Summary
Hier präsentieren wir Live-Zell-Bildgebung, eine ungiftige Mikroskopiemethode, die es Forschern ermöglicht, das Proteinverhalten und die Kerndynamik in lebenden Spalthefezellen während Derose und Meiose zu untersuchen.
Abstract
Die Live-Zell-Bildgebung ist eine Mikroskopietechnik, mit der die Zell- und Proteindynamik in lebenden Zellen untersucht wird. Diese bildgebende Methode ist nicht toxisch, stört in der Regel nicht die Zellphysiologie und erfordert eine minimale experimentelle Handhabung. Die niedrigen technischen Interferenzen ermöglichen es Forschern, Zellen über mehrere Zyklen der Mitose hinweg zu untersuchen und die Meiose von Anfang bis Ende zu beobachten. Mithilfe von fluoreszierenden Tags wie Green Fluorescent Protein (GFP) und Red Fluorescent Protein (RFP) können Forscher verschiedene Faktoren analysieren, deren Funktionen für Prozesse wie Transkription, DNA-Replikation, Kohäsion und Segregation wichtig sind. In Verbindung mit der Datenanalyse mit Fidschi (einer kostenlosen, optimierten ImageJ-Version) bietet die Live-Zell-Bildgebung verschiedene Möglichkeiten zur Bewertung von Proteinbewegungen, Lokalisierung, Stabilität und Timing sowie nuklearer Dynamik und Chromosomensegregation. Wie bei anderen Mikroskopiemethoden wird die Live-Zell-Bildgebung jedoch durch die intrinsischen Eigenschaften des Lichts begrenzt, die die Auflösungsleistung bei hohen Vergrößerungen begrenzen und auch empfindlich auf Photobleichungen oder Phototoxizität bei hoher Wellenlänge reagieren. Frequenzen. Mit einiger Sorgfalt können die Forscher diese physikalischen Einschränkungen jedoch umgehen, indem sie sorgfältig die richtigen Bedingungen, Dehnungen und fluoreszierenden Marker auswählen, um eine angemessene Visualisierung von mitotischen und meiotischen Ereignissen zu ermöglichen.
Introduction
Die Live-Zell-Mikroskopie ermöglicht es Forschern, die Kerndynamik zu untersuchen, ohne Spalthefezellen abzutöten, und eliminiert die Notwendigkeit tödlicher Fixierungen und Flecken. Es ist möglich, die Stabilität, Bewegung, Lokalisierung und das Timing von fluoreszierend markierten Proteinen zu beobachten, die an wichtigen Ereignissen wie Chromosomenreplikation, Rekombination und Segregation beteiligt sind, zusätzlich zu der Membran und dem Zytoskelett Bewegungen. Durch die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und ungiftige Signalerkennung gibt es ein minimales physiologisches Eindringen. Bei sachgemäßer Behandlung kann diese Mikroskopiemethode verwirrende Effekte reduzieren, die sich aus der erweiterten technischen Handhabung oder aus der falschen chemischen Reaktivität ergeben. Darüber hinaus können Forscher während eines Experiments relevante Beobachtungen von Spalthefe-Ernährungs- und Stresszuständen, proliferativer Effizienz und apoptotischem Status machen, die auf unangemessene bildgebende Parameter oder abnorme Zellphysiologie hinweisen1 ,2,3.
Mitose und Meiose zeichnen sich durch nukleare und zelluläre Teilung aus. Bei der Meiose wird im Gegensatz zur Mitose der genetischeGehalt halbiert, da Elternzellen Tochterzellen 4 hervorrufen. Da die Live-Zell-Bildgebung zusätzlich zur räumlichen Beziehung eine zeitliche Dimension bietet, können viele Zellen in Echtzeit untersucht werden. Die Live-Zell-Mikroskopie hat es den Forschern ermöglicht, die Dynamik der Kernteilung mit fluoreszierenden Tags für Histone5, Kohäsin-Untereinheiten6, Mikrotubuli7, Zentromere8, Kinetochores9, Komponenten von Spindelpolkörper (SPB)10und die des Chromosomen-Passagierkomplexes (CPC)11. Außerhalb des Chromosomensegregationsapparates hat die Live-Zell-Bildgebung auch das Verhalten von Proteinen erfasst, die notwendig sind, aber nicht direkt an der Chromosomensegregation beteiligt sind. Die Funktion dieser Proteine hat gezeigt, dass die Replikation, Chromosomenrekombination, Kernbewegung und Chromosomenbindung an Mikrotubuli12,13,14beeinflussen. Diese Beobachtungen haben zu einem besseren Verständnis zellulärer Ereignisse beigetragen, deren funktionelle Komponenten nicht für biochemische oder genetische Untersuchungen geeignet waren. Mit neuen Fortschritten in der Mikroskopietechnologie werden Einschränkungen wie schlechte Auflösung, Photobleaching, Phototoxizität und Fokusstabilität abschwächen, wodurch bessere Echtzeitbeobachtungen der mitotischen und meiotischen Kerndynamik erleichtert werden1, 2,3. Meiose ist eine besondere Herausforderung, da es sich um einen terminalen Differenzierungspfad handelt, der eine genaue Aufmerksamkeit auf das Timing erfordert.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache Methode zur Untersuchung der Kerndynamik von Echtzeitspalthefe bei Mitose und Meiose zu präsentieren. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, Zellen zu verwenden, die nicht Umweltbelastungen ausgesetzt waren, Agarose-Pads vorzubereiten, die längeren Bildgebungen standhalten können, und Zellen an Dichten zu montieren, die die Visualisierung von Einzelzelldynamik erleichtern. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll Zellen, die fluoreszierend markierte Proteine tragen, die als nützliche Marker für die Kernkinetik (Hht1-mRFP oder Hht1-GFP), Chromosomensegregation (Sad1-DsRed), Zytoskelettdynamik (Atb2-mRFP), Aktivierung in G1/S (Tos4-GFP) und Kohäsionsstabilität in der Meiose (Rec8-GFP). Diese Methode führt auch zusätzliche kernnukleare und zytosolische Marker ein (Tabelle I), die in verschiedenen Kombinationen verwendet werden können, um Fragen zu bestimmten zellulären Prozessen zu beantworten. Darüber hinaus werden grundlegende Fidschi-Tools vorgestellt, um Forschern bei der Verarbeitung von Live-Zell-Bildern und der Analyse verschiedener Arten von Daten zu helfen. Die Stärke dieses Ansatzes ergibt sich aus der Verwendung von Echtzeitbeobachtungen der Proteindynamik, des Timings und der Stabilität, um Prozesse zu beschreiben, die für die ordnungsgemäße Ausführung von Mitose und Meiose integral sind.
Protocol
1. Medienvorbereitung15,16
- Aktienlösungen
- Bereiten Sie eine 50-fache Salzstocklösung vor, indem Sie 52,5 g MgCl2,6H20, 0,735 g CaCl22 0, 50 g KCl und 2 g Na2S04 in eine Flasche mit 1 L destilliertem Wasser geben. Mischen Sie die Lösung gründlich und sterilisieren Sie durch Filtration. Bei 4 °C zur Langzeitlagerung aufstellen.
- Machen Sie eine 1.000x Vitamin-Stammlösung durch Mischen von 1 g Pantothensäure, 10 g Nikotinsäure, 10 g Inositol und 10 mg Biotin in einer Flasche mit 1 L destilliertem Wasser. Mischen Sie die Lösung gut und sterilisieren Sie durch Filtration. Zur Langzeitlagerung bei 4 °C aufbewahren.
- Bereiten Sie eine 10.000x Mineralstofflösung vor, indem Sie 5 g Borsäure, 4 g MnSO4, 4 g ZnSO4,7H2O, 2 g FeCl26H2O, 1 g KI, 0,4 g Molybdänsäure, 0,4 g CuSO4,5H20 und 10 g Zitronensäure in einer Flasche mit 1 L destilliertem Wasser. Mischen Sie die Lösung gründlich und sterilisieren Sie durch Filtration. Bei 4 °C zur Langzeitlagerung aufstellen.
- Machen Sie individuelle Nährstoff-Stammlösungen, indem Sie 7,5 g Entweder Adenin, Leucin, Histidin oder Lysin in eine Flasche mit 1 L destilliertem Wasser geben. Verwenden Sie nur 3,75 g, um die Uracil-Lösung herzustellen. Sterilisieren Sie Lösungen durch Autoklavieren.
HINWEIS: Im Laufe der Zeit fällt Uracil aus der Lösung. Um die Lösung wieder in die Lösung zu bringen, in der Mikrowelle bei 60% Leistung in 10 s Schritten erwärmen oder 20 min in ein 55 °C Wasserbad stellen. Die warme Lösung verwirbeln, bis alle Uracil-Klumpen verschwinden.
