Summary
Her præsenterer vi Live-Cell Imaging, som er en ikke-giftige mikroskopi metode, der giver forskerne mulighed for at studere protein adfærd og nuklear dynamik i levende fission gærceller under mitose og meiosis.
Abstract
Live-Cell Imaging er en mikroskopi teknik, der anvendes til at undersøge celle-og protein dynamik i levende celler. Denne Imaging metode er ikke giftigt, generelt ikke forstyrrer celle fysiologi, og kræver minimal eksperimentel håndtering. De lave niveauer af teknisk interferens gør det muligt for forskerne at studere celler på tværs af flere cyklusser af mitose og observere meiose fra start til. Ved hjælp af fluorescerende Tags såsom grøn fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende protein (RFP), forskere kan analysere forskellige faktorer, hvis funktioner er vigtige for processer som transkriptionen, DNA-replikering, samhørighed, og adskillelse. Kombineret med dataanalyse ved hjælp af Fiji (en gratis, optimeret ImageJ version), Live-Cell Imaging tilbyder forskellige måder at vurdere protein bevægelse, lokalisering, stabilitet, og timing, samt nuklear dynamik og kromosom adskillelse. Men som det er tilfældet med andre mikroskopi metoder, er levende celle billeddannelse begrænset af de iboende egenskaber af lys, som sætter en grænse for opløsningen magt ved høje forstørrelser, og er også følsom over for foto blegning eller fototoksicitet ved høj bølgelængde Frekvenser. Men, med en vis omhu, efterforskere kan omgå disse fysiske begrænsninger ved omhyggeligt at vælge de rigtige betingelser, stammer, og fluorescerende markører for at muliggøre en passende visualisering af mitotiske og meiotiske hændelser.
Introduction
Levende celle mikroskopi giver forskerne mulighed for at undersøge nuklear dynamik uden at dræbe fissions gærceller og eliminerer behovet for dødbringende fikater og pletter. Det er muligt at observere stabilitet, bevægelse, lokalisering og timing af fluorescently mærkede proteiner, der er involveret i vigtige begivenheder såsom kromosom replikation, rekombination, og adskillelse, ud over membranen og cytoskelet Bevægelser. Ved at opretholde cellelevedygtighed og ikke-giftige signaldetektering, der er minimal fysiologisk indtrængen. Når det udføres korrekt, denne mikroskopi metode kan reducere forstyrrende virkninger, der opstår fra den udvidede tekniske håndtering eller fra falsk kemisk reaktivitet. Endvidere, under et eksperiment, forskere kan gøre relevante observationer af fission gær ernæringsmæssige og stress tilstande, proliferativ effektivitet, og apoptotiske status, der indikerer uhensigtsmæssige Imaging parametre eller unormal celle fysiologi1 ,2,3.
Mitose og meiose er karakteriseret ved nuklear og cellulær division. I meiosis, i modsætning til mitose, er genetisk indhold halveret som stamceller giver anledning til datter celler4. Da Live-Cell Imaging giver en tidsmæssig dimension ud over det rumlige forhold, kan et stort antal celler undersøges i realtid. Live-Cell mikroskopi har gjort det muligt for forskerne at undersøge dynamikken i nuklear division ved hjælp af fluorescerende Tags for histoner5, sammenhængende under enheder6, mikrotubuli7, centromeres8, kinetochores9, komponenter af spindel pole Body (SPB)10, og dem af kromosom passager Complex (CPC)11. Uden for kromosom segregation apparat, Live-Cell Imaging har også fanget opførsel af proteiner nødvendigt, men ikke direkte involveret i kromosom adskillelse. Funktionen af disse proteiner har vist sig at påvirke replikation, kromosom rekombination, nuklear bevægelse, og kromosom fastgørelse til mikrotubuli12,13,14. Disse observationer har bidraget til en bedre forståelse af cellulære hændelser, hvis funktionelle komponenter ikke var modtagelige for biokemiske eller genetiske undersøgelser. Med nye fremskridt inden for mikroskopi teknologi, begrænsninger såsom dårlig opløsning, foto blegning, fototoksicitet, og fokus stabilitet vil mindske, og dermed lette bedre real-time observationer af mitotisk og meiotisk nuklear dynamik1, 2,3. Meiosis er særlig udfordrende, da det er en terminaldifferentierings vej, der kræver nøje opmærksomhed på timing.
Formålet med denne protokol er at fremlægge en forholdsvis enkel metode til undersøgelse af realtids fission af fissions gær i mitose og meiosis. For at opnå dette, er det nødvendigt at bruge celler, der ikke har været udsat for miljømæssig stress, forberede agrose Pads, der kan modstå langvarig billeddannelse, og montere celler på tætheder, som letter visualisering af enkelt celle dynamik. Desuden gør denne protokol brug af celler, der bærer fluorescently mærkede proteiner, som fungerer som nyttige markører for nuklear kinetik (Hht1-mRFP eller Hht1-GFP), kromosom adskillelse (Sad1-DsRed), cytoskelet dynamik (Atb2-mRFP), transkriptional aktivering i G1/S (Tos4-gfp) og samhørigheds stabilitet i meiose (Rec8-gfp). Denne metode introducerer også yderligere nukleare og cytosolisk markører (tabel I), der kan bruges i forskellige kombinationer til at løse spørgsmål om specifikke cellulære processer. Endvidere, grundlæggende Fiji værktøjer er featured for at hjælpe forskere behandle Live-celle billeder og analysere forskellige typer af data. Styrken af denne tilgang stammer fra brugen af real-time observationer af protein dynamik, timing, og stabilitet til at beskrive processer, der er integreret for korrekt udførelse af mitose og meiosis.
Protocol
1. forberedelse af medier15,16
- Stam løsninger
- Forbered en 50x salt stamopløsning ved tilsætning af 52,5 g MgCl2· 6h20, 0,735 g af CaCl2· 2H20, 50 g KCl og 2 g af na2s04 i en flaske indeholdende 1 L destilleret vand. Bland opløsningen grundigt og sterilisere ved filtrering. Plads ved 4 °C ved langtidsopbevaring.
- Lav en 1.000 x vitamin stamopløsning ved at blande 1 g pantothensyre, 10 g nicotinsyre, 10 g inositol og 10 mg biotin i en flaske indeholdende 1 L destilleret vand. Bland opløsningen godt og Steriliser ved filtrering. Opbevares ved 4 °C ved langtidsopbevaring.
- Forbered en 10.000 x mineralsk stamopløsning ved tilsætning af 5 g borsyre, 4 g MnSO4, 4 g af znso4· 7h2o, 2 g fæl2· 6h2o, 1 g Ki, 0,4 g molybdisk syre, 0,4 g CuSO4· 5T20 , og 10 g citronsyre i en flaske indeholdende 1 L destilleret vand. Bland opløsningen grundigt og sterilisere ved filtrering. Plads ved 4 °C ved langtidsopbevaring.
- Lav individuelle næringsstoffer stamopløsninger ved at tilføje 7,5 g af enten adenin, leucin, histidin eller lysin i en flaske indeholdende 1 L destilleret vand. Brug kun 3,75 g til at fremstille uracil-opløsningen. Steriliser opløsninger ved autoclaving.
