लगभग मध्य लॉग चरण (ओडी595 के 0.4)। 1 मिनट के लिए 1,375 x g पर सेल निलंबन के सेंट्रीफ्यूज 1 एमएल, supernatant को हटाने और कम से कम मध्यम प्लस की एक अंतिम मात्रा के लिए पूरक कक्ष गोली resuspend 100 $L.
    2. meiotic घटनाओं छवि करने के लिए, कम से कम मध्यम प्लस देर से लॉग चरण के लिए पूरक में स्टार्टर संस्कृतियों से कोशिकाओं को विकसित (ओडी595 के 0.7-1.0). 1 एमएल सेल निलंबन में विपरीत मेट-प्रकार की कोशिकाओं (ज- और ज+) के बराबर वॉल्यूम ्स-मायूड को संयोजित करें. 1 मिनट के लिए 1,375 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं और तरल ME में गोली resuspend. कुशल पोषक तत्व हटाने सुनिश्चित करने के लिए इस चरण को तीन बार दोहराएँ।
    3. पिछले ME धोने के बाद, मुझे के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और यह 9 एमएल ME युक्त एक 50 एमएल फ्लास्क में जोड़ें. न्यूनतम रोटेशन गति (50-100 आरपीएम) पर 22-25 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 एच के लिए इनक्यूबेट। प्रचुर मात्रा में कोशिका ऊर्णन, जो कई दौर विखंडन खमीर clumps में परिणाम और कुशल संभोग इंगित करता है.
    4. संभोग संस्कृति और अपकेंद्रित्र का 1 एमएल नमूना 1 मिनट के लिए 1,375 x ग्राम पर लें। सुपरनेटेंट को हटा दें, लेकिन कोशिकाओं को फिर से चालू करने के लिए ट्यूब में 250 डिग्री सेल्सियस छोड़ दें। Agarose पैड पर कोशिकाओं रखने से पहले, भंवर जोरदार 5 s के लिए clumps को बाधित करने के लिए.
      नोट: कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले शेष 250 जेडएल ME में संभोग कारक होते हैं जो कोशिकाओं को आयसिस में प्रवेश करने में मदद करते हैं।
    5. 2% अगारोस पैड पर या तो एक माइटोटिक या मीओटिक सेल निलंबन का 20 डिग्री सेल्सियस रखें। स्लाइड उलट और 2-3 s के लिए एक लिंट मुक्त कागज तौलिया के शीर्ष पर डाल द्वारा किसी भी अतिरिक्त माध्यम निकालें (चित्र 1D)। स्लाइड पैड साइड सेट अप और धीरे एक गिलास coverslip जगह है, यह सुनिश्चित करने के लिए हवा बुलबुले उत्पन्न नहीं (चित्र1F).
      नोट: एक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त माध्यम को खत्म करने गुरुत्वाकर्षण अवशोषण की तुलना में अधिक समय कुशल है, जो अर्धसूत्री प्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
    6. एक सेल मोनोलेयर बनाने के लिए, एक (मिटोसिस) या दो (मीओसिस) पूर्ण फेरे के लिए तर्जनी के साथ कवरस्लिप दक्षिणावर्त घुमाएं (चित्र1एफ)। सुनिश्चित करें कि सेल पदार्थ एकल कोशिकाओं या asci के बेहतर जुदाई के लिए अनुमति agarose पैड भर में disperses. एक छोटी सी लकड़ी की छड़ी की सहायता से, प्रत्येक agarose पैड सील करने के लिए कवरस्लिप के किनारों के साथ पिघला हुआ सीलेंट वितरित करें (चित्र 1जी)।
    7. एक बार जब अगारोस पैड को सील कर दिया जाए, तो इसे सूक्ष्मदर्शी अवस्था पर रखें और इसे उपयुक्त इमेजिंग स्थितियों (उदाहरण के लिए, तापमान) (चित्र 1H) पर 10-15 मिनट के लिए बराबर होने दें ताकि वायु बुलबुले नष्ट हो जाते हैं और किसी भी अंतिम मिनट के agarose बदलाव होने दें। इमेजिंग शुरू एक बार स्लाइड कुशलता से समतुल्य है और यह मंच से हटा नहीं जब तक डेटा संग्रह समाप्त होता है.
      नोट: तापमान और आर्द्रता का नियंत्रण माइक्रोस्कोप प्रणाली कार्यरत और विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं द्वारा निर्धारित किया जाता है। यदि मौजूद हैं, सभी इमेजिंग प्रयोगों के लिए तापमान और आर्द्रता नियंत्रण लागू होते हैं। यदि अनुपस्थित, शोधकर्ताओं को तापमान में उतार-चढ़ाव को रोकने के लिए एक तरीका तैयार करना चाहिए, विशेष रूप से आयसिस प्रयोगों के दौरान.

4. लाइव-सेल इमेजिंग2 और प्रोसेसिंग

  1. छवि को देखने के लिए उपयुक्त फ़ील्ड ढूँढने के लिए 40x उद्देश्य का उपयोग करें. डेटा प्राप्ति शुरू करने के लिए 60x उद्देश्य पर स्विच करें. माइक्रोस्कोप प्रणाली का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है, बाद में refocusing और प्रत्येक समय बिंदु पर नमूने पर अनुभागिंग मैन्युअल रूप से या एक माइक्रोस्कोप के माध्यम से या सॉफ्टवेयर स्वचालित प्रक्रिया हो जाएगा.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत छवियों एक deconvolution, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप Sedat, आरएफपी और GFP फिल्टर सेट, नैनो गति चरण, 60x NA 1.4 उद्देश्य लेंस, और 12 बिट सीसीडी कैमरा के साथ सुसज्जित का उपयोग कर एकत्र किए गए थे. निर्मित यांत्रिक शटर और motorized फिल्टर पहियों कम उत्तेजना जोखिम और नमूनों की photobleaching के लिए अनुमति दी.
  2. छवियों को प्राप्त करने और संसाधित करने के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें. छवियों को कम करने के लिए, निर्माता-प्रदत्त ऑप्टिकल स्थानांतरण कार्यों को रोजगार दें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सूक्ष्मदर्शी उपकरण और सॉफ्टवेयर के विवरण के लिए सामग्री तालिका कासंदर्भ लें।
  3. लाइव-सेल छवियों को प्राप्त करने के लिए एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए यह सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप डिजिटल रूप से डेटा एकत्र करता है, 1.2 से अधिक संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ 40x या 60x उद्देश्य हैं, और ऑप्टिकल सेक्शनिंग करने में सक्षम है।
    नोट: इन आवश्यकताओं के बिना, छवियों को कम संकल्प दिखाएगा, सूक्ष्म माप और गुणात्मक टिप्पणियों की गुणवत्ता समझौता.
  4. छवि अधिग्रहण 17,18,19,20 के दौरान इसके विपरीत नुकसान से उत्पन्न होने वाली व्यवस्थित कलंक त्रुटियों को कम करने के लिए और उचित मात्रात्मक विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए मुक्त प्लग-इन प्रोग्राम (जैसे, फिजी) का उपयोग करें फ्लोरोसेंट तीव्रता और सेल के भीतर अन्य लौकिक और गतिशील घटनाओं की.
    नोट: अन्य उपलब्ध वाणिज्यिक deconvolution कार्यक्रम सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है.
  5. सबसे अच्छा अवलोकन के तहत फ्लोरोफोर से मेल खाते हैं कि माइक्रोस्कोप फिल्टर सेट चुनें। सुनिश्चित करें कि उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर सही बैंड गुजरता है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विशिष्ट पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं. उदाहरण के लिए, CFP संकेत का पता लगाने के लिए, एक उत्तेजना और उत्सर्जन बैंड पास 430/25 और 470/30 उपयुक्त है, लेकिन RFP फ्लोरोसेंट के लिए नहीं.
  6. एकाधिक समय बिंदुओं पर विखंडन खमीर इमेजिंग जब एक न्यूनतम प्रभावी सेटिंग्स दृष्टिकोण (MESA) का प्रयोग करें. दूसरे शब्दों में, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लंबे समय तक उपयोग से बचने और सबसे कम उत्तेजना शक्ति और जोखिम समय है कि स्वीकार्य उत्पन्न रोजगार, अभी तक परिमाणात्मक और reproduible इमेजिंग डेटा.
  7. mitosis या अर्धासन के दौरान लंबे समय तक इमेजिंग के लिए, अधिग्रहण समय अंक के बीच अंतराल को 5-10 मिनट तक सीमित करें। हालांकि 2% agarose पैड 12 से 16 एच इमेजिंग सत्र का सामना कर सकते हैं, सेल agarose वाष्पीकरण के कारण स्थानांतरण की संभावना है. इसलिए, क्रमशः 4-6 ज या 8-10 एच खिड़कियों में पूर्ण mitosis या अर्धसूत्री प्रयोग करें।
  8. 4-8 एच के लिए इमेजिंग डेटा ले लीजिए कम से कम 24-48 अधिग्रहण समय अंक से मिलकर, क्रमशः, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और एक z-स्टैक प्रति समय बिंदु और फ्लोरोसेंट चैनल के साथ 13 वर्गों के शामिल 0.5-$m रिक्ति एक 60x उद्देश्य का उपयोग कर. यह हार्ड ड्राइव संग्रहण स्थान के कम से कम 0.5-1 GB की आवश्यकता है। इस प्रकार, photobleaching और सेल स्थानांतरण को नष्ट करने के अलावा, एक कार्यप्रवाह है कि कंप्यूटिंग क्षमताओं पर विचार करता हैबनाएँ 1,2,3.
    नोट: ये अधिग्रहण पैरामीटर आम तौर पर सेट और सॉफ्टवेयर है कि माइक्रोस्कोप कार्यों को नियंत्रित करता है और जो एकत्र करता है और छवियों को संसाधित में संशोधित कर रहे हैं.
  9. विशिष्ट परमाणु प्रक्रियाओं की बारीकी से विस्तार से जांच करने के लिए, हर 5-10 s छवि अधिग्रहण प्रदर्शन, जब तक उत्सर्जन लगातार जोखिम के बाद काफी हद तक कमी नहीं है. विभिन्न समयअवधिओं में प्रारंभिक फ्लोरोसेंट तीव्रता विश्लेषण करें ताकि वह बिंदु निर्धारित किया जा सके जिसके बाद एकत्र किए गए आंकड़ों की सटीकता अब विश्वसनीय नहीं रह गई है1,3.
  10. छवि अधिग्रहण और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में, छवि z-स्टैक पर अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करने के लिए एक 2 डी विमान पर उच्च फ्लोरोसेंट घनत्व के साथ सभी संरचनाओं का निरीक्षण उनके ऊर्ध्वाधर स्थान1की परवाह किए बिना,2, 3. यह विभिन्न वोकेल्स में होने वाली नाभिकीय प्रक्रियाओं की तेजी से जांच करने की सुविधा प्रदान करता है। प्रेक्षण के अधीन कोशिकाओं का संदर्भ चित्र जनरेट करने के लिए मध्य-फोकल ब्राइट-फ़ील्ड छवि एकत्र करें.