- Hefe-Extrakt plus Ergänzungen (JA)
- In einem 2 L-Kolben 1 L destilliertes Wasser, 5 g Hefeextraktbasis, 30 g Glukose und je 225 mg Adenin, Uracil, L-Histidin, L-Leucin und L-Lysin hinzufügen. Fügen Sie 20 g Agar hinzu, um das feste Medium zu machen.
- Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um Die Zutaten vollständig in die Lösung aufzulösen. Agar wird schmelzen, nachdem das Medium durch Autoklavieren sterilisiert wird.
HINWEIS: Der Einfachheit halber ist gebrauchsfertiges YES-Pulver auch im Handel erhältlich.
- Edinburgh minimal medium (EMM) und pombe glutamat medium (PMG)
- In einem 2 L Kolben 1 L destilliertes Wasser mit 3 g Kaliumhydrogenphthalat, 2,2 g Na2HPO4,5 g NH4Cl, 20 g Glukose, 20 ml Salzstocklösung, 1 ml Vitaminstocklösung und 0,1 ml Mineralstofflösung. NH4Cl durch 2,2 g L-Glutaminsäure-Mononatriumsalz zur Zubereitung von PMG ersetzen. Um das feste Medium zu machen, fügen Sie 20 g Agar hinzu.
- Mit einem magnetischen Rührstab, zutaten gründlich auflösen. Agar wird schmelzen, nachdem das Medium durch Autoklavieren sterilisiert wird. Vor der Verwendung, fügen Sie Nährstoff-Stammlösungen nach Bedarf. Pro 1 L Medium je 15 ml Adenin, Leucin, Histidin und Lysin hinzufügen. Verwenden Sie 30 ml für Uracil, da es weniger konzentriert als die anderen Nährstofflösungen ist.
HINWEIS: Der Einfachheit halber sind gebrauchsfertige EMM- und PMG-Pulver im Handel erhältlich.
- Malzextrakt (ME)
- Verwenden Sie einen 2-L-Kolben, um 1 L destilliertes Wasser mit 30 g Malzextrakt und je 225 mg Adenin, Uracil, Histidin und Leucin zu mischen. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,5 ein. 20 g Agar einschließen, um das feste Medium herzustellen.
- Lösen Sie Komponenten mit einem magnetischen Rührstab in die Lösung. Agar wird schmelzen, nachdem das Medium durch Autoklavieren sterilisiert wird.
- Sporulationsagar mit Nahrungsergänzungsmitteln (SPAS)
- In einem 2 L-Kolben 1 L destilliertes Wasser, 10 g Glukose, 1 g KH2PO4, 1 ml Vitaminvorrat, je 45 mg Adenin, Uracil, Histidin, Leucin und Lysinhydrochlorid hinzufügen. Fügen Sie 20 g Agar hinzu, um das feste Medium zu machen.
- Verwenden Sie eine magnetische Rührstange, um Zutaten gründlich zu kombinieren. Agar wird schmelzen, nachdem das Medium durch Autoklavieren sterilisiert wird.
2. Spalthefe Kultur15,16
- Verwenden Sie YES festes Medium, um Spalthefestämme aus kryogener Konservierung aufzuwecken. Je nach Temperaturanforderungen der einzelnen Stämme, entweder bei 25 °C oder 32 °C für 3-5 Tage inkubieren.
- Wenn Kolonien sichtbar sind, bereiten Sie eine Starter-Flüssigkeitskultur vor. Wählen Sie Zellen aus einzelnen Kolonien und impfen Sie sie in Reagenzgläser mit 3 ml JA flüssigem Medium. Wachsen Sie bei der entsprechenden Temperatur bis zur mittleren oder späten Logphase.
HINWEIS: Für die richtige Belüftung rohre oder Kolben mit einem Volumen verwenden, das mindestens 5x größer ist als das vorgesehene Flüssigkeitskulturvolumen. Schüttelgeschwindigkeiten zwischen 150 und 220 Umdrehungen/min sind für das routinemäßige Kulturwachstum üblich. - Geben Sie 250-500 l Starterkultur in einen 50 ml Kolben mit 9,5-9,75 ml entweder JA, EMM oder PMG plus geeignete Ergänzungen. Lassen Sie Zellen auf die gewünschte Dichte wachsen und überprüfen Sie unter dem Mikroskop die richtige Zellmorphologie und Ernährungszustand.
HINWEIS: Um geweckte Stämme bis zu einem Monat zu lagern, versiegeln Sie JA-Platten mit Paraffinband und legen Sie sie bei 4 °C ab.
3. Probenvorbereitung2
- Mikroskop-Dia-Setup
- Fügen Sie 2 g Agarose in einem 500 ml Becher mit 100 ml entweder minimalen Medium plus Ergänzungen (Mitose) oder flüssigem SPAS (Meiose) hinzu. Erwärmen Sie die Agarose-Lösung in einer Mikrowelle mit 60% Leistung in 10 s Schritten oder legen Sie sie in ein 55 °C-Wasserbad für 10 min. Wirbeln Sie die Lösung, um ein effizientes Schmelzen zu gewährleisten. Bereiten Sie agarose Slide-Making-Setup (Abbildung 1A) vor, um eine schnelle Pad-Vorbereitung zu gewährleisten und zu verhindern, dass geschmolzene Agarose vorzeitig erstarrt.
- Lassen Sie die geschmolzene Agarose 1 min bei Raumtemperatur abkühlen und geben Sie 50-100 L Flecken auf Mikroskopschlitten mit Breitbohrpipettenspitzen aus. Bevor die Agarose abkühlt, legen Sie einen Mikroskopschlitten auf die Oberseite, um ein Streupolster von etwa 1,5-2 cm Durchmesser zu erzeugen (Abbildung1B-C). Die Breite des Agarose-Pads ist in der Regel proportional zur Länge der Bildgebungszeit. Mit anderen Worten, dickere Pads halten längeren Bildzeiten stand.
- Verwenden Sie ein Kohlenwasserstoffgemisch als Dichtstoff, um eine ordnungsgemäße Abdeckung der Dias mit dicken Agarose-Pads zu gewährleisten und um eine Lösungsmittelexposition an den deckscheinfesten Kanten zu verhindern. Zugleichen (w/w) von Petroleumgelee, Lanolin und Paraffin in einem 500 ml Becher mischen. Zutaten auf einer heißen Platte bei 120 °C für 5 min erhitzen. Wenn die Komponenten schmelzen, wirbeln Sie die geschmolzene Lösung vorsichtig, um eine angemessene Mischung zu gewährleisten.
- Beispieleinrichtung
- Zur Untersuchung von mitotischen Ereignissen wachsen Zellen aus Starterkulturen entweder in flüssigem EMM oder PMG plus Ergänzungen bis etwa Mid-Log-Phase (OD595 von 0,4). Zentrifuge 1 ml der Zellsuspension bei 1.375 x g für 1 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im minimalen Medium plus Ergänzungen zu einem Endvolumen von 100 l wieder auf.
- Um meiotische Ereignisse abzubilden, wachsen Zellen aus Starterkulturen im Minimalmedium plus Ergänzungen zur Späten Logphase (OD595 von 0,7-1,0). Kombinieren Sie gleiche Volumina von gegenüberliegenden Mate-Typ-Zellen (h- und h+) in einer 1 ml Zellsuspension. Zentrifugenzellen bei 1.375 x g für 1 min und das Pellet in flüssigem ME wieder aufsetzen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um eine effiziente Nährstoffentfernung zu gewährleisten.
- Nach der letzten ME-Wäsche, setzen Sie Zellen in 1 ml ME wieder aus und fügen Sie sie einem 50 ml Kolben hinzu, der 9 ml ME enthält. Inkubieren für 12-16 h bei 22-25 °C bei minimaler Drehzahl (50-100 RPM). Reichlich Zellflockung, die zu vielen runden Spalthefeklumpen führt und auf eine effiziente Paarung hinweist.
- Nehmen Sie 1 ml Probe der Paarungskultur und Zentrifuge bei 1.375 x g für 1 min. Beseitigen Sie den Überstand, aber lassen Sie 250 l in der Röhre, um Zellen wieder auszusetzen. Vor dem Platzieren von Zellen auf Agarose-Pads, Wirbel kräftig für 5 s Klumpen zu stören.
HINWEIS: Die restlichen 250 -L ME, die zum Resuspendieren von Zellen verwendet werden, enthalten Paarungsfaktoren, die Zellen bei der Meiose helfen. - Legen Sie 20 L einer mitotischen oder meiotischen Zellsuspension auf ein 2% Agarose-Pad. Entfernen Sie überschüssiges Medium, indem Sie das Dia invertieren und auf die Oberseite eines fusselfreien Papiertuchs für 2-3 s legen (Abbildung 1D). Stellen Sie die Schiebepolsterseite nach oben ein und legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel fest, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen erzeugt werden (Abbildung 1F).