Bemærk: Med tiden udfældning uracil ud af opløsning. For at komme ind i opløsningen igen, varm i mikrobølgeovnen ved 60% strøm i 10 s intervaller eller sted i et 55 °C vandbad i 20 min. Drej den varme opløsning, indtil alle uracil klumper forsvinder.
- Gær ekstrakt plus kosttilskud (ja)
- I en 2 L kolbe tilsættes 1 L destilleret vand, 5 g gær ekstrakt base, 30 g glucose, og 225 mg hver af adenin, uracil, L-histidin, L-leucin, og L-lysin. Tilsæt 20 g agar for at gøre det faste medium.
- Brug en magnetisk omrørbar til at opløse ingredienserne fuldstændigt i opløsningen. Agar vil smelte efter mediet er steriliseret ved autoklave.
Bemærk: For nemheds skyld er klar-til-brug ja pulver også kommercielt tilgængeligt.
- Edinburgh minimal medium (EMM) og pombe glutamat medium (PMG)
- I en 2 L kolbe kombineres 1 L destilleret vand med 3 g kaliumhydrogenphthalat, 2,2 g af na2HPO4,5g NH4CL, 20 g glucose, 20 mL salt stamopløsning, 1 ml vitamin stamopløsning og 0,1 mL mineral stamopløsning. Udskift NH4Cl med 2,2 g L-glutaminsyre mononatriumsalt for at tilberede PMG. For at gøre det faste medium tilsættes 20 g agar.
- Ved hjælp af en magnetisk røre bar, opløse ingredienserne grundigt. Agar vil smelte efter mediet er steriliseret ved autoklave. Før brug tilsættes næringsstof stamopløsninger, hvis det er nødvendigt. For hver 1 L medium tilsættes 15 mL hver af adenin, leucin, histidin og lysin. Brug 30 mL til uracil, da det er mindre koncentreret end de andre næringsstof opløsninger.
Bemærk: For nemheds skyld er klar-til-brug EMM og PMG pulvere også kommercielt tilgængelige.
- Malt ekstrakt (ME)
- Brug en 2 L kolbe til at blande 1 L destilleret vand med 30 g maltekstrakt og 225 mg hver af adenin, uracil, histidin og leucin. Juster pH-værdien til 5,5. Der skal være 20 g agar for at gøre det faste medium.
- Komponenterne opløses i opløsningen ved hjælp af en magnetisk Stir-stang. Agar vil smelte efter mediet er steriliseret ved autoklave.
- Sporulation agar med kosttilskud (KURBADE)
- I en 2 L kolbe tilsættes 1 L destilleret vand, 10 g glucose, 1 g KH2po4, 1 mL vitamin bestand, 45 mg hver af adenin, uracil, histidin, leucin og lysinhydrochlorid. Tilsæt 20 g agar for at gøre det faste medium.
- Brug en magnetisk Stir bar til at kombinere ingredienserne grundigt. Agar vil smelte efter mediet er steriliseret ved autoklave.
2. fission gær kultur15,16
- Brug ja solid medium til at vække fission gær stammer fra kryogen konservering. Afhængigt af temperaturkravene for hver stamme, inkubatér ved enten 25 °C eller 32 °C i 3-5 dage.
- Når kolonier er synlige, forberede en starter flydende kultur. Pluk celler fra individuelle kolonier og inokulere dem i reagensglas indeholdende 3 mL ja flydende medium. Forøg ved den rette temperatur til midten eller sen-log fase.
Bemærk: For korrekt beluftning anvendes rør eller kolber med volumener, som er mindst 5x større end den tilsigtede væske dyrknings volumen. Rystelser hastigheder mellem 150-220 rpm er almindeligt for rutinemæssig kultur vækst. - 250-500 μL start kultur dispenserer i en 50 mL kolbe, der indeholder 9,5-9.75 mL af enten ja, EMM eller PMG plus passende kosttilskud. Lad cellerne vokse til den ønskede tæthed og kontrollere under mikroskopet for den korrekte celle morfologi og ernæringsmæssige tilstand.
Bemærk: For at opbevare vækket stammer i op til en måned, forsegle ja plader med paraffin tape og sted ved 4 °c.
3. prøveforberedelse2
- Opsætning af mikroskop slide
- Der tilsættes 2 g agopstået i et 500 mL bægerglas indeholdende 100 mL af enten minimal medium plus kosttilskud (mitose) eller flydende KURBADE (meiosis). Varm agrose opløsningen i en mikrobølgeovn ved 60% strøm i 10 s intervaller eller Placer i et 55 °C vandbad i 10 min. Drej opløsningen for at sikre effektiv smeltning. Forbered agopstået slide-Making opsætning (figur 1a) for at sikre hurtig pad forberedelse og forhindre smeltet agopstået fra solidifying for tidligt.
- Lad den smeltede agten køle af i 1 min ved stuetemperatur og dispensere 50-100 μL pletter på mikroskop glider ved hjælp af bred-bore pipettespidser. Før agopstod køler ned, placere en mikroskop slide på toppen for at generere en spredning pad på omkring 1.5-2 cm i diameter (figur 1b-C). Bredden af agrose pad er typisk proportional med længden af billedbehandlings tiden. Med andre ord, tykkere puder modstå længere billeddannelse perioder.
- Brug en kulbrinte blanding som fugemasse for at sikre korrekt dækning af slides med tykke agrose Pads og for at forhindre celledød fra solvent eksponering på dækglas kanter. Bland lige dele (w/w) af petroleumsgelé, lanolin og paraffin i et 500 mL bægerglas. Varme ingredienser på en kogeplade ved 120 °C i 5 min. Når komponenterne smelter, skal du forsigtigt hvirvle den smeltede opløsning for at sikre passende blanding.
- Eksempel på opsætning
- Til undersøgelse af mitotiske hændelser, dyrke celler fra starter kulturer i enten Liquid EMM eller PMG plus kosttilskud til omtrent Mid-log fase (OD595 af 0,4). 1 mL af cellesuspensionen centrifugeres ved 1.375 x g i 1 min., Fjern supernatanten, og Genoptag celle pellet i minimalt medium plus supplementer til et endeligt volumen på 100 μl.
- Til billede meiotiske begivenheder, dyrke celler fra starter kulturer i minimal medium plus kosttilskud til sen-log fase (OD595 af 0,7-1,0). Kombiner lige store mængder af modsatte Mate-type celler (h- og h+) i en 1 ml cellesuspension. Centrifuge celler ved 1.375 x g i 1 min. og resuspension pellet i væske mig. Gentag dette trin tre gange for at sikre effektiv fjernelse af næringsstoffer.
- Efter den sidste mig vask, resuspension celler i 1 mL af mig og tilsæt det til en 50 mL kolbe indeholdende 9 mL mig. Inkuber for 12-16 h ved 22-25 °C på minimal rotationshastighed (50-100 RPM). Rigelig celle flokkulering, hvilket resulterer i mange runde fission gær klumper og indikerer effektiv parring.
- Tag 1 mL prøve af parring kultur og centrifuge ved 1.375 x g i 1 min. Eliminer supernatanten, men lad 250 μl i røret for at resuspendere cellerne. Før du placerer celler på agrose Pads, vortex kraftigt for 5 s at forstyrre klumper.
