Summary
여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.
Abstract
살아있는 세포 화상 진찰은 살아있는 세포에 있는 세포 그리고 단백질 역학을 검토하기 위하여 이용된 현미경 검사법 기술입니다. 이 화상 진찰 방법은 유독하지 않으며, 일반적으로 세포 생리학을 방해하지 않으며, 최소한의 실험 처리를 요구합니다. 기술적인 간섭의 낮은 수준은 연구원이 유사분열의 다중 주기에 걸쳐 세포를 공부하고 처음부터 끝까지 만이기스를 관찰하는 것을 가능하게 합니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 적색 형광 단백질 (RFP)와 같은 형광 태그를 사용하여 연구원은 전사, DNA 복제, 응집력 및 분리와 같은 프로세스에 중요한 다양한 요인을 분석 할 수 있습니다. 피지(무료, 최적화된 ImageJ 버전)를 사용한 데이터 분석과 결합된 라이브 셀 이미징은 단백질 이동, 국소화, 안정성 및 타이밍뿐만 아니라 핵 역학 및 염색체 분리를 평가하는 다양한 방법을 제공합니다. 그러나 다른 현미경 검사법의 경우와 마찬가지로, 살아있는 세포 이미징은 고배율에서 해상도 전력에 제한을 두는 빛의 본질적 특성에 의해 제한되며, 고파장에서 광표백 또는 광독성에 민감합니다. 주파수. 그러나, 몇몇 주의를 기울여, 조사자는 유사분열과 meiotic 사건의 적당한 시각화를 허용하기 위하여 적당한 조건, 긴장 및 형광마커를 신중하게 선택해서 이 물리적인 한계를 우회할 수 있습니다.
Introduction
살아있는 세포 현미경 검사법은 연구원이 핵분열 효모 세포를 죽이지 않고 핵 역학을 검토하고 치명적인 고정식 및 얼룩에 대한 필요성을 제거합니다. 막과 세포골격 외에도 염색체 복제, 재조합 및 분리와 같은 중요한 사건에 관여하는 형광 태그단백질의 안정성, 운동, 국소화 및 타이밍을 관찰할 수 있습니다. 움직임. 세포 생존력과 무독성 신호 검출을 유지함으로써 최소한의 생리적 침입이 있습니다. 제대로 수행 할 때,이 현미경 검사법은 확장 된 기술 적 취급 또는 가짜 화학 반응성에서 발생하는 혼란 효과를 줄일 수 있습니다. 또한, 실험 중, 연구원은 핵분열 효모 영양 및 스트레스 상태, 증식 효율성 및 부적절한 이미징 매개 변수 또는 비정상적인 세포 생리학을 나타내는 세포 사멸 상태의 관련 관찰을 할 수 있습니다1 ,2,3.
미토시스와 만이기스는 핵 및 세포 분열이 특징입니다. 유사분열과는 반대로, 부모 세포가 딸 세포를 초래함에 따라 유전 적 함량이 반으로 줄어듭니다4. 라이브 셀 이미징은 공간 적 관계 이외에 시간적 차원을 제공하기 때문에 많은 수의 셀을 실시간으로 검사 할 수 있습니다. 살아있는 세포 현미경 검사법은 히스톤5,응집체 소단위6,미세관7,centromeres8,키네토초레9,성분에 대한 형광 태그를 사용하여 핵 분열의 역학을 조사할 수 있게 했습니다. 스핀들 폴 바디(SPB)10,염색체 여객 복합체(CPC)11. 염색체 분리 장치 의 외부, 살아있는 세포 화상 진찰은 또한 필요한 단백질의 행동을 붙잡습니다, 그러나 염색체 분리에서 직접 관련시키지 않습니다. 이들 단백질의 기능은 미세소관12,13,14에복제, 염색체 재조합, 핵 운동 및 염색체 부착에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이 관측은 그 기능적인 분대가 생화확적인 또는 유전 검사에 순종하지 않은 세포 사건의 더 나은 이해에 기여했습니다. 현미경 기술의 새로운 발전으로, 가난한 해상도, 광 표백, 광독성 및 초점 안정성과 같은 한계가 감소하여 유사분열 및 모방 핵 역학의 실시간 관찰을 용이하게합니다1. 2,3. Meiosis는 타이밍에 세심한주의를 필요로하는 말단 분화 경로이기 때문에 특히 도전적입니다.
이 프로토콜의 목적은 유사분열 및 감피증에서 실시간 핵분열 효모 핵 역학을 검사하기 위한 비교적 간단한 방법을 제시하는 것이다. 이를 위해서는 환경 적 스트레스에 노출되지 않은 세포를 사용하고, 장기간 이미징을 견딜 수있는 아가로즈 패드를 준비하고, 단일 세포 역학의 시각화를 용이하게하는 밀도로 세포를 장착해야합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 핵 역학 (Hht1-mRFP 또는 Hht1-GFP), 염색체 분리 (Sad1-DsRed), 세포 골격 역학 (Atb2-mRFP), 전사에 대한 유용한 마커역할을하는 형광 태그 단백질을 운반하는 세포를 사용합니다. G1/S(Tos4-GFP)에서 활성화되고, 감피증(Rec8-GFP)의 응집력 안정성을 제공합니다. 이 방법은 또한 특정 세포 프로세스에 대한질문을 해결하기 위해 다른 조합으로 사용될 수 있는 추가핵 및 세포질 마커(표 I)를 소개한다. 또한, 기본 피지 도구는 연구원라이브 세포 이미지를 처리 하 고 데이터의 다른 종류를 분석 하는 데 도움이 기능. 이 접근법의 강도는 단백질 역학, 타이밍 및 안정성의 실시간 관찰을 사용하여 유사분열과 간편분열의 적절한 실행을 위해 필수적인 프로세스를 설명하는 데서 비롯됩니다.
Protocol
1. 미디어 준비15,16
- 재고 솔루션
- MgCl2·6H20, 0.735 g의 CaCl 2·2H20, KCl 50 g, Na2S04 2 g를 증류수 1L를 함유한 병에 추가하여 50x 염분 용액을 준비합니다. 용액을 철저히 혼합하고 여과하여 살균하십시오. 장기간 보관할 수 있도록 4°C에 놓습니다.
- 판토테산 1g, 니코틴산 10g, 이노시톨 10g, 비오틴 10mg을 증류수 1L를 함유한 병에 섞어서 1,000x 비타민 스톡 용액을 만드세요. 용액을 잘 혼합하고 여과하여 살균하십시오. 장기간 보관할 수 있도록 4°C에서 보관하십시오.
- 붕산 5g, MnSO 4g, ZnSO4g4g, ZnSO 4·7H2O,FeCl 2·6H2O2g, KI 1g, 몰리브딕산 0.4g, CuSO45H20.4 g을 첨가하여 10,000x 미네랄 스톡 용액을 준비합니다. , 증류수 1 L을 함유 한 병에 구연산 10g. 용액을 철저히 혼합하고 여과하여 살균하십시오. 장기간 보관할 수 있도록 4°C에 놓습니다.
- 증류수 1L를 함유한 병에 아데닌, 류신, 히스티딘 또는 리신 7.5 g을 추가하여 개별 영양육 용액을 만드세요. 3.75g만 사용하여 우라실 용액을 만듭니다. 오토클레이브를 통해 솔루션을 살균합니다.
참고: 시간이 지남에 따라, 우라실은 솔루션에서 침전. 용액을 다시 넣려면 전자레인지에서 60%의 힘으로 10°C로 데우거나 55°C 의 수조에 20분간 두십시오.
- 효 모 추출 물 플러스 보충제 (예)
- 2 L 플라스크에 증류수 1 L, 효모 추출물 염기 5 g, 포도당 30g, 아데닌, 우라실, L-히스티딘, L-류신 및 L-리신 각각 225 mg을 추가합니다. 단단한 매체를 만들기 위해 한천 20g을 추가합니다.