HINWEIS: Die Eliminierung überschüssiger Medien mit einem Papiertuch ist zeiteffizienter als die Schwerkraftabsorption, was bei Meioseexperimenten besonders wichtig ist. - Um eine Zellmonolayer zu erstellen, drehen Sie den Coverslip im Uhrzeigersinn mit dem Zeigefinger für eine (Mitose) oder zwei (Meiose) volle Drehungen (Abbildung 1F). Stellen Sie sicher, dass sich die Zellmaterie über das Agarose-Pad verteilt, was eine bessere Trennung einzelner Zellen oder Asci ermöglicht. Mit Hilfe eines kleinen Holzstabes geschmolzenes Dichtmittel an den Rändern des Deckels verteilen, um jedes Agarose-Pad zu versiegeln (Abbildung 1G).
- Sobald das Agarose-Pad versiegelt ist, legen Sie es auf die Mikroskop-Bühne und lassen Sie es für 10-15 min unter den entsprechenden bildgebenden Bedingungen (z. B. Temperatur) (Abbildung1H)ausweichen, damit sich Luftblasen ableiten und jede Inletzter Agarose verschiebungen kann. Beginnen Sie mit der Bildgebung, sobald die Folie effizient ausgeglichen wurde, und entfernen Sie sie nicht von der Bühne, bis die Datensammlung endet.
HINWEIS: Die Kontrolle von Temperatur und Luftfeuchtigkeit wird durch das eingesetzte Mikroskopsystem und spezifische experimentelle Anforderungen bestimmt. Wenn vorhanden, wenden Sie die Temperatur- und Feuchtigkeitsregelung auf alle bildgebenden Experimente an. Wenn sie abwesend sind, müssen die Forscher einen Weg finden, Temperaturschwankungen zu verhindern, insbesondere bei Meioseexperimenten.
4. Live-Zell-Bildgebung2 und Verarbeitung
- Verwenden Sie das 40x-Ziel, um geeignete Sichtfelder für das Bild zu finden. Wechseln Sie zum 60-fachen Ziel, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Je nach verwendetm Mikroskopsystem erfolgt die anschließende Neufokussierung und Schnittierung der Probe zu jedem Zeitpunkt manuell oder durch einen mikroskop- oder softwareautomatisierten Prozess.
HINWEIS: Die in diesem Protokoll vorgestellten Bilder wurden mit einem Dekonvolution-, Fluoreszenzmikroskop mit Sedat-, RFP- und GFP-Filtersätzen, Nano-Motion-Stufe, 60x NA 1.4 Objektiv und 12-Bit-CCD-Kamera gesammelt. Eingebaute mechanische Rollläden und motorisierte Filterräder ermöglichten die reduzierte Anregungsbelastung und das Photobleichen von Proben. - Verwenden Sie geeignete Software, um Bilder zu erfassen und zu verarbeiten. Um Bilder zu dekonvolvenieren, verwenden Sie vom Hersteller bereitgestellte optische Übertragungsfunktionen.
HINWEIS: Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Mikroskopgeräten und -software finden Sie im Materialverzeichnis. - Die Verwendung eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops zur Erfassung von Live-Zell-Bildern stellt sicher, dass das Mikroskop Daten digital sammelt, 40-x- oder 60-fache Objektive mit numerischen Blenden (NA) größer als 1,2 hat und optische Schnitte durchführen kann.
HINWEIS: Ohne diese Anforderungen zeigen Bilder eine reduzierte Auflösung und gefährden die Qualität mikroskopischer Messungen und qualitativer Beobachtungen. - Verwenden Sie kostenlose Plug-In-Programme (z. B. Fidschi), um systematische Unschärfefehler zu minimieren, die durch den Kontrastverlust während der Bildaufnahme 17,18,19,20 entstehen, und um eine ordnungsgemäße quantitative Analyse zu gewährleisten der Fluoreszenzintensität und anderer zeitlicher und dynamischer Ereignisse innerhalb der Zelle.
HINWEIS: Weitere verfügbare kommerzielle Dekonvolution-Programme finden Sie in der Tabelle der Materialien. - Wählen Sie die Mikroskopfiltersätze, die am besten zu den unter Beobachtung stehenden Fluorophoren passen. Stellen Sie sicher, dass die Anregungs- und Emissionsfilter über die richtigen Banddurchgänge verfügen, die den spezifischen Nachweis von fluoreszierenden Proteinen ermöglichen. Um beispielsweise CFP-Signale zu erkennen, ist ein Anregungs- und Emissionsbanddurchlauf von 430/25 und 470/30 angemessen, jedoch nicht für die RFP-Fluoreszenz.
- Verwenden Sie einen minimal-effektiven Einstellungsansatz (MESA), wenn Sie Spalthefe an mehreren Zeitpunkten abbilden. Mit anderen Worten, vermeiden Sie die längere Verwendung von Anregungswellenlängen und verwenden Sie die niedrigste Anregungsleistung und Belichtungszeit, die akzeptable, aber quantifizierbare und reproduzierbare Bildgebungsdaten erzeugen.
- Bei längerer Bildgebung während Derose oder Meiose, begrenzen Sie das Intervall zwischen Erfassungszeitpunkten auf 5-10 min. Obwohl 2% Agarose-Pads 12 bis 16 h Bildgebungssitzungen standhalten können, ist eine Zellverschiebung aufgrund von Agarose-Verdunstung wahrscheinlich. Führen Sie daher vollständige Mitose- oder Meioseexperimente in 4-6 h bzw. 8-10 h Fenstern durch.
- Sammeln Sie Bildgebungsdaten für 4-8 h, bestehend aus mindestens 24-48 Erfassungszeitpunkten bzw. einem Fluoreszenzprotein und einem Z-Stack pro Zeitpunkt und Fluoreszenzkanal, der aus 13 Abschnitten mit einem Abstand von 0,5 m mit einem 60-fachen Objektiv besteht. Dies erfordert mindestens 0,5-1 GB Festplattenspeicherplatz. So, neben der Beseitigung von Photobleichungen und Zellverschiebung, erstellen Sie einen Workflow, der Rechenfunktionen1,2,3berücksichtigt.
HINWEIS: Diese Erfassungsparameter werden in der Regel in der Software festgelegt und geändert, die Mikroskopfunktionen steuert und Bilder sammelt und verarbeitet. - Um bestimmte kerntechnische Prozesse genauer zu untersuchen, führen Sie alle 5-10 s bildbezogene Bildaufnahme durch, solange die Emission nach häufiger Exposition nicht wesentlich abnimmt. Führen Sie eine vorläufige Fluoreszenzintensitätsanalyse über verschiedene Zeiträume durch, um den Punkt zu bestimmen, nach dem die Genauigkeit der gesammelten Daten nicht mehr zuverlässig ist1,3.
- Verwenden Sie in der Bildaufnahme- und Bildverarbeitungssoftware die maximale Intensitätsprojektion auf die Bild-Z-Stacks, um alle Strukturen mit hoher Fluoreszenzdichte auf einer 2D-Ebene unabhängig von ihrer vertikalen Position zu beobachten1,2, 3. Dies erleichtert eine schnelle Untersuchung nuklearer Prozesse, die in verschiedenen Voxel nen auftreten. Sammeln Sie ein mittelfokales Hellfeldbild, um ein Referenzbild der beobachteten Zellen zu erzeugen.
5. ImageAnalyse20,21
HINWEIS: Die Bildanalyse in diesem Protokoll wird mit Fidschi durchgeführt. Weitere Analyseprogramme und Fidschi-Plug-Ins finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- Laden Sie ein dekonvolvedes Bild hoch, indem Sie die Funktion Bio-Formats Importer im Menü Plugins auswählen. Wählen Sie im Popupfenster Importoptionen Hyperstack, Standardfarbmodusaus, und aktivieren Sie autoscale, bevor Sie die Schaltfläche OK drücken.
- Stellen Sie sicher, dass das angezeigte Fenster die richtige Anzahl von Fluoreszenzkanälen und Zeitrahmen enthält, indem Sie seitlich auf den entsprechenden Balken unten scrollen. Speichern als Tiff-Datei, die keine Daten komprimiert und Informationsverlust verhindert.
- Öffnen Sie ein Bild, das einen Maßstabsbalken enthält, der während der Datenverarbeitung von der Mikroskopsoftware generiert wurde. Bestimmen Sie die Pixellänge der Maßstabsleiste mithilfe des Werkzeugs Gerade Linie, um eine parallele Linie ähnlicher Größe zu zeichnen, und wählen Sie Im Menü Analysieren die Option Messen aus. Fügen Sie eine Maßstabsleiste hinzu, indem Sie das Verhältnis von Pixel zu Bild festlegen, indem Sie im Menü Analysieren die Option Skalierung festlegen auswählen.