Bemærk: De resterende 250 μL mig brugt til at resuspendere celler indeholder parring faktorer, der hjælper celler ind meiosis. - Der placeres 20 μL af enten en mitotisk eller meiotisk cellesuspension på en 2% agopstået pad. Fjern eventuelt overskydende medium ved at invertere diaset og sætte det på toppen af et fnugfri papirhåndklæde til 2-3 s (figur 1d). Indstil slide puden-side opad, og Placer forsigtigt en glas dækseddel, der sikrer, at der ikke dannes luftbobler (figur 1f).
Bemærk: Eliminering af overskydende medium med et papirhåndklæde er mere tidseffektivt end tyngdekraften absorption, hvilket er særligt kritisk i meiose eksperimenter. - Hvis du vil oprette et celle monolayer, skal du dreje dæksedlen med uret med pegefingeren for en (mitose) eller to (meiosis) fulde omdrejninger (figur 1f). Sørg for, at celle stoffet spredes på tværs af agrose pad giver mulighed for bedre adskillelse af enkeltceller eller ASCI. Ved hjælp af en lille træpind skal du dispensere smeltet fugemasse langs kanterne af dæksedlen for at forsegle hver agrose pad (figur 1G).
- Når agrose pad er forseglet, skal du placere den på mikroskopet og lade den ækvibrere for 10-15 min ved de relevante billeddannelses forhold (f. eks. temperatur) (figur 1H) for at tillade luftbobler at sprede sig og lade eventuelle sidste-minut agerede forskydninger forekomme. Begynd billeddannelse, når diaset er effektivt ækvibreret, og fjern det ikke fra scenen, før dataindsamlingen slutter.
Bemærk: Kontrol af temperatur og fugtighed bestemmes af det anvendte mikroskop system og specifikke eksperimentelle krav. Hvis det er til stede, skal du anvende temperatur-og fugtigheds kontrollen på alle billedbehandlings eksperimenter. Hvis de ikke er til stede, skal forskerne udtænke en måde at forhindre temperaturudsving på, især i forbindelse med meiose-eksperimenter.
4. live-Cell Imaging2 og behandling
- Brug 40x-målsætningen til at finde passende visningsfelter til billedet. Skift til 60x-målsætningen for at begynde dataindsamlingen. Afhængigt af det anvendte mikroskop system vil efterfølgende refokusering og skæring af prøven på hvert tidspunkt ske manuelt eller via en mikroskop-eller software automatiseret proces.
Bemærk: De billeder, der præsenteres i denne protokol blev indsamlet ved hjælp af en dekoncentrering, fluorescens mikroskop udstyret med Sedat, RFP og GFP filtersæt, Nano-motion fase, 60x NA 1,4 objektiv linse, og 12-bit CCD kamera. Indbyggede mekaniske skodder og motoriserede filter hjul er tilladt for den reducerede excitation eksponering og foto blegning af prøver. - Brug passende software til at erhverve og behandle billeder. At devolve billeder, ansætte producent-leverede optiske overførsel funktioner.
Bemærk: For detaljer om mikroskop udstyr og software, der anvendes i denne protokol, henvises til tabellen over materialer. - At bruge en konventionel fluorescens mikroskop til at erhverve levende celle billeder sikre, at mikroskop indsamler data digitalt, har 40x eller 60x mål med numeriske åbninger (NA) større end 1,2, og er i stand til at udføre optisk skæring.
Bemærk: Uden disse krav, billeder vil vise reduceret opløsning, kompromittere kvaliteten af mikroskopiske målinger og kvalitative observationer. - Brug gratis plug-in-programmer (f. eks. Fiji) til at minimere systematiske slør fejl, der opstår som følge af kontrast tabet under billed anskaffelsen17,18,19,20 og for at sikre en korrekt kvantitativ analyse Fluorescens intensitet og andre tidsmæssige og dynamiske hændelser i cellen.
Bemærk: Andre tilgængelige kommercielle devolution programmer kan findes i tabellen over materialer. - Vælg det mikroskop filtersæt, der passer bedst til fluorophorerne under observation. Sørg for, at excitation og emission filtre har den rigtige bånd passerer, der giver mulighed for specifik påvisning af fluorescerende proteiner. For eksempel, at detektere den fælles fiskeripolitik signal, en excitation og emission band pass af 430/25 og 470/30 er passende, men ikke for RFP fluorescens.
- Brug en minimal-effektiv-indstilling tilgang (MESA), når Imaging fission gær på flere tidspunkter. Med andre ord, undgå langvarig brug af excitation bølgelængder og ansætte den laveste excitation magt og eksponeringstid, der genererer acceptable, men kvantificerbare og reproducerbare imaging data.
- For længerevarende billeddannelse under mitose eller meiose, begrænse intervallet mellem Optjening tid point til 5-10 min. Selv om 2% agopstået pads kan modstå 12 til 16 h Imaging sessioner, celle-skiftende på grund af agopstået fordampning er sandsynlig. Derfor udføre fuld mitose eller meiose eksperimenter i 4-6 h eller 8-10 h vinduer, hhv.
- Indsaml billeddata for 4-8 h, der består af mindst 24-48 anskaffelsestidspunkt, henholdsvis et fluorescens protein og en z-stak pr. tidspunkt og fluorescerende kanal bestående af 13 sektioner med en afstand på 0,5 μm ved hjælp af en 60x-målsætning. Dette kræver mindst 0,5-1 GB harddisk lagerplads. Således, udover at eliminere foto blegning og celle-shifting, oprette en arbejdsgang, der betragter computing kapaciteter1,2,3.
Bemærk: Disse anskaffelses parametre er typisk indstillet og modificeret i den software, der styrer mikroskop funktioner, og som indsamler og behandler billeder. - At undersøge specifikke nukleare processer i nærmere detaljer, udføre billed erhvervelse hver 5-10 s, så længe emissionen ikke falder væsentligt efter hyppig eksponering. Foretage en foreløbig analyse af fluorescens intensitet over forskellige tidsperioder for at bestemme det punkt, efter hvilket nøjagtigheden af de indsamlede data ikke længere er pålidelig1,3.
- I billed-erhvervelse og billedbehandling software, bruge maksimal intensitet projektion på billedet z-stakke at observere alle strukturer med høj fluorescens tæthed på et 2D plan uanset deres lodrette placering1,2, 3. Dette letter en hurtig undersøgelse af nukleare processer, der forekommer i forskellige voxels. Saml et Mid-focal lys-felt billede for at generere et referencebillede af cellerne under observation.
5. imageanalysis20,21
Bemærk: Billedanalyse i denne protokol udføres ved hjælp af Fiji. For andre analyseprogrammer og Fiji plug-ins Se tabel over materialer.
- Upload en devolveret billede ved at vælge den bio-formater importør funktion i menuen plugins . I pop op-vinduet import indstillinger skal du vælge hyperstack, standard farvetilstandog kontrollere Autoscale , før du trykker på knappen OK .
- Sørg for, at det viste vindue har det korrekte antal fluorescens kanaler og tidsrammer ved at rulleside læns på de respektive bjælker nederst. Gem som en TIFF-fil, som ikke komprimerer data og forhindrer tab af oplysninger.