- 마그네틱 스트로우 바를 사용하여 재료를 용액에 완전히 용해시큐어합니다. 한천은 매질이 오토클레이브에 의해 살균된 후에 녹습니다.
참고: 편의를 위해 즉시 사용할 수 있는 YES 파우더도 시판되고 있습니다.
- 에든버러 최소 배지(EMM) 및 폼베 글루타메이트 배지(PMG)
- 증류수 1L와 수소 프탈레이트 칼륨 3g, Na2HPO4g, NH4Cl 5 g, 포도당 20g, 소금 스톡 솔루션 20 mL, 비타민 스톡 용액 1 mL을 결합합니다. , 및 광물 재고 용액의 0.1 mL. PMG를 준비하기 위해 NH4Cl을 2.2 g의 L-글루타믹 산 모노 나트륨 소금으로 대체하십시오. 단단한 매체를 만들려면 한천 20g을 추가합니다.
- 마그네틱 교반 바를 사용하여 재료를 완전히 녹입니다. 한천은 매질이 오토클레이브에 의해 살균된 후에 녹습니다. 사용하기 전에 필요에 따라 영양분 스톡 솔루션을 추가하십시오. 배지 1L마다 아데닌, 류신, 히스티딘, 리신 각각 15 mL를 첨가하십시오. 다른 영양소 용액보다 농축이 적기 때문에 우라실에 30 mL를 사용하십시오.
참고: 편의를 위해 즉시 사용할 수 있는 EMM 및 PMG 분말도 시판되고 있습니다.
- 맥아 추출물 (ME)
- 2 L 플라스크를 사용하여 증류수 1L와 맥아 추출물 30 g, 아데닌, 우라실, 히스티딘 및 류신 각각 225 mg을 섞습니다. pH를 5.5로 조정합니다. 단단한 매체를 만들기 위해 한천 20g을 포함합니다.
- 마그네틱 교반 막대를 사용하여 성분을 용액에 용해시. 한천은 매질이 오토클레이브에 의해 살균된 후에 녹습니다.
- 보충제를 곁들인 산발한 한천 (SPAS)
- 2 L 플라스크에 증류수 1 L, 포도당 10g, KH2PO 4, 비타민 스톡 1 mL, 아데닌, 우라실, 히스티딘, 류신 및 리신 염산염 각각 45 mg을 추가합니다. 단단한 매체를 만들기 위해 한천 20g을 추가합니다.
- 마그네틱 스트라인 바를 사용하여 재료를 철저히 결합합니다. 한천은 매질이 오토클레이브에 의해 살균된 후에 녹습니다.
2. 핵분열 효모 문화15,16
- 극저온 보존에서 핵분열 효모 균주를 깨우려면 YES 고체 배지를 사용합니다. 각 균주의 온도 요구 사항에 따라 3-5 일 동안 25 °C 또는 32 °C에서 배양하십시오.
- 식민지가 보이면 스타터 액체 문화를 준비하십시오. 개별 식민지에서 세포를 선택하고 3 mL YES 액체 매체를 포함하는 시험관으로 접종하십시오. 중간 또는 후반 로그 단계로 적절한 온도에서 성장.
참고: 적절한 폭기의 경우, 의도한 액체 배양량보다 5배 이상 큰 부피가 있는 튜브 나 플라스크를 사용하십시오. 150-220 rpm 사이의 흔들림 속도는 일상적인 문화 성장을 위한 관습입니다. - 250-500 μL의 스타터 배양을 YES, EMM 또는 PMG 플러스 적절한 보충제의 9.5-9.75 mL를 함유한 50 mL 플라스크에 분배합니다. 세포가 원하는 밀도로 성장하도록 허용하고 적절한 세포 형태와 영양 상태에 대한 현미경으로 확인합니다.
참고: 최대 한 달 동안 깨어난 균주를 저장하려면 파라핀 테이프로 YES 플레이트를 밀봉하고 4 °C에 놓습니다.
3. 견본 준비2
- 현미경 슬라이드 설정
- 최소 배지 플러스 보충제(유사분열) 또는 액체 SPAS(마인시오시스)를 100 mL함유 500 mL 비커에 2 g첨가하십시오. 아가로즈 용액을 전자레인지에서 60%의 전력으로 10°C로 데우거나 55°C 수조에 10분간 소탕하여 효율적인 용융을 보장합니다. 빠른 패드 준비를 보장하고 용융 아가로오스가 조기에 응고되는 것을 방지하기 위해 아가로즈 슬라이드 만들기 설정 (그림1A)을준비하십시오.
- 용융 된 아가로스가 실온에서 1 분 동안 식히고 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 현미경 슬라이드에 50-100 μL 반점을 분배하십시오. 아가로즈가 식기 전에 현미경 슬라이드를 상단에 놓고 직경이 약 1.5-2 cm의 스프레드 패드를 생성합니다(그림1B-C). 아가로즈 패드의 폭은 일반적으로 이미징 시간의 길이에 비례한다. 즉, 두꺼운 패드는 더 긴 이미징 기간을 견딜 수 있습니다.
- 두꺼운 아가로즈 패드로 슬라이드를 적절하게 커버하고 커버슬립 가장자리에서 용매가 노출되는 것을 방지하기 위해 탄화수소 혼합물을 실란트로 사용하십시오. 500 mL 비커에 석유 젤리, 라놀린, 파라핀의 동등한 부분 (w/w)을 섞는다. 120 °C에서 핫 플레이트에 재료를 5 분 동안 가열합니다. 부품이 녹을 때, 적절한 혼합을 보장하기 위해 용융 용액을 조심스럽게 소용돌이치십시오.
- 샘플 설정
- 유사 분열 사건의 검사를 위해, 액체 EMM 또는 PMG 플러스 보충제에서 시작 배양에서 세포를 약 중간 로그 단계 (OD595 의 0.4)로 성장시. 1,375 x g에서 1 분 동안 세포 현탁액의 원심 분리기, 상류를 제거하고 최소 배지플러스 보충제에서 세포 펠릿을 100 μL의 최종 부피로 재중단시켰다.
- meiotic 사건을 심상하기 위하여는, 최소 배지 플러스 보충제에서 시작 배양에서 후기 로그 단계 (OD595 의 0.7-1.0)에 세포를 성장시다. 1 mL 셀 현탁액에 반대 메이트 형 세포 (h- 및 h +)의 동일한 볼륨을 결합합니다. 1,375 x g에서 1 분 동안 원심 분리 세포를 액체 ME에 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 효율적인 영양소 제거를 위해 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 마지막 ME 세척 후, ME의 1 mL에 세포를 다시 중단하고 9 mL ME를 포함하는 50 mL 플라스크에 추가합니다. 최소 회전 속도 (50-100 RPM)에 22-25 °C에서 12-16 시간 동안 배양하십시오. 풍부한 세포 응고, 많은 둥근 핵분열 효모 덩어리를 초래하고 효율적인 짝짓기를 나타냅니다.
- 1분 동안 1,375 x g에서 짝짓기 배양 및 원심분리기의 1 mL 샘플을 채취하십시오. 아가로즈 패드에 세포를 배치하기 전에, 5 s에 대한 격렬하게 소용돌이 덩어리를 방해합니다.
참고: 세포를 재중단하는 데 사용되는 나머지 250 μL ME에는 세포가 남성분열에 들어가는 데 도움이 되는 짝짓기 인자를 포함합니다. - 2% 아가로즈 패드에 유사분열 또는 메오틱 세포 현탁액 을 20 μL에 놓습니다. 슬라이드를 반전시키고 보풀이 없는 종이 타월 위에 2-3s(그림 1D)를놓음으로써 여분의 매체를 제거합니다. 슬라이드 패드 쪽을 위로 설정하고 유리 커버 슬립을 부드럽게 배치하여기포가 생성되지 않도록 합니다(그림 1F).
