Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøkelse av mitotisk og Meiotic fisjon gjær Nuclear Dynamics av fluorescens Live-Cell mikroskopi

Published: June 24, 2019 doi: 10.3791/59822
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Program in Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 2Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

Summary

Her presenterer vi Live-celle Imaging som er en ikke-giftig mikroskopi metode som gjør det mulig for forskere å studere protein atferd og kjernefysiske dynamikk i levende fisjon gjærceller under mitose og meiose.

Abstract

Live-celle Imaging er en mikroskopi teknikk som brukes til å undersøke celle og protein dynamikk i levende celler. Dette tenkelig metoden er ikke giftig, vanligvis ikke forstyrrer celle fysiologi, og krever minimal eksperimentell håndtering. De lave nivåene av teknisk interferens gjør det mulig for forskere å studere celler på tvers av flere sykluser med mitose og observere meiose fra begynnelse til slutt. Ved hjelp av fluorescerende koder som grønn fluorescerende protein (GFP) og røde fluorescerende protein (RFP), kan forskerne analysere ulike faktorer som funksjoner er viktig for prosesser som transkripsjon, DNA-replikering, samhold, og segregering. Sammen med dataanalyse ved hjelp av Fiji (en gratis, optimalisert ImageJ versjon), tilbyr live-celle Imaging ulike måter å vurdere protein bevegelse, lokalisering, stabilitet og timing, samt kjernefysiske dynamikk og kromosom segregering. Men som tilfellet er med andre mikroskopi metoder, er live-celle Imaging begrenset av den iboende egenskapene til lys, som satte en grense for oppløsnings kraft ved høye forstørrelser, og er også følsom for photobleaching eller Phototoksisitet ved høy bølgelengde Frekvenser. Men med litt omsorg, etterforskere kan omgå disse fysiske begrensningene ved nøye å velge riktig forhold, stammer, og fluorescerende markører for å muliggjøre den aktuelle visualisering av mitotisk og meiotic hendelser.

Introduction

Live-celle mikroskopi tillater forskere å undersøke kjernefysiske dynamikk uten å drepe fisjon gjærceller og eliminerer behovet for dødelige fiksativene og flekker. Det er mulig å observere stabilitet, bevegelse, lokalisering og timing av fluorescensmerkete merkede proteiner som er involvert i viktige hendelser som kromosom replikering, rekombinasjon, og segregering, i tillegg til membranen og cytoskjelettkomponenter Bevegelser. Ved å opprettholde celle levedyktighet og ikke-giftig signal deteksjon, det er minimal fysiologisk inntrenging. Når den utføres riktig, kan denne mikroskopi metoden redusere forvirrende effekter som oppstår fra den utvidede tekniske håndteringen eller fra falsk kjemisk reaktivitet. Videre, under et eksperiment, kan forskerne gjøre relevante observasjoner av fisjon gjær ernæringsmessige og stress tilstander, proliferativ effektivitet, og apoptotisk status som indikerer upassende bildebehandling parametere eller unormal celle fysiologi1 ,2,3.

Mitose og meiose er preget av kjernefysiske og cellulære divisjon. I meiose, i motsetning til mitose, er genetisk innhold halvert som overordnede celler gir opphav til datteren celler4. Ettersom sann tids avbildning gir en temporal dimensjon i tillegg til den romlige relasjonen, kan et stort antall celler undersøkes i sanntid. Live-Cell mikroskopi har gjort det mulig for forskere å undersøke dynamikken i kjernefysisk divisjon ved hjelp av fluorescerende koder for histoner5, cohesin under enheter6, mikrotubuli7, centromeres8, kinetochores9, komponenter i spindel Pol kroppen (SPB)10, og de av kromosom passasjer kompleks (CPC)11. Utenfor kromosom raseskille apparat, har Live-celle Imaging også fanget atferden til proteiner nødvendig, men ikke direkte involvert i kromosom segregering. Funksjonen av disse proteinene har vist å påvirke replikering, kromosom rekombinasjon, kjernefysisk bevegelse, og kromosom vedlegg til mikrotubuli12,13,14. Disse observasjonene har bidratt til en bedre forståelse av cellulære hendelser hvis funksjonelle komponenter ikke var mottagelig for biokjemiske eller genetisk undersøkelse. Med nye fremskritt innen mikroskopi teknologi, vil begrensninger som dårlig oppløsning, photobleaching, Phototoksisitet og fokus stabilitet minske, og dermed tilrettelegge for bedre sann tids observasjoner av mitotisk og meiotic kjernefysiske dynamikk1, 2,3. Meiose er spesielt utfordrende som det er en Terminal differensiering vei som krever nøye med timing.

Målet med denne protokollen er å presentere en relativt enkel metode for å undersøke sanntids fisjon gjær kjernefysiske dynamikk i mitose og meiose. For å oppnå dette, er det nødvendig å bruke celler som ikke har vært utsatt for miljømessige stress, forberede agarose pads som tåler langvarig bildebehandling, og montere celler ved tetthet som letter visualisering av enkelt celle dynamikk. Videre gjør denne protokollen bruk av celler som frakter fluorescensmerkete merkede proteiner som fungerer som nyttige markører for kjernefysisk Kinetics (Hht1-mRFP eller Hht1-GFP), kromosom segregering (Sad1-DsRed), cytoskeleton dynamikk (Atb2-mRFP), transcriptional aktivering i G1/S (Tos4-GFP), og samhold stabilitet i meiose (Rec8-GFP). Denne metoden introduserer også flere kjernefysiske og cytosolic markører (tabell I) som kan brukes i ulike kombinasjoner for å løse spørsmål om spesifikke cellulære prosesser. Videre er grunnleggende Fiji verktøy kjennetegnet for å hjelpe forskere behandle Live-celle bilder og analysere ulike typer data. Styrken i denne tilnærmingen stammer fra bruk av sanntids observasjoner av protein dynamikk, timing, og stabilitet for å beskrive prosesser som er integrert for riktig utførelse av mitose og meiose.