5. ImageAnalysis20,21

नोट: इस प्रोटोकॉल में छवि विश्लेषण फिजी का उपयोग कर किया जाता है। अन्य विश्लेषण कार्यक्रमों और फिजी प्लग-इन के लिए सामग्री तालिकादेखें।

  1. Plugins मेनू के तहत जैव प्रारूप आयातक सुविधा का चयन करके एक deconvolved छवि अपलोड करें. आयात विकल्प पॉप-अप विंडो में, हाइपरस्टैक, डिफ़ॉल्ट रंग मोडका चयन करें, और OK बटन दबाने से पहले ऑटोस्केल की जाँच करें.
  2. सुनिश्चित करें कि प्रदर्शित खिड़की तल पर संबंधित सलाखों पर बग़ल में स्क्रॉल करके फ्लोरोसेंट चैनलों और समय फ्रेम की सही संख्या है। Tiff फ़ाइल के रूप में सहेजें, जो डेटा संपीड़ित नहीं करता है और जानकारी की हानि को रोकता है.
  3. एक छवि खोलें जिसमें माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा डेटा प्रोसेसिंग के दौरान उत्पन्न स्केल बार होता है। समान आकार की एक समानांतर रेखा आरेखित करें और विश्लेषण मेनू से माप का चयन करने के लिए सीधे रेखा उपकरण का उपयोग कर स्केल पट्टी की पिक्सेल लंबाई निर्धारित करें। विश्लेषण मेनू से स्केल सेट करें का चयन करके छवि पिक्सेल-से-$m अनुपात सेट करके स्केल बार जोड़ें.
    1. सेट स्केल पॉप-अप विंडो में, पिक्सेल में परिकलित दूरी दर्ज करें और $m में ज्ञात दूरीदर्ज करें, पिक्सेल पक्ष अनुपात को 1.0 पर सेट करें, माइक्रोन को लंबाई की इकाई केरूप में रखें, और क्लिक करने से पहले ग्लोबल बॉक्स को चेक करें ठीक बटन.
  4. उपायका चयन करते समय मात्रा निर्धारित करने के लिए विभिन्न मापदंडों का चयन करने के लिए विश्लेषण मेनू के तहत माप सेट विकल्प का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, निम्नलिखित मैट्रिक्स का चयन करें: क्षेत्र, परिधि, मतलब ग्रे मूल्य, माध्य, न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मूल्य, एकीकृत घनत्व, स्टैक स्थिति, और प्रदर्शन लेबल|
  5. संग्रहीत डेटा की शुद्धता के आधार पर, दशमलव स्थानों विकल्प के लिए 1 से अधिक दर्ज करें और यदि आवश्यक हो तो वैज्ञानिक संकेतन बॉक्स की जाँच करें। उपाय आदेश लागू करने के बाद, एक परिणाम पॉप-अप विंडो प्रत्येक प्रासंगिक पैरामीटर के लिए मान दिखाएगा। आँकड़े प्रोग्राम में भावी विश्लेषण के लिए परिणामों को .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें.
    नोट: यह लंबाई का निर्धारण करने के लिए अपने घटक फ्लोरोसेंट चैनलों में एक छवि को अलग करने के लिए आवश्यक नहीं है, जब तक कि वहाँ अलग अलग रंग के बीच संकेत हस्तक्षेप है जो मामले में नीचे विस्तृत कदम का पालन करें.
  6. संकेत हस्तक्षेप के मामले में, छवि मेनू से रंग और चैनल उपकरण का चयन करें और अलग से प्रत्येक रंग का विश्लेषण. गैर-रेखीय संरचनाओं की लंबाई को मापने के लिए, रेखा उपकरण पर राइट-क्लिक करें और इच्छित ऑब्जेक्ट्स का पता लगाने के लिए सेगमेंट्ड लाइन या फ्रीहैंड लाइन विकल्प का उपयोग करें।
    1. रैखिक संरचनाओं के लिए या दो बिंदुओं के बीच की दूरी निर्धारित करने के लिए, सीधे रेखा सुविधा का उपयोग करें और विश्लेषण मेनू से माप का चयन करें। $m में लंबाई के लिए मान स्वचालित रूप से सेट माप विकल्प के अंतर्गत पहले चयनित पैरामीटर में जोड़ दिए जाएँगे.
  7. संकेत आकार और फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन को मापने के लिए, पहले ब्याज का एक क्षेत्र बनाने (रॉय) पुस्तकालय, जो परिमाणीकरण सटीकता बढ़ जाती है और एक छवि ढेर भर में तेजी से माप की सुविधा. छवि मेनू के अंतर्गत रंग और चैनल टूल का चयन करें.
  8. चैनल पॉप-अप विंडो में, जिसके लिए तीव्रता या क्षेत्र मापा जाएगा रंग चैनल की जाँच करें। छवि मेनू के अंतर्गत समायोजित और थ्रेशहोल्ड सुविधाएँ चुनें. डार्क बैकग्राउंड बॉक्स की जांच करें, डिफ़ॉल्ट विधि का चयन करें (जब तक कि अन्यथा संग्रहीत डेटा द्वारा आवश्यक न हो), और ब्याज के संकेतों को ओवरले करने के लिए लाल चुनें.
    नोट: प्रोटीन स्थिरता, आंदोलन, और स्थानीयकरण के मापन बारीकी से ROI पुस्तकालयों बनाने के लिए इस्तेमाल रंग सीमा पर निर्भर हैं. यह फ्लोरोसेंट मार्कर संकेत के प्रकार के लिए सही दहलीज विधि का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है कल्पना की जा करने के लिए17,18.
  9. रुचि की प्रत्येक संरचना को हाइलाइट करने के लिए वांड टूल का उपयोग करें और पॉप-अप ROI प्रबंधक विंडो में चयनित ROI जोड़ने के लिए कुंजीपटल पर अक्षर T दबाएँ. छवि ढेर में प्रत्येक टुकड़ा (समय सीमा) के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ और अधिक बटन पर क्लिक करके और सहेजेंका चयन करके सभी ROIs की दुकान.
  10. ROI प्रबंधक लोड करने के लिए ज़िपित ROI फ़ोल्डर खोलें और बाईं ओर पैनल पर प्रत्येक ROI पहचानकर्ता पर क्लिक करें. विश्लेषण मेनू से उपाय का चयन करें और छवि स्टैक के सभी स्लाइस में ब्याज की वस्तुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक ROI पहचानकर्ता पर इस आदेश को दोहराएँ।
  11. यदि सेल स्थानांतरण कोई समस्या नहीं है और स्टैक के सभी स्लाइसों के लिए फोकल प्लेन समान रहता है, तो ROI प्रबंधकमें मल्टी माप पर क्लिक करें. पॉप-अप विंडो में, छवि स्टैक में माप को फिर से रेट करने के लिए स्लाइस प्रति एक पंक्ति के बजाय सभी स्लाइस मापें चुनें. एक csv फ़ाइल के रूप में परिणाम सहेजें और एक सांख्यिकी कार्यक्रम में माप का विश्लेषण.