- Geben Sie im Popup-Fenster Maßstab festlegen die berechnete Entfernung in Pixel und die bekannte Entfernung in mein, legen Sie das Pixel-Seitenverhältnis auf 1,0 fest, setzen Sie Mikron als Längeneinheit,und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global, bevor Sie auf die OK-Taste.
- Verwenden Sie die Option Messungen festlegen im Menü Analysieren, um verschiedene Parameter auszuwählen, die bei der Auswahl von Measurequantifiziert werden sollen. Wählen Sie für die Zwecke dieses Protokolls die folgenden Metriken aus: Fläche, Umfang, Mittlerer Grauwert, Median, Min & max Grauwert, Integrierte Dichte, Stapelpositionund Anzeige Etikett.
- Geben Sie je nach Genauigkeit der gesammelten Daten mehr als 1 für die Option Dezimalstellen ein und aktivieren Sie ggf. das Feld Wissenschaftliche Notation. Nach dem Anwenden des Befehls Measure werden in einem Popupfenster Ergebnisse die Werte für jeden relevanten Parameter angezeigt. Speichern Sie die Ergebnisse als .csv-Datei für zukünftige Analysen in einem Statistikprogramm.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, ein Bild in seine konstituierenden Leuchtstoffkanäle zu trennen, um die Länge zu bestimmen, es sei denn, es gibt Signalstörungen zwischen den verschiedenen Farben in diesem Fall folgen Sie dem unten beschriebenen Schritt. - Wählen Sie bei Signalstörungen im Menü Bild Farbe und Kanalwerkzeug aus und analysieren Sie jede Farbe separat. Um die Länge nichtlinearer Strukturen zu messen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Linienwerkzeug, und verwenden Sie die Option Segmentierte Linie oder Freihandlinie, um die gewünschten Objekte zu verfolgen.
- Verwenden Sie für lineare Strukturen oder um den Abstand zwischen zwei Punkten zu bestimmen, das Feature Gerade Linie, und wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messen aus. Die Werte für die Länge in m werden automatisch zu den Parametern hinzugefügt, die zuvor unter der Option Messungen festlegen ausgewählt wurden.
- Für die Messung von Änderungen der Signalgröße und Fluoreszenzintensität erstellen Sie zunächst eine Bibliothek von Interesse (ROI), die die Quantifizierungsgenauigkeit erhöht und schnelle Messungen über einen Bildstapel hinweg ermöglicht. Wählen Sie Farb- und Kanalwerkzeug im Menü Bild aus.
- Überprüfen Sie im Popupfenster Kanäle den Farbkanal, für den Intensität oder Fläche gemessen wird. Wählen Sie die Funktionen Anpassen und Schwellenwert im Menü Bild aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Dunkles Hintergrund, wählen Sie die Standardmethode aus (sofern die gesammelten Daten nichts anderes benötigen), und wählen Sie Rot aus, um die Interessensignale zu überlagern.
HINWEIS: Die Messung von Proteinstabilität, -bewegung und -lokalisierung hängt stark von der Farbschwelle ab, die zum Erstellen von ROI-Bibliotheken verwendet wird. Es ist wichtig, die richtige Schwellenwertmethode für die Art des zu visualisierenden Fluoreszenzmarkersignals zu wählen17,18. - Verwenden Sie das Werkzeug Wand, um jede Struktur von Interesse hervorzuheben, und drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten ROI zum Popup-ROI-Managerfenster hinzuzufügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Slice (Zeitrahmen) im Bildstapel, und speichern Sie alle ROIs, indem Sie auf die Schaltfläche Mehr klicken und Speichernauswählen.
- Öffnen Sie den ZIP-ROI-Ordner, um den ROI-Manager zu laden, und klicken Sie auf jede ROI-Idliste auf der linken Seitenseite. Wählen Sie Messen im Menü Analysieren aus, und wiederholen Sie diesen Befehl für jeden ROI-Bezeichner, um die Objekte zu quantifizieren, die für alle Slices des Image-Stacks von Interesse sind.
- Wenn das Verschieben von Zellen kein Problem ist und die Fokusebene für alle Segmente des Stapels gleich bleibt, klicken Sie im ROI-Managerauf Multi measure . Wählen Sie im Popupfenster alle Slices statt einer Zeile pro Slice messen aus, um Messungen im gesamten Bildstapel zu iterieren. Speichern Sie Die Ergebnisse als csv-Datei und analysieren Sie Messungen in einem Statistikprogramm.
- Für mehrere Kernsignale, die die Struktur des Interesses umfassen, drücken Sie die Umschalttaste, während Sie Objekte mit dem Werkzeug Wand auswählen, um einen einzelnen ROI zu erstellen. Alternativ können Sie mit dem Oval-Tool einen ROI konstanter Größe erstellen, um alle Signale von Interesse zu erfassen.
HINWEIS: Dieser ovale Ansatz kann notwendig sein, um das Signalverhalten über einen Bereich zu messen und zu beschreiben, in dem fluoreszenzsignalim Laufe der Zeit Größen- und Intensitätsänderungen aufweist. Die Signalintensität ist in diesem Fall die mittlere Signaldichte über einem bestimmten Bereich. - Qualitativ bestimmen Ko-Lokalisierung von zwei fluoreszierenden Signalen durch die Änderung der Farbe des Signalüberlappungsbereichs. Da sich die Kolokalisierungszone jedoch verengt, ist es schwieriger, Signalüberlappungen zu unterscheiden. Führen Sie in diesem Fall die unten beschriebenen Schritte aus.
- Zeichnen Sie mit dem Kanalwerkzeug, wie in Schritt 5.6 beschrieben, eine gerade Linie über jedes betreffende Signal, und wählen Sie den Befehl Diagrammprofil unter dem Menü Analysieren aus.
- Wiederholen Sie diesen Schritt für alle betreffenden Farben mit derselben gezeichneten Linie.
- Drücken Sie im Beispiel-Popupfenster, das nach jedem Profilerstellungsschritt angezeigt wird, die Schaltfläche Liste, um ein Plot-Werte-Fenster aufzurufen, und speichern Sie die Messungen für jedes Signal als csv-Datei.
- Erstellen Sie in einem Statistikprogramm ein Diagramm, das den Grauwert für jedes Signal an der entsprechenden Position (in m) entlang der gezeichneten Linie zeichnet. Mangelnde Überlappung zwischen Signalprofildiagrammen deutet im Allgemeinen auf den Mangel an Kolokalisierung hin.
HINWEIS: Verwenden Sie das Werkzeug Diagrammprofil für projizierte Bilder, um die Signalkolokalisierung zu untersuchen. Dies ist nur dann zuverlässig, wenn eine solche Überlappung auch durch den Bild-Z-Stack beobachtet wird.
- Verwenden Sie das Multi Kymograph-Tool, das im Menü Analysieren zu finden ist, um das dynamische Verhalten fluoreszierender Proteine im Laufe der Zeit zu überwachen. Das resultierende Bild zeigt die fluoreszierende Signalbewegung durch eine Reihe von kondensierten Momentaufnahmen in jedem Abschnitt des Z-Stacks, der einzelne Zeitpunkte darstellt.
- Verwenden Sie das Kanalwerkzeug, wie in Schritt 5.6 beschrieben, um das Objekt des Interesses im richtigen Kanal zu isolieren. Stellen Sie sicher, dass sich das ausgewählte Objekt oder die ausgewählte Struktur nicht erheblich durch den Z-Stack verschiebt. Platzieren Sie eine gerade Linie oder ein Rechteck über dem Objekt, wählen Sie das Multi Kymograph-Werkzeug aus dem Menü Analysieren aus, und geben Sie die gewünschte Breite der Linie ein, die das Objekt überlagert.
- Erstellen Sie Bildfelder, die die nukleare Dynamik über ein bestimmtes Zeitfenster mithilfe des Kanalwerkzeugs anzeigen, wie in Schritt 5.6 beschrieben, und indem Sie die Werkzeuge "Stapel" und "Montage erstellen" aus dem Menü Bild auswählen. Geben Sie im Popupfenster Montage erstellen die Anzahl der gewünschten Spalten und Zeilen ein, legen Sie einen Skalierungsfaktor von 1,0 fest, wählen Sie die ersten und letzten Slices (Zeitrahmen) aus, und ändern Sie die Grenzbreite auf mindestens 5, bevor Sie OK drücken. Es ist möglich, auszuwählen, welche Bilder im Stapel angezeigt werden sollen, indem Sie Die Inkremente entsprechend der gewünschten Sequenz ändern.