- Åbn et billede, der indeholder en skaleringslinje, som genereres under databehandling af mikroskop-softwaren. Bestem pixel længden for skalalinjen ved hjælp af værktøjet lige streg for at tegne en parallel linje af samme størrelse, og vælg mål i menuen Analysér. Tilføj en skaleringslinje ved at angive billedets pixel-til-μm-forhold ved at vælge Angiv skalering i menuen Analysér.
- I pop op-vinduet Indstil skalering skal du angive den beregnede afstand i pixel og den kendte afstand i μm, angive pixel størrelsesforhold til 1,0, sætte micron som enhed af længdenog kontrollere den globale boks, før du klikker på Knappen OK .
- Brug indstillingen Angiv mål i menuen Analysér til at vælge forskellige parametre, der skal kvantificeres, når du vælger mål. I forbindelse med denne protokol skal du vælge følgende Metrics: område, omkreds, gennemsnitlig grå værdi, median, min & Max grå værdi, integreret tæthed, stak positionog display etiketten.
- Afhængigt af præcisionen af de indsamlede data, skal du indtaste mere end 1 for indstillingen decimal pladser og kontrollere den videnskabelige notation boks, hvis det er nødvendigt. Når du har anvendt kommandoen measure , vises værdierne for hver relevant parameter i et pop op-vindue med resultater . Gem resultaterne som en. csv-fil til fremtidig analyse i et statistikprogram.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at adskille et billede i dets konstituerende fluorescerende kanaler til bestemmelse af længden, medmindre der er signal interferens mellem de forskellige farver i hvilket tilfælde følge trin detaljeret nedenfor. - I tilfælde af signal interferens skal du vælge farve-og kanal værktøj i menuen billede og analysere hver farve separat. Hvis du vil måle længden af ikke-lineære strukturer, skal du højreklikke på linje værktøjet og bruge indstillingen segmenteret linje eller frihåndslinje til at spore de ønskede objekter.
- For lineære strukturer eller for at bestemme afstanden mellem to punkter, skal du bruge den lige linje funktion og vælg mål fra Analysér menu. Værdier for længde i μm vil automatisk blive føjet til de parametre, der tidligere er valgt under indstillingen Indstil mål .
- For at måle ændringer i signal størrelse og fluorescens intensitet, først oprette en region af interesse (ROI) bibliotek, som øger kvantificering nøjagtighed og letter hurtige målinger på tværs af en billedstak. Vælg farve -og kanal værktøj i menuen billede .
- I pop op-vinduet kanaler skal du kontrollere den farvekanal, som intensiteten eller området måles for. Vælg justerings -og tærskel funktionerne i menuen billede . Tjek den mørke baggrund boks, Vælg standard metode (medmindre andet kræves af de indsamlede data), og pluk rød for at overlejre de signaler af interesse.
Bemærk: Måling af protein stabilitet, bevægelse og lokalisering afhænger nøje af den farve tærskel, der bruges til at oprette ROI-biblioteker. Det er vigtigt at vælge den korrekte tærskel metode for den type fluorescerende markør signal, der skal visualiseres17,18. - Brug trylle værktøjet til at fremhæve hver enkelt interesse struktur, og tryk på bogstavet T på tastaturet for at føje det valgte investeringsafkast til vinduet til ROI Manager . Gentag denne proces for hvert udsnit (tidsramme) i billed stakken, og Gem alle ROIs ved at klikke på knappen mere og vælge Gem.
- Åbn den zippede ROI-mappe for at indlæse ROI Manager , og klik på hver ROI Identifier i venstre sidepanel. Vælg mål i menuen Analysér , og Gentag denne kommando på hvert ROI-id for at kvantificere de objekter, som interesserer sig for alle udsnit af billed stakken.
- Hvis celle forskydning ikke er et problem, og brændplanet forbliver det samme for alle skiver i stakken, klik på multi måling i ROI Manager. I pop op-vinduet skal du vælge mål alle udsnit i stedet for én række pr. udsnit for at gentage målingerne på tværs af billed stakken. Gem resultater som en CSV-fil, og analysér målinger i et statistikprogram.
- For flere nukleare signaler, der omfatter strukturen af interesse, skal du trykke på Skift -tasten, mens du vælger objekter med tryllestav værktøj til at oprette en enkelt Roi. Alternativt kan du oprette et ROI af konstant størrelse med det ovale værktøj til at omfatte alle de signaler af interesse.
Bemærk: Denne ovale fremgangsmåde kan være nødvendig for at måle og beskrive signal adfærden over et område, hvor fluorescens signalet ændres i størrelse og intensitet over tid. Signalintensitet, i dette tilfælde, er den gennemsnitlige signal tæthed over et givet område. - Kvalitativt bestemme samlokalisering af to fluorescerende signaler ved ændringen i farven på signalet overlap region. Men da samlokaliserings zonen indsnævrer, er det vanskeligere at skelne mellem signal overlap. I dette tilfælde skal du følge trinene nedenfor.
- Ved hjælp af kanal værktøjet, som beskrevet i trin 5,6, skal du tegne en lige linje over hvert af de pågældende signaler og vælge kommandoen plot Profile i menuen Analysér.
- Gentag dette trin for alle de pågældende farver ved hjælp af den samme tegnede linje.
- I pop op-vinduet plot of Sample , der vises efter hvert profilerings trin, skal du trykke på knappen liste for at hente vinduet afbildnings værdier og gemme målingerne for hvert signal som en CSV-fil.
- I et statistikprogram, oprette en graf, der plotter den grå værdi for hvert signal mod den tilsvarende placering (i μm) langs den tegnede linje. Manglende overlap mellem signal profil plots indikerer generelt manglen på samlokalisering.
Bemærk: Brug plottet profil værktøj på projicerede billeder til at undersøge signal samlokalisering. Dette er kun pålideligt, hvis en sådan overlapning også observeres gennem billedet z-stack.
- For at overvåge den dynamiske opførsel af fluorescerende proteiner over tid bruge multi Kymograph værktøj findes under Analysér menu. Det resulterende billede viser den fluorescerende signal bevægelse gennem en serie af kondenserede Snapshots i hver skive af z-stakken, som repræsenterer individuelle tidspunkter.
- Brug værktøjet kanaler som beskrevet i trin 5,6 til at isolere objektet af interesse i den korrekte kanal. Sørg for, at det markerede objekt eller den valgte struktur ikke skifter betydeligt gennem z-stakken. Placer en lige linje eller et rektangel over objektet, Vælg multi Kymograph -værktøjet i menuen Analysér , og Indtast den ønskede bredde på linjen, der oversætter objektet.
- Opret billedpaneler, der viser nuklear dynamik over et bestemt tidsvindue ved hjælp af kanal værktøjet som beskrevet i trin 5,6 og ved at vælge stabler og oprette montage værktøjer fra menuen billede. I pop op-vinduet Make montage skal du angive antallet af ønskede kolonner og rækker, angive en skaleringsfaktor på 1,0, vælge det første og sidste udsnit (tidsrammer) og ændre kantbredden til mindst 5, før du trykker på OK. Det er muligt at vælge, hvilke billeder i stakken til at vise ved at ændre intervaller, der passer til den ønskede sekvens.