  12. ब्याज की संरचना को शामिल कई परमाणु संकेतों के लिए, एक एकल ROI बनाने के लिए वांड उपकरण के साथ वस्तुओं का चयन करते समय शिफ्ट कुंजी दबाएँ। वैकल्पिक रूप से, ब्याज के सभी संकेतों को शामिल करने के लिए ओवल उपकरण के साथ निरंतर आकार का एक ROI बनाएँ।
    नोट: इस अंडाकार दृष्टिकोण को मापने और एक क्षेत्र है जहां समय के साथ आकार और तीव्रता में फ्लोरोसेंट संकेत परिवर्तन पर संकेत व्यवहार का वर्णन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. सिग्नल तीव्रता, इस मामले में, एक दिए गए क्षेत्र पर मतलब संकेत घनत्व है.
  13. गुणात्मक संकेत ओवरलैप क्षेत्र के रंग में परिवर्तन से दो फ्लोरोसेंट संकेतों के सह-स्थानीयकरण निर्धारित करते हैं। हालांकि, के रूप में सह-स्थानीयकरण ज़ोन narrows, यह संकेत ओवरलैप भेद करने के लिए और अधिक कठिन है। इस स्थिति में, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.
  14. चैनल उपकरण का उपयोग करना, के रूप में चरण 5.6 में वर्णित, प्रश्न में प्रत्येक संकेत पर एक सीधी रेखा आकर्षित, और विश्लेषण मेनू के तहत प्लॉट प्रोफ़ाइल आदेश का चयन करें.
    1. एक ही तैयार की गई रेखा का उपयोग कर प्रश्न में सभी रंगों के लिए इस चरण को दोहराएँ।
    2. प्रत्येक प्रोफाइलिंग चरण के बाद प्रकट होता है कि नमूना पॉप-अप विंडो के प्लॉट में, एक प्लॉट मान विंडो को कॉल करने के लिए सूची बटन दबाएँ, और एक सीएसवी फ़ाइल के रूप में प्रत्येक संकेत के लिए माप को बचाने के।
    3. सांख्यिकी प्रोग्राम में, एक ग्राफ़ बनाएँ जो आरेखित रेखा के साथ इसके संगत स्थान ($m में) के विरुद्ध प्रत्येक सिग्नल के लिए धूसर मान को प्लॉट करता है. सिग्नल प्रोफाइल भूखंडों के बीच ओवरलैप की कमी आम तौर पर सह-स्थानीयकरण की कमी को इंगित करती है।
      नोट: संकेत सह-स्थानीयकरण की जाँच करने के लिए अनुमानित छवियों पर प्लॉट प्रोफ़ाइल उपकरण का उपयोग करें। यह केवल विश्वसनीय है यदि इस तरह के ओवरलैप भी छवि z-स्टैक के माध्यम से मनाया जाता है।
  15. समय के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गतिशील व्यवहार की निगरानी करने के लिए विश्लेषण मेनू के तहत पाया बहु Kymograph उपकरण का उपयोग करें. परिणामस्वरूप छवि z-स्टैक के प्रत्येक स्लाइस में संघनित स्नैपशॉट की एक श्रृंखला के माध्यम से फ्लोरोसेंट संकेत आंदोलन से पता चलता है, जो व्यक्तिगत समय अंक का प्रतिनिधित्व करता है.
    1. सही चैनल में रुचि के ऑब्जेक्ट को अलग करने के लिए चरण 5.6 में वर्णित के रूप में चैनल उपकरण का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि चयनित ऑब्जेक्ट या संरचना z-स्टैक के माध्यम से काफी बदलाव नहीं करता है। ऑब्जेक्ट पर एक सीधी रेखा या आयत रखें, विश्लेषण मेनू से मल्टी Kymograph उपकरण का चयन करें, और ऑब्जेक्ट overlaying लाइन की वांछित चौड़ाई दर्ज करें।
  16. छवि पैनल है कि एक विशिष्ट समय खिड़की पर परमाणु गतिशीलता दिखाने के रूप में कदम 5.6 में वर्णित चैनल उपकरण का उपयोग कर और ढेर का चयन करके और छवि मेनू से असेंबल उपकरण बनाओ बनाएँ. असेंबल पॉप-अप करें विंडो में, वांछित स्तंभों और पंक्तियों की संख्या दर्ज करें, 1.0 का स्केल फैक्टर सेट करें, पहले और अंतिम स्लाइस (समय फ़्रेम) का चयन करें, और ठीक दबाने से पहले सीमा चौड़ाई को कम से कम 5 में बदलें। यह वांछित अनुक्रम के अनुरूप करने के लिए Increments बदलकर दिखाने के लिए ढेर में जो छवियों का चयन करने के लिए संभव है.
    1. कोई चलचित्र जनरेट करने के लिए, इच्छित हाइपरस्टैक अपलोड करें, फ़ाइल मेनू से AVI फ़ाइल के रूप में सहेजें का चयन करें, संपीड़नके लिए कोई भी चुनें, और 2-8 एफपीएस की फ़्रेम दर दर्ज करें. मर्ज या छवि शामिल सभी रंगों को अलग करने के लिए चैनल उपकरण में समग्र उठा जबकि असेंबल बनाओ आदेश का चयन करें।
      नोट: दो AVI फ़ाइलें (मूवी 1-2) इस प्रोटोकॉल में प्रदान की जाती हैं. चरण 5 में हाइलाइट की गई विभिन्न सुविधाओं का प्रयास करने के लिए फिजी में उनका उपयोग करें.
    2. किसी एकल, प्रतिनिधि कक्ष को दिखाने के लिए, छवि मेनू से रूपांतरण और घुमाएँ का उपयोग करें और घुमाने की डिग्री दर्ज करें. ऋणात्मक संख्याएँ ऑब्जेक्ट्स को बाईं ओर घुमाती हैं, जबकि धनात्मक मान ऑब्जेक्ट्स को दाईं ओर घुमाते हैं. एक बार सेल उचित अभिविन्यास में है, एक आयत है कि z-स्टैक के माध्यम से या ब्याज के समय फ्रेम के दौरान पूरे सेल शामिल आकर्षित और छवि मेनू से फसल का चयन करें. एक छवि पैनल या फिल्म उत्पन्न करने के लिए चरण 5.16 और 5.16.1 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
  17. विश्लेषण मेनू से उपकरण और स्केल बार का चयन करके छवि पैनल या चलचित्र में स्केल बार जोड़ें. स्केल बार पॉप-अप विंडो में, एकल कक्षों के लिए माइक्रोन में चौड़ाई के लिए 5-15 या दृश्य के पूरे क्षेत्रों के लिए 100-250 दर्ज करें, रंग के लिए सफेद या काले रंग चुनें, और स्केल बार रखने के लिए कोई उपयुक्त स्थान चुनें.
    1. फिल्मों के लिए, यह परमाणु घटनाओं के दौरान समय प्रगति दिखाने के लिए उपयोगी है. फ़्रेम्स के बीच समय परिवर्तन दिखाने के लिए, छविका चयन करें, स्टैकपर क्लिक करें, समय स्टाम्पर उपकरण का उपयोग करें, समय श्रृंखला में प्रारंभ फ़्रेम इंगित करें, और समय प्रदर्शन के लिए एक उपयुक्त स्थान का चयन करें.