- Um einen Film zu generieren, laden Sie den gewünschten Hyperstack hoch, wählen Sie Speichern als Avi-Datei aus dem Menü Datei, wählen Sie keine für Komprimierungaus, und geben Sie eine Bildrate von 2-8 fps ein. Wählen Sie den Befehl Montage erstellen aus, während Sie Composite im Kanalwerkzeug auswählen, um alle Farben, die das Bild umfassen, zusammenzuführen oder zu trennen.
HINWEIS: Zwei avi-Dateien (Film 1-2) werden in diesem Protokoll bereitgestellt. Verwenden Sie sie in Fidschi, um verschiedene Funktionen zu versuchen, die in Schritt 5 hervorgehoben wurden. - Um eine einzelne, repräsentative Zelle anzuzeigen, verwenden Sie Transformieren und Drehen aus dem Menü Bild, und geben Sie Drehgrade ein. Negative Zahlen drehen Objekte nach links, während positive Werte Objekte nach rechts drehen. Sobald sich die Zelle in der richtigen Ausrichtung befindet, zeichnen Sie ein Rechteck, das die gesamte Zelle durch den Z-Stack oder während der zeiträume von Interesse umfasst, und wählen Sie Im Menü Bild zuschneiden aus. Fahren Sie wie in Schritt 5.16 und 5.16.1 erwähnt vor, um ein Bildfenster oder einen Film zu generieren.
- Um einen Film zu generieren, laden Sie den gewünschten Hyperstack hoch, wählen Sie Speichern als Avi-Datei aus dem Menü Datei, wählen Sie keine für Komprimierungaus, und geben Sie eine Bildrate von 2-8 fps ein. Wählen Sie den Befehl Montage erstellen aus, während Sie Composite im Kanalwerkzeug auswählen, um alle Farben, die das Bild umfassen, zusammenzuführen oder zu trennen.
- Fügen Sie dem Bildbereich oder Film eine Maßstabsleiste hinzu, indem Sie im Menü Analysieren die Option Extras und Maßstabauswählen auswählen. Geben Sie im Popupfenster Skalierungsleiste 5-15 für Breite in Mikrometern für einzelne Zellen oder 100-250 für ganze Ansichtsfelder ein, wählen Sie Weiß oder Schwarz für Farbe aus, und wählen Sie eine geeignete Position aus, um die Maßstabsleiste zu platzieren.
- Für Filme ist es nützlich, die Zeitentwicklung während nuklearer Ereignisse anzuzeigen. Um Zeitänderungen zwischen Frames anzuzeigen, wählen Sie Bildaus , klicken Sie auf Stapel, verwenden Sie das Zeitstempelwerkzeug, geben Sie den Startrahmen in der Zeitreihe an, und wählen Sie eine geeignete Position für die Zeitanzeige aus.
Representative Results
Ob Live-Zell-Bildgebung für Mitose oder Meiose verwendet wird, es ist wichtig, gesunde Spalthefezellen zu verwenden, bevor jede Art von Beobachtung zu machen. Die Qualität der resultierenden Daten hängt stark vom Ausgangsmaterial ab. Wenn Zellen aufgrund von Nährstoffbeschränkung oder Überwucherung verhungern, zeigen sie überschüssige Vakuolen und eine verminderte Zellgröße (Hunger, Abbildung 2A). Bei Mitose-Experimenten ist es am besten, die Verwendung von Zellen zu vermeiden, die zellulären Stress zeigen (Hunger, Abbildung 2A). Andernfalls sind die experimentellen Ergebnisse inkonsistent und nicht reproduzierbar. Um diese Einschränkung zu umgehen, wählen Sie die richtigen Wildtyp-Kontrollen und machen Sie sich mit den verschiedenen Phänotypen von Mutanten von Interesse vertraut. Zum Beispiel, mitotische Zellen für 12 h ausgehungert aufhören, aktiv DNA zu replizieren. Da die Tos4-GFP-Expression mit der G1/S-Phase-Aktivität22,23assoziiert ist, zeigen logarithmische Zellen, die diesen Marker tragen, und eine für die Kernteilung (Sad1-DsRed10) eine pannukleare Tos4-GFP-Expression, Sad1-DsRed-Foci Trennung und laufende Septation (die eine aktive DNA-Replikation und Zellteilung nahelegt) (Log, Abbildung 2A), während ausgehungerte Zellen keine solche Aktivität aufweisen (Hunger, Abbildung 2A). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Auswirkungen der Nährstoffbeschränkung in Spalthefe, die die Transkription in G1 verringert, den G1/S-Zellzyklus-Checkpoint aktiviert und den G0-Eintrag5fördert. Für Meioseexperimente müssen Die Zellen zu einer hohen Dichte heranwachsen, jedoch ohne die stationäre Phase zu erreichen. Danach werden Zellen beider Mate-Typen in niedrigstickstoffhaltigen Medien gemischt und inkubiert. Wenn die Zellen nicht gepaart werden, wie dies der Fall ist, wenn sie nicht ausreichend an Stickstoff verhungern, wird sie daran gehindert, in die Meiose einzutreten (Ineffizient, Abbildung 2B). Robuste Flockung der Paarungszellsuspension erhöht die Zell-zu-Zell-Interaktion und weist somit auf eine erfolgreiche Paarung und effiziente meiotische Induktion hin (Effizient, Abbildung 2B).
Agarose-Gel-Pads und physikalische Störungen von Zellklumpen garantieren eine korrekte Visualisierung einzelner Zellen oder Asci (Log, Abbildung 2A; Effizient, Abbildung 2B). Pads müssen eine starre, aber feuchte Plattform bieten, auf der Zellen gleichzeitig fixiert und vor Austrocknung geschützt sind. Darüber hinaus müssen die Pads dick genug sein, um Änderungen aufgrund der Verdunstung standzuhalten und eine nivellierte Oberfläche bereitzustellen, die eine angemessene Fokussierung während der gesamten Bildaufnahme ermöglicht (Abbildung 1C). Die Coverslip-Rotation ist erforderlich, um Zellen innerhalb von Paarungsaggregaten zu trennen und zu verteilen (Abbildung1F; Effizient, Abbildung 2B). Ohne diesen Schritt werden nur wenige Asci-, aber zahlreiche haploide Zellen beobachtet, weil Asci in unzugänglichen Schichten von Paarungsklumpen gefangen werden, während haploide Zellen frei sind, alle verfügbaren Monolayer-Spots zu bevölkern (Abbildung 2B). Selbst bei mitotischen Experimenten, bei denen zellverknöpft weniger problematisch ist, verschiebt die verdeckte Rotation Zellen um das Pad, um eine einzelne Zellschicht mit genügend Platz zwischen den Zellen zu schaffen, um Überdringungseffekte zu reduzieren und Zellduplizierung zu ermöglichen (Log, Abbildung 2A ).
Atb2 ist eine an der Chromosomensegregation bei Spalthefemitose und Meiose7,14beteiligte Komponente. Wenn diese Zytoskelettkomponente fluoreszierend markiert ist, können die Stadien untersucht werden, die die Kerntrennung bei Mitose charakterisieren. Während der Prophase (0'-20', Abbildung 3A) tritt die Keimbildung der mitotischen Spindel in der Kernseite der Spindelpolkörper (SPBs) auf, wie Atb2-mRFP-Fasern vor einem Pankern-Hintergrund von Htt1-GFP5 zeigen. Während des Metaphasen-Anaphasen-Übergangs (20'-40', Abbildung 3A) erstreckt sich die mitotische Spindel nach außen und der Kern spaltet sich in zwei Teile. Wenn die Zelle in die Telophase eintritt (60'-80', Abbildung 3A), dehnt sich Atb2-mRFP bidirektional aus, bis chromosomale Chromosomen vollständig getrennt sind. Danach gruppieren sich Atb2-mRFP-Fasern neu und breiten sich über die Zelloberfläche aus, um ihre Interphasenform in jeder der resultierenden Tochterzellen wiederzuerlangen. Zytokinese (>120', Abbildung 3A) tritt erst auf, nachdem sich ein Septum bildet und die Zelle durch Spaltung teilt. Die Veränderungen der Hht1-GFP-Intensität über einen mitotischen Zyklus zeigen drei wichtige Schritte in der Kerndynamik: Metaphasen-Anaphase (mittlere Intensität, DNA-Verdichtung: 20'-40', Abbildung 3A-B), Telophase (niedrige Intensität, DNA-Trennung: 60'-80', Abbildung 3A-B) und G1 (zunehmende Intensität, DNA-Duplikation: 100'-120', Abbildung 3A-B). In ähnlicher Weise, aber mit Zellen, die nur Hht1-mRFP tragen und mit dem Multi-Kymograph-Tool (siehe Schritt 5.15) in Fidschi, ist es möglich, die mitotische Teilung von Metaphase zu Telophase zu beobachten und die nuklearen Bewegungen zu bewerten, die während der richtigen Schwesterchromatid beteiligt sind Segregation (Normal, Abbildung 3C). Falschseigerische Kymographen zeigen Signalaktivität zwischen den beiden Hauptnuklearen Pfaden, was auf eine mögliche Fehlsegregation aufgrund von Chromosomenfragmentierung oder ungeeigneter Chromatidtrennung hindeutet (Lagging, Abbildung 3C).
