Summary
ここでは、有分裂・マイオシス時の生きた核分裂酵母細胞におけるタンパク質挙動や核ダイナミクスを研究者が研究できる非毒性顕微鏡法である生細胞イメージングを紹介する。
Abstract
生細胞イメージングは、生細胞の細胞とタンパク質のダイナミクスを調べるために使用される顕微鏡検査技術です。このイメージング方法は毒性ではなく、一般に細胞生理学を妨げない、最小限の実験的処理を必要とする。技術的干渉のレベルが低いことから、研究者は複数のサイクルにわたる細胞の研究を行い、最初から最後までマイオシスを観察できます。グリーン蛍光タンパク質(GFP)や赤色蛍光タンパク質(RFP)などの蛍光タグを使用して、転写、DNA複製、凝着、分離などのプロセスに重要な機能を持つさまざまな因子を分析できます。フィジー(無料で最適化されたImageJバージョン)を使用したデータ解析と相まって、生細胞イメージングはタンパク質の動き、局在、安定性、タイミング、核ダイナミクス、染色体分離を評価するさまざまな方法を提供します。しかし、他の顕微鏡法と同様に、ライブセルイメージングは光の本質的な特性によって制限され、高倍率での分解能に限界があり、高波長での光漂白や光毒性にも敏感です。周波数。しかし、いくつかの注意を払って、研究者は、有線およびメオティックイベントの適切な視覚化を可能にするために、適切な条件、株、蛍光マーカーを慎重に選択することによって、これらの物理的な制限をバイパスすることができます。
Introduction
生細胞顕微鏡検査は、研究者が核のダイナミクスを核のダイナミクスを死滅させることなく調べ、致死的な固定剤や汚れの必要性を排除することを可能にします。膜や細胞骨格に加えて、染色体複製、組み換え、分離などの重要な事象に関与する蛍光タグ付きタンパク質の安定性、動き、局在、タイミングを観察することが可能です。動き。細胞の生存率と非毒性信号検出を維持することにより、生理的侵入を最小限に抑えます。適切に実行すると、この顕微鏡法は、拡張された技術的な取り扱いまたは偽の化学反応性から生じる交絡効果を低減することができます。さらに、実験中に、研究者は、不適切なイメージングパラメータや異常な細胞生理学を示す核分裂酵母の栄養とストレス状態、増殖効率、およびアポトーシス状態の適切な観察を行うことができます1 、2、3.
ミトシスとマイオシスは、核と細胞の分裂によって特徴付けされます。マイオシスでは、有人化とは対照的に、親細胞が娘細胞を生み出すにつれて遺伝的含有量が半減する4.生細胞イメージングは空間的な関係に加えて時間次元を提供するため、多数の細胞をリアルタイムで調べることができます。生細胞顕微鏡検査により、研究者はヒストン5、コヘシンサブユニット6、微小管7、セントロメレス8、キネトコレ9、成分の蛍光タグを用いて核分裂のダイナミクスを調べることを可能にした。スピンドルポール本体(SPB)10、及び染色体旅客複合体(CPC)11のもの。染色体分離装置の外では、生細胞イメージングは必要なタンパク質の挙動も捕捉しているが、染色体分離には直接関与していない。これらのタンパク質の機能は、複製、染色体の組み換え、核運動、および微小管12、13、14への染色体の付着に影響を与えることが示されている。これらの観察は、機能成分が生化学的または遺伝的検査に適していない細胞事象のより良い理解に貢献している。顕微鏡検査技術の新たな進歩により、分解能の低下、光漂白、光毒性、焦点安定性などの限界が軽減され、微量およびメオティック核ダイナミクス1のより良いリアルタイム観測が容易になります。 2,3.Meiosisは、タイミングに細心の注意を払う必要がある末端分化経路であるため、特に困難です。
このプロトコルの目的は、人芽分離とマイオシスにおけるリアルタイム核分裂酵母核ダイナミクスを調べるための比較的簡単な方法を提示することです。そのためには、環境ストレスにさらされていない細胞を使用し、長時間のイメージングに耐えうるアガロースパッドを用意し、単一細胞ダイナミクスの可視化を容易にする密度で細胞を取り付ける必要があります。さらに、このプロトコルは、核動態(Hht1-mRFPまたはHht1-GFP)、染色体分離(Sad1-DsRed)、細胞骨格ダイナミクス(Atb2-mRFP)、転写物の有用なマーカーとして有用なマーカーとして機能する蛍光タグ付きタンパク質を運ぶ細胞を利用しています。G1/S(Tos4-GFP)の活性化、およびmeiosis(Rec8-GFP)における凝着安定性。この方法はまた、特定の細胞プロセスに関する質問に対処するために異なる組み合わせで使用することができる追加の核マーカーおよびサイトソーリックマーカー(表I)を導入する。さらに、研究者が生細胞画像を処理し、さまざまな種類のデータを分析するのに役立つ基本的なフィジーツールが紹介されています。このアプローチの強さは、タンパク質ダイナミクス、タイミング、安定性のリアルタイム観察を使用して、人芽生およびマイオシスの適切な実行に不可欠なプロセスを記述することに由来します。
Protocol
1. メディア準備15,16
- ストックソリューション
- 蒸留水1Lを含むボトルにMgCl2・6H20、CaCl2・00gの0.735g、KClの52.5g、Na2 S04の2gを添加して50倍塩ストック溶液を調出する。溶液を十分に混ぜ、濾過して殺菌します。長期保存のため、4°Cに置きます。
- パントテイン酸1g、ニコチン酸10g、イノシトール10g、蒸留水1Lを含むボトルにビオチン10mgを混合して、1,000倍のビタミンストック溶液を作ります。溶液をよく混ぜ、濾過で殺菌します。長期保存のため、4°Cに保管してください。
- 10,000倍のミネラルストック液を5gのホウ酸、4gのMnSO 4g、ZnSO4~7H2 Oの4g、FeCl 2~6H2Oの2g、KIの1g、モリブジン酸0.4g、CuSO×45H20を加えて調剤する。、1Lの蒸留水を含むボトル中に10gのクエン酸を含む。溶液を十分に混ぜ、濾過して殺菌します。長期保存のため、4°Cに置きます。
- アデニン、ロイシン、ヒスチジンまたはリジンの7.5gを蒸留水の1Lを含むボトルに加えることによって、個々の栄養ストック溶液を作ります。ウラシル溶液を作るために3.75 gだけを使用してください。オートクレーブによる溶液の滅菌。
注:時間が経つにつれて、ウラシルは溶液から沈殿します。溶液に再び持ち込むには、電子レンジで60%の電力で10s刻みまたは55°Cの水浴場に20分間入れ、すべてのウラシル塊が消えるまで温かい溶液を旋回します。
- 酵母エキスプラスサプリメント(はい)
- 2Lフラスコに、蒸留水1L、酵母エキス塩基5g、グルコース30g、アデニン、ウラシル、L-ヒスチジン、L-ロイシン、およびL-リジンをそれぞれ225mg加える。固形媒体を作るために寒天の20グラムを追加します。