참고: 종이 타월로 여분의 매체를 제거하는 것은 중력 흡수보다 시간 효율적이며, 이는 특히 이기아 증 실험에서 중요합니다. - 셀 단층을 만들려면 검지 손가락으로 커버슬립을 시계 방향으로 돌리면서 한 두 번(유사분열)풀 턴(그림 1F)을 만듭니다. 세포 물질이 아가로즈 패드에 분산되어 단일 세포 또는 asci를 더 잘 분리할 수 있도록 하십시오. 작은 나무 막대기의 도움으로, 각 아가로즈 패드를 밀봉 커버 슬립의 가장자리를 따라 용융실란트를 분배 (그림 1G).
- 아가로즈 패드가 밀봉되면, 현미경 단계에 놓고 적절한 이미징 조건 (예 : 온도)에서 10-15 분 동안 평형하게하여 기포가 소멸되고 마지막 순간에 아가로가 이동하게하십시오. 슬라이드가 효율적으로 보정되면 이미징을 시작하고 데이터 수집이 끝날 때까지 스테이지에서 제거하지 마십시오.
참고: 온도 및 습도 의 제어는 채택 된 현미경 시스템과 특정 실험 요구 사항에 의해 결정됩니다. 존재하는 경우, 모든 이미징 실험에 온도 및 습도 조절을 적용하십시오. 결석하는 경우에, 연구원은 온도 동요를 방지하는 쪽을 고안해야 합니다, 특히 만피증 실험 도중.
4. 라이브 셀 이미징2 및 처리
- 40x 목표를 사용하여 이미지에 적합한 시야를 찾습니다. 60x 목표로 전환하여 데이터 수집을 시작합니다. 사용되는 현미경 시스템에 따라, 각 시점에서 샘플에 대한 후속 재초점 및 단면은 수동으로 또는 현미경 또는 소프트웨어 자동화 프로세스를 통해 발생합니다.
참고: 이 프로토콜에 제시된 이미지는 Sedat, RFP 및 GFP 필터 세트, 나노 모션 스테이지, 60x NA 1.4 대물 렌즈 및 12비트 CCD 카메라가 장착된 데콘볼루션, 형광 현미경을 사용하여 수집되었습니다. 내장 된 기계식 셔터와 전동 필터 휠은 샘플의 흥분 노출 및 광 표백을 줄일 수 있습니다. - 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하고 처리합니다. 이미지를 데콘볼브하려면 제조업체에서 제공하는 광학 전송 기능을 사용합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 현미경 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를참조하십시오. - 기존의 형광 현미경을 사용하여 라이브 셀 이미지를 획득하여 현미경이 디지털 데이터를 수집하고, 1.2보다 큰 숫자 조리개(NA)를 가진 40x 또는 60x 목표를 가지고 있으며, 광학 단면을 수행할 수 있습니다.
참고: 이러한 요구 사항이 없으면 이미지가 해상도를 감소시키고 현미경 측정 및 정성적 관찰의 품질을 저하시게 됩니다. - 무료 플러그인 프로그램(예: Fiji)을 사용하여 이미지 수집 시 대비 손실로 인한 체계적인 흐림 오류를 최소화하고17,18,19,20을 사용하여 적절한 정량 분석을 보장합니다. 형광 강도와 세포 내의 다른 시간적 및 동적 사건의.
참고: 다른 사용 가능한 상업적 데컨볼루션 프로그램은 재료 표에서 찾을 수 있습니다. - 관찰 중인 형광단과 가장 잘 일치하는 현미경 필터 세트를 선택합니다. 여기 및 방출 필터에 형광 단백질의 특정 검출을 허용하는 올바른 밴드 패스가 있는지 확인합니다. 예를 들어 CFP 신호를 감지하려면 430/25 및 470/30의 여기 및 방출 대역 통과가 적절하지만 RFP 형광에는 적합하지 않습니다.
- 여러 시점에서 핵분열 효모를 이미징할 때 최소한의 효과적인 설정 접근법(MESA)을 사용하십시오. 즉, 여기 파장의 장기간 사용을 피하고 허용 가능하면서도 정량화 가능하고 재현 가능한 이미징 데이터를 생성하는 가장 낮은 여기 전력 및 노출 시간을 사용합니다.
- 유사분열 또는 만피증 중 장시간 이미징의 경우 획득 시점 사이의 간격을 5-10분으로 제한하십시오. 비록 2% 아가로즈 패드 는 12 받는 사람의 이미징 세션을 견딜 수 있지만, 아가로즈 증발로 인한 세포 이동가능성이 높습니다. 따라서, 각각 4-6 시간 또는 8-10 h 창에서 전체 유사분열 또는 감피 실험을 수행한다.
- 60x 목표를 사용하여 0.5 μm 간격으로 13개의 섹션으로 구성된 시간 포인트 및 형광 채널당 각각 24-48개의 획득 시점, 및 z-stack으로 구성된 4-8시간 동안의 이미징 데이터를 수집합니다. 이를 위해서는 최소 0.5-1GB의 하드 드라이브 저장 공간이 필요합니다. 따라서, 광표백 및 세포 이동을 제거하는 것 외에도 컴퓨팅 기능1,2,3을고려하는 워크플로우를 만듭니다.
참고: 이러한 수집 매개 변수는 일반적으로 현미경 기능을 제어하고 이미지를 수집하고 처리하는 소프트웨어에서 설정 및 수정됩니다. - 특정 핵 공정을 자세히 검토하려면 빈번한 노출 후 배출량이 크게 감소하지 않는 한 5-10s마다 이미지 수집을 수행합니다. 상이한 기간에 걸쳐 예비 형광 강도 분석을 수행하여 수집된 데이터의 정확도가 더 이상신뢰할 수 없는 지점을 결정하기 위해 1,3.
- 이미지 수집 및 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지 z-스택의 최대 강도 투영을 사용하여 수직 위치1,2에관계없이 2D 평면에서 형광 밀도가 높은 모든 구조를 관찰합니다. 3. 이것은 다른 복셀에서 발생하는 핵 공정의 신속한 검사를 용이하게합니다. 중간 초점 밝은 필드 이미지를 수집하여 관찰 중인 셀의 참조 그림을 생성합니다.
5. 이미지 분석20,21
참고: 이 프로토콜의 이미지 분석은 피지를 사용하여 수행됩니다. 다른 분석 프로그램 및 피지 플러그인에 대 한 재료의 표를참조 하십시오.
- 플러그인 메뉴에서 바이오 포맷 수입업체 기능을 선택하여 디폰브업 된 이미지를 업로드합니다. 옵션 가져오기 팝업 창에서 하이퍼스택, 기본 색상 모드를선택하고 확인 버튼을 누르기 전에 자동 크기 조정을 선택합니다.
- 표시된 창에 아래쪽의 각 막대에서 옆으로 스크롤하여 정확한 형광 채널 수와 시간 프레임이 있는지 확인합니다. 데이터를 압축하지 않고 정보 손실을 방지하는 Tiff 파일로 저장합니다.
- 현미경 소프트웨어에 의해 데이터 처리 중에 생성된 스케일 막대가 포함된 이미지를 엽니다. 직선 도구를 사용하여 배율 막대의 픽셀 길이를 결정하여 비슷한 크기의 평행선을 그리고 분석 메뉴에서 측정을 선택합니다. 분석 메뉴에서 배율 설정을 선택하여 이미지 픽셀 대 μm 비율을 설정하여 축척 막대를 추가합니다.
- [축척] 팝업 창에서 계산된 거리(픽셀 및 알려진 거리)를 μm으로입력하고 픽셀 종횡비를 1.0으로 설정하고 미론을 길이 단위로넣은 다음 전역 상자를 클릭하기 전에 확인 버튼.