Protocol

1. Media forberedelse15,16

  1. Stock-løsninger
    1. Forbered en 50x saltlager løsning ved å legge 52,5 g MgCl2· 6h20, 0,735 g CaCl2· 2h20, 50 g av KCl, og 2 g av na2S04 i en flaske inneholdende 1 L av destillert vann. Bland løsningen grundig og sterilisere ved filtrering. Plasseres ved 4 ° c for langtidsoppbevaring.
    2. Lag en 1, 000x vitamin lagerløsning ved å blande 1 g Pantotensyre syre, 10 g nikotins syre, 10 g Inositol, og 10 mg biotin i en flaske som inneholder 1 L destillert vann. Bland løsningen godt og sterilisere ved filtrering. Oppbevares ved 4 ° c for langtidsoppbevaring.
    3. Forbered en 10, 000x Minerallager løsning ved å tilsette 5 g borsyre syre, 4 g MnSO 4, 4 g av ZnSO4· 7H2o, 2 g av FeCl2· 6h2O, 1 g av KI, 0,4 g av molybdic syre, 0,4 g av CuSO4· 5h20 , og 10 g sitronsyre i en flaske som inneholder 1 L av destillert vann. Bland løsningen grundig og sterilisere ved filtrering. Plasseres ved 4 ° c for langtidsoppbevaring.
    4. Lag individuelle næringsstoffer lager løsninger ved å legge 7,5 g av enten adenine, leucine, histidin eller lysin i en flaske som inneholder 1 L av destillert vann. Bruk bare 3,75 g for å lage den uracil løsningen. Sterilisere løsninger etter autoklavering.
      Merk: Over tid, uracil precipitates ut av løsningen. For å bringe inn i løsningen igjen, varm i mikrobølgeovnen på 60% strøm i 10 s trinn eller plass i et 55 ° c vannbad i 20 min. snurr den varme løsningen til alle uracil klumper forsvinner.
  2. Gjærekstrakt pluss kosttilskudd (YES)
    1. I en 2 L kolbe, tilsett 1 L av destillert vann, 5 g gjærekstrakt base, 30 g glukose, og 225 mg hver av adenine, uracil, L-histidin, L-leucine, og L-lysin. Legg til 20 g av agar å gjøre solid medium.
    2. Bruk en magnetisk røre bar for å fullstendig oppløse ingrediensene i løsningen. Agar vil smelte etter at mediet er sterilisert med autoklavering.
      Merk: For enkelhets skyld er klar til bruk Ja pulver også kommersielt tilgjengelig.
  3. Edinburgh minimal medium (EMM) og pombe glutamat medium (PMG)
    1. I en 2 L kolbe, kombinere 1 L destillert vann med 3 g kalium hydrogen ftalat, 2,2 g av na2HPO4, 5 g av NH4CL, 20 g glukose, 20 mL saltlager løsning, 1 ml vitamin lagerløsning og 0,1 mL Minerallager løsning. Erstatt NH4Cl med 2,2 g av L-Glutaminsyre acid monosodium salt for å forberede PMG. For å gjøre det solide mediet, tilsett 20 g agar.
    2. Ved hjelp av en magnetisk rør bar, oppløse ingrediensene grundig. Agar vil smelte etter at mediet er sterilisert med autoklavering. Legg til næringsrike lager løsninger etter behov før bruk. For hver 1 L medium, tilsett 15 mL hver av adenine, leucine, histidin, og lysin. Bruk 30 mL for uracil, siden det er mindre konsentrert enn de andre næringsstoffene.
      Merk: For enkelhets skyld, er klar til bruk EMM og PMG pulver også kommersielt tilgjengelig.
  4. Malt ekstrakt (ME)
    1. Bruk en flaske på 2 liter til å blande 1 L destillert vann med 30 g malt ekstrakt og 225 mg hver av adenine, uracil, histidin og leucine. Juster pH til 5,5. Inkluder 20 g av agar å gjøre solid medium.
    2. Oppløse komponenter i løsningen ved hjelp av en magnetisk røre bar. Agar vil smelte etter at mediet er sterilisert med autoklavering.
  5. Sporulation agar med kosttilskudd (SPAS)
    1. I en 2 L kolbe, tilsett 1 L destillert vann, 10 g glukose, 1 g KH2PO4, 1 mL vitamin lager, 45 mg hver av adenine, uracil, histidin, leucine, og lysin hydrochloride. Legg til 20 g av agar å gjøre solid medium.
    2. Bruk en magnetisk røre bar å grundig kombinere ingredienser. Agar vil smelte etter at mediet er sterilisert med autoklavering.

2. fisjon gjær kultur15,16

  1. Bruk Ja solid medium for å våkne opp fisjon gjær stammer fra kryogene bevaring. Avhengig av temperatur kravene for hver stamme, ruge ved enten 25 ° c eller 32 ° c i 3-5 dager.
  2. Når koloniene er synlige, utarbeide en for rett flytende kultur. Plukk celler fra individuelle kolonier og vaksinere dem i reagensrør som inneholder 3 mL Ja flytende medium. Vokse i riktig temperatur til midten eller slutten av loggen fase.
    Merk: For riktig lufting, bruk rør eller flasker med volumer på minst 5x større enn det tiltenkte flytende kultur volumet. Risting hastigheter mellom 150-220 rpm er vanlig for rutinemessig kultur vekst.
  3. Dispensere 250-500 μL av Start kulturen til en 50 mL kolbe som inneholder 9,5-9.75 mL enten YES, EMM eller PMG pluss egnede kosttilskudd. Tillat cellene å vokse til ønsket tetthet og sjekk under mikroskopet for riktig celle morfologi og ernæringsmessig tilstand.
    Merk: For å lagre vekket stammer i opptil en måned, forsegle YES-plater med para fin tape og plasser ved 4 ° c.