- 材料を溶液に完全に溶解するには、磁気攪拌バーを使用してください。寒天は、培地がオートクレーブによって殺菌された後に溶融する。
注:便宜上、すぐに使用できるYES粉末も市販されています。
- エディンバラ最小媒体(EMM)およびポンベグルタミン酸媒体(PMG)
- 2Lフラスコで、蒸留水1Lとフタル酸カリウム3g、Na2 HPO4の2.2g、NH4 Clの5g、ブドウ糖20g、塩ストック溶液20mL、ビタミンストック溶液1mLを組み合わせる。、および鉱物ストック溶液の0.1 mL。NH4Clを 2.2 g の L-グルタミン酸ナトリウム塩に置き換えて PMG を調製します。固形培地を作るために、寒天の20グラムを追加します。
- 磁気攪拌バーを使用して、成分を十分に溶解させます。寒天は、培地がオートクレーブによって殺菌された後に溶融する。使用する前に、必要に応じて栄養ストック溶液を追加します。培地の1Lごとに、アデニン、ロイシン、ヒスチジン、リジンのそれぞれ15 mLを加えます。それは他の栄養溶液よりも濃縮が少ないため、ウラシルのために30 mLを使用してください。
注:便宜上、すぐに使用できるEMMおよびPMG粉末も市販されている。
- 麦芽エキス(ME)
- 2 L フラスコを使用して、蒸留水 1 L と 30 g の麦芽抽出物と 225 mg の各アデニン、ウラシル、ヒスチジン、およびロイシンを混合します。pH を 5.5 に調整します。固形培地を作るために寒天の20グラムを含めます。
- 磁気攪拌バーを使用して溶液に成分を溶解します。寒天は、培地がオートクレーブによって殺菌された後に溶融する。
- サプリメント付き胞子寒天 (SPAS)
- 2Lフラスコに、蒸留水1L、グルコース10g、KH2 PO4の1g、ビタミンストック1mL、アデニン、ウラシル、ヒスチジン、ロイシン、塩酸リジンをそれぞれ加える。固形媒体を作るために寒天の20グラムを追加します。
- 材料を十分に組み合わせるには、磁気攪拌バーを使用してください。寒天は、培地がオートクレーブによって殺菌された後に溶融する。
2. 核分裂酵母培養15,16
- YES固体培地を使用して、極低温保存から核分裂酵母株を目覚めさせる。各株の温度要件に応じて、3〜5日間25°Cまたは32°Cのいずれかでインキュベートします。
- コロニーが見える場合は、スターター液体培養物を準備します。個々のコロニーから細胞を選び、3 mL YES液体培地を含む試験管に接種します。適切な温度で、ログの中間フェーズまたは後期の段階に成長します。
注:適切な通気のために、意図した液体培養体積より少なくとも5倍大きい容積を持つ管またはフラスコを使用する。150-220 rpm間の揺れ速度は、日常的な文化の成長のための慣習である。 - スターター培養の250-500 μLを、YES、EMMまたはPMGのいずれかの9.5-9.75 mLを含む50 mLフラスコに分配し、適切なサプリメントを加えます。細胞が所望の密度に成長し、適切な細胞形態と栄養状態を顕微鏡下で確認できるようにします。
注:目覚めた菌株を最大1ヶ月間保存するには、YESプレートをパラフィンテープでシールし、4°Cに置きます。
3. サンプル調製2
- 顕微鏡スライドのセットアップ
- 最小培地プラスサプリメント(有芽症)または液体SPAS(マイオシス)のいずれかの100 mLを含む500 mLビーカーに2gアガロースを追加します。アガロース溶液を電子レンジで60%の電力で10分ずつ温めるか、55°Cの水風呂に10分間入れ、溶液を10分間旋回して、効率的な溶融を確保します。アガローススライド作りセットアップ(図1A)を準備し、迅速なパッドの準備を確保し、溶融アガロースが早期に固化するのを防ぎます。
- 溶融アガロースを室温で1分間冷却し、広い穴のピペットの先端を使用して顕微鏡スライドに50-100 μLの斑点を分配します。アガロースが冷却する前に、顕微鏡スライドを上部に置き、直径約1.5〜2cmのスプレッドパッドを生成します(図1B-C)。アガロースパッドの幅は、典型的には、撮像時間の長さに比例する。言い換えれば、より厚いパッドは、より長いイメージング期間に耐えます。
- 炭化水素混合物をシーラントとして使用して、厚いアガロースパッドを備えたスライドの適切なカバレッジを確保し、カバースリップエッジでの溶媒暴露による細胞死を防ぎます。500 mLビーカーに石油ゼリー、ラノリン、パラフィンの等しい部分(w/w)を混ぜます。120°Cで5分間熱くする。成分が溶けるように、適切な混合を確保するために、慎重に溶融溶液を旋回します。
- サンプル設定
- 水動事象の検査のために、液体EMMまたはPMGのスターター培養物から約中間対数相(0.4のOD595)に細胞を成長させる。1分間1,375 x gの細胞懸濁液の遠心分離機1 mLを、上清を除去し、最小培地にセルペレットを再懸濁し、100 μLの最終容積に補足する。
- マイオティックイベントを画像化するには、最小培地でスターター培養物からサプリメントを後期ログ相(0.7~1.0のOD595)に成長させます。1 mL セル懸濁液に対等の合致型セル (h-および h+) を組み合わせます。遠心分離球を1分間1,375xgで、液体ME中でペレットを再ステーペンズする。 効率的な栄養素の除去を確保するために、このステップを3回繰り返します。
- 最後のME洗浄後、MEの1mLで細胞を再中断し、9 mL MEを含む50 mLフラスコに添加する。最低回転速度(50-100 RPM)で22-25 °Cで12-16 hのインキュベート。豊富な細胞凝集は、多くの丸い核分裂酵母の塊を生じ、効率的な交配を示す。
- 交配培養と遠心分離機の1mLサンプルを1分間1,375 x gで取り出し、上清を取り除くが、チューブ内に250μLを残して細胞を再中断する。アガロースパッドに細胞を置く前に、5秒間激しく渦を起用して塊を破壊する。
注:細胞の再中断に使用される残りの250 μL MEには、細胞がマイオシスに入るのを助ける交配因子が含まれています。 - 2%のアガロースパッドに、20μLの水痘またはメオティック細胞懸濁液を置きます。スライドを反転し、糸くずのないペーパータオルの上に2-3 s(図1D)を貼って余分な媒体を取り除きます。スライドパッド側を上にセットし、ガラスカバースリップを静かに配置し、気泡が発生しないようにします(図1F)。
注:ペーパータオルで余分な媒体を排除することは、重力吸収よりも時間効率が良く、これはマイオシス実験で特に重要です。 - セル単層を作成するには、人差し指でカバースリップを 1 回 (ミトシス) または 2 (meiosis) フルターン (図 1F)で時計回りに回転させます。細胞物質がアガロースパッド全体に分散していることを確認し、単一の細胞またはアシのより良い分離を可能にします。小さな木製の棒の助けを借りて、カバースリップの端に沿って溶融シーラントを分配し、各アガロースパッドを密封する(図1G)。