Representative Results

चाहे लाइव-सेल इमेजिंग mitosis या अर्धासन के लिए प्रयोग किया जाता है, यह अवलोकन के किसी भी प्रकार बनाने से पहले स्वस्थ विखंडन खमीर कोशिकाओं को रोजगार के लिए महत्वपूर्ण है. परिणामी डेटा की गुणवत्ता प्रारंभिक सामग्री पर काफी निर्भर करती है. यदि कोशिकाएं पोषक तत्वों की सीमा या अतिवृद्धि के कारण भूखे हैं, तो वे अतिरिक्त धानी दिखाएगी और कोशिका का आकार कम कर देगी (भुखमरी, चित्र 2क)। mitosis प्रयोगों के लिए, यह सबसे अच्छा है कोशिकाओं है कि सेलुलर तनाव दिखाने का उपयोग कर से बचने के लिए (Starvation, चित्र 2A). अन्यथा, प्रयोगात्मक परिणाम असंगत और अपरिवर्तनीय हो जाएगा. इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, उचित जंगली प्रकार के नियंत्रण का चयन और ब्याज के म्यूटेंट के विभिन्न phenotypes के साथ परिचित हो जाते हैं। उदाहरण के लिए, 12 ज के लिए भूखे माइटोटिक कोशिकाओं को सक्रिय रूप से डीएनए को दोहराने के लिए संघर्ष करें। के बाद से Tos4-GFP अभिव्यक्ति G1/S-चरण गतिविधि22,23, लघुगणकीय कोशिकाओं इस मार्कर ले जाने और परमाणु विभाजन के लिए एक (Sad1-DsRed10)शो पैन परमाणु Tos4-GFP अभिव्यक्ति, Sad1-DsRed foci के साथ जुड़ा हुआ है पृथक्करण, और चल रहे सेप्टेशन (सक्रिय डीएनए प्रतिकृति और कोशिका विभाजन का सुझाव देना) (लॉग, चित्र 2A),जबकि भूखे कोशिकाओं ऐसी कोई गतिविधि नहीं दिखाते हैं (Starvation, चित्र 2A) . यह परिणाम विखंडन खमीर में पोषक तत्व सीमा के प्रभाव के अनुरूप है, जो G1 में प्रतिलेखन कम हो जाती है, G1/S सेल चक्र जांच की चौकी को सक्रिय करता है, और G0 प्रविष्टि5को बढ़ावा देता है। meiosis प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को एक उच्च घनत्व के लिए विकसित करना चाहिए, लेकिन स्थिर चरण तक पहुँचने के बिना. इसके बाद, दोनों मेट प्रकारों की कोशिकाओं को कम नाइट्रोजन मीडिया में एक साथ मिलाया जाता है और इनक्यूबेट किया जाता है। साथी के लिए विफलता, के रूप में मामला है जब कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से नाइट्रोजन के भूखे नहीं हैं, उन्हें meiosis में प्रवेश करने से रोक देगा (अकुशल, चित्र 2B). संभोग सेल निलंबन के मजबूत flocculation सेल से सेल बातचीत बढ़ जाती है और इस प्रकार सफल संभोग और कुशल meiotic प्रेरण इंगित करता है (कुशल, चित्र 2B).

Agarose जेल पैड और सेल clumps के शारीरिक विघटन एकल कोशिकाओं या Asci के उचित दृश्य की गारंटी (लॉग, चित्र 2A; कुशल, चित्र 2B) पैड एक कठोर, अभी तक नम मंच है जिस पर कोशिकाओं को एक साथ जगह में तय कर रहे हैं और शुष्कता से संरक्षित प्रदान करना चाहिए. इसके अलावा, पैड वाष्पीकरण के कारण परिवर्तन का सामना करने के लिए पर्याप्त मोटी होना चाहिए और एक समतल सतह है कि छवि अधिग्रहण भर में उचित ध्यान देने की अनुमति प्रदान (चित्र 1C). आवरणक्रम घूर्णन समागम के भीतर कोशिकाओं को अलग और प्रसार करने के लिए आवश्यक है (चित्र 1F; कुशल, चित्र 2B) इस कदम के बिना, कुछ एएससी लेकिन कई अगुणित कोशिकाओं को देखा जाता है क्योंकि एएससी संभोग clumps के दुर्गम परतों के भीतर फंस जाते हैं, जबकि अगुणित कोशिकाओं को सभी उपलब्ध मोनोलेयर स्पॉट आबाद करने के लिए स्वतंत्र हैं (चित्र 2B)। यहां तक कि माइटोटिक प्रयोगों के लिए, जहां सेल क्लंपिंग कम समस्याग्रस्त है, कवरस्लिप रोटेशन भीड़ प्रभाव को कम करने और सेल डुप्लिकेशन के लिए अनुमति देने के लिए कोशिकाओं के बीच पर्याप्त स्थान के साथ एक एकल सेल परत बनाने के लिए पैड के चारों ओर कोशिकाओं को ले जाता है (लॉग, चित्र ाहा 2A ).

Atb2 विखंडन खमीर mitosis और अर्धसूत्री विभाजन7,14में गुणसूत्र अलगाव में शामिल एक जेड-ट्यूबुलिन घटक है। जब फ्लोरोसेंट टैग किया गया, तो यह साइटोस्केलेटन घटक उन चरणों की परीक्षा की अनुमति देता है जो मिटोसिस में परमाणु जुदाई की विशेषता है। प्रोफेज (0'-20', चित्र 3क)के दौरान, माइटोटिक धुरी का नाभिक धुरी ध्रुव निकायों (एसपीबी) के परमाणु पक्ष में होता है, जैसा कि एक Htt1-GFP5 पैन-न्यूक्लियर पृष्ठभूमि के खिलाफ सेट Atb2-mRFP फाइबर द्वारा पता चला। मेटाफेज-एनाफेज संक्रमण के दौरान (20-40', चित्र 3क) माइटोटिक तर्कु बाहर की ओर फैली हुई है और नाभिक दो भागों में विभाजित होता है। जैसे-जैसे कोशिका telophase (60'-80', चित्र 3A) में प्रवेश करती है, Atb2-mRFP द्विदिश रूप से तब तक फैलता है जब तक गुणसूत्र पूरी तरह से अलग नहीं हो जाते। इस बिंदु के बाद, Atb2-mRFP फाइबर फिर से समूह और सेल सतह भर में फैल परिणामस्वरूप बेटी कोशिकाओं में से प्रत्येक में अपने interphase फार्म हासिल करने के लिए. साइटोकिनेसिस ([120', चित्र 3क) पट के रूप में ही होता है और कोशिका को विखंडन द्वारा विभाजित करता है। एक माइटोटिक चक्र पर Hht1-GFP तीव्रता में परिवर्तन के बाद परमाणु गतिशीलता में तीन महत्वपूर्ण कदम से पता चलता है: metaphase-anaphase (मध्यम तीव्रता, डीएनए संहनन: 20'-40', चित्रा 3A-B), telophase (कम तीव्रता, डीएनए जुदाई: 60'-80', चित्र 3A-B), और G1 (बढ़ती तीव्रता, डीएनए दोहराव: 100'-120', चित्र 3A-B)। इसी तरह, लेकिन कोशिकाओं है कि केवल Hht1-mRFP ले और बहु kymograph उपकरण को रोजगार का उपयोग कर (चरण 5.15 देखें) फिजी में, यह मेटाफेज से telphase के लिए mitotic विभाजन का पालन करें और उचित बहन क्रोमैटिड के दौरान शामिल परमाणु आंदोलनों का मूल्यांकन करने के लिए संभव है पृथक्करण (सामान्य, चित्र 3C)। मिस-पृथक्करण किमोग्राफ दो मुख्य नाभिकीय पथों के बीच संकेत गतिविधि दर्शाते हैं, जो गुणसूत्र विखंडन या अनुपयुक्त क्रोमैटिक पृथक्करण के कारण संभावित गलत पृथक्करण का संकेत देते हैं (लैगिंग, चित्र 3 ब्)।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, नवोदित और विखंडन खमीर में, Tos4 G1 में लिखा है और एस चरण22,23में डीएनए प्रतिकृति के दौरान कार्य करता है. यह एक kymograph में देखा जा सकता है जहां Tos4-GFP अभिव्यक्ति Sad1-DsRed10 foci विपरीत दिशाओं के लिए कदम के बाद नाभिक में बढ़ जाती है (परमाणु विभाजन का संकेत), लेकिन पट रूपों से पहले, जो cytokinesis से पहले (39', चित्रा 3 डी ; 36', चित्र 3E) उच्च Tos4-GFP गतिविधि का चरण M-G1/S संक्रमण (45', चित्र 3E) के अंत में शुरू होता है और G2 में समाप्त होता है (gt;60', चित्र 3E), सही सेल विभाजन के बाद. जबकि बहुत G1 के दौरान फैलाना, Tos4-GFP संकेत तीव्रता anaphase के बाद बढ़ जाती है और एस चरण भर में और अलग Sad1-DsRed foci के साथ सह-स्थानीयकरण (45'-DsRed foci ', चित्रा 3E). यह परिणाम विखंडन खमीर में सेप्टेशन अवधि का पता चलता है जब जीनोम दोहराव बेटी कोशिकाओं में शुरू हो गया है (G1/S), लेकिन साइटोकिनेसिस अभी तक नहीं हुआ है.