Wie bereits erwähnt, wird Tos4 in Derbuden- und Spalthefe in G1 transkribiert und funktioniert während der DNA-Replikation in S Phase22,23. Dies kann in einem Kymographen beobachtet werden, bei dem die Tos4-GFP-Expression im Kern zunimmt, nachdem Sad1-DsRed 10-Brennpunkte sich in entgegengesetzte Richtungen bewegen (was auf die kerntechnische Teilung hinweist), aber vor den Septumformen, die der Zytokinese vorausgeht (39', Abbildung 3D ; 36', Abbildung 3E). Die Phase der hohen Tos4-GFP-Aktivität beginnt am Ende des M-G1/S-Übergangs (45', Abbildung 3E) und endet in G2 (>60', Abbildung 3E), direkt nach der Zellteilung. Während während G1 stark diffundiert, erhöht sich die Tos4-GFP-Signalintensität nach der Anaphase und während der gesamten S-Phase und lokalisiert mit getrennten Sad1-DsRed-Brennpunkten (45'-60', Abbildung 3E). Dieses Ergebnis zeigt die Septationszeit in Spalthefe, wenn die Genomduplizierung in Tochterzellen (G1/S) begonnen hat, aber zytokinese ist noch nicht aufgetreten.
Hht1 ist Histon H3 in Spalthefe und wird häufig mit fluoreszierenden Tags modifiziert, um Kern-DNA5,14zu visualisieren. Bei der Mitose werden zwei unterscheidbare Veränderungen der Kernmasse beobachtet, wenn Zellen von metaphase zu Telophase (20'-120', Abbildung 3A)übergehen. Die erste Änderung betrifft eine Kontraktion der kernkraftlichen Größe in der Metaphase (20', Abbildung 3A), während die zweite die Zellspaltewährend während der Anaphase zeigt (40', Abbildung 3A). Neben der gemeinsamen Nutzung dieser Veränderungen mit mitmitotischen Zellen weisen meiotische Zellen eine nukleare Oszillation (d. h. Pferdeschwanz) (-100' bis -50', Abbildung 4A-B) während der homologen Rekombination und weiteren Verringerung der Kerngröße am Ende der Anaphase II (70'-90', Abbildung 4A). Hht1-mRFP wird verwendet, um Misssegregations-Phänotypen wie verzögerte oder fragmentierte Chromosomen zu untersuchen (Lagging, Abbildung 3C). Es wird auch verwendet, um die nukleare Dynamik in jeder der Phasen der Meiose zu beobachten und zu beschreiben (Abbildung 4A-B). Die Kernmasse ist groß und schwankt während eines Großteils des Pferdeschwanzes in ihrer Größe (HT: -100' bis -50', Abbildung 4A-B)). Wenn Zellen in die Metaphase eintreten (MT: -40' bis 0', Abbildung 4A-B), nehmen die Kerngröße und die Schwingung ab, was mit der erhöhten Kondensationsaktivität in diesem Stadium übereinstimmt. Der Beginn der beiden Anaphase I (MI: 10'-60', Abbildung 4A-B) und II (MII: 70'-90', Abbildung 4A-B) ist mit einer weiteren nuklearen Reduktion und dem Mangel an kernatischer Bewegung verbunden, die gut mit den beiden kerntechnischen Abteilungen korreliert, die Meiose I und II (MI & MII). So ist Meiose mit nuklearen Größenschwankungen verbunden, wenn homologe Chromosomen nach zwei Runden Chromosomentrennung ausrichten und rekombinieren und mit nuklearen Größenreduktionen. Allele, die diese nukleare Dynamik verändern, sind wahrscheinlich mit der Genomstabilitätsregulation in meiosis12,13verbunden.
Rec8 ist die Untereinheit von meiotischem Kohesin in Spalthefe. Es wird nach der DNA-Replikation (mei-S) auf das Chromatin geladen und hält Schwesterchromatide bis an Anaphase II aneinander gebunden. Nach Metaphase I wird Rec8 durch Separase aus den Chromosomenarmen entfernt und am Zentromer durch Sgo1-PP2A geschützt. Am Ende der Homologensegregation wird Rec8 auch am Zentromer eliminiert, wodurch eine Schwesterchromatidtrennung ermöglicht wird (Abbildung 5A)6,24. Rec8-GFP zusammen mit Markern der Chromosomensegregation wie Sad1-DsRed oder Hht1-mRFP ermöglichen die Visualisierung der Kohäsionsdynamik während der Meiose. Rec8-GFP-Signal ist pan-nuklear während mei-S (<<-90', Abbildung 5A-B), Prophase I (-90' bis -50', Abbildung 5A-B), und Metaphase I (-40' bis 0', Abbildung 5A-B). Diese Beobachtung zeigt die Assoziation von Rec8-GFP entlang der Chromosomenachsen, die DNA-Duplikation folgt. Wenn Zellen in Anaphase I eintreten (10', Abbildung 5A-B), nimmt die Rec8-GFP-Intensität im gesamten Kern ab, bleibt aber stark am Zentromer, wo sie einen Schwerpunkt in jeder Kernmasse bildet (20'-70', Abbildung 5A-B). Dieses Ergebnis stimmt mit dem Rec8-GFP-Abbau entlang der Chromosomenarme überein, nicht aber am Zentromer, der sich nach homologer Segregation ergibt. Vor der Anaphase II verschwindet der Rec8-Fokus und befreit Schwesterchromatide für die Trennung in MII (70'-80', Abbildung 5A-B). Der Rec8-GFP-Marker ist daher nützlich, um Bedingungen zu untersuchen, die die Etablierung, Entfernung und allgemeine Stabilität des meiotischen Zusammenhalts stören. Gepaart mit einem Marker der nuklearen Teilung wie Hht1-mRFP5,13kann Rec8-GFP eingesetzt werden, um Fragen zu beantworten, wie sich Kohäsionszeitpunkt und Stabilität vor und während der Meiose auf die richtige Chromosomensegregation auswirken12 ,13. Dieses Protokoll befasst sich nicht mit Proteinen, deren Dynamik hauptsächlich im Zytosol auftritt. Tabelle I zeigt jedoch einige zytosolische Proteine, die häufig zur Untersuchung von Zytoskelett- und Membranprozessen verwendet werden, die unter anderem für Endozytose, Exozytose und Zytokinese notwendig sind.