- アガロースパッドが密閉されたら、顕微鏡の段階に置き、適切なイメージング条件(例えば、温度)で10〜15分間平衡化し、気泡が消散し、最後の分のアガロースシフトが起こるようにします。スライドが効率的に平衡化され、データ収集が終了するまでステージから削除しないイメージングを開始します。
注:温度および湿度の制御は採用される顕微鏡システムおよび特定の実験条件によって決定される。存在する場合は、すべてのイメージング実験に温度と湿度制御を適用します。不在の場合、研究者は、特にマイオシス実験中に温度変動を防止する方法を考案する必要があります。
4. ライブセルイメージング2と処理
- 40倍の目的を使用して、画像に対する適切な視野を見つけます。データ取得を開始するには、60倍の目標に切り替えます。使用する顕微鏡システムに応じて、各時点でサンプルにその後の再焦点と断面が手動で、または顕微鏡またはソフトウェア自動化されたプロセスを介して行われます。
注:このプロトコルで提示された画像は、セダット、RFPおよびGFPフィルターセット、ナノモーションステージ、60x NA 1.4対物レンズ、および12ビットCCDカメラを搭載した逆畳み、蛍光顕微鏡を使用して収集されました。作り付けの機械シャッターおよびモーターを備え付けされたフィルター車輪はサンプルの減らされた興奮の露出および光漂白を可能にした。 - 適切なソフトウェアを使用して画像を取得および処理します。画像をデコンボルブするには、メーカーが提供する光転送機能を採用します。
注:このプロトコルで使用される顕微鏡装置およびソフトウェアの詳細については、材料の表を参照してください。 - 従来の蛍光顕微鏡を使用して生細胞画像を取得するには、顕微鏡がデータをデジタル的に収集し、1.2より大きい数値絞り(NA)で40倍または60倍の目的を持ち、光学断面を行うことができることを保証します。
注:これらの要件がなければ、画像は解像度の低下を示し、顕微鏡測定と定性的な観察の品質を損ないます。 - 無料のプラグインプログラム(例えば、フィジー)を使用して、画像取得時のコントラスト損失に起因する系統的なぼかしエラーを最小限に抑え、適切な定量分析を行います。蛍光強度および細胞内の他の時間的および動的事象の。
注:その他の商用逆畳み込みプログラムは、材料の表に示されています。 - 観察下の蛍煙に最も合った顕微鏡フィルターセットを選択します。励起および放出フィルターが蛍光タンパク質の特定の検出を可能にする右のバンドパスを持っていることを確認してください。例えば、CFP信号を検出するためには、430/25および470/30の励起および発光バンドパスが適切であるが、RFP蛍光には適していない。
- 複数の時点で核分裂酵母をイメージングする場合は、最小限の有効設定アプローチ(MESA)を使用します。言い換えれば、励起波長の長時間の使用を避け、許容可能でありながら定量化可能で再現可能なイメージングデータを生成する最も低い励起力と露光時間を採用します。
- 人芽切りまたはマイオシス中の長時間のイメージングの場合は、取得時間ポイント間の間隔を 5 ~ 10 分に制限します。2%のアガロースパッドは12~16時間のイメージングセッションに耐えることができますが、アガロース蒸発による細胞シフトが起こりそうです。したがって、4-6 hまたは8-10 hウィンドウで完全な人芽症またはマイオシス実験をそれぞれ行います。
- 少なくとも24~48時間の集録時間ポイントからなる4~8時間のイメージングデータを収集し、それぞれ1つの蛍光タンパク質、および60倍の目的を使用して0.5-μm間隔を持つ13のセクションで構成される13のセクションと蛍光チャネルごとにZスタックを収集します。これには、少なくとも 0.5 ~ 1 GB のハード ドライブストレージ領域が必要です。したがって、光漂白とセルシフトを排除することに加えて、コンピューティング機能1、2、3を考慮するワークフローを作成します。
注:これらの取得パラメータは、通常、顕微鏡機能を制御し、画像を収集し、処理するソフトウェアで設定および変更されます。 - 特定の核プロセスをより詳細に調べるには、頻繁な暴露後に放出が大幅に減少しない限り、5~10sごとに画像取得を行う。異なる期間にわたって予備的な蛍光強度分析を行い、収集されたデータの精度がもはや信頼できない点を決定する1,3.
- 画像集録および画像処理ソフトウェアでは、画像Zスタック上の最大強度投影を使用して、垂直位置1、2に関係なく、2D平面上の高い蛍光密度を持つすべての構造を観察します。 3.これは異なったボクセルで起こる核プロセスの急速な調査を促進する。中間焦点の明視野画像を収集して、観察対象のセルの参照画像を生成します。
5. 画像解析20,21
注:このプロトコルの画像解析は、フィジーを使用して行われます。その他の分析プログラムおよびフィジー プラグインについては、「材料の表」を参照してください。
- プラグインメニューの下にある[バイオフォーマットインポーダー]機能を選択して、デコンボルブ画像をアップロードします。[インポートオプション]ポップアップウィンドウで、[ハイパースタック]、[デフォルトカラーモード]を選択し、[OK]ボタンを押す前に自動スケールをオンにします。
- 下部の各バーを横にスクロールして、表示されたウィンドウに正しい蛍光チャンネルと時間枠があることを確認します。データを圧縮せず、情報の損失を防ぐ Tiff ファイルとして保存します。
- 顕微鏡ソフトウェアによるデータ処理中に生成されたスケールバーを含む画像を開きます。[直線]ツールを使用して縮尺バーのピクセル長を決定し、類似したサイズの平行線を描画し、[分析]メニューから[測定]を選択します。[分析] メニューから [スケールを設定] を選択して、イメージのピクセルと μm の比率を設定して、スケール バーを追加します。
- [スケールの設定] ポップアップ ウィンドウで、計算された距離 (ピクセル単位)と既知の距離をμm で入力し、[ピクセル縦横比]を 1.0 に設定し、ミクロンを長さの単位として設定し、 をクリックする前に[グローバル]チェック ボックスをオンにします。[OK]ボタンをクリックします。
- [測定の設定] メニューの [測定]オプションを使用して、[測定]を選択するときに定量化するさまざまなパラメータを選択します。このプロトコルの目的で、次のメトリックを選択します:面積、周長、平均グレー値、中央値、最小と最大グレーの値、統合密度、スタック位置、および表示ラベル.