3. prøveforberedelse2

  1. Oppsett av mikroskop
    1. Tilsett 2 g agarose i et 500 mL beger som inneholder 100 mL enten minimal medium pluss kosttilskudd (mitose) eller flytende SPAS (meiose). Varm den agarose løsningen i en mikrobølgeovn på 60% strøm i 10 s trinn eller plasser i et 55 ° c vannbad i 10 min. virvel løsningen for å sikre effektiv smelting. Forbered agarose Slide-Making Setup (figur 1a) for å sikre rask pad forberedelse og forhindre smeltet agarose fra solidifying for tidlig.
    2. La smeltet agarose avkjøles i 1 min ved romtemperatur og dispensere 50-100 μL flekker på objektglass ved hjelp av brede pipette-spisser. Før agarose kjøler seg ned, plasserer du et mikroskop lysbilde på toppen for å generere en sprednings pute på ca. 1,5-2 cm i diameter (figur 1B-C). Bredden på agarose puten er vanligvis proporsjonal med lengden på avbildnings tiden. Med andre ord, tykkere pads tåler lengre Imaging perioder.
    3. Bruk en blanding av hydrokarboner som tetningsmiddel for å sikre riktig dekning av lysbilder med tykke agarose pads og for å forhindre at cellen dør av løsemiddel eksponering ved dekkglass kanter. Bland like deler (w/w) av Petroleum gelé, lanolin og parafin i et 500 mL beger. Heat ingrediensene på en varm plate ved 120 ° c i 5 min. Som komponenter smelter, forsiktig virvel smeltet løsning for å sikre hensiktsmessig blanding.
  2. Eksempel oppsett
    1. For undersøkelse av mitotisk hendelser, vokser celler fra Start kulturer i enten flytende EMM eller PMG pluss kosttilskudd til omtrent midten av loggen fase (OD595 av 0,4). Sentrifuger 1 mL av celle fjæringen ved 1 375 x g i 1 min, Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i minimal medium pluss kosttilskudd til et endelig volum på 100 μL.
    2. Til bilde meiotic hendelser, vokse celler fra Start kulturer i minimal medium pluss kosttilskudd til sen-log fase (OD595 på 0,7-1.0). Kombiner like volumer av motsatte kompis-type celler (h- og h+) i en 1 ml celle suspensjon. Sentrifuger celler på 1 375 x g for 1 min og resuspend pellet i flytende Me. Gjenta dette steget tre ganger for å sikre effektiv fjerning av næringsstoffer.
    3. Etter den siste ME vask, resuspend celler i 1 mL av meg og legge den til en 50 mL kolbe inneholder 9 mL ME. Ruge for 12-16 h ved 22-25 ° c på minimal rotasjonshastighet (50-100 RPM). Rikelig celle flokk ule Rings, som resulterer i mange runde fisjon gjær klumper og indikerer effektiv mating.
    4. Ta 1 mL prøve av parings kulturen og sentrifuger ved 1 375 x g i 1 min. Eliminer supernatanten, men la 250 μL i røret til resuspend celler. Før du plasserer celler på agarose pads, Vortex kraftig for 5 s for å forstyrre klumper.
      Merk: De resterende 250 μL ME brukes til å resuspend celler inneholder mating faktorer som hjelper cellene inn meiose.
    5. Plasser 20 μL av enten en mitotisk eller meiotic celle fjæring på en 2% agarose pute. Fjern overflødig medium ved å invertere og sette det på toppen av en lofri papir håndkle for 2-3 s (figur 1d). Sett Glide pute-side opp og forsiktig plassere et glass dekkglass, slik at ikke å generere luftbobler (figur 1F).
      Merk: Eliminerer overflødig medium med et papir håndkle er mer tid-effektiv enn tyngdekraften absorpsjon, noe som er spesielt viktig i meiose eksperimenter.
    6. Hvis du vil opprette en celle monolag, roterer du dekkglass med klokken med pekefingeren for én (mitose) eller to (meiose) fulle svinger (figur 1F). Sikre det cellen materie sprer vannrett det agarose pute tillater for det bedre atskillelse av enkeltceller eller ASCII. Ved hjelp av en liten tre pinne, dispensere smeltet tetningsmasse langs kantene av dekkglass for å forsegle hver agarose pad (figur 1g).
    7. Når den agarose puten er forseglet, plasser den på mikroskopet og la den likevekt i 10-15 min ved passende bildeforhold (f.eks. temperatur) (figur 1h) for å tillate luftbobler å forsvinne og la noen siste-minutt agarose Skift forekomme. Begynn bildebehandling når lysbildet er effektivt equilibrated og ikke fjerne det fra scenen før datainnsamlingen slutter.
      Merk: Kontroll av temperatur og fuktighet bestemmes av mikroskop systemet ansatt og spesifikke eksperimentelle krav. Hvis det finnes, kan du bruke temperatur-og luft fuktighets kontrollen på alle bilde eksperimenter. Hvis det er fraværende, må forskerne tenke ut en måte å forhindre temperatursvingninger, spesielt under meiose eksperimenter.