- 분석 메뉴에서 측정 설정 옵션을 사용하여 측정을선택할 때 정량화할 다른 매개변수를 선택합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 다음 메트릭을 선택: 영역, 둘레, 평균 회색값, 중앙값, 최소 & 최대 회색값, 통합 밀도,스택 위치,및 디스플레이 레이블이지정됩니다.
- 수집된 데이터의 정밀도에 따라 소수점 배치 옵션에 대해 1 이상을 입력하고 필요한 경우 과학 표기법의 확인란을 선택합니다. 측정 명령을 적용한 후 결과 팝업 창에는 각 관련 매개 변수에 대한 값이 표시됩니다. 통계 프로그램에서 향후 분석을 위해 결과를 .csv 파일로 저장합니다.
참고: 다른 색상 들 간의 신호 간섭이 없는 한 이미지를 구성 형광 채널로 분리하여 길이를 결정할 필요가 없습니다. - 신호 간섭의 경우 이미지 메뉴에서 색상 및 채널 도구를 선택하고 각 색상을 개별적으로 분석합니다. 비선형 구조물의 길이를 측정하려면 선 도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 세그먼트선 또는 자유형 선 옵션을 사용하여 원하는 객체를 추적합니다.
- 선형 구조물의 경우 또는 두 점 사이의 거리를 결정하려면 직선 피쳐를 사용하고 분석 메뉴에서 측정을 선택합니다. μm 길이값은 측정 설정 옵션에서 이전에 선택한 매개변수에 자동으로 추가됩니다.
- 신호 크기 및 형광 강도의 변화를 측정하기 위해 먼저 관심영역(ROI) 라이브러리를 생성하여 정량화 정확도를 높이고 이미지 스택 전반에 걸쳐 빠른 측정을 용이하게 합니다. 이미지 메뉴에서 색상 및 채널 도구를 선택합니다.
- 채널 팝업 창에서 강도 또는 영역이 측정될 색상 채널을 확인합니다. 이미지 메뉴에서 조정 및 임계값 피쳐를 선택합니다. 어두운 배경 상자를 선택하고 기본 메서드를 선택하고(수집된 데이터에 달리 필요하지 않은 경우) 빨간색을 선택하여 관심 신호를 오버레이합니다.
참고: 단백질 안정성, 이동 및 지역화 측정은 ROI 라이브러리를 만드는 데 사용되는 색상 임계값에 따라 밀접하게 달라집니다. 형광 마커 신호의 유형에 대한 올바른 역문판 방법을 선택하는 것이 중요하다17,18. - 지팡이 도구를 사용하여 관심 있는 각 구조를 강조 표시하고 키보드의 문자 T를 눌러 선택한 ROI를 팝업 ROI 관리자 창에 추가합니다. 이미지 스택의 각 슬라이스(시간 프레임)에 대해 이 프로세스를 반복하고 추가 단추를 클릭하고 저장을선택하여 모든 ROI를 저장합니다.
- 지퍼가 달린 ROI 폴더를 열어 ROI 관리자를 로드하고 왼쪽 패널의 각 ROI 식별자를 클릭합니다. 분석 메뉴에서 측정을 선택하고 각 ROI 식별자에서 이 명령을 반복하여 이미지 스택의 모든 조각에서 관심 있는 개체를 정량화합니다.
- 셀 이동이 문제가 되지 않고 초점 평면이 스택의 모든 조각에 대해 동일하게 유지되는 경우 ROI관리자에서 다중 측정을 클릭합니다. 팝업 창에서 슬라이스당 한 행 대신 모든 슬라이스 측정을 선택하여 이미지 스택 전체에서 측정을 반복합니다. 결과를 csv 파일로 저장하고 통계 프로그램에서 측정값을 분석합니다.
- 관심 있는 구조를 포함하는 여러 핵 신호의 경우 지팡이 도구를 사용하여 오브젝트를 선택하면서 Shift 키를 눌러 단일 ROI를 만듭니다. 또는 Oval 도구를 사용하여 일정한 크기의 ROI를 만들어 관심 있는 모든 신호를 포괄합니다.
참고: 이 타원형 접근법은 형광 신호가 시간이 지남에 따라 크기와 강도가 변하는 영역에 대한 신호 거동을 측정하고 설명하는 데 필요할 수 있습니다. 이 경우 신호 강도는 지정된 영역에 대한 평균 신호 밀도입니다. - 신호 중첩 영역의 색상 변화에 의해 두 개의 형광 신호의 공동 지역화를 정성적으로 결정합니다. 그러나 공동 지역화 영역이 좁아짐에 따라 신호 중첩을 구별하기가 더 어렵습니다. 이 경우 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
- 5.6단계에서 설명한 대로 채널 도구를 사용하여 해당 신호에 직선을 그리고 분석 메뉴 에서 플롯 프로파일 명령을 선택합니다.
- 동일한 그려진 선을 사용하여 문제의 모든 색상에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 각 프로파일링 단계 후에 나타나는 샘플 팝업 창 플롯에서 목록 단추를 눌러 플롯 값 창을 호출하고 각 신호에 대한 측정값을 csv 파일로 저장합니다.
- 통계 프로그램에서 그려진 선을 따라 해당 위치(μm)에 대해 각 신호에 대한 회색 값을 플로팅하는 그래프를 만듭니다. 신호 프로파일 플롯 간의 중복 부족은 일반적으로 공동 지역화의 부족을 나타냅니다.
참고: 투영된 이미지의 플롯 프로파일 도구를 사용하여 신호 공동 지역화를 검사합니다. 이러한 중복도 이미지 z 스택을 통해 관찰 되는 경우에 신뢰할 수 있습니다.
- 시간이 지남에 따라 형광 단백질의 동적 거동을 모니터링하려면 분석 메뉴 아래에 있는 Multi Kymograph 도구를 사용하십시오. 결과 이미지는 개별 시간 포인트를 나타내는 z 스택의 각 조각에서 일련의 응축된 스냅샷을 통해 형광 신호 이동을 보여줍니다.
- 5.6단계에 설명된 대로 채널 도구를 사용하여 올바른 채널에서 관심 있는 개체를 격리합니다. 선택한 개체 또는 구조가 z 스택을 통해 상당히 이동하지 않는지 확인합니다. 오브젝트 위에 직선 또는 사각형을 배치하고 분석 메뉴에서 다중 Kymograph 도구를 선택하고 오브젝트를 오버레이하는 선의 원하는 너비를 입력합니다.
- 5.6단계에서 설명한 대로 채널 도구를 사용하고 이미지 메뉴에서 스택 및 몽타주 만들기 도구를 선택하여 특정 시간 창에 핵 역학을 표시하는 이미지 패널을 만듭니다. 몽타주 만들기 팝업 창에서 원하는 열 및 행 수를 입력하고 배율 계수를 1.0으로 설정하고, 첫 번째 및 마지막 조각(시간 프레임)을 선택하고, 확인을 누르기 전에 테두리 너비를 5로 변경합니다. 원하는 순서에 맞게 증분을 변경하여 스택에서 표시할 이미지를 선택할 수 있습니다.
- 영화를 생성하려면 원하는 하이퍼스택을 업로드하고 파일 메뉴에서 avi 파일로 저장을 선택하고 압축에 대해 없음을 선택하고 2-8fps의 프레임 속도를 입력합니다. 채널 도구에서 합성을 선택하면서 몽타주 만들기 명령을 선택하여 이미지를 구성하는 모든 색상을 병합하거나 구분합니다.
참고: 이 프로토콜에는 두 개의 avi 파일(Movie1-2)이제공됩니다. 피지에서 그들을 사용 하 여 5 단계에 걸쳐 강조 다른 기능을 시도 합니다. - 단일 대표 셀을 표시하려면 이미지 메뉴에서 변형 및 회전을 사용하고 회전 정도를 입력합니다. 음수는 오브젝트를 왼쪽으로 회전하고 양수 값은 오브젝트를 오른쪽으로 회전합니다. 셀이 올바른 방향으로 설정되면 z-스택을 통해 또는 관심 있는 시간 프레임 동안 전체 셀을 포괄하는 사각형을 그리고 이미지 메뉴에서 자르기를 선택합니다. 5.16 및 5.16.1 단계에서 언급한 대로 진행하여 이미지 패널 또는 영상을 생성합니다.