Abbildung 1: Vorbereitung von Agarose-Pads für die Live-Zell-Bildgebung. (A) Diavorbereitungs-Setup mit Einem Pipettenspitzenhalter, Laborband und Mikroskopschlitten montiert. Wenn Sie Dias senkrecht zueinander platzieren, entsteht eine Tasche, in der sich das Agarose-Pad bildet. Durch das Hinzufügen von Laborbandstücken an den Seiten wird die Agarose-Pad-Breite an die geforderten Spezifikationen angepasst. (B) Geschmolzene Agarose wird abkühlen lassen, bevor sie auf Mikroskop-Dias gesetzt wird, um Pads zu machen. In diesem Schritt ist es notwendig, das Agarosevolumen langsam zu verteilen, um Luftblasen zu vermeiden. (C) Der obere Schlitten wird auf dem abgegebenen Agarose-Spot platziert, um ein kreisförmiges Pad mit einer geraden Oberfläche, geraden Kanten und keine sichtbaren AgaroseRisse zu bilden. (D) Nach dem Auflegen einer Probe der Zellsuspension auf dem Agarose-Pad, invertieren Und auf ein fusselfreies Papiertuch legen, um zusätzlicheflüssige Medium zu entfernen. (E) Legen Sie vorsichtig einen Coverslip auf das Agarose-Pad, stellen Sie sicher, keine Luftblasen zu fangen und überprüfen Sie, ob die Fokusebene flach ist, um Zellverschiebungen und Fokussierungsprobleme zu vermeiden. (F) Drehen Sie den Deckel im Uhrzeigersinn langsam, um Zellklumpen zu stören und eine Zellmonoschicht zu erzeugen, die eine Zellerweiterung und eine bessere Zellvisualisierung ermöglicht. (G,H) Verwenden Sie ein erhitztes Kohlenwasserstoffgemisch, um Agarose-Pads zu versiegeln und sie vor der Bildgebung auf die gewünschte Temperatur ausdemieren zu lassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswählen der richtigen Zellen. (A) Die oberen Paneele zeigen Spalthefezellen, die in EMM plus Ergänzungen für 72 h verhungern, und das untere Panel zeigt Zellen, die ein logarithmisches Wachstum durchlaufen. In Zellen, die verhungern müssen, können kleine Zellmorphologien geschätzt werden. Der rote offene Pfeil zeigt vakuolare Granulate, die für den Hunger charakteristisch sind. In logarithmischen Kulturen sind Zellen, die langgestreckte Morphologien und Septen (roter Pfeil) zeigen, im Überfluss vorhanden, was auf eine aktive Dynamik des Radfahrens hinweist. Die rechten Paneele zeigen Zellen, die Tos4-GFP- und Sad1-DsRed-Signale während des Hungers und der Proliferation exdrücken. Pannukleare Tos4-GFP-Expression und Sad1-DsRed-Signale, die sich zu entgegengesetzten Zellpolen lokalisieren, werden während der aktiven Proliferation gesehen, aber nicht im Hungertod. (B) Das obere Panel zeigt Zellen desselben Mate-Typs (h+), die nicht effizient gepaart werden können. Der rote offene Pfeil zeigt ein Paar vakuumare Zellen, die sich karyogamy unterziehen. Dies ist nicht ungewöhnlich in Kulturen von h+-Zellen, wo 10% der Zellen den Verknüpfungstyp auf h- umstellen können. Das untere Panel zeigt Asci, der aus einer effizienten Paarung resultiert. Zygotische Asci nehmen mehrere Formen an, einschließlich der Zick-Zack-Formen (roter Pfeil) und Bananenzellenformen (roter offener Pfeil). Skalenbalken = 5 m Länge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mitotische Kerndynamik. (A) Histon-H3-Proteine (Hht1-GFP) und Mikrotubuli (Atb2-mRFP) wurden während eines Mitose-Zyklus (120 min) verfolgt. Einzelne Signale für Hht1-GFP und Atb2-mRFP werden in Schwarzweiß-Panels dargestellt, während die BF-Merge sie in ihren jeweiligen Farben anzeigt. (B) Quantifizierung der Hht1-mGFP-Intensität über einen mitotischen Zyklus. Die Veränderung der Hht1-Werte deutet auf eine nukleare Teilung während der Mitose und DNA-Duplizierung in G1 hin. (C) Kymographen, die eine normale oder abnorme Segregation bei Derose zeigen, bei denen die resultierenden nuklearen Pfade entweder die DNA-Integrität verzweiten und beibehalten oder abweichen und die Chromosomenfragmentierung bzw. vorzeitige Chromatidtrennung fördern. (D,E) Kymographen und Mikrographen, die die Dauer von M-zu-G1/S zeigen, die durch die Segregation von Sad1-DsRed und das Auftreten von nuklearen Tos4-GFP-Signalen aufgedeckt wurden. Beachten Sie die mittleren Paneele in E, die mit der FIRE LUT in Fidschi erzeugt wurden, um eine intensitätsgraduale Wärmekarte zu erstellen, die die Identifizierung von Flecken mit hohem Tos4-GFP-Ausdruck erleichtert; in diesem Fall, lokalisiert auf den Kern und überlappende Sad1-DsRed Signale, wie erwartet. Skalenbalken = 5 m Länge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Meiotische Kerndynamik. (A) Panel-Serie zeigt Bewegung, Verdichtung und Teilung des Kerns (Hht1-mRFP) während der Meiose. Horsetailing (HT) zeigt ausgedehnte nebeneinander-nukleare Schwingungen, gefolgt von Metaphase (MT), wo die nukleare Seitenbewegung abnimmt und direkt vor anaphase I vollständig zum Stillstand kommt. In meiose I (MI) teilt sich die Kernmasse in zwei, während in meiose II (MII) vier Kerne während des Prozesses der Schwesterchromatid-Trennung erzeugt werden. (B) Quantifizierung der Veränderung des kerntechnischen Gebiets (Hht1-mRFP) in Prophase, Metaphase, MI & MII. Kernfläche ist dynamisch während HT-Oszillationen, wird in MT kondensiert, und weitere Abnahme der Größe während MI & MII, wo wenig nukleare Bewegung beobachtet wird (Lange Kernachse). Die Messung der längsten Kernachse (Lange Kernachse) basiert auf der Idee, dass ein Kreis, der sich ausdehnt, aufhört, einen konstanten Durchmesser zu haben und mindestens zwei Hauptachsen erzeugt: lange und kurze. Bei der Überwachung von Veränderungen im Kern liefern Veränderungen in der langen oder kurzen Achse also Hinweise auf die nukleare Bewegung. Skalenbalken = 5 m Länge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Meiotische Kohesindynamik. (A) Panel-Serie zeigt, wie Rec8-GFP Signaländerung mit meiotischer Kerndynamik korreliert. Während HT und MT ist das Rec8-GFP-Signal pannuklear und folgt der nuklearen Bewegung (Hht1-mFRP). Bei MI löst sich Rec8-GFP aus dem Kern und hinterlässt nur ein Paar Brennpunkte, was mit der Entfernung von Rec8 aus chromosomischen Armen und der Etablierung des Sgo1-PP2A-Schutzes am Zentromer übereinstimmt. Als sich die Zelle MII nähert, beginnen Rec8-GFP-Brennpunkte zu verschwinden und werden nicht mehr direkt vor der Anaphase II gesehen. (B) Quantifizierung der Rec8-GFP-Intensität von HT zu MII. Ähnlich wie in Agesehen, GFP-Signal ist hoch durch HT und MT, deutlich während MI abnimmt und vollständig in MII verschwinden. Dieses Muster bestätigt die Kohesindynamik an Chromosomenarmen und dem Zentromer, wo es Schwesterchromatide gebunden hält, bis sie in MII getrennt werden können. Skalenbalken = 5 m Länge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| protein | funktion | Kommentare | Etikett | Verweise | ||
| Hht1 | Histon H3 an DNA-Verpackungbeteiligt | Wird zur Untersuchung der Chromosomendynamik verwendet | Hht1-mRFP | 5,14 | ||
| Tos4 | Tos4-Funktion tritt während der G1-Phase auf | Eingesetzt zum Studium des G1-Timings | Tos4-GFP | 22,23 | ||
| Rad21/ Rec8 | Cohesin-Untereinheiten, die nach der Replikation Schwesterchromatiden zusammenhalten | Wird zur Analyse der Kohäsionsstabilität während der Mitotik (Rad21) und der meiotischen Segregation (Rec8) verwendet | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 6,24 | ||
| Rad11 | Die RPA-Aktivität tritt während der mitotischen DNA-Reparatur, der meiotischen Rekombination auf und endet in | Verwendet, um DNA-Reparatur bei Mitose und Rekombinationsdynamik bei Meiose zu studieren | Rad11-YFP | 5,13 | ||
| Rad52 | Rad52-Acivity erfolgt während der mitotischen DNA-Reparatur und meiotischen Rekombination | Verwendet, um DNA-Reparatur bei Mitose und Rekombinationsdynamik bei Meiose zu studieren | Rad52-CFP | 5,13 | ||
| Cnp1 | Histone H3 CENP-A lokalisiert speziell am Zentromer | Wird verwendet, um der Chromosomensegregationsdynamik bei Mitose und Meiose zu folgen | Cnp1-mCherry | 13 | ||
| Swi6 | HP1-Homologprotein an Heterochromatin-Bildung beteiligt | Einsatz zur Untersuchung der Heterochromatin-Mobilisierung an den Zentromeren und Telomere | Swi6-GFP | 13 | ||
| Sad1 | Sad1 ist an der Lokalisierung des Spindelpolkörpers an der Kernhülle beteiligt | Einsatz zur Analyse der Chromosomensegregation bei Mitose und Meiose | Sad1-mCherry | 10 | ||
| CYTOSOL & MEMBRANE | ||||||
| Atb2 | Tubulin alpha 2 an der Organisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts beteiligt | Wird zur Untersuchung der Chromosomensegregation bei Mitose und Meiose verwendet | Atb2-mRFP | 7,14 | ||
| Ync13 | Exozytose und Endozytose Regulator in vesikelvermittelten Transport beteiligt | Verwendet, um die Zellwandintegrität während der Zytokinese zu untersuchen | Ync13-mECitrine | 25 | ||
| Rlc1 | Untereinheit Myosin II, die an kontraktiler Ringkontraktion beteiligt ist | Wird verwendet, um die Dynamik der Septumreifung und Kontraktion zu erforschen | RIc1-mCherry | 25 | ||
| Ccr1 | NADPH-Cytochrom p450-Reduktase, die Teil der ER-, Plasma- und mitochrondrialen Außenmembran ist | Wird zur Untersuchung membranassoziierter Dynamiken wie Endozytose, Exozytose und Zytokinese eingesetzt | Ccr1N-GFP | 5 | ||
| Gef1 | Rhoguanyl-Nukleotid-Austauschfaktor, der an der Etablierung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität beteiligt ist | Wird verwendet, um die globale, mikrotubulieabhängige Zellpolaritätsdynamik zu untersuchen | Gef1-mCherry-GBP | 26 | ||
| Fus1 | Formin beteiligt an Actin-Fusion-Fokus-Montage während der Zytogamie | Wird verwendet, um Fusionsdynamik im Zusammenhang mit Spalthefe-Paarung zu studieren | Fus1-sfGFP | 27 | ||
| Mnn9 | Mannolsyltransferase-Untereinheit, die an der Protein-N-verknüpften Glykosylierung im Golgi-Apparat beteiligt ist | Eingesetzt, um die Ladungsreifung in der Golgi zu studieren, während sie von cis-Golgi zu trans-Golgi schreitet | Mnn9-mCherry | 28 | ||
| Num1 | Kortikaler Verankerungsfaktor für Dynein, der an der Pferdeschwanzierung beteiligt ist | Wird zur Untersuchung von Mitochondrien-abhängigem Dynein bei der Kernschwingung in der meiotischen Prophase I | Num1-yEGFP | 29 | ||
Tabelle 1: Marker der nuklearen und zytosolischen Dynamik.