4. live-Cell Imaging2 og prosessering

  1. Bruk 40x-målet til å finne passende visningsfelt for bildet. Bytt til målsettingen 60x for å starte datainnhenting. Avhengig av hvilket mikroskop system som brukes, vil påfølgende refocusing og snitting på prøven på hvert tidspunkt inntreffe manuelt eller gjennom en mikroskop-eller programvare automatisert prosess.
    Merk: Bildene som presenteres i denne protokollen ble samlet inn ved hjelp av en deconvolution, fluorescens mikroskop utstyrt med Sedat, RFP og GFP filter sett, Nano-Motion scenen, 60x NA 1,4 objektiv linse, og 12-bits CCD-kamera. Innebygd mekaniske skodder og motoriserte filter hjul tillatt for redusert eksitasjon eksponering og photobleaching av prøvene.
  2. Bruk riktig programvare til å anskaffe og behandle bilder. Hvis du vil deconvolve bilder, bruker du de optiske overføringsfunksjonene fra produsenten.
    Merk: For detaljer om mikroskop utstyr og programvare som brukes i denne protokollen, se tabell over materialer.
  3. Hvis du vil bruke et konvensjonelt fluorescens mikroskop for å få levende celle bilder, må du sørge for at mikroskopet samler inn data digitalt, har 40x eller 60x mål med numeriske blenderåpninger (NA) som er større enn 1,2, og som kan utføre optisk snitting.
    Merk: Uten disse kravene vil bilder vise redusert oppløsning, og kvaliteten på mikroskopiske målinger og kvalitative observasjoner.
  4. Bruk gratis plug-in-programmer (f. eks Fiji) for å minimere systematiske uklarhet feil som oppstår fra kontrasten tap under bildet oppkjøpet17,18,19,20 og for å sikre riktig kvantitativ analyse fluorescens intensitet og andre timelige og dynamiske hendelser i cellen.
    Merk: Andre tilgjengelige kommersielle deconvolution programmer finnes i tabellen av materialer.
  5. Velg mikroskop filter settene som passer best til fluorophores under observasjon. Sørg for at eksitasjon-og utslipps filtrene har de riktige bånd passene som muliggjør spesifikk påvisning av fluorescerende proteiner. For eksempel, for å oppdage CFP signal, en eksitasjon og utslipp Band Pass på 430/25 og 470/30 er hensiktsmessig, men ikke for RFP fluorescens.
  6. Bruk en minimal-effektiv-innstillinger tilnærming (MESA) når Imaging fisjon gjær på flere tidspunkt poeng. Med andre ord, unngå langvarig bruk av eksitasjon bølgelengder og ansette den laveste eksitasjon kraft og eksponeringstid som genererer akseptable, men målbare og reproduserbar Imaging data.
  7. For langvarig bildebehandling under mitose eller meiose, Begrens intervallet mellom anskaffelses tiden peker til 5-10 min. Til tross for 2% agarose pads kanne motstå 12 å 16 h tenkelig møter, cellen-skifter på grunn av agarose fordampning er sikkert. Derfor utføre full mitose eller meiose eksperimenter i 4-6 h eller 8-10 h Vinduer, henholdsvis.
  8. Samle Imaging data for 4-8 h bestående av minst 24-48 oppkjøpet tid poeng, henholdsvis en fluorescens protein, og en z-stack per gang punkt og fluorescerende kanal består av 13 seksjoner med 0,5-μm avstand ved hjelp av en 60x mål. Dette krever minst 0,5-1 GB harddisk lagringsplass. Således, for resten eliminerer photobleaching og cellen-skifter, opprette en arbeidsstyrke det vurderer arbeider med computer evnene1,2,3.
    Merk: Disse anskaffelses parametrene er vanligvis angitt og endret i programvaren som styrer mikroskop funksjoner og som samler inn og behandler bilder.
  9. For å undersøke spesifikke kjernefysiske prosesser i nærmere detalj, utføre bildeoppkjøp hver 5-10 s, så lenge utslippet ikke reduseres vesentlig etter hyppig eksponering. Gjennomføre en foreløpig fluorescens intensitet analyse over ulike tidsperioder for å bestemme punktet hvoretter nøyaktigheten av de innsamlede dataene ikke lenger er pålitelig1,3.
  10. I bilde-oppkjøpet og bilde-prosessering programvare, bruk maksimal intensitet projeksjon på bildet z-stabler å observere alle strukturer med høy fluorescens tetthet på et 2D-plan uavhengig av deres vertikale plassering1,2, 3i denne. Dette forenkler en rask undersøkelse av kjernefysiske prosesser som forekommer i ulike voxels. Samle en mid-fokal lyse felt bilde for å generere et referanse bilde av cellene under observasjon.

5. ImageAnalysis20,21

Merk: Bildeanalyse i denne protokollen utføres ved hjelp av Fiji. For andre analyseprogrammer og Fiji plug-ins se tabell over materialer.