- 영화를 생성하려면 원하는 하이퍼스택을 업로드하고 파일 메뉴에서 avi 파일로 저장을 선택하고 압축에 대해 없음을 선택하고 2-8fps의 프레임 속도를 입력합니다. 채널 도구에서 합성을 선택하면서 몽타주 만들기 명령을 선택하여 이미지를 구성하는 모든 색상을 병합하거나 구분합니다.
- 분석 메뉴에서 도구 및 배율 막대를 선택하여 이미지 패널 또는 동영상에 축척 막대를 추가합니다. [Scale Bar 팝업 창]에서 단일 셀의 너비에 대해 5-15를 입력하거나 전체 보기 필드에 대해 100-250을 입력하고 색상에 대해 흰색 또는 검은색을 선택하고 배율 막대를 배치할 적절한 위치를 선택합니다.
- 영화의 경우 핵 이벤트 중 시간 진행 상황을 표시하는 것이 유용합니다. 프레임 간 시간 변경을 표시하려면 이미지, 스택클릭, 시간 스탬퍼 도구를 사용하고, 타임 시리즈의 시작 프레임을 표시하고, 시간 표시에 적합한 위치를 선택합니다.
Representative Results
살아있는 세포 화상 진찰이 유사분열 또는 만두증을 위해 사용되든, 관찰의 어떤 모형든지 하기 전에 건강한 핵분열 효모 세포를 채택하는 것이 중요합니다. 결과 데이터의 품질은 시작 재료에 크게 의존합니다. 세포가 영양제한 또는 과성장으로 인해 굶주린 경우, 그들은 과잉 액액과 감소된 세포 크기를 보여줄 것이다(기아, 도 2A). 유사분열 실험의 경우 세포 스트레스를 보이는 세포를 사용하지 않는 것이 가장 좋습니다(기아, 그림 2A). 그렇지 않으면 실험 결과가 일관되지 않고 재현할 수 없습니다. 이러한 제한을 우회하려면 적절한 야생 형 컨트롤을 선택하고 관심 있는 돌연변이의 다양한 표현형에 익숙해집니다. 예를 들어, 12시간 동안 굶주인 유사분열 세포는 DNA를 적극적으로 복제하는 것을 중단한다. Tos4-GFP 발현은 G1/S상 활성22,23,핵분열(Sad1-DsRed 10)을 운반하는로그세포와 연관되어 있기 때문에 범핵 Tos4-GFP 발현, Sad1-DsRed 포시 분리, 및 진행 중인 패립(활성 DNA 복제 및 세포 분열 제안)(로그, 도 2A),굶주린 세포는 이러한 활성을 나타내지 않는 반면(기아, 도 2A). 이 결과는 G1의 전사를 감소시키고 G1/S 세포 주기 체크포인트를 활성화하며 G0 항목5를촉진하는 핵분열 효모의 영양소 제한효과와 일치합니다. 만피사증 실험의 경우 세포는 고밀도로 성장해야 하지만 고정 단계에 도달하지 않아야 합니다. 그 후, 두 메이트 유형의 세포는 낮은 질소 매체에서 함께 혼합및 배양된다. 세포가 질소를 충분히 굶지 하지 않은 경우와 같이 메이트하지 못하면 감피증으로 들어가는 것을 방지할 수 있습니다(비효율적, 그림 2B). 결합 셀 현탁액의 견고한 응집는 세포 대 세포 상호 작용을 증가시키고, 따라서 성공적인 결합 및 효율적인 meiotic 유도를 나타낸다 (효율적, 도 2B).
아가로즈 젤 패드 및 세포 덩어리의 물리적 중단은 단일 세포 또는asci의 적절한 시각화를 보장합니다 (로그, 그림 2A; 효율적, 그림 2B). 패드는 세포가 동시에 제자리에 고정되고 탈수로부터 보호되는 단단하면서도 습한 플랫폼을 제공해야합니다. 또한 패드는 증발로 인한 변화를 견딜 수 있을 만큼 충분히 두꺼워야 하며 이미지 수집전반에 걸쳐 적절한 초점을 허용하는 평평한 표면을 제공해야 합니다(그림 1C). 결합 응집체 내에서 세포를 분리하고 확산시키기 위해 커버슬립 회전이 필요합니다(그림1F; 효율적, 그림 2B). 이 단계없이, 아시가 결합 덩어리의 접근 할 수없는 층 내에 갇혀되기 때문에 몇 asci하지만 수많은 haploid 세포가 관찰된다,haploid 세포는 사용 가능한 모든 단층 반점을 채울 무료동안 (그림 2B). 세포 응집이 덜 문제가 되는 유사분열 실험의 경우에도 커버슬립 회전은 패드 주위로 세포를 이동시켜 셀 사이에 충분한 공간이 있는 단일 세포 층을 만들어 군중 효과를 줄이고 세포 중복을 허용합니다(Log, 그림 2A) ).
Atb2는 핵분열 효모 유사분열 및 만피증7,14에서염색체 분리에 관여하는 α-tubulin 성분이다. 형광 태그때,이 세포 골격 구성 요소는 유사분열의 핵 분리를 특징짓는 단계를 검사 할 수 있습니다. Htt1-GFP5 범핵 배경에 대해 설정된 Atb2-mRFP 섬유에 의해 밝혀진 바와 같이, 프로페이즈(0'-20', 도 3A)동안, 유사분열 스핀들의 핵형성은 스핀들 폴 바디(SPB)의 핵측에서 발생한다. 메타페이즈-아나페이즈 전이(20'-40', 도 3A)동안 유사분열 스핀들은 바깥쪽으로 확장되고 핵은 두 개로 갈라지다. 세포가 말단 단계 (60'-80', 그림 3A)로들어가면, Atb2-mRFP는 염색체가 완전히 분리 될 때까지 양방향으로 확장됩니다. 이 시점 이후에, Atb2-mRFP 섬유는 세포 표면을 다시 그룹화하고 확산시켜 생성된 딸 세포의 각각에서 그들의 상간 형태를 회복한다. 사이토카인시스(>120',도 3A)는중격이 형성된 후에만 발생하며 분열로 세포를 분할한다. 유사분열 주기에 걸친 Hht1-GFP 강도의 변화에 따라 핵 역학의 세 가지 중요한 단계인 중이도-아나페이즈(중간 강도, DNA 다짐: 20'-40',그림 3A-B),텔로페이즈(저강도, DNA 분리: 60'-80', 도 3A-B),및 G1(증가 강도, DNA 복제: 100'-120',그림 3A-B). 유사하게, 단지 Hht1-mRFP를 운반하는 세포를 사용하여 피지에서 다중 kymograph 공구 (단계 5.15 참조)를 채택하, 전단상에 있는 유사분열을 관찰하고 적당한 자매 염색질 도중 관련시킨 핵 운동을 평가하는 것이 가능합니다 분리(보통, 그림 3C). 잘못된 분리 계단은 두 가지 주요 핵 경로 사이의 신호 활성을 나타내며, 염색체 단편화 또는 부적절한 염색체 분리로 인한 잘못된 분리 가능성을 나타냅니다(지연, 그림 3C).