- 収集したデータの精度に応じて、[小数点以下の桁数] オプションに 1 を超える値を入力し、必要に応じて[科学的表記]ボックスをオンにします。メジャーコマンドを適用すると、[結果]ポップアップ ウィンドウに、関連する各パラメーターの値が表示されます。統計プログラムで将来の分析のために結果を .csv ファイルとして保存します。
注:長さを決定するために画像を構成する蛍光チャネルに分離する必要はありません。 - 信号干渉の場合は、[画像]メニューから[カラーとチャンネル]ツールを選択し、各色を個別に分析します。非線形構造の長さを測定するには、ライン ツールを右クリックし、[セグメント線]または [フリーハンド ライン] オプションを使用して目的のオブジェクトをトレースします。
- 線形構造または 2 点間の距離を決定するには、[直線]フィーチャーを使用し、[分析]メニューから[測定]を選択します。μm の長さの値は、[測定値の設定] オプションで以前に選択したパラメータに自動的に追加されます。
- 信号サイズと蛍光強度の変化を測定するには、まず、定量精度を高め、画像スタック全体で迅速な測定を容易にする目的領域(ROI)ライブラリを作成します。[イメージ] メニューで [色とチャンネル] ツールを選択します。
- [チャンネル]ポップアップ ウィンドウで、強度または面積を測定するカラー チャンネルを確認します。[イメージ]メニューの下で[調整]機能としきい値機能を選択します。[暗い背景]チェック ボックスをオンにし、[既定の方法] を選択し (収集されたデータで特に必要な場合を除く)、[赤]を選択して対象の信号をオーバーレイします。
注:タンパク質の安定性、動き、局在の測定は、ROIライブラリの作成に使用される色閾値に大依存します。可視化される蛍光マーカー信号の種類に対して正しい閾値法を選択することが重要である17,18. - Wand ツールを使用して、対象の各構造を強調表示し、キーボードの文字Tキーを押して、選択した ROI をポップアップROI マネージャウィンドウに追加します。イメージ スタック内の各スライス (時間枠) に対してこのプロセスを繰り返し、[その他] ボタンをクリックして [保存] を選択して、すべての ROA を保存します。
- ジッパー付きROIフォルダを開いてROIマネージャをロードし、左側のパネルにある各ROI識別子をクリックします。[分析]メニューから[測定]を選択し、各 ROI 識別子でこのコマンドを繰り返して、イメージ スタックのすべてのスライスで対象のオブジェクトを定量化します。
- セルシフトが問題ではなく、スタックのすべてのスライスで焦点面が同じままの場合は、ROIマネージャで[マルチメジャー]をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、[スライスごとに 1 行ではなくすべてのスライスを測定] を選択して、イメージ スタック全体の測定値を反復化します。結果を csv ファイルとして保存し、統計プログラムで測定値を分析します。
- 対象の構造を構成する複数の核信号の場合は、Shiftツールを使用してオブジェクトを選択しながらShiftキーを押して、単一の ROI を作成します。または、楕円形ツールを使用して一定サイズのROIを作成し、対象のすべての信号を包含します。
注:この楕円形のアプローチは、蛍光信号が時間の経過とともにサイズと強度が変化する領域上の信号挙動を測定し、記述するために必要な場合があります。信号強度(この場合)は、特定の領域上の平均信号密度です。 - シグナルの重なり領域の色の変化によって2つの蛍光シグナルの共局在を定性的に決定する。ただし、共ローカリゼーション ゾーンが狭くなるにつれて、信号の重複を区別するのが難しくなります。この場合は、以下の手順に従います。
- ステップ 5.6 で説明するように、チャネル ツールを使用して、問題の各信号の上に直線を描画し、[分析] メニューの下で [プロファイルのプロット] コマンドを選択します。
- 同じ描画線を使用して、問題のすべての色に対してこの手順を繰り返します。
- 各プロファイリング ステップの後に表示されるサンプルポップアップ ウィンドウの [リスト]ボタンを押して[プロット値]ウィンドウを呼び出し、各信号の測定値を csv ファイルとして保存します。
- 統計プログラムで、各信号のグレー値を、描画された線に沿って対応する位置 (μm) に対してプロットするグラフを作成します。信号プロファイルプロット間の重複の欠如は、一般に、共ローカリゼーションの欠如を示します。
注:投影画像のプロット プロファイルツールを使用して、信号の共ローカリゼーションを調べます。これは、このようなオーバーラップが画像Zスタックを介して観察される場合にのみ信頼できます。
- 時間の経過に伴う蛍光タンパク質の動的な動作を監視するには、[分析] メニューの下にあるマルチキモグラフ ツールを使用します。結果の画像は、個々のタイムポイントを表すZスタックの各スライスにおける一連の凝縮スナップショットを通した蛍光信号の動きを示しています。
- 手順 5.6 で説明されているように、チャネル ツールを使用して、対象となる対象オブジェクトを正しいチャネルで分離します。選択したオブジェクトまたは構造体が Z スタックを大きくシフトしないことを確認します。オブジェクトの上に直線または長方形を配置し、[分析]メニューからマルチキモグラフツールを選択し、オブジェクトをオーバーレイする線の必要な幅を入力します。