  1. Last opp et deconvolved bilde ved å velge funksjonen for import av bio-formater under plugins -menyen. I popup-vinduet import valg velger du Hyperstack, standard fargemodusog kontrollerer Autoskalering før du trykker på OK -knappen.
  2. Kontroller at det viste vinduet har riktig antall fluorescens kanaler og tidsrammer ved å rulle sidelengs på de respektive stolpene nederst. Lagre som en TIFF-fil, som ikke komprimerer data og hindrer tap av informasjon.
  3. Åpne et bilde som inneholder en Skalerings linje som genereres under databehandlingen av mikroskop programvaren. Bestem piksel lengden for Skalerings linjen ved hjelp av rett linje-verktøyet for å tegne en parallell linje med lignende størrelse, og Velg mål på analyser-menyen. Legg til en Skalerings linje ved å angi forholdet mellom piksel og μm ved å velge angi skala på analyser-menyen.
    1. I Sett skala popup-vindu, Skriv inn den beregnede avstanden i piksler og kjent avstand i μm, sett pikselstørrelsesforhold til 1,0, sett mikron som enhet av lengde, og sjekk den globale boksen før du klikker på OK -knappen.
  4. Bruk alternativet Angi målenheter under analyser -menyen til å velge ulike parametere som skal kvantifisere når du velger mål. Velg følgende beregninger i forbindelse med denne protokollen: areal, perimeter, gjennomsnittlig grå verdi, median, min & maks grå verdi, integrert tetthet, stabel posisjonog skjerm på etiketten.
  5. Avhengig av presisjonen til de innsamlede dataene, skriver du inn mer enn 1 for alternativet desimalplasser og merker av for vitenskapelig notasjon hvis det er nødvendig. Når du har brukt kommandoen mål , vil et popup-vindu for resultater vise verdiene for hver relevante parameter. Lagre resultatene som en CSV-fil for fremtidig analyse i et statistikk program.
    Merk: Det er ikke nødvendig å skille et bilde i sine bestanddeler fluorescerende kanaler for å bestemme lengden, med mindre det er signalforstyrrelser blant de forskjellige fargene i så fall følge trinnene beskrevet nedenfor.
  6. Når det gjelder signalforstyrrelser, velger du farge-og kanal verktøy på bilde-menyen og analyserer hver farge separat. Å mål lengden av ingen-lineær strukturer, rett-falle i staver på line verktøyet og bruk det segmentert line eller Frihånd line valgmuligheten å spor det ønsket emner.
    1. For lineære strukturer eller for å bestemme avstanden mellom to punkter, bruker du rett linje funksjon og velger mål fra analyser -menyen. Verdier for lengde i μm blir automatisk lagt til parametrene som tidligere er valgt under alternativet Angi målenheter .
  7. For å måle endringer i signal størrelsen og fluorescens intensitet, Opprett først en region av interesse (ROI) bibliotek, noe som øker kvantifisering nøyaktighet og forenkler raske målinger på tvers av en bildestakk. Velg farge -og kanal verktøy under bilde -menyen.
  8. I popup-vinduet kanaler kontrollerer du fargekanalen som intensiteten eller området skal måles for. Velg Juster og terskel funksjoner under bilde -menyen. Sjekk mørk bakgrunn boksen, velg standard metode (med mindre annet kreves av de innsamlede dataene), og velg rød for å overlappe signalene av interesse.
    Merk: Måling av protein stabilitet, bevegelse og lokalisering er tett avhengig av farge terskelen som brukes til å opprette ROI-biblioteker. Det er viktig å velge riktig terskelverdi metode for type fluorescerende markør signal som skal visualisere17,18.
  9. Bruk tryllestaven til å markere hver struktur av interesse og trykk på bokstaven T på tastaturet for å legge til den valgte avkastningen i vinduet for avkastnings behandling for popup-vindu. Gjenta denne prosessen for hver skive (tidsramme) i bildet stabelen og lagre alle ROIs ved å klikke på mer -knappen og velge Lagre.
  10. Åpne den zippede ROI-mappen for å laste ROI Manager og klikk på hver ROI identifikator på venstre sidepanel. Velg mål fra analyser -menyen, og gjenta denne kommandoen på hver ROI-ID for å kvantifisere objektene av interesse i alle sektorer i bildes takken.
  11. Hvis celle forskyvning ikke er et problem, og fokalplanet forblir den samme for alle sektorer i stabelen, klikker du på multi-mål i ROI Manager. I popup-vinduet velger du mål alle sektorer i stedet for én rad per sektor for å gjenta mål på tvers av bildes takken. Lagre resultatene som en CSV-fil og analyser målinger i et statistikk program.
  12. For flere kjernefysiske signaler som består av strukturen av interesse, trykk på Shift -tasten mens du velger objekter med tryllestaven verktøy for å opprette en enkelt avkastning. Alternativt kan du opprette en ROI av konstant størrelse med det ovale verktøyet til å omfatte alle signalene av interesse.
    Merk: Denne ovale tilnærmingen kan være nødvendig å måle og beskrive signal atferden over et område der fluorescens signal endringer i størrelse og intensitet over tid. Signal intensitet, i dette tilfellet, er gjennomsnittlig signal tetthet over et gitt område.
  13. Kvalitativt bestemme co-lokalisering av to fluorescerende signaler ved endring i fargen på signalet overlapper regionen. Men som co-lokalisering sonen begrenses, er det vanskeligere å skille signal overlapping. I dette tilfellet følger du trinnene som er beskrevet nedenfor.
  14. Bruk kanal verktøyet, som beskrevet i trinn 5,6, til å tegne en rett linje over hvert signal det gjelder, og velg plott profil-kommandoen på analyser-menyen.
    1. Gjenta dette trinnet for alle fargene i spørsmålet ved hjelp av den samme tegnede linjen.
    2. Trykk på liste -knappen i handlings vinduet som vises etter hvert profil trinn, for å hente frem et plott verdi vindu, og lagre målingene for hvert signal som en CSV-fil.
    3. I et statistikk program oppretter du en graf som plotter den grå verdien for hvert signal mot den tilsvarende plasseringen (i μm) langs den tegnede linjen. Mangel på overlapping mellom signal profil plott indikerer generelt mangelen på co-lokalisering.
      Merk: Bruk plot Profile Tool på projiserte bilder for å undersøke signal co-lokalisering. Dette er bare pålitelig hvis slik overlapping er også observert gjennom bildet z-stakken.
  15. For å overvåke den dynamiske atferden til fluorescerende proteiner over tid, bruk multi Kymograph-verktøyet som finnes under analyser-menyen. Det resulterende bildet viser fluorescerende signal bevegelsen gjennom en serie med kondensert øyeblikksbilder i hver sektor av z-stakken, som representerer individuelle tids punkt.
    1. Bruk kanal verktøyet som beskrevet i trinn 5,6 for å isolere objektet av interesse i riktig kanal. Kontroller at det valgte objektet eller strukturen ikke forskyves betraktelig gjennom z-stakken. Plasser en rett linje eller et rektangel over objektet, velg multi Kymograph -verktøyet fra analyser -menyen, og skriv inn ønsket bredde på linje overliggende objekt.
  16. Lag bilde paneler som viser kjernefysisk dynamikk over et bestemt tidsvindu ved hjelp av kanal verktøyet som beskrevet i trinn 5,6, og ved å velge stabler og make Montage verktøy fra bilde-menyen. I make Montage popup-vinduet, Skriv inn antall kolonner og rader ønsket, angi en skala faktor på 1,0, velg første og siste skiver (tidsrammer), og endre Border bredde til minst 5 før du trykker OK. Det er mulig å velge hvilke bilder i stabelen for å vise ved å endre trinn som passer til ønsket rekkefølge.
    1. For å generere en film, laste opp ønsket hyperstack, velg Lagre som en AVI -fil fra fil- menyen, Velg ingen for komprimering, og angi en bildefrekvens på 2-8 fps. Velg gjør Montage kommandoen mens du plukker kompositt i kanaler Tool til å fusjonere eller skille alle farger som består av bildet.
      Merk: To AVI-filer (Movie 1-2) er gitt i denne protokollen. Bruk dem i Fiji for å prøve forskjellige funksjoner uthevet i trinn 5.
    2. Hvis du vil vise en enkelt, representativ celle, bruker du Transformer og Roter fra bilde menyen og angir rotasjons grader. Negative tall roterer objekter mot venstre, mens positive verdier roterer objekter mot høyre. Når cellen er i riktig retning, tegne et rektangel som omfatter hele cellen gjennom z-stakken eller i løpet av tidsrammer av interesse og velg Beskjær fra bilde -menyen. Fortsett som nevnt i trinn 5,16 og 5.16.1 for å generere et bilde panel eller en film.
  17. Legg til en Skalerings linje i bilde panelet eller filmen ved å velge verktøy og Skaler linje på analyser-menyen. I Scale bar-lokalmenyen skriver du inn 5-15 for bredde i mikron for enkeltceller eller 100-250 for hele visningsfelt, velger hvit eller svart for farge, og velg en passende plassering for å plassere Skalerings linjen.
    1. For filmer er det nyttig å vise tids progresjon under kjernefysiske hendelser. Hvis du vil vise tidsendring mellom rammer, velger du bilde, klikker på stabler, bruker tids stamper verktøyet, angir startbildet i tidsserien og velger en passende plassering for tidsvisningen.