- Hvis du vil generere en film, skal du uploade den ønskede hyperstak, vælge Gem som en AVI -fil i menuen filer , vælge ingen til komprimeringog angive en billedhastighed på 2-8 fps. Vælg kommandoen gør montage , mens du plukker sammensat i kanal værktøjet for at flette eller adskille alle farver, som indeholder billedet.
Bemærk: Der findes to AVI-filer (film 1-2) i denne protokol. Brug dem i Fiji for at prøve forskellige funktioner, der er fremhævet i trin 5. - Hvis du vil have vist en enkelt repræsentativ celle, skal du bruge Transformer og Roter fra menuen billede og angive rotationsgrader. Negative tal roterer objekter til venstre, mens positive værdier roterer objekter til højre. Når cellen er i den rigtige retning, skal du tegne et rektangel, der omfatter hele cellen gennem z-stakken eller i tidsrammerne af interesse og vælge Beskær fra menuen billede . Fortsæt som nævnt i trin 5,16 og 5.16.1 for at generere et billedpanel eller en film.
- Hvis du vil generere en film, skal du uploade den ønskede hyperstak, vælge Gem som en AVI -fil i menuen filer , vælge ingen til komprimeringog angive en billedhastighed på 2-8 fps. Vælg kommandoen gør montage , mens du plukker sammensat i kanal værktøjet for at flette eller adskille alle farver, som indeholder billedet.
- Føj en skaleringslinje til billedpanelet eller filmen ved at vælge værktøjer og Skaler linje i menuen Analysér. I vinduet Skaleringslinje skal du indtaste 5-15 for bredde i mikron for enkeltceller eller 100-250 for hele synsfelter, vælge hvid eller sort for farve, og vælg en passende placering for at placere skalalinjen.
- For film er det nyttigt at vise tids progression under nukleare begivenheder. Hvis du vil vise tidsskift mellem rammer, skal du vælge billede, klikke på stakke, bruge værktøjet tids Stamper , angive start rammen i tidsserien og vælge en passende placering til tidsvisningen.
Representative Results
Uanset om levende celle billeddannelse anvendes til mitose eller meiosis, er det afgørende at ansætte sunde fissions gærceller, før der foretages nogen form for observation. Kvaliteten af de resulterende data afhænger i høj grad af udgangsmaterialet. Hvis cellerne sulter på grund af næringsstof begrænsning eller overvækst, vil de vise overskydende vakuoler og nedsat Cellestørrelse (sult, figur 2a). For mitose eksperimenter, er det bedst at undgå at bruge celler, der viser cellulære stress (sult, figur 2a). Ellers vil eksperimentelle resultater være inkonsekvente og ureproducerbare. For at omgå denne begrænsning, vælge ordentlig vildtype kontrol og blive fortrolig med de forskellige fænotyper af mutanter af interesse. For eksempel, mitotiske celler sultet for 12 h ophører med aktivt at replikere DNA. Da Tos4-gfp-udtryk er associeret med G1/S-fase aktivitet22,23, logaritmiske celler, der bærer denne markør og en for nuklear division (Sad1-dsred10) Vis pan-nuklear Tos4-gfp udtryk, Sad1-dsred Foci adskillelse, og igangværende septation (tyder på aktiv DNA replikation og celle division) (log, figur 2a), mens udsultede celler viser ingen sådan aktivitet (sult, figur 2a). Dette resultat er i overensstemmelse med virkningerne af næringsstof begrænsning i fissions gær, som nedsætter transkriptionen i G1, aktiverer G1/S celle cyklus check point, og fremmer G0 Entry5. For meiose eksperimenter, celler skal vokse til en høj densitet, men uden at nå den stationære fase. Bagefter, celler af begge Mate typer blandes og inkuberet sammen i lav kvælstof medier. Manglende mate, som det er tilfældet, når cellerne ikke er tilstrækkeligt sultet af kvælstof, vil forhindre dem i at komme ind meiose (ineffektiv, figur 2b). Robust flokkulering af parring cellesuspensionen øger celle-til-celle interaktion og dermed indikerer vellykket parring og effektiv meiotisk induktion (effektiv, figur 2b).
Agrose gel Pads og fysisk forstyrrelse af celle klumper garanterer korrekt visualisering af enkeltceller eller ASCI (Log, figur 2a; Effektivt, figur 2b). Puder skal give en stiv, men fugtig platform, hvor cellerne samtidig er fastgjort på plads og beskyttet mod udtørring. Desuden skal puder være tykke nok til at modstå ændringer på grund af fordampning og give en nivelleret overflade, der tillader korrekt fokus i hele billedet erhvervelse (figur 1c). Dækseddel rotation er nødvendig for at adskille og sprede celler inden for parring aggregater (figur 1f; Effektivt, figur 2b). Uden dette trin observeres få ASCI men talrige haploide celler, fordi ASCI bliver fanget i utilgængelige lag af parring klumper, mens haploide celler er frie til at udfylde alle tilgængelige enkeltlags pletter (figur 2b). Selv for mitotiske eksperimenter, hvor celle sammenklumpning er mindre problematisk, flytter Cover slip rotation celler rundt om puden for at oprette et enkelt celle lag med tilstrækkelig plads mellem cellerne til at reducere fortrængnings effekterne og tillade celle duplikering (log, figur 2a ).
Atb2 er en α-Tubulin komponent involveret i kromosom adskillelse i fission gær mitose og meiose7,14. Når fluorescently Tagged, denne cytoskelet komponent giver mulighed for undersøgelse af de stadier, der karakteriserer nuklear adskillelse i mitose. Under prophase (0 '-20 ', figur 3a), nukleation af mitotisk spindel forekommer i den nukleare side af spindel pole organer (spbs), som afsløret af Atb2-mrfp fibre sat mod en HTT1-gfp5 pan-nuklear baggrund. Under metaphase-anaphase-overgangen (20 '-40 ', figur 3a) strækker den mitotiske spindel udad, og kernen opdeles i to. Som cellen indtaster telophase (60 '-80 ', figur 3a), udvider Atb2-mrfp bidirektionelt, indtil kromosomer er helt adskilt. Efter dette punkt, regruppere Atb2-mRFP-fibre og spredes over cellens overflade for at genvinde deres Interphase-form i hver af de resulterende datter celler. Cytokinesis (> 120 ', figur 3a) forekommer kun efter en septum former og opdeler cellen ved fission. Efter ændringer i Hht1-GFP intensitet over en mitotisk cyklus afslører tre vigtige trin i nuklear dynamik: metaphase-anaphase (medium intensitet, DNA komprimering: 20 '-40 ', figur 3a-B), telophase (lav INTENSITET, DNA-adskillelse: 60 '-80 ', Figur 3A-B) og G1 (stigende intensitet, DNA-duplikering: 100 '-120 ', figur 3a-b). På samme måde, men ved hjælp af celler, der kun bære Hht1-mrfp og ansætte multi-kymograph værktøj (Se trin 5,15) i Fiji, er det muligt at observere mitotiske division fra Metaponto til at telophase og evaluere de nukleare bevægelser involveret under ordentlig søster kromosomale adskillelse (normal, figur 3c). Mis-segregation kymografer viser signal aktivitet mellem de to vigtigste nukleare veje, hvilket indikerer mulig mis-segregation på grund af kromosom fragmentering eller uhensigtsmæssig kromatid separation (halter, figur 3c).