- ステップ 5.6 で説明されているように、チャネル ツールを使用して、特定の時間枠で核ダイナミクスを表示するイメージ パネルを作成し、[イメージ] メニューから [スタック] ツールと [モンタージュを作成]ツールを選択します。[モンタージュを作成]ポップアップウィンドウで、必要な列と行の数を入力し、スケール係数を 1.0 に設定し、[最初と最後のスライス](タイム フレーム)を選択し、[OK] を押す前に [境界線の幅]を少なくとも 5 に変更します。目的のシーケンスに合わせて増分を変更することで、スタック内のどのイメージを表示するかを選択できます。
- ムービーを生成するには、目的のハイパースタックをアップロードし、[ファイル] メニューから aviファイルとして保存を選択し、[圧縮] に [なし] を選択し、フレーム レートを 2 ~ 8 fps に入力します。 [チャネル]ツールで[コンポジット]を選択して、画像を構成するすべての色をマージまたは区切る場合は、[モンタージュを作成]コマンドを選択します。
注:このプロトコルでは、2 つの avi ファイル (ムービー 1-2)が用意されています。フィジーでそれらを使用して、ステップ 5 で強調表示されたさまざまな機能を試してみてください。 - 1 つの代表的なセルを表示するには、[イメージ]メニューから[変換]と[回転]を使用し、回転の度数を入力します。負の値はオブジェクトを左に回転し、正の値はオブジェクトを右に回転させます。セルが適切な向きになったら、Z スタックまたは目的の時間枠内にセル全体を囲む四角形を描画し、[イメージ]メニューから[トリミング]を選択します。手順 5.16 および 5.16.1 に記載されているように、イメージ パネルまたはムービーを生成します。
- ムービーを生成するには、目的のハイパースタックをアップロードし、[ファイル] メニューから aviファイルとして保存を選択し、[圧縮] に [なし] を選択し、フレーム レートを 2 ~ 8 fps に入力します。 [チャネル]ツールで[コンポジット]を選択して、画像を構成するすべての色をマージまたは区切る場合は、[モンタージュを作成]コマンドを選択します。
- [分析] メニューから [ツール] と [スケール] バーを選択して、イメージ パネルまたはムービーにスケール バーを追加します。[スケール バー] ポップアップ ウィンドウで、[1 つのセルの幅の幅] の場合は 5 ~ 15、視野全体に 100 ~ 250 を入力し、[色] に白または黒を選択し、適切な場所を選択してスケール バーを配置します。
- 映画の場合、核イベント中の時間の進行を示すのに役立ちます。フレーム間の時間変化を表示するには、[イメージ]を選択し、[スタック] をクリックし、タイム スタンパーツールを使用し、時系列の開始フレームを指定し、時刻表示に適した場所を選択します。
Representative Results
生細胞イメージングが人芽細胞やマイオシスに使用されるかどうかにかかわらず、あらゆる種類の観察を行う前に健康な核分裂酵母細胞を使用することが重要です。結果として得られるデータの品質は、開始材料に大きく依存します。細胞が栄養制限や過剰増殖によって飢餓した場合、過剰な液胞と減少した細胞サイズが示されます(飢餓、図2A)。人体炎実験では、細胞ストレスを示す細胞の使用を避けることをお考えです(飢餓、図2A)。それ以外の場合、実験結果は一貫性がなく、再現不能になります。この制限を回避するには、適切な野生型コントロールを選択し、関心のある変異体の様々な表現型に精通します。例えば、12時間飢えた水虫細胞は、DNAを積極的に複製するのをやめる。Tos4-GFP発現はG1/S相活性22、23に関連しているので、このマーカーを運ぶ対数細胞と核分裂用の対数細胞(Sad1-DsRed10)は、汎核Tos4-GFP発現、Sad1-DsRed病式を示す分離、および進行中の隔離(活性DNA複製および細胞分裂を示唆する)(Log,図2A)、飢えた細胞はそのような活性を示さない(飢餓、図2A)。この結果は、G1の転写を減少させ、G1/S細胞周期チェックポイントを活性化し、G0エントリ5を促進する核分裂酵母における栄養制限の効果と一致する。マイオシス実験では、細胞は高密度に成長する必要がありますが、静止した段階に達する必要があります。その後、両方の合致型の細胞を低窒素培地中で混合し、一緒にインキュベートする。細胞が窒素で十分に飢えていない場合と同様に、交尾に失敗すると、それらはメイアシスに入るのを防ぐことができます(非効率的、図2B)。交配細胞懸濁液の堅牢な凝集は細胞間相互作用を増加させ、従って正常な交配および効率的なマイオティック誘導を示す(効率的、図2B)。
アガロースゲルパッドと細胞塊の物理的な破壊は、単一細胞またはアシの適切な視覚化を保証します (ログ,図 2A;効率的な、図2B)。パッドは、細胞が同時に所定の位置に固定され、乾燥から保護される堅く、まだ湿ったプラットホームを提供する必要があります。さらに、パッドは蒸発による変化に耐え、画像取得を通じて適切な焦点を可能にする平らな表面を提供するのに十分な厚さでなければなりません(図1C)。カバースリップ回転は、交配凝集体内でセルを分離および広げる必要があります (図 1F;効率的な、図2B)。このステップがなければ、アシが交配束のアクセス不能な層内に閉じ込められるため、少数のアシが多数のハプロイド細胞が観察され、ハプロイド細胞は利用可能なすべての単層スポットを自由に取り込むことが可能である(図2B)。細胞の束が問題になれない人差し欠実験でも、カバースリップ回転はパッドの周りにセルを動かして、細胞間に十分なスペースを持つ単一の細胞層を作成し、群集効果を低減し、細胞の複製を可能にします(Log,図2A)).