Representative Results

Enten Live-celle Imaging brukes til mitose eller meiose, er det avgjørende å ansette sunne fisjon gjærceller før du gjør noen form for observasjon. Kvaliteten på de resulterende dataene avhenger svært mye av Start materialet. Hvis cellene sulte på grunn av næringsstoffer begrensning eller overvekst, vil de vise overflødig vakuoler og redusert Cellestørrelse (sult, figur 2a). For mitose eksperimenter, er det best å unngå å bruke celler som viser cellulær stress (sult, figur 2a). Ellers vil eksperimentelle resultater være inkonsekvent og ved uforklarlige. For å omgå denne begrensningen, velge riktig vill type kontroller og bli kjent med de ulike fenotyper av mutanter av interesse. For eksempel mitotisk celler sultet for 12 h slutte å aktivt gjenskape DNA. Siden Tos4-GFP uttrykk er forbundet med G1/S-fase aktivitet22,23, logaritmisk celler bærer denne markøren og en for kjernefysisk divisjon (Sad1-DsRed10) viser Pan-kjernefysiske Tos4-GFP uttrykk, Sad1-DsRed fokus separasjon, og pågående septation (foreslå aktiv DNA-replikering og celledeling) (log, figur 2a), mens sultet celler viser ingen slik aktivitet (sult, figur 2a). Dette resultatet er konsistent med effekten av næringsstoffer begrensning i fisjon gjær, som reduserer transkripsjon i G1, aktiverer G1/S celle syklus Checkpoint, og fremmer G0 oppføring5. For meiose eksperimenter, må cellene vokse til en høy tetthet, men uten å nå den stasjonære fasen. Etterpå er celler av begge kompis typer blandes og inkubert sammen i lav nitrogen medier. Unnlatelse av å mate, slik tilfellet er når cellene ikke er tilstrekkelig sultet av nitrogen, vil hindre dem fra å komme inn meiose (ineffektiv, figur 2b). Robust flokk ule Rings av parings celle fjæringen øker celle-til-celle-interaksjon og indikerer dermed vellykket mating og effektiv meiotic induksjon (effektiv, figur 2b).

Agarose gel pads og fysisk forstyrrelse av celle klumper garantere riktig visualisering av enkeltceller eller ASCII (log, figur 2a; Effektiv, figur 2b). Pads må gi en stiv, men likevel fuktig plattform på hvilke celler er samtidig fast på plass og beskyttet mot uttørking. I tillegg må pads være tykk nok til å tåle endringer på grunn av fordampning og gi en jevnet overflate som tillater riktig fokus gjennom bildet oppkjøpet (figur 1C). Dekkglass rotasjon er nødvendig for å skille og spre celler i par Rings aggregater (figur 1F; Effektiv, figur 2b). Uten dette trinnet, noen ASCII men mange haploide celler er observert fordi ASCII bli fanget i utilgjengelige lag med parring klumper, mens haploide celler står fritt til å fylle alle tilgjengelige monolag flekker (figur 2b). Selv for mitotisk eksperimenter, der celle klumper er mindre problematisk, dekkglass rotasjon flytter celler rundt puten for å lage et enkelt celle lag med tilstrekkelig avstand mellom cellene for å redusere trengsel effekter og tillate celle duplisering (log, figur 2a ).

Atb2 er en α-tubulin komponent involvert i kromosom segregering i fisjon gjær mitose og meiose7,14. Når fluorescensmerkete merket, tillater denne cytoskeleton komponenten for undersøkelse av stadier som karakteriserer kjernefysisk separasjon i mitose. Under profase (0 '-20 ', figur 3a), kjernedannelse av mitotisk spindelen oppstår i den kjernefysiske siden av spindel stang organer (SPBs), som avslørt av Atb2-mRFP fibre satt mot en HTT1-GFP5 Pan-kjernefysisk bakgrunn. Under metafase-anaphase overgang (20 '-40 ', figur 3a) mitotisk spindelen strekker seg utover og kjernen deler seg i to. Som cellen går inn telophase (60 '-80 ', figur 3a), Atb2-mRFP utvider bidirectionally inntil kromosomer er helt separert. Etter dette punktet, Atb2-mRFP fibre gruppere og spredt over celleoverflaten for å gjenvinne sin Interphase form i hver av de resulterende datter celler. Cytokinesi (> 120 ', figur 3a) oppstår bare etter en septum former og deler cellen ved fisjon. Etter endringer i Hht1-GFP intensitet over en mitotisk syklus avslører tre viktige skritt i kjernefysiske dynamikk: metafase-anaphase (middels intensitet, DNA-komprimering: 20 '-40 ', figur 3a-B), telophase (lav INTENSITET, DNA separasjon: 60 '-80 ', Figur 3A-B), og G1 (økende intensitet, DNA duplisering: 100 '-120 ', figur 3a-B). Tilsvarende, men ved hjelp av celler som bare bærer Hht1-mRFP og ansette multi-kymograph verktøyet (se trinn 5,15) i Fiji, er det mulig å observere mitotisk divisjon fra metafase til telophase og evaluere den kjernefysiske bevegelser involvert under riktig søster chromatid segregering (normal, figur 3c). MIS-segregering kymographs viser signal aktivitet mellom de to viktigste kjernefysiske stier, noe som indikerer mulig mis-segregering på grunn av kromosom fragmentering eller upassende chromatid separasjon (henger, figur 3c).