Som tidligere nævnt, i spirende og fissions gær, er Tos4 transskriberet i G1 og funktioner under DNA-replikering i S fase22,23. Dette kan observeres i en kymograph, hvor Tos4-gfp ekspression stiger i kernen efter Sad1-dsred10 Foci flytte til modsatte retninger (indikerer nuklear division), men før septum former, der går forud for cytokinese (39 ', figur 3D ; 36 ', figur 3e). Fasen med høj Tos4-gfp-aktivitet begynder i slutningen af M-G1/S-overgangen (45 ', figur 3e) og slutter i G2 (> 60', figur 3e), lige efter celledelingen. Mens den er meget diffbrugt under G1, øger Tos4-gfp-signal intensiteten post kaldelse og i hele S-fasen og co-localizes med adskilte Sad1-dsred Foci (45 '-60 ', figur 3e). Dette resultat afslører septation periode i fissions gær, når genom duplikering er begyndt i datter celler (G1/S), men cytokinese er ikke forekommet endnu.
Hht1 er Histon H3 i fission gær og er almindeligt modificeret med fluorescerende Tags til at visualisere nukleare DNA5,14. I mitose, som celler overgang fra Metaponto til telophase (20 '-120 ', figur 3a), observeres to skelne ændringer til nuklear masse. Den første ændring indebærer en indskrænkning af den nukleare størrelse i Metaponto (20 ', figur 3a), mens den anden viser Nucleus opdeling under kaldelse (40 ', figur 3a). Ud over at dele disse ændringer med mitotiske celler udviser meiotiske celler nukleare svingning (dvs. hestehandel) (-100 ' til-50 ', figur 4a-B) under homologe rekombination og yderligere reduktion af kerne størrelsen i slutningen af kaldelse II (70 '-90 ', Figur 4a). Hht1-mRFP anvendes til at undersøge mis-segregation fænotyper såsom tilbagestående eller fragmenterede kromosomer (halter, figur 3c). Det er også ansat til at observere og beskrive den nukleare dynamik i hver af faserne i meiose (figur 4a-B). Den nukleare masse er stor og svinger i størrelse under en stor mængde af heste (HT:-100 ' til-50 ', figur 4a-B)). Da cellerne indtaster metadata (MT:-40 ' til 0 ', figur 4a-B), reduceres den nukleare størrelse og svingningen, hvilket er i overensstemmelse med øget kondensations aktivitet på dette stadie. Fremkomsten af både kaldelse i (MI: 10 '-60 ', figur 4a-b) og II (MII: 70 '-90 ', figur 4a-b) er forbundet med yderligere nuklear reduktion og mangel på nuklear bevægelse, som korrelerer godt med de to nukleare divisioner, der karakteriserer meiose I og II (MI & MII). Således er meiose forbundet med nukleare størrelses udsving, når homologe kromosomer justeres og rekombineres og med nukleare størrelses reduktioner efter to runder af kromosom separation. Alleler, der ændrer disse nukleare dynamik er sandsynligvis forbundet med genom stabilitet forordning i meiose12,13.
Rec8 er α-kleisin-under enheden af meiotisk samhørighed i fissions gær. Det er indlæst på kromatin efter DNA-replikation (Mei-S) og holder søster chromatids bundet til hinanden indtil kaldelse II. Efter metafase I, Rec8 er fjernet fra kromosom arme ved separase og er beskyttet på centromer af Sgo1-PP2A. Ved udgangen af ligner segregation, Rec8 er også elimineret på centromere, hvilket giver mulighed for søster kromosomale separation (figur 5a)6,24. Rec8-GFP sammen med markører for kromosom adskillelse såsom Sad1-DsRed eller Hht1-mRFP giver mulighed for visualisering af samhørigheden dynamik under meiosis. Rec8-gfp-signalet er pan-nuklear under Mei-S (< <-90 ', figur 5a-b), profase I (-90 ' til-50 ' , figur 5a-b) og metafase I (-40 ' til 0 ', figur 5a-b). Denne observation afslører sammenslutningen af Rec8-GFP langs kromosomer akser, der følger DNA-duplikering. Da cellerne indtaster kaldelse I (10 ', figur 5a-B), falder Rec8-gfp-intensiteten i hele kernen, men forbliver stærk i centromere, hvor der er fokus på hver atommasse (20 '-70 ', figur 5a-B). Dette resultat er i overensstemmelse med Rec8-gfp nedbrydning langs kromosom arme, men ikke på centromere, der ensues efterligner segregation. Før kaldelse II forsvinder Rec8 Focus og frigør søster chromatids til separation i MII (70 '-80', figur 5a-B). Rec8-GFP-mærket er derfor nyttigt til at undersøge forhold, der forstyrrer etableringen, fjernelsen og den overordnede stabilitet af den meiotiske samhørighed. Parret med en markør for nuklear division såsom Hht1-mrfp5,13, Rec8-gfp kan anvendes til at løse spørgsmål om, hvordan samhørighed timing og stabilitet før og under meiose påvirker korrekt kromosom adskillelse12 ,13. Denne protokol omhandler ikke proteiner, hvis dynamik primært forekommer i cytosol. Men tabel I viser et par cytosolisk proteiner, der er almindeligt anvendt til at undersøge cytoskelet og membran processer er nødvendige for endokytose, exocytose, og cytokinese blandt andre processer.