Atb2は、核分裂酵母ミトシスおよびマイオシス7、14における染色体分離に関与するα-チューブリン成分である。蛍光タグ付けされた場合、この細胞骨格成分は、有人化における核分離を特徴付ける段階の検査を可能にする。プロフェーズ(0'-20'、図3A)の間に、有糸性スピンドルの核化は、Htt1-GFP5パン核の背景に対して設定されたAtb2-mRFP繊維によって明らかにされたスピンドル極体(SPB)の核側で起こる。メタフェーズアナフェイズ遷移(20'-40'、図3A)の間に、ツトオティックスピンドルは外側に伸び、核は2つに分割されます。細胞がテロ相(60'-80'、図3A)に入ると、Atb2-mRFPは染色体が完全に分離されるまで双方向に膨張する。この時点の後、Atb2-mRFP繊維が再グループ化し、細胞表面全体に広がり、得られた各娘細胞の相間形態を取り戻す。サイトカインシス(>120'、図3A)は、中隔が形成され、核分裂によって細胞を分割した後にのみ起こる。人工的サイクルにおけるHht1-GFP強度の変化に続いて、核ダイナミクスにおける3つの重要なステップを明らかにする:メタフェーズアナセレーション(中強度、DNA圧縮:20'-40'、図3A-B)、テロ相(低強度、DNA分離:60'-80'、 図3A-B)、およびG1(強度の増加、DNA複製:100'-120'、図3A-B)。同様に、Hht1-mRFPのみを搭載し、フィジーでマルチキモグラフツール(ステップ5.15参照)を使用する細胞を使用して、メタフェーズからテロ相までの電離分裂を観察し、適切な姉妹クロマチドの間に関与する核の動きを評価することが可能です。分離(通常、図3C)。誤分化キモグラフは、2つの主要な核経路間の信号活動を示し、染色体断片化または不適切なクロマチド分離による誤分化の可能性を示す(遅れ、図3C)。
前述したように、発芽および核分裂酵母において、Tos4はG1で転写され、S相22、23におけるDNA複製中に機能する。これは、Sad1-DsRed10の病巣が反対方向(核分裂を示す)に移動した後に核内でTos4-GFP発現が増加するキモグラフで観察できるが、サイトカインシスの前に中隔が形成される前に(39'、図3D); 36'、図3E)。高Tos4-GFP活性の位相は、M-G1/S遷移の終わり(45',図3E)で始まり、細胞分裂直後のG2(>60'、図3E)で終わります。G1の間に大きく拡散する一方で、Tos4-GFP信号強度は、アナフェーズ後およびS相全体を通じて増加し、分離されたSad1-DsRed病巣(45'-60'、図3E)と共にローカライズします。この結果は、娘細胞(G1/S)でゲノム複製が始まった場合の核分裂酵母の分離期間を明らかにするが、サイトカインシスはまだ起こっていない。
Hht1は核分裂酵母におけるヒストンH3であり、核DNA5、14を可視化するために蛍光タグで一般的に改変される。人芽細胞では、細胞がメタ相からテロ相に移行するにつれて(20'-120'、図3A)、核質量に対する2つの顕著な変化が観察される。最初の変化は、メタフェーズ(20'、図3A)における核サイズの収縮を伴い、2番目の変化はアナフェーズ中の核分裂を示す(40'、図3A)。これらの変化を有位細胞と共有することに加えて、マイオティック細胞は、相同組換え時に核振動(すなわち、馬尾翼)(-100'~-50'、図4A-B)を示し、アナフェーズII(70'-90')の終わりに核サイズのさらなる減少、図4A)。Hht1-mRFP は、遅れや断片化した染色体などの誤分化表現型を調べるために使用されます (遅れ、図3C)。また、meiosの各段階における核ダイナミクスを観察し、記述するためにも用いられる(図4A-B)。核質量は大きく、馬尾の多く(HT:-100'~-50'、図4A-B)の間に大きさが変動する。細胞がメタフェイズ(MT:-40'~0'、図4A-B)に入ると、核サイズと発振が減少し、この段階での結露活性の増加と一致する。アナフェーズI(MI:10'-60'、図4A-B)とII(MII:70'-90'、図4A-B)の両方の発症は、さらなる核削減と核移動の欠如に関連しており、これは特徴的な2つの核部門とよく相関しています。マイオシスIとII(MI&MII)。したがって、同種染色体が整列して再結合し、2回の染色体分離後の核サイズの減少と共に核サイズの変動に関連する。これらの核ダイナミクスを変化するアエレは、マイオシス12,13におけるゲノム安定性調節に関連している可能性が高い。
Rec8は、核分裂酵母におけるマイオティックコヒーシンのα-クライシンサブユニットである。DNA複製後にクロマチンにロードされ(mei-S)、アナフェイズIIまで互いにつなぎ合った姉妹クロマチドを保持します。メタフェーズIの後、Rec8は分離によって染色体アームから除去され、Sgo1-PP2Aによってセントロメアで保護される。ホモロゲ分泌の終わりに、Rec8もセントロメアで排除され、それによって姉妹クロマチド分離(図5A)6、24を可能にする。Rec8-GFPは、Sad1-DsRedやHht1-mRFPなどの染色体分離のマーカーと共に、マイオシス中の凝着力力学の可視化を可能にします。Rec8-GFP信号は、mei-S(<-90'、図5A-B)、プロフェーズI(-90'~-50'、図5A-B)、メタフェーズI(-40~0'、図5A-B)の間に汎核です。この観察は、DNA複製に続く染色体軸に沿ったRec8-GFPの関連を明らかにする。細胞がアナフェイズI(10',図5A-B)に入ると、Rec8-GFP強度は核全体で減少するが、各核質量(20'-70'、図5A-B)に焦点を合わせるセントロメアで強いままである。この結果は、染色体アームに沿ったRec8-GFPの劣化と一致するが、心分離の後に起こるセントロメレでは一致しない。アナフェーズIIの前に、Rec8フォーカスが消え、MII(70'-80'、図5A-B)で分離するための姉妹クロマチドを解放する。Rec8-GFPマーカーは、したがって、明美凝着の確立、除去、および全体的な安定性を妨げる条件を調べるのに有用である。Hht1-mRFP 5、13などの核分裂のマーカーと組み合わせることで、Rec8-GFPは、マイオシスの前および間の凝固タイミングと安定性が適切な染色体分離にどのように影響するかの質問に対処するために使用することができます12 、13.このプロトコルは、主にサイトソルでダイナミクスが発生するタンパク質には対処しません。しかし、表Iは、他のプロセスの中で、エンドサイトシス、エキソサイトトーシス、およびサイトカインシスに必要な細胞骨格および膜プロセスを調べるために一般的に使用されるいくつかのサイトソーリックタンパク質を示す。
図1:生細胞イメージング用アガロースパッドの調製(A) ピペットチップホルダー、ラボテープ、顕微鏡スライドを使用して組み立てたスライド準備セットアップ。互いに垂直なスライドを配置すると、アガロースパッドが形成されるポケットが作成されます。側面にラボテープ片を追加すると、必要な仕様に合わせてアガロースパッドの幅が調整されます。(B)溶融アガロースは、パッドを作るために顕微鏡スライド上に設定する前に冷却することができます。このステップでは、気泡を作成しないように、アガロースの体積をゆっくりと分配する必要があります。(C) 上部スライドは、真っ直ぐな表面、さらにはエッジ、目に見えるアガロースの亀裂を持つ円形のパッドを形成するために、分配されたアガローススポットに配置されます。(D) セルサスペンションのサンプルをアガロースパッドに置いた後、スライドを反転させ、糸くずのないペーパータオルの上に置き、余分な液体媒体を除去します。(E) アガロースパッドにカバースリップを慎重に配置し、気泡をトラップしないようにし、セルシフトやフォーカスの問題を避けるためにフォーカスプレーンが平らであることを確認します。(F) ゆっくりと慎重に、カバースリップを時計回りに回転させて細胞の塊を破壊し、細胞の膨張と細胞の視覚化を可能にするセル単層を生成します。(G,H)加熱炭化水素混合物を使用してアガロースパッドをシールし、イメージング前に所望の温度に平衡化させます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 適切なセルを選択します。(A) トップパネルは、EMMに飢えに残された核分裂酵母細胞を示し、72時間のサプリメントと下部パネルは対数成長を受けている細胞を示す。