Hht1 विखंडन खमीर में histone H3 है और आमतौर पर फ्लोरोसेंट टैग के साथ संशोधित किया जाता है परमाणु डीएनएकल्पना 5,14. मिटोसिस में, मेटाफेज से टेलोफेज (20-120', चित्र 3क) में कोशिकाओं के संक्रमण के रूप में, परमाणु द्रव्यमान में दो विशिष्ट परिवर्तन पाए जाते हैं। प्रथम परिवर्तन में मेटाफेज (20,चित्र 3क)में नाभिकीय आकार का संकुचन होता है, जबकि दूसरा अंक चरण (40', चित्र 3क) के दौरान नाभिक विभाजन दर्शाता है। इन परिवर्तनों को माइटोटिक कोशिकाओं के साथ साझा करने के अलावा, मीओटिक कोशिकाएं परमाणु दोलन (अर्थात, घोड़े की पूंछ) (-100' से -50 तक, चित्र 4ए-बी) के साथ समजात पुनर्संयोजन के दौरान और एनाफेज II (70-90') के अंत में नाभिक आकार में और कमी प्रदर्शित करती हैं। चित्र 4A). Hht1-mRFP इस तरह के ठंड या खंडित गुणसूत्रों के रूप में गलत अलगाव phenotypes की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है (लैगिंग, चित्र 3C)। यह मध्याह्न ताके के प्रत्येक चरण में नाभिकीय गतिशीलता का अवलोकन और वर्णन करने के लिए भी कार्यरत है (चित्र 4क-बी)। परमाणु द्रव्यमान बड़ा है और घोड़े की पूंछ के अधिकांश के दौरान आकार में उतार चढ़ाव (एचटी: -100' करने के लिए -50', चित्र 4A-B)). के रूप में कोशिकाओं metaphase में प्रवेश (एमटी: -40' करने के लिए 0', चित्र 4A-B),परमाणु आकार और दोलन कमी, इस स्तर पर वृद्धि हुई संघनन गतिविधि के साथ संगत. दोनों anaphase मैं (एमआई: 10'-60', चित्रा 4A-B) और द्वितीय (MII: 70'-90', चित्र 4A-B) की शुरुआत आगे परमाणु कमी और परमाणु आंदोलन की कमी है, जो दो परमाणु डिवीजनों कि विशेषता के साथ अच्छी तरह से संबंधित है के साथ जुड़ा हुआ है meiosis मैं और द्वितीय (एमआई और एम आई आई)। इस प्रकार, समियोसिस परमाणु आकार में उतार-चढ़ाव के साथ जुड़ा हुआ है जब समजात गुणसूत्र संरेखित और recombine और परमाणु आकार में कमी के साथ गुणसूत्र जुदाई के दो दौर के बाद. इन परमाणु गतिशीलता को बदलने वाले एलेल्स संभवत : 12,13में जीनोम स्थिरता विनियमन से जुड़े हुए हैं .

Rec8 विखंडन खमीर में meiotic cohesin की जेड-क्लीसिन उपइकाई है। यह डीएनए प्रतिकृति (मी-एस) के बाद क्रोमैटिन पर लोड किया जाता है और बहन क्रोमैटिड को एक दूसरे से टेढ़े रखता है जब तक कि एनाफेज II नहीं। मेटाफेज I के बाद, Rec8 गुणसूत्र हथियारों से separase द्वारा हटा दिया जाता है और Sgo1-PP2A द्वारा केंद्र में संरक्षित है. होमोलॉग पृथक्करण के अंत में, रे8 को भी सेन्ट्रोम्री में समाप्त कर दिया जाता है , जिससे बहन क्रोमैटिड पृथक्करण की अनुमति मिल जाती है (चित्र 5क)6,24. Rec8-GFP ऐसे Sad1-DsRed या Hht1-mRFP के रूप में गुणसूत्र अलगाव के मार्करों के साथ meiosis के दौरान सामंजस्य गतिशीलता के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं. Rec8-GFP संकेत mei-S के दौरान पैन-परमाणु है (और lt;lt;-90', चित्रा 5A-B), prophase मैं (-90' से -50', चित्रा 5A-B),और metaphase I (-40' से 0', चित्रा 5A-B)। इस अवलोकन गुणसूत्र अक्ष है कि डीएनए दोहराव का पालन करता है साथ Rec8-GFP के सहयोग से पता चलता है. के रूप में कोशिकाओं anaphase मैं प्रवेश (10', चित्र ा-बी), Rec8-GFP तीव्रता नाभिक भर में कम हो जाती है, लेकिन centromere पर मजबूत रहता है, जहां यह प्रत्येक परमाणु द्रव्यमान में एक ध्यान रूपों (20'-70', चित्र 5A-B). यह परिणाम गुणसूत्र हथियारों के साथ Rec8-GFP गिरावट के साथ संगत है, लेकिन centromere पर नहीं, कि homolog अलगाव के बाद ensues. ANaphase द्वितीय से पहले, Rec8 फोकस गायब हो जाता है, MII में जुदाई के लिए बहन क्रोमैटाइड मुक्त (70'-80', चित्र 5A-B) . Rec8-GFP मार्कर है, इस प्रकार, स्थिति है कि स्थापना को बाधित की जांच करने के लिए उपयोगी, हटाने, और meiotic सामंजस्य के समग्र स्थिरता. इस तरह के Hht1-mRFP 5,13, Rec8-GFP के रूप में परमाणु विभाजन के एक मार्कर के साथ युग्मित कैसे सामंजस्य समय और स्थिरता से पहले और meiosis के दौरान उचित गुणसूत्र अलगाव को प्रभावित करने के सवालों को संबोधित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है12 ,13. इस प्रोटोकॉल प्रोटीन जिनकी गतिशीलता cytosol में मुख्य रूप से होते हैं पता नहीं है. हालांकि, तालिका मैं कुछ cytosolic प्रोटीन है कि आमतौर पर endocytosis के लिए आवश्यक cytoskeleton और झिल्ली प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है से पता चलता है, exocytosis, और अन्य प्रक्रियाओं के बीच साइटोकिनेसिस.