Figur 1: forberedelse af agrose Pads til live-Cell Imaging. (A) klargøring af slide forberedelse samlet ved hjælp af en pipettespids holder, laboratorie tape og mikroskop slides. Placering af slides vinkelret på hinanden skaber en lomme, hvor den agrose pad former. Tilsætning af Lab tape stykker i siderne justerer agrose pad bredde til de nødvendige specifikationer. (B) smeltet agopstået er lad at køle ned, før du indstiller det på mikroskop slides til at gøre puder. I dette trin er det nødvendigt at dispensere den agopstået volumen langsomt for at undgå at skabe luftbobler. (C) den øverste slide er placeret på den dispenserede agerede spot til at danne en cirkulær pad med en lige overflade, selv kanter, og ingen synlige agopstået revner. (D) efter at have sat en prøve af cellesuspension på agrose pad, vendes glide og Placer oven på et fnugfri papirhåndklæde for at fjerne ekstra væske medium. (E) Placer forsigtigt en dækseddel på agrose pad, og sørg for ikke at fælde eventuelle luftbobler og kontrollere, at fokusplanet er fladt for at undgå celle Skift og fokus problemer. (F) langsomt og forsigtigt, Roter dækglas med uret for at forstyrre celle klumper og for at generere en celle enkeltlags, der giver mulighed for celle udvidelse og bedre celle visualisering. (G,H) Brug en opvarmet kulbrinte blanding til at forsegle agopstået puder og give dem mulighed for at ækvibrere til den ønskede temperatur før billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: picking de rigtige celler. (A) top paneler viser fission gær celler tilbage til at SULTE i EMM plus kosttilskud for 72 h og nederste panel viser celler gennemgår logaritmisk vækst. I celler, der er overladt til at sulte, kan små celle morfologier værdsættes. Den røde åbne pil viser vakuolære granulat, der er karakteristiske for sult. I logaritmiske kulturer, celler viser aflange morfologier og septa (rød pil) vrimler, indikerer aktiv cykling dynamik. De højre paneler viser celler, som udtrykker Tos4-GFP-og Sad1-DsRed-signaler under hungersnød og spredning. Pan-Nuclear Tos4-GFP-udtryk og Sad1-DsRed-signaler, der lokaliserer til modsatrettede celle poler, ses under aktiv spredning, men ikke i hungersnød. (B) toppanelet viser celler af samme Mate-type (h +) undlader at parre sig effektivt. Den røde åbne pil viser et par vakuolære celler, der gennemgår karyogamy. Dette er ikke usædvanligt i kulturer af h + celler, hvor 10% af cellerne kan skifte Mate-type til h-. Bundpanelet viser ASCI som følge af effektiv parring. Zygotic ASCI tage flere former, herunder zig-zag (rød pil) og banan celle former (rød åben pil). Scale bar = 5 μm i længden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mitotisk nuklear dynamik. A) proteiner fra histone H3 (Hht1-gfp) og mikrotubulus (Atb2-mrfp) blev fulgt i en mitose cyklus (120 min). Individuelle signaler for Hht1-GFP og Atb2-mRFP vises i sorte og hvide paneler, mens BF-fletningen viser dem i deres respektive farver. B) kvantificering af Hht1-mgfp-intensitet over en mitotisk cyklus. Ændringen i Hht1 niveauer er en indikation af nuklear division under mitose og DNA-duplikering i G1. C) kymografer, der udviser normal eller unormal adskillelse i mitose, hvor de resulterende nukleare veje enten bifurer og bevarer DNA-integriteten eller afviger og fremmer kromosom fragmentering eller tidlig kromatid separation. (D,E) Kymograph og Mikrograf paneler viser varigheden af M-til-G1/S afsløret ved adskillelse af Sad1-DsRed og udseende af nukleare Tos4-GFP signaler. Bemærk de midterste paneler i E , som blev genereret ved hjælp af ilden lut i Fiji at skabe en intensitet-gradueret termisk kort, der letter identifikationen af pletter med høj TOS4-gfp udtryk; i dette tilfælde, lokaliseret til kernen og overlappende Sad1-DsRed signaler, som forventet. Scale bar = 5 μm i længden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: meiotisk nuklear dynamik. A) panel serier med bevægelse, komprimering og opdeling af kernen (Hht1-mrfp) under meiosis. Hestehandel (HT) viser omfattende side-til-side nukleare svingninger efterfulgt af metaphase (MT), hvor nuklear lateral bevægelse falder og helt standser lige før kaldelse I. I meiose i (MI) opdeles den største nukleare masse i to, mens der i meiose II (MII) dannes fire kerner under processen med søster kromosomale separation. B) kvantificering af ændringer i det nukleare område (Hht1-mrfp) i prophase, metaphase, MI & MII. Nukleare område er dynamisk under HT Oscillations, bliver kondenseret i MT, og yderligere fald i størrelse under MI & MII, hvor lidt nuklear bevægelse observeres (lang nuklear akse). Måling af den længste nukleare akse (lang nuklear akse) er baseret på ideen om, at som en cirkel strækker sig, det ophører med at have en konstant diameter og genererer mindst to hovedakser: lang og kort. Således, når overvågning ændringer i kernen, ændringer i enten den lange eller korte akse giver indikationer af nuklear bevægelse. Scale bar = 5 μm i længden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: meiotisk sammenhængen i dynamikken. A) panel serier,derviser, hvordan REC8-gfp-signalskift korrelerer med meiotisk kerne dynamik. Under HT og MT, Rec8-GFP signal er pan-nuklear og følger nuklear bevægelse (Hht1-mFRP). I MI, Rec8-GFP spredes fra kernen, forlader kun et par Foci, som er i overensstemmelse med Rec8 fjernelse fra kromosom arme og etablering af Sgo1-PP2A beskyttelse på centromere. Da cellen nærmer sig MII, begynder Rec8-gfp Foci at forsvinde og ses ikke længere lige før kaldelse II. B) kvantificering af REC8-gfp-INTENSITET fra HT til MII. Svarende til hvad der er set i en, gfp signal er høj gennem HT og MT, væsentligt falder under mi og helt forsvinder i MII. Dette mønster bekræfter sammenhængen i dynamikken ved kromosom arme og centromere, hvor det holder søster kromatid'er tøjret, indtil de er klar til at blive separeret i MII. Scale bar = 5 μm i længden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protein | Funktion | Kommentarer | Tag | Referencer | ||
| Hht1 | Histone H3 involveret i DNA-emballering | Bruges til at undersøge kromosom dynamik | Hht1-mRFP | 5, 14 | ||
| Tos4 | Tos4 funktion opstår under G1 fase | Ansat til at studere G1 timing | Tos4-GFP | 22, 23 | ||
| Rad21/ Rec8 | Sammenhængen i de under enheder, der er involveret i at holde søster kromatid'er | Bruges til at analysere samhørigheds stabiliteten under mitotisk (Rad21) og meiotisk adskillelse (Rec8) | Rad21-GFP/Rec8-GFP | 6, 24 | ||
| Rad11 | RPA-aktivitet opstår under mitotisk DNA-reparation, meiotisk rekombination og ender i metafase | Ansat til at studere DNA-reparation i mitose og rekombinationsdynamik i meiose | Rad11-YFP | 5, 13 | ||
| Rad52 | Rad52 acivitet finder sted under mitotisk DNA-reparation og meiotisk rekombination | Ansat til at studere DNA-reparation i mitose og rekombinationsdynamik i meiose | Rad52-CFP | 5, 13 | ||
| Cnp1 | Histone H3 cenp-A lokaliserer specifikt på centromer | Anvendes til at følge kromosom adskillelses dynamik i mitose og meiose | Cnp1-mCherry | 13 | ||
| Swi6 | HP1 hæfte homologen protein involveret i heterokromatin dannelse | Anvendt til at studere heterochromatin-mobilisering hos centromer og telomerer | Swi6-GFP | 13 | ||
| Sad1 | Sad1 er involveret i lokalisering af spindel pole Body til den nukleare konvolut | Anvendes til at analysere kromosom adskillelse i mitose og meiose | Sad1-mCherry | 10 | ||
| CYTOSOL & MEMBRAN | ||||||
| Atb2 | Tubulin alpha 2 involveret i mikrotubulus cytoskelet organisation | Anvendes til at undersøge kromosom adskillelse i mitose og meiose | Atb2-mRFP | 7, 14 | ||
| Ync13 | Exocytose og endocytose regulator involveret i vesikel-medieret transport | Ansat til at studere cellevæggens integritet under cytokinese | Ync13-mECitrine | 25 | ||
| Rlc1 | Myosin II underenhed involveret i kontraktile ring sammentrækning | Bruges til at udforske dynamikken i septum modning og sammentrækning | RIc1-mCherry | 25 | ||
| Ccr1 | NADPH-cytochrom P450 reduktase, der er en del af ER, plasma, og mitochrondrial ydre membran | Til at undersøge membran-associeret dynamik såsom endokytose, exocytose og cytokinese | Ccr1N-GFP | 5 | ||
| Gef1 | Rho guanyl-nukleotid udvekslings faktor involveret i etablering og vedligeholdelse af celle polaritet | Bruges til at undersøge global, mikrotubulær-afhængig celle polaritet dynamik | Gef1-mCherry-GBP | 26 | ||
| Fus1 | Formin involveret i actin fusion Focus assembly under cytogamy | Anvendes til at studere fusions dynamik forbundet med fission gær parring | Fus1-sfGFP | 27 | ||
| Mnn9 | Mannolsyltransferase-underenhed involveret i protein N-forbundet glykosylering i Golgi-apparatet | Ansat til at studere gods modning i Golgi, da det skrider frem fra CIS-Golgi til Trans-Golgi | Mnn9-mCherry | 28 | ||
| Num1 | Kortikale forankrings faktor for dynein involveret i hestehandel | Anvendes til at undersøge mitokondria-afhængig dynein forankring under nukleare svingning i meiotiske prophase i | Num1-yEGFP | 29 | ||
Tabel 1: markører for nuklear og cytosolisk dynamik.