飢えのままの細胞では、小さな細胞形態が理解できる。赤い開いた矢印は、飢餓の特徴である真空顆粒を示しています。対数培養では、細長い形態とセプタ(赤い矢印)を示す細胞が多く、活発な循環力学を示す。右側のパネルは、飢餓および増殖中にTos4-GFPおよびSad1-DsRed信号を発現する細胞を示す。汎核Tos4-GFP発現とSad1-DsRed信号は、活動的な増殖中に対極に局在するが、飢餓ではない。(B) トップパネルは、同じ合致タイプ(h+)のセルが効率的に合致しなかったことを示しています。赤い開いた矢印は、カヨガミーを受けている真空細胞のペアを示しています。これは、細胞の10%が合致型をh-に切り替えることができるh+細胞の培養においては珍しいことではない。下のパネルは、効率的な交配から生じるアスキーを示しています。ジグザグ(赤い矢印)とバナナセルの形状(赤い開いた矢印)を含む複数の形態を取ります。スケールバー = 長さ5μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ミトスティック核ダイナミクス。(A) ヒストンH3(Hht1-GFP)および微小管(Atb2-mRFP)タンパク質は、1回の微小症サイクル(120分)中に続いた。Hht1-GFP および Atb2-mRFP の個々の信号は白黒パネルで表示され、BF マージはそれぞれの色で表示されます。(B) 電化サイクルにおけるHht1-mGFP強度の定量化Hht1レベルの変化は、G1における有分裂およびDNA複製中の核分裂を示している。(C) 結果として得られる核経路が、DNAの完全性を二分化し保持するか、染色体断片化または早期クロマチド分離を促進する、ミトシスにおける正常または異常な分離を示すキモグラフ。(D,E)Sad1-DsRedの分離と核Tos4-GFP信号の出現によって明らかにされたM-to-G1/Sの持続時間を示すキモグラフおよび顕微鏡写真パネル。フィジーの FIRE LUT を使用して生成されたEの中央パネルは、Tos4-GFP 式の高いスポットの識別を容易にする強度卒業熱マップを作成することに注意してください。この場合、期待どおりに、核に局在し、Sad1-DsRed 信号を重なり合います。スケールバー = 長さ5μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:明核ダイナミクス。(A) メオシス中の核(Hht1-mRFP)の動き、圧縮、および分裂を示すパネル系列。馬尾翼(HT)は、広範囲にわたる左右の核振動を示し、それに続いてメタフェーズ(MT)が続き、核横方向の動きが減少し、アナフェーズIの直前に完全に停止します。マイオシスI(MI)では、主な核塊が2つに分割され、マイオシスII(MII)では4つの核が姉妹クロマティスト分離の過程で生成される。(B) 原発領域変化(Hht1-mRFP)の定量化、メタフェーズ、MI&MII核領域はHT振動中に動的であり、MTに凝縮され、核の動きがほとんど観察されないMI&MII(長い核軸)の間にさらに小さくなる。最も長い核軸(長い核軸)を測定することは、円が伸びるにつれて、一定の直径を持つことをやめ、少なくとも2つの主軸(長軸と短軸)を生成するという考えに基づいています。したがって、核の変化を監視する場合、長い軸または短軸の変化は、核の動きを示す。スケールバー = 長さ5μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:メイオティック・コーヘン・ダイナミクス(A) Rec8-GFP信号変化がメオティック核ダイナミクスとどのように相関するかを示すパネルシリーズ。HTおよびMTの間、Rec8-GFP信号は汎核であり、核の動き(Hht1-mFRP)に続く。MIでは、Rec8-GFPは核から消散し、染色体アームからのRec8除去およびセントロメールでのSgo1-PP2A保護の確立と一致する一対の病巣のみを残す。細胞がMIIに近づくにつれて、Rec8-GFP病巣は消え始め、アナフェーズIIの直前に見られなくなりました。(B) HTからMIIへのRec8-GFP強度の定量化。Aで見られるものと同様に、GFP信号はHTおよびMTを介して高く、MIの間に実質的に減少し、MIIで完全に消失する。このパターンは、染色体アームとセントロメアの凝膜ダイナミクスを裏付け、MIIで分離する準備ができるまで姉妹のクロマチドをつなぎ続けます。スケールバー = 長さ5μm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| タンパク質 | 関数 | コメント | タグ | 参照 | ||
| Hht1 | DNA包装に関与するヒストンH3 | 染色体のダイナミクスを調べるために使用 | Hht1-mRFP | 5,14の | ||
| トス4 | Tos4機能はG1フェーズ中に発生します | G1タイミングの研究に採用 | トス4-GFP | 22,23の | ||
| ラッド21/ レク8 | 複製後に姉妹クロマチドを一緒に保つことに関与するコーシンサブユニット | 電離性(Rad21)およびメオティック分離(Rec8)中の凝着安定性を解析するために使用 | ラッド21-GFP/Rec8-GFP | 6,24の | ||
| ラッド11 | RPA活性は有面DNA修復、マイオティック組換え、メタフェーズで終わる間に起こる | マイオシスにおける人芽炎と組み換えダイナミクスのDNA修復を研究するために採用 | ラッド11-YFP | 5,13の | ||
| ラッド52 | Rad52アアクティビティは、電離DNA修復およびメオティック組み換えの間に起こる | マイオシスにおける人芽炎と組み換えダイナミクスのDNA修復を研究するために採用 | ラッド52-CFP | 5,13の | ||
| Cnp1 | ヒストンH3 CENP-Aは、セントロメアで特にローカライズします | 人芽細胞およびマイオシスにおける染色体分離ダイナミクスに従うために使用される | Cnp1-mCherry | 13歳 | ||
| スウィー6 | ヘテロクロマチン形成に関与するHP1ホモログタンパク質 | セントロメアとテロメアでのヘテロクロマチン動員の研究に採用 | Swi6-GFP | 13歳 | ||
| 悲しい1 | Sad1は、核封筒にスピンドルポール本体を局所化することに関与しています | 人芽症とマイオシスにおける染色体分離の分析に採用 | 悲しい1-mCherry | 10歳 | ||
| サイトソルと膜 | ||||||
| Atb2 | 微小管細胞骨格組織に関与するツブリンα2 | 人芽細胞およびマイオシスにおける染色体分離を調べるために使用される | Atb2-mRFP | 7,14の | ||
| Ync13 | 小胞媒介輸送に関与するエキソサイトーシスおよびエンドサイトアシスレギュレータ | サイトカイン症時の細胞壁の完全性を研究するために採用 | Ync13-メシトリン | 25名 | ||
| Rlc1 | 収縮リング収縮に関与するミオシンIIサブユニット | 中隔成熟と収縮のダイナミクスを調べるために使用されます。 | RIc1-mCherry | 25名 | ||
| Ccr1 | ER、血漿、ミトクロム外膜の一部であるNADPH-シトクロムp450還元酵素 | エンドサイトアシス、エキソサイトトーシス、サイトカイン症などの膜関連ダイナミクスを調べるために採用 | Ccr1N-GFP | 5 | ||
| ゲフ1 | 細胞極性の確立と維持に関与するロー・グアニル・ヌクレオチド交換因子 | グローバルな微小管依存性細胞極力ダイナミクスの調べに使用 | Gef1-mCherry-GBP | 26歳 | ||
| フス1 | サイトガミー中のアクチン融合フォーカスアセンブリに関与するホルミン | 核分裂酵母交配に関連する融合ダイナミクスの研究に使用 | フス1-sfGFP | 27歳 | ||
| Mnn9 | ゴルジ装置におけるタンパク質N結合グリコシル化に関与するマンノルシルトランスフェラーゼサブユニット | それはシス-ゴルジからトランス-ゴルジに進むにつれてゴルジの貨物成熟を研究するために採用 | Mnn9-mCherry | 28歳 | ||
| ヌム1 | 馬尾に関与するダインの皮質固定係数 | ミトコンドリア依存性ダインアンカーを測定期I相における核振動中に調べるために使用される | Num1-yEGFP | 29歳 | ||