Figure 1
चित्रा 1: लाइव-सेल इमेजिंग के लिए agarose पैड की तैयारी। (ए) स्लाइड तैयारी सेट-अप एक पिपेट टिप धारक, प्रयोगशाला टेप, और माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करके इकट्ठा किया गया। एक दूसरे के लंबवत स्लाइड रखकर एक जेब बनाता है जहां agarose पैड रूपों. पक्षों पर प्रयोगशाला टेप टुकड़े के अलावा आवश्यक विनिर्देशों के लिए agarose पैड चौड़ाई समायोजित कर देता है। (बी) Molten agarose पैड बनाने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्थापित करने से पहले इसे ठंडा करने के लिए छोड़ दिया जाता है। इस चरण में, हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए धीरे-धीरे एग्रोस मात्रा को वितरित करना आवश्यक है। (सी) शीर्ष स्लाइड वितरित agarose स्थान पर रखा गया है एक सीधी सतह के साथ एक परिपत्र पैड बनाने के लिए, यहां तक कि किनारों, और कोई दिखाई agarose दरारें. (डी) agarose पैड पर सेल निलंबन का एक नमूना डालने के बाद, स्लाइड उलटा और अतिरिक्त तरल माध्यम को दूर करने के लिए एक लिंट मुक्त कागज तौलिया के ऊपर जगह है। (ई) ध्यान से agarose पैड पर एक coverslip जगह है, यकीन है कि किसी भी हवा बुलबुले जाल और जाँच है कि फोकस विमान सेल स्थानांतरण और ध्यान केंद्रित मुद्दों से बचने के लिए फ्लैट है नहीं कर रही है. (एफ) धीरे-धीरे और सावधानी से, सेल clumps को बाधित करने के लिए और सेल विस्तार और बेहतर सेल दृश्य के लिए अनुमति देता है कि एक सेल मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए कवरस्लिप दक्षिणावर्त बारी बारी से। (जी,एच) एक गर्म हाइड्रोकार्बन मिश्रण का उपयोग करने के लिए agarose पैड सील और उन्हें इमेजिंग से पहले वांछित तापमान को बराबर करने के लिए अनुमति देते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सही कक्षों को चुनना. (ए) शीर्ष पैनल विखंडन खमीर कोशिकाओं को दिखाने के लिए EMM प्लस की खुराक में भूखे रहने के लिए छोड़ दिया 72 एच और नीचे पैनल के लिए लघुगणकीय विकास के दौर से गुजर कोशिकाओं से पता चलता है. कोशिकाओं है कि भूखे रहने के लिए छोड़ दिया जाता है में, छोटे सेल morphologies की सराहना की जा सकती है. लाल खुला तीर धानी granules कि भुखमरी की विशेषता हैं पता चलता है. लघुगणकीय संस्कृतियों में, लम्बी आकृति विज्ञान और सेप्टा (लाल तीर) को प्रदर्शित करने वाली कोशिकाएं, सक्रिय साइकिल चालन गतिशीलता का संकेत देती हैं। दाईं ओर पैनलों भुखमरी और प्रसार के दौरान Tos4-GFP और Sad1-DsRed संकेतों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को दिखाते हैं। पैन परमाणु Tos4-GFP अभिव्यक्ति और Sad1-DsRed संकेत है कि विपरीत सेल डंडे के लिए स्थानीय सक्रिय प्रसार के दौरान देखा जाता है, लेकिन भुखमरी में नहीं. (बी) शीर्ष पैनल एक ही साथी प्रकार (ज +) कुशलता से दोस्त करने में विफल की कोशिकाओं से पता चलता है. लाल खुला तीर करयोगामी से गुजरने वाली धानी कोशिकाओं की एक जोड़ी दिखाता है। यह एच + कोशिकाओं की संस्कृतियों में असामान्य नहीं है, जहां 10% कोशिकाएं मेट-प्रकार को ज- में स्विच कर सकती हैं। नीचे पैनल कुशल संभोग से उत्पन्न asci से पता चलता है. ज़िगोटिक एसियाई ज़िग-जाग (लाल तीर) और केले के सेल आकार (लाल खुले तीर) सहित कई रूपों को लेते हैं। स्केल बार की लंबाई 5 डिग्री सेल्सियस है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Mitotic परमाणु गतिशीलता. (ए) हिस्टोन एच 3 (एचटी1-जीएफपी) और माइक्रोट्युबल (Atb2-mRFP) प्रोटीन एक mitosis चक्र (120 मिनट) के दौरान पीछा किया गया। Ht1-GFP और Atb2-mRFP के लिए व्यक्तिगत संकेतों काले और सफेद पैनलों में दिखाए जाते हैं, जबकि BF मर्ज उन्हें अपने संबंधित रंग में पता चलता है. (बी) एक माइटोटिक चक्र पर Hht1-mGFP तीव्रता का परिमाणीकरण. Hht1 के स्तर में परिवर्तन Mitosis और G1 में डीएनए दोहराव के दौरान परमाणु विभाजन का संकेत है. (ग) किमोग्राफों में सामान्य या असामान्य पृथक्करण को दिखाया गया है, जहां परिणामी नाभिकीय पथ या तो द्विशाखकारी हैं और डीएनए अखंडता को बनाए रखते हैं या विचलित होते हैं और गुणसूत्र विखंडन या समयपूर्व वर्णीय पृथक्करण को बढ़ावा देते हैं। (डी,ई) Kymograph और micrograph पैनलों Sad1-DsRed के अलगाव और परमाणु Tos4-GFP संकेतों की उपस्थिति से पता चला एम-टू-जी1/एस की अवधि दिखा. ई में मध्यम पैनलों जो फिजी में आग LUT का उपयोग कर एक तीव्रता स्नातक थर्मल नक्शा है कि उच्च Tos4-GFP अभिव्यक्ति के साथ स्थानों की पहचान की सुविधा बनाने के लिए उत्पन्न किए गए थे नोट; इस मामले में, नाभिक और ओवरलैपिंग Sad1-DsRed संकेतों के लिए स्थानीयकृत, के रूप में की उम्मीद है. स्केल बार की लंबाई 5 डिग्री सेल्सियस है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: Meiotic परमाणु गतिशीलता. (ए) अर्धसूत्री विभाजन के दौरान केंद्रक (एचटी1-एमआरएफपी) के संचलन, संहनन और विभाजन को दर्शाने वाली पैनल श्रृंखला। हार्स-टेलिंग (एचटी) मेटाफेज (एमटी) के बाद व्यापक पक्ष-से-साइड न्यूक्लियर दोलनों को दिखाता है, जहां परमाणु पार्श्व आंदोलन कम हो जाता है और anaphase I से पहले पूरी तरह से रुक जाता है। अर्धसूत्री विभाजन में प्रथम (एमआई) मुख्य नाभिकीय द्रव्यमान दो में विभाजित होता है, जबकि अर्धसूत्री विभाजन द्वितीय (एमआईआई) में चार नाभिक सिस्टर क्रोमैटिड पृथक्करण की प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न होते हैं। (ख) प्रोफेज, मेटाफेज, एमआई और एमआईआई में परमाणु क्षेत्र परिवर्तन (एचटी1-एमआरएफपी) का परिमाणीकरण। परमाणु क्षेत्र एचटी दोलनों के दौरान गतिशील है, मीट्रिक टन में संघनित हो जाता है, और एमआई और एमआईआई के दौरान आकार में और अधिक कम हो जाती है, जहां थोड़ा परमाणु आंदोलन मनाया जाता है (लंबे परमाणु अक्ष)। सबसे लंबे समय तक परमाणु अक्ष मापने (लंबे परमाणु अक्ष) विचार है कि एक चक्र के रूप में फैला है पर आधारित है, यह एक निरंतर व्यास है और कम से कम दो मुख्य अक्ष उत्पन्न करता है: लंबे और छोटे. इस प्रकार, जब नाभिक में परिवर्तन की निगरानी, या तो लंबे या छोटे अक्ष में परिवर्तन परमाणु आंदोलन के संकेत प्रदान करते हैं. स्केल बार की लंबाई 5 डिग्री सेल्सियस है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: Meiotic cohesin गतिशीलता. (क) पैनल श्रृंखला जिसमें यह दर्शाने वाली है कि Rec8-GFP सिग्नल परिवर्तन मेयोटिक नाभिकीय गतिशीलता से संबंधित है। एचटी और एमटी के दौरान, Rec8-GFP संकेत पैन परमाणु है और परमाणु आंदोलन (Hht1-mFRP) इस प्रकार है। एमआई में, Rec8-GFP नाभिक से dissipates, foci की केवल एक जोड़ी है, जो गुणसूत्र हथियारों से Rec8 हटाने और Sgo1-PP2A संरक्षण की स्थापना के साथ संगत है छोड़ centromere. के रूप में सेल MII दृष्टिकोण, Rec8-GFP foci गायब करने के लिए शुरू और अब सही anaphase द्वितीय से पहले देखा जाता है. (ख) एचटी से एमआईआई तक Rec8-GFP तीव्रता का परिमाणीकरण। क्या एकमें देखा जाता है के समान , GFP संकेत एचटी और मीट्रिक टन के माध्यम से उच्च है, काफी एमआई के दौरान कम हो जाती है और पूरी तरह से MII में गायब हो जाते हैं. यह पैटर्न गुणसूत्र हथियारों और सेंट्रोम के पास की गतिशीलता की पुष्टि करता है, जहां यह बहन क्रोमैटिड को एमआईआई में अलग होने के लिए तैयार होने तक टेढ़ी रहती है। स्केल बार की लंबाई 5 डिग्री सेल्सियस है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रोटीन समारोह टिप्पणियाँ टैग संदर्भ
Hht1 डीएनए पैकेजिंग में शामिल हिस्टोन एच 3 गुणसूत्र गतिशीलता की जांच करने के लिए प्रयुक्त Hht1-mRFP 5,14
Tos4 Tos4 फ़ंक्शन G1 चरण के दौरान होती है G1 समय का अध्ययन करने के लिए नियोजित Tos4-GFP 22,23
रेड21/ प्रतिकृति के बाद बहन क्रोमैटिड को एक साथ रखने में शामिल कोहेसिन उपइकाइयें माइटोटिक के दौरान सामंजस्य स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए प्रयुक्त (Rad21) और meiotic अलगाव (Rec8) रेड21-जीएफपी/ 6,24
रेड11 RPA गतिविधि माइटोटिक डीएनए मरम्मत के दौरान होती है, meiotic पुनर्संयोजन, और मेटाफेज में समाप्त होता है mitosis में डीएनए की मरम्मत और meiosis में पुनर्संयोजन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित रेड11-वाईएफपी 5,13
रेड52 Rad52 acivity mitotic डीएनए की मरम्मत और meiotic पुनर्संयोजन के दौरान जगह लेता है mitosis में डीएनए की मरम्मत और meiosis में पुनर्संयोजन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित रेड52-सीएफपी 5,13
Cnp1 Histone H3 CENP-एक विशेष रूप से केंद्र में स्थानीयता mitosis और अर्धसूत्री विभाजन में गुणसूत्र अलगाव गतिशीलता का पालन करने के लिए प्रयुक्त Cnp1-mCherry 13
Swi6 HP1 होमोलॉग प्रोटीन हेटेरोक्रोमेटिन गठन में शामिल सेंट्रोमरे और टेलोमर्स में हेटेरोक्रोमेटिन लामबंदी का अध्ययन करने के लिए नियोजित Swi6-GFP 13
साद1 Sad1 परमाणु लिफाफे के लिए धुरी पोल शरीर स्थानीयकरण में शामिल है mitosis और अर्धसूत्री विभाजन में गुणसूत्र अलगाव का विश्लेषण करने के लिए नियोजित साद1-मचेरी 10
CYTOSOL और MEMBRANE
Atb2 ट्यूबुलिन अल्फा 2 माइक्रोट्यूबयूल साइटोस्केलेटन संगठन में शामिल मिटोसिस और अर्धसूत्री विभाजन में गुणसूत्र अलगाव की जांच करने के लिए प्रयुक्त Atb2-mRFP 7,14
Ync13 वेसकल-मध्यस्थ परिवहन में शामिल एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस नियामक साइटोकिनेसिस के दौरान सेल-दीवार अखंडता का अध्ययन करने के लिए नियोजित Ync13-mECitrine 25
Rlc1 मायोसिन द्वितीय उपइकाई जो अनुबंधी वलय संकुचन में शामिल है पट परिपक्वता और संकुचन की गतिशीलता का पता लगाने के लिए प्रयुक्त RIc1-मचेरी 25
Ccr1 NADPH-साइटोक्रोम p450 रिडक्टस कि ईआर, प्लाज्मा, और mitochrondrial बाहरी झिल्ली का हिस्सा है एंडोसाइटोसिस, एक्सोसाइटोसिस, और साइटोकिनेसिस जैसे झिल्ली-संबद्ध गतिशीलता की जांच करने के लिए नियोजित Ccr1N-GFP 5
गफ1 कोशिका ध्रुवता की स्थापना और रखरखाव में शामिल रो गुआनाइल-न्यूक्लिओटाइड विनिमय कारक वैश्विक, microtubule-निर्भर सेल polarity गतिशीलता की जांच करने के लिए प्रयुक्त Gef1-mCherry-GBP 26
फ़्यूस1 cytogamy के दौरान actin संलयन फोकस विधानसभा में शामिल फॉर्मिन विखंडन खमीर संभोग के साथ जुड़े संलयन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रयुक्त Fus1-sfGFP 27
Mnn9 Golgi उपकरण में प्रोटीन एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन में शामिल मैनोसिलट्रांसफरस सबयूनिट यह cis-Golgi से ट्रांस-Golgi के लिए प्रगति के रूप में Golgi में कार्गो परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए रोजगार Mnn9-मचेरी 28
Num1 घोड़े की पूंछ में शामिल डाइनिन के लिए Cortical एंकरिंग कारक माइओटिक प्रोफेज I में परमाणु दोलन के दौरान माइटोकोंड्रिया-निर्भर डाइनिन एंकरिंग की जांच करने के लिए प्रयुक्त Num1-yEGFP 29