앞서 언급했듯이, 신진 및 핵분열 효모에서 Tos4는 G1에 전사되고 S상22,23에서DNA 복제 동안 기능한다. 이것은 Sad1-DsRed10 foci가 반대 방향으로 이동한 후 핵에서 Tos4-GFP 발현이 증가하는 kymograph에서 관찰될 수 있지만(핵 분열을 나타내는), 사이토카인증(39', 그림 3D)을 선행하는 중격 형태 전에 ; 36', 그림 3E). 높은 Tos4-GFP 활성의 단계는 M-G1/S 전이의 끝에서 시작하여 (45', 그림 3E)및 G2에서 끝납니다 (>60', 그림 3E),세포 분열 직후. G1 동안 크게 확산되는 동안, Tos4-GFP 신호 강도는 후 항위상과 S-상 전체에 걸쳐 증가하고 분리 된 Sad1-DsRed 초점 (45'-60', 그림 3E)과공동 지역화합니다. 이 결과는 딸 세포 (G1/S)에서 게놈 중복이 시작되었을 때 핵분열 효모에서 의 정화 기간을 보여 주지만 사이토 카인증은 아직 발생하지 않았습니다.
Hht1은 핵분열 효모에서 히스톤 H3이며 일반적으로 핵 DNA5,14를시각화하기 위해 형광태그로 변형된다. 유사분열에서는 세포가 메타페이즈에서 텔로페이즈로 전이됨에 따라(20'-120', 그림 3A),핵 질량에 대한 두 가지 뚜렷한 변화가 관찰됩니다. 첫 번째 변화는 중형에서 핵 크기의 수축을 포함 (20',그림 3A),두 번째는 anaphase 동안 핵 분할을 보여줍니다 (40', 그림 3A). 유사 분열 세포와 이러한 변화를 공유 하는 것 외에도, meiotic 세포 전시 핵 발진 (즉, 말 꼬리) (-100' 받는 그림 -50', 그림 4A-B)상동 재조합 및 anaphase II의 끝에 핵 크기의 추가 감소 (70'-90', 그림4A). Hht1-mRFP는 지연 또는 단편화된 염색체와 같은 잘못된 분리 표현형을 검사하는 데 사용됩니다(지연, 도 3C). 또한 각 단계의 핵 역학을 관찰하고 설명하기 위해 사용됩니다 (그림4A-B). 핵 질량은 크고 말 꼬리의 많은 동안 크기가 변동 (HT : -100'-50', 그림 4A-B). 세포가 메타페이즈(MT: -40'~ 0', 도 4A-B)에진입함에 따라 핵 크기 및 진동이 감소하며, 이 단계에서 응축 활성이 증가합니다. 두 anaphase I의 발병 (MI: 10'-60', 그림 4A-B)및 II (MII: 70'-90', 그림 4A-B)추가 핵 감소 및 핵 운동의 부족과 관련, 이는 특징 두 핵 부문과 잘 상관 관계 [MI & MII]. 따라서, 만피증은 상동성 염색체가 염색체 분리의 2개의 라운드 다음 핵 크기 감소를 정렬하고 재결합할 때 핵 크기 변동과 연관됩니다. 이러한 핵 역학을 변화시키는 대두는 12,13에서게놈 안정성 조절과 관련이 있는 것으로 보인다.
Rec8은 핵분열 효모에서 의 meiotic 응집력의 α-kleisin 소단위이다. 그것은 DNA 복제 후 염색질에 로드 (mei-S) 및 아나페이즈 II까지 서로 묶여 자매 염색체를 유지합니다. 메타페이즈 I 후, Rec8은 분리체에 의해 염색체 암으로부터 제거되고 Sgo1-PP2A에 의해 중심에서 보호된다. 상동분리의 끝에서, Rec8은 또한 중심에서 제거되고, 이에 의해 자매 염색체 분리를허용한다(도5A)6,24. Rec8-GFP는 Sad1-DsRed 또는 Hht1-mRFP와 같은 염색체 분리의 마커와 함께 간편증 도중 응집력 역학의 시각화를 허용합니다. Rec8-GFP 신호는 mei-S(<-90'), 도 5A-B,프로페이즈 I(-90' ~ -50', 도 5A-B), 및 메타페이즈 I(-40'에서 0', 그림 5A-B)동안범-핵-핵이다. 이 관측은 DNA 중복을 따르는 염색체 축을 따라 Rec8-GFP의 협회를 제시합니다. 세포가 anaphase I (10', 그림 5A-B)를 입력함에 따라, Rec8-GFP 세기는 핵 전체에 걸쳐 감소하지만, 각 핵 질량에 초점을 형성하는 centromere에서 강하게 남아 있습니다 (20'-70', 그림 5A-B). 이 결과는 염색체 암을 따라 Rec8-GFP 저하와 일치하지만, 동종 분리 후에 계속되는 centromere에서는 그렇지 않습니다. anaphase II전에, Rec8 초점은 MII에 있는 분리를 위한 자매 염색체를 풀어 둡니다 (70'-80'및그림 5A-B). Rec8-GFP 마커는, 따라서, meiotic 응집력의 설치, 제거 및 전반적인 안정성을 방해하는 조건을 검토하는 데 유용합니다. Hht1-mRFP 5,13,Rec8-GFP와 같은 핵 분열의 마커와 짝을 이루는 Rec8-GFP는 수용체 전과 간 기조가 적절한 염색체 분리에 미치는 영향에 대한 질문을 해결하기 위해 사용될 수 있습니다12 ,13. 이 프로토콜은 세포에서 주로 역학이 발생하는 단백질을 다루지 않습니다. 그러나, 표 I은 다른 프로세스 들 사이에서 내분비증, 외시성 증 및 사이토카인증에 필요한 세포골격 및 막 과정을 검사하기 위하여 일반적으로 이용되는 몇몇 세포탈 단백질을 보여줍니다.
그림 1: 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 아가로즈 패드의 준비. (A) 파이펫 팁 홀더, 실험실 테이프 및 현미경 슬라이드를 사용하여 조립된 슬라이드 준비 설정. 슬라이드를 서로 수직으로 배치하면 아가로즈 패드가 형성되는 포켓이 만들어집니다. 측면에 실험실 테이프 조각을 추가 하 여 필요한 사양에 아가로즈 패드 폭을 조정 합니다. (B) 녹은 아가로즈는 패드를 만들기 위해 현미경 슬라이드에 설정하기 전에 식힙니다. 이 단계에서는 기포가 생성되지 않도록 아가로즈 부피를 천천히 분배할 필요가 있습니다. (C) 상단 슬라이드는 분주 한 아가로즈 스팟에 배치되어 직선 표면, 균일 한 가장자리, 눈에 보이는 아가로즈 균열이없는 원형 패드를 형성합니다. (D) 아가로즈 패드에 세포 현탁액 샘플을 넣은 후 슬라이드를 뒤집어 보풀이없는 종이 타월 위에 놓고 여분의 액체 매체를 제거합니다. (E) 아가로즈 패드에 커버슬립을 조심스럽게 놓고 기포를 가두지 않도록 하고 초점 평면이 평평한지 확인하여 세포 이동 및 초점 문제를 방지합니다. (F) 천천히 조심스럽게 커버슬립을 시계 방향으로 회전하여 세포 덩어리를 방해하고 세포 확장및 세포 시각화를 가능하게 하는 세포 단층을 생성합니다. (G,H) 가열된 탄화수소 혼합물을 사용하여 아가로즈 패드를 밀봉하고 이미징 전에 원하는 온도에 평형을 허용하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 올바른 셀을 선택합니다. (A) 상부 패널은 72시간 동안 EMM 플러스 보충제에 굶어 남은 핵분열 효모 세포를 보여주고 하단 패널은 로그성장을 겪고 있는 세포를 나타낸다. 굶주림에 남아있는 세포에서, 작은 세포 형태는 평가 될 수있다. 빨간색 열린 화살표는 기아의 특징인 진공 청소기 과립을 보여줍니다. 로그학 배양에서, 길쭉한 형태와 패혈증 (빨간 화살표)을 보여주는 세포는 활성 사이클링 역학을 나타내는 풍부합니다. 우측 패널은 기아와 증식 시 Tos4-GFP 및 Sad1-DsRed 신호를 발현하는 세포를 보여줍니다. 범핵 Tos4-GFP 발현 및 Sad1-DsRed신호는 활성 증식 중에 반대세포극으로 국소화되지만 기아는 보이지 않는다. (B) 위쪽 패널은 동일한 메이트 유형(h+)의 셀이 효율적으로 메이트되지 못하는 것을 보여줍니다. 빨간 열린 화살표는 karyogamy를 겪고 있는 공소공 세포의 쌍을 보여줍니다. 이것은 세포의 10%가 짝형을 h-로 전환할 수 있는 h+ 세포의 배양에서 드문 일이 아닙니다. 