Film 1: M-zu-G1/S-Übergang mit Spindelpolkörper (SPB; Sad1-DsRed) Trennung vor der Septation und Akkumulation des Tos4-GFP-Kernsignals. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Film 2: Abschluss des mitotischen Zyklus, der die Mitobule-Erweiterung (Atb2-mRFP) zeigt, die mit der Kernabteilung (Hht1-GFP) korreliert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Discussion
Die Live-Zell-Bildgebung während der Mitose und Meiose bietet die Möglichkeit, die Kerndynamik zu untersuchen, ohne die Spalthefephysiologie während der Datenerfassung wesentlich zu stören. Es ist jedoch Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die Zellen zu den gewünschten Dichten ohne Umweltbelastungen heranwachsen; und für die Meiose, dass die Zellen während der Zeit der terminalen Differenzierung abgebildet werden und nicht zu früh oder spät. Überschüssige zelluläre Smenge, Hunger und unangemessene Wachstumstemperaturen sind häufige Faktoren, die zu unproduzierbaren Beobachtungen beitragen. Darüber hinaus ist es während der Dehnungskonstruktion entscheidend zu testen, dass fluoreszierende Tags die Funktionen von Zielgenen nicht beeinträchtigen und sich nicht auf die allgemeine Zellfitness auswirken. Wenn die Phänotypen von Stämmen, die fluoreszierende Marker tragen, nicht genau untersucht werden, kann dies zu inkonsistenten und unvergleichlichen Ergebnissen über ähnliche Genotypen führen.
Obwohl Mikroskop-Agarose-Pads einfach zu montieren sind, können sie auch eine Hürde darstellen, um wertvolle Bilddaten zu erhalten. Das Erstellen von Agarose-Pads ist so einfach wie das Parallelen von drei Mikroskopdias parallel zueinander, das Dosieren von geschmolzener Agarose auf dem mittleren Dia und das Platzieren eines Dias, das die Oberseite der anderen Dias transquert. Es ist jedoch sinnvoll, ein Schiebegerät zu montieren, das Breitenmodifikationen zur Herstellung widerstandsfähiger, situationsspezifischer Agarose-Pads ermöglicht. Ein einfacher Schieber, der Flexibilität bei der Padbreite bietet, besteht aus einer Plattform (Pipette-Spitzenhalter oder der Bank), zwei Mikroskopschlitten und Laborband, das als Pad-Breiten-Einstellmechanismus fungiert (Abbildung 1A). Die genaue Pad-Dicke hängt von den Anforderungen an die Bildzeit, der Agarose-Marke, der Temperatur, dem Abdeckschversiegelungsmittel, der Verdunstungsrate usw. ab. Daher ist es wichtig, das Bildgebungssystem vor der Datenerfassung zu kalibrieren, um die technische Reproduzierbarkeit zu erhöhen und die Qualität der Live-Zell-Bildgebung1,2,3zu verbessern. Pad-Oberfläche, Steifigkeit und Zusammensetzung sind bei längerer Bildaufnahme unerlässlich. Agarose hat eine geringe Hintergrundfluoreszenz, kann leicht geformt werden und hält bei entsprechender Konzentration strukturellen Verformungen durch Verdunstung stand. Darüber hinaus beeinträchtigt die Kombination von Spalthefemedien mit Agarose nicht die Bildqualität und ermöglicht eine erweiterte Beobachtung mehrerer Milben und Meiosezyklen. Außerdem ist es wichtig, Luftblasen für die Zeitraffermikroskopie zu vermeiden. Innerhalb der Agarose-Pads und innerhalb der Probe dehnen sich die Lufttaschen im Laufe der Zeit aus, was zu Zellverschiebungen und störenden Brennebenen führt. Sofern Zellen effizient durch deckungsfeste Rotation verteilt werden, können Forscher mitotische Prozesse über mehrere Generationen hinweg und meiotische Ereignisse von der Kernfusion bis zur Sporulation verfolgen. Die Herstellung und Auswahl des richtigen Pads für bildgebende Experimente braucht Zeit, um zu meistern, kann aber, sobald es erreicht ist, zu hochinformativen Mikroskopbeobachtungen beitragen.
Wie bei anderen Methoden ist die Live-Zell-Mikroskopie nicht frei von technischen Einschränkungen. Die Verwendung von fluoreszierend markierten Proteinen führt Grenzen für Experimente ein, die den Umfang dessen einschränken, was untersucht werden kann. Fotobleichungen und Fototoxizität sind typische Probleme der längeren Bildaufnahme. Sie können entgegenwirken, indem Zellen zu lange oder zu häufig kurzen Wellenlängen aussetzen. Für Experimente mit GFP, GFP, YFP, mRFP und DsRed, typischen fluoreszierenden Proteinen, die in der Spalthefe-Livezell-Bildgebung verwendet werden, ist es üblich, 5-15% Anregungslicht und 100-500 ms Expositionszeit für Routineexperimente einzusetzen. Diese Parameter ändern sich jedoch entsprechend den spezifischen Versuchsanforderungen des Forschers. Darüber hinaus reichen Z-Stacks, die aus 9-13 Abschnitten mit einem Abstand von 0,5 m mit einem 60-fachen Objektiv bestehen, aus, um die Dicke einer Spalthefezelle aufzulösen. Darüber hinaus ist es wichtig zu bestätigen, dass Fluoreszenzmarker die ordnungsgemäße Regulierung oder Funktion von Zielproteinen nicht stören oder falsche Phänotypen erzeugen. Daher ist es ratsam, Stämme zu konstruieren, die verschiedene Fluoreszenz- und Affinitäts-Tags für dasselbe Zielgen enthalten, um Beobachtungen mit unterschiedlichen Mitteln zu bestätigen. Darüber hinaus liegt es in der Verantwortung der Forscher, dafür zu sorgen, dass experimentelle Parameter experimentell reproduziert werden können und dass die gesammelten Daten für die nachgelagerte Analyse1,3geeignet sind. Keine Technologie kann die bewährte Praxis der sorgfältigen Validierung experimenteller Systeme durch eine sorgfältige Beobachtung und strenge Untersuchung der Linearität bei der Erkennung von Fluoreszenzsignalen ersetzen.
Schließlich ist es wichtig, Mikroskopiedaten in Formaten zu analysieren, die keine Rohbilder ändern. Fidschi bietet ausgezeichnete Dokumentationstools, um Rohdatenmessungen nachzuverfolgen, und ermöglicht es Forschern, verschiedene Zellparameter in einer einzigen Sitzung zu untersuchen. Diese Funktionen, sowie seine Fülle an Online-Tutorials und umfangreiche Literaturberichterstattung, machen Fidschi zu einem wichtigen Werkzeug für die Messung, Analyse und Präsentation von Live-Zell-Bildgebungsdaten, die die nukleare Dynamik von Spalthefe in Mitose und Meiose beschreiben.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Natalia La Fourcade und Mon LaFerte dafür, dass sie die Erstellung dieses Manuskripts zu einem unterhaltsameren Unterfangen gemacht haben. Vielen Dank an die Mitglieder des Forsburg Lab, die mit ihrer Einsicht, Experimentierideen und moralischer Unterstützung zum Abschluss dieser Arbeit beigetragen haben. Dieses Projekt wurde von NIGMS R35 GM118109 bis SLF unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
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