तालिका 1: परमाणु और साइटोसोलिक गतिशीलता के मार्करों.

Movie 1
मूवी 1: M-to-G1/S संक्रमण दिखा धुरी पोल शरीर (SPB; Sad1-DsRed) जुदाई पूर्ववर्ती सितम्बर और Tos4-GFP परमाणु संकेत के संचय. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
मूवी 2: microtubule (Atb2-mRFP) विस्तार परमाणु (Hht1-GFP) विभाजन के साथ संबंधित दिखा mitotic चक्र का समापन. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

mitosis और अर्धसूत्री विज्ञान के दौरान लाइव सेल इमेजिंग डेटा अधिग्रहण के दौरान विखंडन खमीर शरीर क्रिया विज्ञान को काफी हद तक बाधित किए बिना परमाणु गतिशीलता की जांच करने का अवसर प्रदान करता है। हालांकि, सावधानी सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को पर्यावरण तनाव से मुक्त वांछित घनत्व के लिए विकसित किया जाना चाहिए; और meiosis के लिए, कि कोशिकाओं टर्मिनल भेदभाव के समय के दौरान छवि रहे हैं और बहुत जल्दी या देर से नहीं. अतिरिक्त सेलुलर भीड़, भुखमरी, और अनुचित विकास तापमान आम कारक है कि अपरिवर्तनीय टिप्पणियों के लिए योगदान कर रहे हैं. इसके अलावा, तनाव निर्माण के दौरान, यह परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट टैग लक्ष्य जीन के कार्यों के साथ हस्तक्षेप नहीं करते हैं और न ही समग्र सेल फिटनेस को प्रभावित करते हैं। बारीकी से फ्लोरोसेंट मार्करों ले जाने उपभेदों के phenotypes निरीक्षण करने में विफलता समान जीनोटाइप भर में असंगत और अतुलनीय परिणाम में परिणाम हो सकता है.