하단 패널은 효율적인 결합으로 인한 asci를 보여줍니다. Zygotic asci는 지그재그 (빨간 화살표) 및 바나나 세포 모양 (빨간 열린 화살표)를 포함하여 여러 형태를 취합니다. 배율 막대 = 길이가 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미토틱 핵 역학. (a) 히스톤 H3(Hht1-GFP) 및 미세투관(Atb2-mRFP) 단백질을 1회 유사분열 주기(120분)에 따라 하였다. Hht1-GFP 및 Atb2-mRFP에 대한 개별 신호는 흑백 패널로 표시되며 BF 병합은 각각의 색상으로 표시됩니다. (B) 유사분열 주기에 걸쳐 Hht1-mGFP 강도를 정량화한다. Hht1 수준의 변화는 G1에서 유사분열 및 DNA 복제 중 핵 분열을 나타냅니다. (C) 유사분열에서 정상 또는 비정상적인 분리를 보여주는 Kymographs는 결과핵 경로가 DNA 무결성을 분기및 유지하거나 이탈하여 염색체 단편화 또는 조기 염색체 분리를 각각 촉진합니다. (D,E) Sad1-DsRed의 분리와 핵 Tos4-GFP 신호의 외관에 의해 밝혀진 M-to-G1/S의 지속 시간을 보여주는 Kymograph 및 현미경 패널. 높은 Tos4-GFP 식으로 반점의 식별을 용이하게 강도 졸업 열지도를 만들기 위해 피지에서 화재 LUT를 사용하여 생성 된 E의 중간 패널을 참고; 이 경우 예상대로 핵에 국한되고 Sad1-DsRed 신호가 겹칩니다. 배율 막대 = 길이가 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 메이오틱 핵 역학. (A) 패널 시리즈는 간편분열 시 핵의 움직임, 다짐 및 분열(Hht1-mRFP)을 보여준다. 말 꼬리 (HT)는 핵 측면 운동이 감소하고 완전히 anaphase I 전에 정지 메타 페이즈 (MT)에 이어 광범위한 좌우 핵 진동을 보여줍니다. 만피증 I (MI)에서, 주요 핵 질량은 2로 분할되고, 반면 만감II (MII) 4 개의 핵은 자매 염색체 분리의 과정에서 생성된다. (B) 원자력 영역 변화 (Hht1-mRFP)의 정량화 는 위상, 메타 페이즈, MI 및 MII. 핵 영역은 HT 진동 중에 동적이며 MT에서 응축되고, 핵 이동이 거의 관찰되지 않는 MI & MII(Long Nuclear Axis)동안 크기가 더욱 감소합니다. 가장 긴 핵 축(Long Nuclear Axis)을 측정하는 것은 원이 늘어날수록 일정한 직경을 가지지 못하고 길이와 짧은 두 개의 주 축을 생성한다는 생각을 기반으로 합니다. 따라서 핵의 변화를 모니터링할 때 장대하거나 짧은 축의 변화는 핵 운동의 징후를 제공합니다. 배율 막대 = 길이가 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 메이오틱 응집력 역학. (A) Rec8-GFP 신호 변화가 어떻게 암소 핵 역학과 상관관계가 있는지 보여주는 패널 시리즈. HT 및 MT 동안, Rec8-GFP 신호는 범핵이며 핵 운동(Hht1-mFRP)을 따른다. MI에서, Rec8-GFP는 핵에서 소멸, 초점의 쌍을 떠나, 이는 염색체 무기에서 Rec8 제거및 중심에서 Sgo1-PP2A 보호의 설립과 일치. 세포가 MII에 접근할 때, Rec8-GFP 초점은 사라지기 시작하고 anaphase II의 앞에 더 이상 보이지 않습니다. (B) HT에서 MII로의 Rec8-GFP 강도정량화. A에서 볼 수 있는 것과 유사하게, GFP 신호는 HT 및 MT를 통해 높고, MI 동안 실질적으로 감소하고 MII에서 완전히 사라진다. 이 패턴은 염색체 암과 centromere에서 응집력 역학을 부식시며, MII에서 분리 될 준비가 될 때까지 자매 염색체를 묶습니다. 배율 막대 = 길이가 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단백질 | 함수 | 코멘트 | 태그 | 참조 | ||
| Hht1 | DNA 포장에 관여하는 히스톤 H3 | 염색체 역학을 검사하는 데 사용 | Hht1-mRFP | 5,14 | ||
| 토스4 | Tos4 기능은 G1 단계에서 발생합니다. | G1 타이밍을 연구하기 위해 사용 | 토스4-GFP | 22,23 | ||
| Rad21/ Rec8 | 복제 후 자매 염색체를 함께 유지하는 데 관련된 응집력 있는 하위 단위 | 유사분열(Rad21) 및 조소분리 시 응집력 안정성을 분석하는 데 사용됩니다(Rec8) | 라드21-GFP/Rec8-GFP | 6,24 | ||
| 라드 11 | RPA 활동은 유사 분열 DNA 복구 도중 생기고, meiotic 재결합, 및 metaphase에서 끝납니다 | 유사분열및편분열의 DNA 수리및재결합역학연구에채용 | 라드11-YFP | 5,13 | ||
| 라드 52 | Rad52 acivity는 유사분열 DNA 복구 및 meiotic 재결합 도중 일어납니다 | 유사분열및편분열의 DNA 수리및재결합역학연구에채용 | 라드52-CFP | 5,13 | ||
| Cnp1 | 히스톤 H3 CENP-A는 특히 센트로메레에서 현지화됩니다. | 유사분열과 만피증의 염색체 분리 역학을 따르는 데 사용됩니다. | Cnp1-m체리 | 13세 | ||
| 스위6 | 헤테로크로마틴 형성에 관여하는 HP1 상동단백질 | 센트로메르와 텔로미어에서 헤테로크로마틴 동원을 연구하기 위해 사용 | 스위6-GFP | 13세 | ||
| 슬픈 1 | Sad1은 스핀들 폴 바디를 핵 봉투에 국소화하는 데 관여합니다. | 유사분열 및 만피증의 염색체 분리를 분석하기 위해 사용 | 슬픈 1-m체리 | 10개 | ||
| 세포산 및 멤브레인 | ||||||
| Atb2 | 투불린 알파 2 미세 관 세포 골격 조직에 관여 | 유사분열과 만피증의 염색체 분리를 검사하는 데 사용됩니다. | Atb2-mRFP | 7,14 | ||
| Ync13 | 소포 매개 수송에 관여하는 외래 세포증 및 내분비증 레귤레이터 | 사이토카인증 중 세포벽 무결성 연구에 사용 | Ync13-mECitrine | 25개 | ||
| Rlc1 | 수축링 수축에 관여하는 묘신 II 소단위 | 중격 성숙 및 수축의 역학을 탐구하는 데 사용됩니다. | RIc1-m체리 | 25개 | ||
| Ccr1 | ER, 플라즈마 및 미토크론드리아 외막의 일부인 NADPH-시토크롬 p450 환원효소 | 내분비증, 외세포증 및 사이토카인시스와 같은 막 관련 역학을 검사하기 위해 채택되었습니다. | Ccr1N-GFP | 5개 | ||
| 게프1 | 세포 극성의 확립 및 유지에 관여하는 로구닐-뉴클레오티드 교환 인자 | 전 세계, 미세소관 의존성 세포 극성 역학을 검사하는 데 사용됩니다. | Gef1-m체리-GBP | 26세 | ||
| 푸스1 | 세포화 동안 액틴 융합 포커스 어셈블리에 관여하는 포르민 | 핵분열 효모 결합과 관련된 융합 역학 연구에 사용 | Fus1-sfGFP | 27세 | ||
| Mn9 | 골지 장치에서 단백질 N-연결된 글리코실화에 관여하는 만놀실 트랜스퍼라제 소단위 | 그것은 시스-Golgi에서 트랜스-Golgi로 진행으로 골지에서화물 성숙을 연구하기 위해 고용 | Mn9-mCherry | 28세 | ||
| 누 1 | 말 꼬리에 관여하는 다인에 대한 피질 고정 인자 | meiotic prophase에서 핵 진동 도중 미토콘드리아 의존다 다인 앵커링을 검사하는 데 사용됩니다 I | 넘1-예그FP | 29세 | ||
표 1: 핵 및 세포역학의 마커.