Som nevnt tidligere, i spirende og fisjon gjær, er Tos4 skrives i G1 og funksjoner under DNA-replikering i S fase22,23. Dette kan observeres i en kymograph der Tos4-GFP uttrykket øker i kjernen etter Sad1-DsRed10 fokus flytte til motsatt retninger (indikerer kjernefysisk divisjon), men før septum former, som foran cytokinesi (39 ', figur 3D ; 36, figur 3e). Fasen av høy Tos4-GFP aktivitet begynner på slutten av M-G1/S overgang (45 ', figur 3e) og slutter i G2 (> 60', figur 3e), rett etter celledelingen. Mens sterkt diffust under G1, Tos4-GFP signal intensitet øker post anaphase og gjennom S-fase og co-lokaliseres med segregert Sad1-DsRed fokus (45 '-60 ', figur 3e). Dette resultatet avslører septation perioden i fisjon gjær når Genova duplisering har begynt i datter celler (G1/S), men cytokinesi har ikke skjedd ennå.

Hht1 er histone H3 i fisjon gjær og er vanligvis modifisert med fluorescerende koder for å visualisere kjernefysisk DNA5,14. I mitose, som celler overgang fra metafase til telophase (20 '-120 ', figur 3a), er to skilles endringer i kjernefysisk masse observert. Den første endringen innebærer en sammentrekning av kjernefysisk størrelse i metafase (20 ', figur 3a), mens den andre viser nucleus splitting under anaphase (40 ', figur 3a). I tillegg til å dele disse endringene med mitotisk celler viser meiotic celler kjernefysisk bevegelse (dvs. heste Tailing) (-100 ' til-50 ', figur 4a-B) under homologe rekombinasjon og ytterligere reduksjon av nucleus størrelse på slutten av anaphase II (70 '-90 ', Figur 4a). Hht1-mRFP brukes til å undersøke mis-segregering fenotyper som henger eller fragmentert kromosomer (henger, figur 3c). Det er også brukt til å observere og beskrive kjernefysiske dynamikken i hver av fasene av meiose (figur 4a-B). Kjernefysisk masse er stor og svinger i størrelse under mye av hest-Tailing (HT:-100 ' til-50 ', figur 4a-B)). Ettersom cellene kommer inn metafase (MT:-40 ' til 0 ', figur 4a-B), reduseres kjernefysisk størrelse og bevegelse, i samsvar med økt kondens aktivitet på dette stadiet. Utbruddet av både anaphase jeg (MI: 10 '-60 ', figur 4a-B) og II (MII: 70 '-90 ', figur 4a-B) er forbundet med ytterligere kjernefysisk reduksjon og mangel på kjernefysisk bevegelse, som samsvarer godt med de to kjernefysiske divisjoner som karakteriserer meiose I og II (MI & MII). Således er meiose forbundet med kjernefysiske størrelses svingninger når homologe kromosomer align og recombine og med kjernefysiske størrelses reduksjoner etter to runder med kromosom separasjon. Alleler som endrer disse kjernefysiske dynamikken er sannsynligvis forbundet med Genova stabilitet regulering i meiose12,13.

Rec8 er α-kleisin delenhet av meiotic cohesin i fisjon gjær. Den er lastet inn på kromatin etter DNA-replikering (Mei-S) og holder søsteren chromatids bundet til hverandre til anaphase II. Etter metafase jeg, Rec8 er fjernet fra kromosom armer av separase og er beskyttet på centromeren av Sgo1-PP2A. På slutten av homologe segregering, er Rec8 også eliminert på centromeren, og dermed gir for søsteren chromatid separasjon (figur 5a)6,24. Rec8-GFP sammen med markører for kromosom segregering som Sad1-DsRed eller Hht1-mRFP tillate visualisering av samhold dynamikk under meiose. Rec8-GFP signal er Pan-kjernefysiske under Mei-S (< <-90 ', figur 5a-b), profase I (-90 ' til-50 ', figur 5a-B), og metafase I (-40 ' til 0 ', figur 5a-b). Denne observasjonen avslører foreningen av Rec8-GFP langs kromosomer akser som følger DNA duplisering. Som celler inn anaphase jeg (10 ', figur 5a-b), Rec8-GFP intensitet avtar gjennom kjernen, men er fortsatt sterk på centromeren, der den danner et fokus i hver kjernefysisk masse (20 '-70 ', figur 5a-b). Dette resultatet er konsistent med Rec8-GFP degradering langs kromosom armer, men ikke på centromeren, som følger etter homologe segregering. Før anaphase II, forsvinner Rec8 fokus, frigjør søster chromatids for separasjon i MII (70 '-80', figur 5a-B). Den Rec8-GFP markør er dermed nyttig å undersøke forhold som forstyrrer etablering, fjerning, og generell stabilitet av meiotic samhold. Sammenkoblet med en markør for kjernefysisk divisjon som Hht1-mRFP5,13, Rec8-GFP kan anvendes for å løse spørsmål om hvordan samhold timing og stabilitet før og under meiose påvirke riktig kromosom segregering12 ,13. Denne protokollen løser ikke proteiner hvis dynamikk forekommer hovedsakelig i stoffer. Men tabell jeg viser noen cytosolic proteiner som vanligvis brukes til å undersøke cytoskeleton og membran prosesser som er nødvendige for endocytose, exocytosis, og cytokinesi blant andre prosesser.