हालांकि माइक्रोस्कोप agarose पैड इकट्ठा करने के लिए सरल कर रहे हैं, वे भी मूल्यवान इमेजिंग डेटा प्राप्त करने में एक बाधा पैदा कर सकता है. agarose पैड बनाना एक दूसरे के समानांतर तीन माइक्रोस्कोप स्लाइड रखने के रूप में सरल है, बीच स्लाइड पर पिघला हुआ agarose वितरण, और एक स्लाइड है कि अन्य स्लाइड के ऊपर transverses डाल. यह उपयोगी है, तथापि, एक स्लाइड निर्माता उपकरण है कि चौड़ाई संशोधनों के लिए प्रतिरोधी, स्थिति विशेष agarose पैड का निर्माण करने के लिए अनुमति देता है इकट्ठा करने के लिए. पैड चौड़ाई लचीलापन देता है कि एक सरल स्लाइड निर्माता एक मंच (पिपेट युक्तियाँ धारक या बेंच), दो माइक्रोस्कोप स्लाइड, और प्रयोगशाला टेप पैड चौड़ाई समायोजन तंत्र के रूप में अभिनय के होते हैं (चित्र 1A). सटीक पैड मोटाई इमेजिंग समय आवश्यकताओं, agarose ब्रांड, तापमान, कवरस्लिप सीलेंट, वाष्पीकरण दर, आदि पर निर्भर करेगा इस प्रकार, तकनीकी पुन: उत्पादन क्षमता बढ़ाने के लिए और लाइव-सेल इमेजिंग 1,2,3की गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए डेटा अधिग्रहण से पहले इमेजिंग प्रणाली की जांच करना महत्वपूर्ण है। पैड सतह, कठोरता, और संरचना लंबे समय तक छवि अधिग्रहण के दौरान आवश्यक हैं. Agarose कम पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट है, आसानी से ढाला जा सकता है, और उचित एकाग्रता पर, वाष्पीकरण के कारण संरचनात्मक विरूपण का सामना. इसके अलावा, agarose के साथ विखंडन खमीर मीडिया के संयोजन छवि गुणवत्ता समझौता नहीं करता है और कई mitoses और अर्धासन चक्र की विस्तारित अवलोकन के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए किसी भी हवा के बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। Agarose पैड के अंदर और नमूने के भीतर, हवा जेब समय के साथ विस्तार, सेल स्थानांतरण और फोकल विमानों को बाधित करने के कारण. लेकिन कोशिकाओं कुशलता से कवरस्लिप रोटेशन द्वारा अलग फैल रहे हैं, शोधकर्ताओं ने कई पीढ़ियों और परमाणु संलयन से sorulation के लिए meiotic घटनाओं भर में माइटोटिक प्रक्रियाओं का पालन कर सकते हैं. बनाने और इमेजिंग प्रयोगों के लिए सही पैड का चयन मास्टर करने के लिए समय लगता है, लेकिन एक बार हासिल की, अत्यधिक जानकारीपूर्ण माइक्रोस्कोप टिप्पणियों के लिए योगदान कर सकते हैं.

के रूप में अन्य तरीकों के साथ मामला है, लाइव सेल माइक्रोस्कोपी तकनीकी सीमाओं से मुक्त नहीं है. फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग उन प्रयोगों के लिए सीमाओं का परिचय देता है जो अध्ययन किए जा सकने वाले दायरे को सीमित करते हैं। फोटो ब्लीचिंग और फोटो-विषाक्तता लंबे समय तक छवि अधिग्रहण की विशिष्ट समस्याएं हैं। वे भी लंबे समय या बहुत बार के लिए कम तरंगदैर्ध्य के लिए कोशिकाओं को उजागर नहीं द्वारा प्रतिक्रिया की जा सकती है. GFP, CFP, YFP, mRFP, और DsRed, ठेठ फ्लोरोसेंट प्रोटीन विखंडन खमीर लाइव सेल इमेजिंग में इस्तेमाल शामिल प्रयोगों के लिए, यह 5-15% उत्तेजना प्रकाश और नियमित प्रयोगों के लिए 100-500 एमएस जोखिम समय को रोजगार के लिए आम है. तथापि, अनुसंधानकर्ता की विशिष्ट प्रयोग आवश्यकताओं के अनुसार ये पैरामीटर परिवर्तित होते हैं। इसके अलावा, z-स्टैक एक 60x उद्देश्य का उपयोग कर 0.5 डिग्री सेल्सियस रिक्ति के साथ 9-13 वर्गों के शामिल एक विखंडन खमीर सेल की मोटाई को हल करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट मार्करों उचित विनियमन या लक्ष्य प्रोटीन के समारोह को बाधित नहीं करते हैं या नकली phenotypes उत्पन्न करते हैं. इस प्रकार, यह एक ही लक्ष्य जीन के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट और आत्मीयता टैग युक्त उपभेदों का निर्माण करने के लिए विभिन्न साधनों से टिप्पणियों की पुष्टि करने के लिए सलाह दी जाती है. इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना शोधकर्ताओं की जिम्मेदारी है कि प्रयोगात्मक पैरामीटरों को प्रयोगों में पुनरुत्पादित किया जा सकता है और यह कि एकत्र किए गए डेटा डाउनस्ट्रीम विश्लेषण1,3के लिए उपयुक्त हैं। कोई भी प्रौद्योगिकी सावधानीपूर्वक प्रेक्षण और फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने में रैखिकता की कठोर परीक्षा द्वारा प्रयोगात्मक प्रणालियों को सावधानीपूर्वक मान्य करने के समय-परीक्षण अभ्यास को बदल नहीं सकती है।

अंत में, यह प्रारूपों है कि कच्चे छवियों को संशोधित नहीं करते में माइक्रोस्कोपी डेटा का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है. फिजी कच्चे डेटा माप का ट्रैक रखने के लिए उत्कृष्ट प्रलेखन उपकरण प्रदान करता है और शोधकर्ताओं को एक ही सत्र में विभिन्न सेल मापदंडों की जांच करने की अनुमति देता है. इन सुविधाओं, साथ ही ऑनलाइन ट्यूटोरियल और व्यापक साहित्य कवरेज के अपने धन, फिजी को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाने, विश्लेषण, और लाइव सेल इमेजिंग डेटा है कि mitosis और meiosis में विखंडन खमीर के परमाणु गतिशीलता का वर्णन पेश.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि की तैयारी एक और अधिक सुखद प्रयास करने के लिए नतालिया ला Fourcade और सोम LaFerte शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. Forsburg लैब जो अपनी अंतर्दृष्टि, प्रयोग विचारों, और नैतिक समर्थन के साथ इस काम के पूरा होने में योगदान के सदस्यों के लिए धन्यवाद. इस परियोजना NIGMS R35 GM118109 द्वारा SLF के लिए समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60x Plan Apochromat objective lens Olympus AMEP4694
Adenine Sigma A-8751
Agar 7558B IB4917-10 kg
Agarose Sigma A9539-500g
Belly Dancer rotator Stovall US Patent #4.702.610
Biotin Sigma B-4501
Boric acid Sigma B-6768-5kg
CaCl2·2H20, Sigma C3306-500G
Citric acid Sigma C-0759
Convolve 3D software plug-in OptiNav, Inc. n/a
CoolSnap HQ CCD camera Roper n/a
Cover slip VWR 16004-302
CuSO4·5H20, END CX-2185-1
DeltaVision deconvolution fluorescence microscope GE Healthcare/Applied Precision n/a
Diffraction PSF 3D software plug-in OptiNav, Inc. n/a
Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen Sunrise 2023;1kg
FeCl2·6H2O END FX9259-04
Glucose Sigma G-7021
Heat plate Barnstead Thermo Lyne
Histidine Sigma H8125-100g
Huygens deconvolution software SVI n/a
Imaris deconvolution software Bitplane n/a
Incubator Shell lab #3015
Inositol Sigma I-5125
Iterative Deconvolve 3D software plug-in OptiNav, Inc. n/a
KCl Mallinckvadt 6858-04
Lanolin Sigma L7387-1kg
Leucine Sigma L8912-100g
Lysine Sigma L5626-500g
Malt extract (ME) MP 4103-032
MgCl2·6H20 AMRESCO 0288-500G
MetaMorph Molecular Devices n/a
Microscope slides VWR 16004-422
MnSO4, Mallinckvadt 6192-02
Molybdic acid Sigma M-0878
Na2S04 Mallinckvadt 8024-03
Nicotinic acid, Sigma N-4126
Pantothenic acid Sigma P-5161
Paraffin wax Fisher s80119WX
Pombe glutamate medium (PMG) Sunrise 2060-250
softWorx v3.3 image processing software GE Healthcare n/a
Sporulation Medium powder Sunrise 1821-500
Temperature controlled centrifuge Beckman Allwgra 6KR xentrifuge
Uracil AMRESCO 0847-500g
Vaseline Equaline F79658
Yeast extract EMD 1.03753.0500
Yeast extract plus supplements (YES) Sunrise 2011-1kg
ZnSO4·7H2O J.T.Baker 4382-04

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References

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Escorcia, W., Shen, K. F., Yuan, J. P., Forsburg, S. L. Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59822, doi:10.3791/59822 (2019).

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