동영상 1: 스핀들 폴 바디를 보여주는 M-to-G1/S 트랜지션(SPB; Sad1-DsRed) Tos4-GFP 핵 신호의 정화 및 축적 에 앞서 분리. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
동영상 2: 핵(Hht1-GFP) 분열과 상관관계가 있는 미세투관(Atb2-mRFP) 확장을 나타내는 유사분열 주기의 완료. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
Discussion
유사분열 및 만피증 중 살아있는 세포 이미징은 데이터 수집 중에 핵분열 효모 생리학을 실질적으로 방해하지 않고 핵 역학을 검사할 수 있는 기회를 제공합니다. 그러나, 세포가 환경 스트레스의 자유로운 원하는 밀도로 성장하기 위하여 주의를 기울여야 합니다; 그리고 만피증의 경우, 세포가 말단 분화 의 시간 동안 너무 일찍 또는 늦지 않도록 이미지화됩니다. 과잉 셀 룰 러 우 밀기, 기아, 그리고 부적 당한 성장 온도는 재현 할 수없는 관찰에 기여 하는 일반적인 요인. 또한, 균주 시공 중에 형광 태그가 표적 유전자의 기능을 방해하거나 전반적인 세포 적합성에 영향을 미치지 않는다는 것을 테스트하는 것이 중요합니다. 형광마커를 운반하는 균주의 표현형을 면밀히 검사하지 못하면 유사한 유전자형에 걸쳐 일관되지 않고 비교할 수 없는 결과를 초래할 수 있습니다.
현미경 아가로즈 패드는 조립이 간단하지만, 그들은 또한 귀중한 이미징 데이터를 얻기에 장애물을 제기 할 수 있습니다. 아가로즈 패드를 만드는 것은 세 개의 현미경 슬라이드를 서로 평행하게 배치하고, 중간 슬라이드에 용융 아가로스를 분배하고, 다른 슬라이드의 상단을 가로가는 슬라이드를 넣는 것만큼 간단합니다. 그러나, 내성, 상황별 아가로즈 패드를 제조하기 위해 폭 을 수정할 수 있는 슬라이드 메이커 장치를 조립하는 것이 유용하다. 패드 폭 유연성을 제공하는 간단한 슬라이드 메이커는 플랫폼 (파이펫 팁 홀더 또는 벤치), 두 개의 현미경 슬라이드 및 패드폭 조정 메커니즘 역할을하는 실험실 테이프로 구성됩니다 (그림 1A). 정확한 패드 두께는 이미징 시간 요구 사항, 아가로즈 브랜드, 온도, 커버 슬립 실란트, 증발 속도 등에 따라 달라집니다. 따라서, 데이터 수집 전에 이미징 시스템을 교정하여 기술적 재현성을 높이고 라이브 셀 이미징의 품질을향상시키는 것이 중요하다 1,2,3. 패드 표면, 강성 및 구성은 장시간 이미지 수집 중에 필수적입니다. 아가로즈는 배경 형광이 낮고 쉽게 성형 할 수 있으며 적절한 농도로 증발로 인한 구조적 변형을 견딜 수 있습니다. 또한 핵분열 효모 매체와 아가로즈를 결합해도 이미지 품질이 저하되지 않으며 여러 유사분열 및 감피증 주기를 연장관찰할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경 검사에 대한 기포를 피하는 것이 중요합니다. 아가로즈 패드 내부와 샘플 내에서 에어 포켓은 시간이 지남에 따라 확장되어 세포 이동을 일으키고 초점 평면을 방해합니다. 세포가 커버슬립 회전에 의해 효율적으로 확산되면 연구자들은 핵 융합에서 포출에 이르는 여러 세대의 유사분열 과정과 모방 사건을 따를 수 있습니다. 이미징 실험을 위한 올바른 패드를 만들고 선택하는 데는 시간이 걸리지만, 일단 달성되면 매우 유익한 현미경 관찰에 기여할 수 있습니다.
다른 방법의 경우와 마찬가지로, 살아있는 세포 현미경 검사법은 기술적 인 제한이 없습니다. 형광 태그가 붙은 단백질의 사용은 연구될 수 있는 무슨의 범위를 제한하는 실험에 경계를 소개합니다. 사진 표백 및 사진 독성은 장시간 이미지 수집의 전형적인 문제입니다. 그(것)들은 너무 오래 또는 너무 자주 짧은 파장에 세포를 노출시키지 않음으로써 중화될 수 있습니다. 핵분열 효모 라이브 세포 이미징에 사용되는 전형적인 형광 단백질인 GFP, CFP, YFP, mRFP 및 DsRed와 관련된 실험의 경우 일상적인 실험을 위해 5-15% 여기 광과 100-500ms 노출 시간을 사용하는 것이 일반적입니다. 그러나 이러한 매개 변수는 연구원의 특정 실험 요구 사항에 따라 변경됩니다. 또한, 60x 대물렌즈를 사용하여 0.5 μm 간격을 가진 9-13개의 섹션으로 구성된 z-stack은 핵분열 효모 세포의 두께를 해결하기에 충분하다. 더욱이, 형광 마커가 표적 단백질의 적당한 규칙 또는 기능을 방해하거나 가짜 표현형을 생성하지 않는다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 따라서, 다른 수단에 의해 관찰을 확증하기 위해 동일한 표적 유전자에 대해 상이한 형광 및 친화성 태그를 포함하는 균주를 구성하는 것이 바람직하다. 또한 실험 파라미터를 실험 전반에 걸쳐 재현할 수 있고 수집된 데이터가 다운스트림 분석1,3에적합하도록 하는 것은 연구자의 책임입니다. 어떤 기술도 형광 신호 검출시 선형성에 대한 신중한 관찰과 엄격한 검사를 통해 실험 시스템을 꼼꼼하게 검증하는 오랜 검증된 관행을 대체할 수 없습니다.
마지막으로, 원시 이미지를 수정하지 않는 형식으로 현미경 데이터를 분석하는 것이 중요합니다. Fiji는 원시 데이터 측정을 추적할 수 있는 우수한 문서화 도구를 제공하며 연구원이 단일 세션에서 다양한 셀 파라미터를 검사할 수 있도록 합니다. 이러한 기능뿐만 아니라 온라인 자습서 및 광범위한 문학 범위의 풍부한, 피지 측정을위한 중요한 도구, 분석, 유사분열과 편감에서 핵 분열 효모의 핵 역학을 설명하는 라이브 세포 이미징 데이터를 제시하기위한 중요한 도구.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자들은 이 원고의 준비를 더욱 즐거운 노력으로 만들어 준 나탈리아 라 포르카데와 몬 라페르테에게 감사를 표하고 싶습니다. 그들의 통찰력, 실험 아이디어 및 도덕적 지원으로이 작품의 완성에 기여 한 Forsburg 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIGMS R35 GM118109에서 SLF로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
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