表1:核と細胞動態のマーカー
ムービー 1: スピンドルポール本体を示す M-to-G1/S 遷移 (SPB;Sad1-DsRed)分離先行の分離とTos4-GFP核信号の蓄積。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ムービー2:核(Hht1-GFP)分裂と相関する微小管(Atb2-mRFP)拡張を示す微小サイクルの完了。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
Discussion
有分裂およびマイオシス中の生細胞イメージングは、データ取得中に核分裂酵母生理学を実質的に破壊することなく、核ダイナミクスを調べる機会を提供します。ただし、細胞が環境ストレスのない所望の密度に成長するように注意する必要があります。そして、マイオシスのために、細胞は、末端分化の時間の間に画像化され、あまりにも早くまたは遅くはありません。過剰な細胞の混雑、飢餓、および不適切な成長温度は、再現不可能な観察に寄与する一般的な要因です。さらに、歪み構築中に、蛍光タグが標的遺伝子の機能を妨げず、全体的な細胞適合性に影響を与えないことをテストすることが重要です。蛍光マーカーを運ぶ株の文種を綿密に検査しないと、類似のジェノタイプ間で一貫性がなく、比類のない結果が生じる可能性があります。
顕微鏡アガロースパッドは簡単に組み立てることができますが、貴重な画像データを得る上でハードルを生み出すこともあります。アガロースパッドの作成は、3つの顕微鏡スライドを平行に配置し、中央のスライドに溶融アガロースを分配し、他のスライドの上部を横切るスライドを置くことと同じくらい簡単です。しかし、耐シチュエーション、状況に特化したアガロースパッドを製造するために幅の変更を可能にするスライドメーカー装置を組み立てることは有用である。パッド幅の柔軟性を与えるシンプルなスライドメーカーは、プラットフォーム(ピペットチップホルダーまたはベンチ)、2つの顕微鏡スライド、およびパッド幅調整機構として機能するラボテープで構成されています(図1A)。正確なパッドの厚さは、イメージング時間の要件、アガローズブランド、温度、カバースリップシーラント、蒸発速度などに依存します。したがって、技術的な再現性を高め、生細胞イメージング1、2、3の品質を向上させるために、データ集録の前にイメージングシステムを校正することが重要である。パッド表面、剛性、組成は、長時間の画像集録時に不可欠です。アガロースは、背景蛍光が低く、容易に成形することができ、適切な濃度で、蒸発による構造変形に耐える。さらに、核分裂酵母培中とアガロースを組み合わせることで、画質を損なうおらず、複数のミトセスやマイオシスサイクルの延長観察が可能です。また、タイムラプス顕微鏡検査のための気泡を避けることも重要です。アガロースパッド内およびサンプル内では、エアポケットは時間の経過とともに膨張し、セルシフトを引き起こし、焦点面を破壊します。カバースリップ回転によって細胞が効率的に広がることで、研究者は核融合から胞子まで、数世代にわたる有電分裂プロセスや模倣事象に従うことができます。イメージング実験に適したパッドを作って選択するには時間がかかりますが、一度達成すれば、非常に有益な顕微鏡観察に貢献することができます。
他の方法と同様に、生細胞顕微鏡検査には技術的な制限はありません。蛍光タグ付きタンパク質の使用は、研究可能なものの範囲を制限する実験に境界を導入します。光漂白および光毒性は、長期画像取得の典型的な問題である。彼らはあまりにも長いまたはあまりにも頻繁に短い波長に細胞を公開しないことによって対抗することができます。GFP、CFP、YFP、mRFP、およびDsRedを含む実験では、核分裂酵母ライブセルイメージングに使用される典型的な蛍光タンパク質は、通常の実験に5〜15%の励起光と100-500ミリ秒の露光時間を使用するのが一般的です。しかし、これらのパラメータは、研究者の特定の実験要件に応じて変化します。さらに、60倍の目的を使用して0.5 μm間隔を持つ9~13のセクションで構成されるZスタックは、核分裂酵母細胞の厚さを解決するのに十分です。さらに、蛍光マーカーが標的タンパク質の適切な調節や機能を妨げなかったり、偽の動きを生成したりしないことを確認することが重要です。したがって、同じ標的遺伝子に対して異なる蛍光タグと親和性タグを含む株を構築し、異なる手段で観察を裏付けることをお勧めします。さらに、実験パラメータを実験全体で再現し、収集したデータが下流分析1、3に適合することを確認するのは、研究者の責任です。蛍光信号を検出する場合の線形性を注意深く観察し、厳密に調べることによって、実験システムを細心の注意を払って検証する時間テストの実践に取って代わる技術はありません。
最後に、生の画像を変更しない形式で顕微鏡データを分析することが重要です。フィジーは、生データ測定値を追跡するための優れたドキュメンテーションツールを提供し、研究者が単一のセッションで異なる細胞パラメータを調べることができます。これらの機能は、オンラインチュートリアルと広範な文献カバレッジの豊富さと同様に、フィジーは、人分裂とマイオシスにおける核分裂酵母の核ダイナミクスを記述するライブ細胞イメージングデータを測定、分析、および提示するための重要なツールにします。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者たちは、この原稿の準備をより楽しいものにしてくれたナタリア・ラ・フォーケードとモン・ラフェルテに感謝したいと思います。彼らの洞察力、実験のアイデア、道徳的なサポートでこの作業の完了に貢献したForsburgラボのメンバーに感謝します。このプロジェクトは、NIGMS R35 GM118109 から SLF にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy–tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
- Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
- Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
- Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
- Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
- Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
- Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
- Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
- Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
- Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
- Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
- Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
- Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
- Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
- Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
- Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
- Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
- Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
- Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).