Film 1: M-til-G1/S overgang viser spindel pole Body (Spb; Sad1-DsRed) adskillelse forud for septation og ophobning af Tos4-GFP nukleare signal. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Movie 2: færdiggørelse af mitotisk cyklus viser mikrotubulus (Atb2-mrfp) udvidelse korrelation med nuklear (Hht1-gfp) division. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Discussion
Live-Cell Imaging under mitose og meiose giver mulighed for at undersøge nuklear dynamik uden væsentligt at forstyrre fission gær fysiologi under dataindsamling. Der skal dog udvises forsigtighed for at sikre, at cellerne vokser til de ønskede tætheder uden miljømæssige belastninger. og for meiosis, at cellerne er afbildet i tidspunktet for den terminale differentiering og ikke for tidligt eller sent. Overskydende cellulære fortrængning, sult og uhensigtsmæssige vækst temperaturer er almindelige faktorer, der bidrager til irreproducerbare observationer. Hertil kommer, under stammen byggeri, er det afgørende at teste, at fluorescerende Tags ikke forstyrrer funktionerne af Target gener eller indvirkning samlede celle egnethed. Manglende nøje inspektion af fænotyper af stammer, der transporterer fluorescerende markører kan resultere i inkonsekvente og uforlignelige resultater på tværs af lignende genotyper.
Selvom mikroskop agopstået puder er enkle at samle, kan de også udgøre en forhindring i at få værdifulde billeddannelse data. Oprettelse af agrose Pads er så simpelt som at placere tre mikroskop glider parallelt med hinanden, dispensering smeltet agopstået på den midterste slide, og sætte et dias, der krydser toppen af de andre slides. Det er imidlertid nyttigt at samle et slide-Maker apparat, der giver mulighed for bredde modifikationer til fremstilling af resistente, situationsspecifikke agrose Pads. En simpel slide-Maker, der giver pad bredde fleksibilitet består af en platform (pipettespidser indehaveren eller bænken), to mikroskop slides, og lab tape fungerer som pad-bredde justeringsmekanismen (figur 1a). Nøjagtig pad tykkelse vil afhænge af Imaging tid krav, agopstået mærke, temperatur, dækglas fugemasse, fordampning sats, etc. Det er derfor vigtigt at kalibrere billed systemet før dataindsamlingen for at øge den tekniske reproducerbarhed og forbedre kvaliteten af levende celle billeder1,2,3. Pad overflade, stivhed, og sammensætning er afgørende ved længerevarende billed erhvervelse. Agopstået har lav baggrunds fluorescens, kan let formes, og i den relevante koncentration, modstår strukturel deformation på grund af fordampning. Desuden, kombinere fission gær medier med agopstået ikke kompromitterer billedkvaliteten og giver mulighed for udvidet observation af flere mitoser og meiose cyklusser. Det er også vigtigt at undgå luftbobler for time-lapse mikroskopi. Indvendige agrose Pads og inden i prøven, luftlommer ekspandere over tid, forårsager celle-skiftende og forstyrre brændfly. Forudsat celler effektivt spredes fra hinanden ved dækglas rotation, kan forskerne følge mitotiske processer på tværs af flere generationer og meiotiske begivenheder fra nuklear fusion til sporulation. At gøre og vælge den rigtige pad til billeddannelse eksperimenter tager tid at mestre, men når det er opnået, kan bidrage til meget informative mikroskop observationer.
Som det er tilfældet med andre metoder, er levende celle mikroskopi ikke fri for tekniske begrænsninger. Brugen af fluorescently-mærkede proteiner introducerer grænser til eksperimenter, der begrænser omfanget af, hvad der kan undersøgt. Foto-blegning og foto-toksicitet er problemer typisk for langvarig billed erhvervelse. De kan modvirkes ved ikke at udsætte celler for korte bølgelængder for længe eller for ofte. For eksperimenter, der involverer GFP, CFP, YFP, mRFP, og DsRed, typiske fluorescerende proteiner anvendes i fission gær Live-Cell Imaging, det er almindeligt at ansætte 5-15% excitation lys og 100-500 MS eksponeringstid for rutine eksperimenter. Disse parametre ændrer sig dog i henhold til forskeres specifikke eksperiment krav. Desuden z-stakke består af 9-13 sektioner med 0,5 μm afstand ved hjælp af en 60x mål er nok til at løse tykkelsen af en fission gær celle. Desuden er det vigtigt at bekræfte, at fluorescerende markører ikke forstyrrer korrekt regulering eller funktion af målproteiner eller genererer spuriøse fænotyper. Det er derfor tilrådeligt at konstruere stammer, der indeholder forskellige fluorescerende og affinitets Tags for det samme målgen til at underbygge observationer med forskellige midler. Det er endvidere forskernes ansvar at sikre, at eksperimentelle parametre kan gengives på tværs af eksperimenter, og at de indsamlede data er egnede til downstream-analyse1,3. Ingen teknologi kan erstatte den tidstestede praksis med omhyggeligt at validere eksperimentelle systemer ved omhyggelig observation og grundig undersøgelse af linearitet i påvisning fluorescerende signaler.
Endelig er det afgørende at analysere mikroskopi data i formater, der ikke ændrer RAW-billeder. Fiji giver fremragende dokumentationsværktøjer til at holde styr på rå data målinger og giver forskerne mulighed for at undersøge forskellige celle parametre i en enkelt session. Disse funktioner, samt dens rigdom af online tutorials og omfattende litteratur dækning, gøre Fiji et vigtigt redskab til at måle, analysere og præsentere levende celle billeddannelse data, der beskriver den nukleare dynamik af fissions gær i mitose og meiosis.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Natalia La Fourcade og mon LaFerte for at gøre forberedelsen af dette manuskript til en mere fornøjelig bestræbelse. Takket være medlemmer af Forsburg Lab, der bidrog til færdiggørelsen af dette arbejde med deres indsigt, eksperiment ideer, og moralsk støtte. Dette projekt blev støttet af NIGMS R35 GM118109 til SLF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| Yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
- Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
- Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
- Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
- Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
- Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
- Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
- Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
- Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
- Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
- Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
- Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
- Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
- Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
- Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
- Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
- Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
- Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
- Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
- Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
- Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).