Figure 1
Figur 1: utarbeidelse av agarose pads for levende celle bilder. (A) oppsett for lysbilde klargjøring montert ved hjelp av en pipette tupp holder, laboratorie bånd og objektglass. Plassere lysbilder vinkelrett på hverandre skaper en lomme der agarose puten former. Tilsetting av lab tape brikker på sidene justerer agarose puten bredde til de nødvendige spesifikasjonene. (B) smeltet agarose er la avkjøles før du setter den på mikroskop lysbilder å lage pads. I dette trinnet er det nødvendig å dispensere det agarose volumet langsomt for å unngå å skape luftbobler. (C) det øverste lysbildet er plassert på den utlevert agarose stedet for å danne en sirkulær pad med en rett overflate, selv kanter, og ingen synlige agarose sprekker. (D) etter å ha satt et utvalg av celle suspensjon på agarose puten, inverter skyve og plassere på toppen av en lofri papir håndkle for å fjerne ekstra flytende medium. (E) nøye plassere en dekkglass på agarose puten, og pass på å ikke felle noen luftbobler og kontrollere at fokuset flyet er flatt for å unngå celle skiftende og fokusering problemer. (F) sakte og forsiktig, Roter dekkglass med klokken for å forstyrre celle klumper og generere en celle monolag som gjør det mulig for celleutvidelse og bedre celle visualisering. (G,H) Bruk en oppvarmet hydrokarboner blanding å forsegle agarose pads og tillate dem å likevekt til ønsket temperatur før Imaging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: plukke de riktige cellene. (A) Top paneler viser fisjon gjærceller igjen å SULTE i EMM pluss kosttilskudd for 72 h og bunnpanel viser celler gjennomgår logaritmisk vekst. I celler som er igjen å sulte, kan små celle morfologier bli verdsatt. Den røde åpne pilen viser vacuolar granulater som er karakteristisk for sult. I logaritmisk kulturer, celler som viser langstrakt morfologier og septa (rød pil) florerer, noe som indikerer aktiv sykling dynamikk. Høyre sidepanelene viser celler som uttrykker Tos4-GFP og Sad1-DsRed signaler under sult og spredning. Pan-kjernefysiske Tos4-GFP uttrykk og Sad1-DsRed signaler som lokaliserer til motsatt celle poler blir sett under aktiv spredning, men ikke i sult. (B) top panel viser celler av samme kompis-type (h +) unnlater å mate effektivt. Den røde åpne pilen viser et par vacuolar celler som gjennomgår karyogamy. Dette er ikke uvanlig i kulturer av h + celler, hvor 10% av cellene kan bytte kompis-type til h-. Bunnen panel viser ASCII som følge av effektiv mating. Zygotic ASCII ta flere former inkludert sikk-sakk (rød pil) og banan celle figurer (rød åpen pil). Scale bar = 5 μm i lengde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: mitotisk kjernefysiske dynamikk. (A) histone H3 (HHT1-GFP) og Mikrotubulinettverket (Atb2-mRFP) proteiner ble fulgt under en mitose syklus (120 min.). Individuelle signaler for Hht1-GFP og Atb2-mRFP vises i svart-hvitt-paneler, mens BF-flettingen viser dem i sine respektive farger. (B) kvantifisering av Hht1-mGFP intensitet over en mitotisk syklus. Endringen i Hht1 nivåer er et tegn på kjernefysisk divisjon under mitose og DNA duplisering i G1. (C) Kymographs viser normal eller unormal segregering i mitose der den resulterende kjernefysiske stier enten bifurcate og beholde DNA integritet eller avvike og fremme kromosom fragmentering eller for tidlig chromatid separasjon, henholdsvis. (D,E) Kymograph og mikroskop paneler som viser varigheten av M-to-G1/S avslørt av segregering av Sad1-DsRed og utseende av kjernefysiske Tos4-GFP signaler. Legg merke til de midterste panelene i E som ble generert ved hjelp av fire lut i Fiji for å lage en intensitet-gradert termisk kart som letter identifisering av flekker med høy TOS4-GFP uttrykk; i dette tilfellet, lokalisert til kjernen og overlappende Sad1-DsRed signaler, som forventet. Scale bar = 5 μm i lengde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Meiotic kjernefysiske dynamikk. (A) panel serie som viser bevegelse, komprimering og deling av kjernen (Hht1-mRFP) under meiose. Horse-Tailing (HT) viser omfattende side-til-side kjernefysiske svingninger etterfulgt av Metafase (MT), hvor kjernefysisk lateral bevegelse avtar og helt stopper rett før anaphase I. I meiose jeg (MI), deler den viktigste kjernefysiske massen i to, mens i meiose II (MII) fire kjerner er generert under prosessen med søster chromatid separasjon. (B) kvantifisering av kjernefysisk område endring (Hht1-mRFP) i profase, METAFASE, MI & MII. Kjernekraft området er dynamisk under HT svingninger, blir kondensert i MT, og ytterligere nedgang i størrelse under MI & MII, hvor lite kjernefysisk bevegelse er observert (Long Nuclear Axis). Måle den lengste kjernefysiske aksen (lang kjernefysisk akse) er basert på ideen om at som en sirkel strekker seg, opphører det å ha en konstant diameter og genererer minst to hoved akser: lang og kort. Således, når du overvåker endringer i kjernen, endringer i enten lang eller kort akse gi indikasjoner på kjernefysisk bevegelse. Scale bar = 5 μm i lengde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Meiotic cohesin dynamikk. (A) panel serie som viser hvordan REC8-GFP signal endring samsvarer med meiotic kjernefysiske dynamikk. I løpet av HT og MT, Rec8-GFP signal er Pan-kjernefysiske og følger kjernefysisk bevegelse (Hht1-mFRP). I MI, Rec8-GFP avleder fra kjernen, slik at bare et par av prioriteringer, som er forenlig med Rec8 fjerning fra kromosom armer og etablering av Sgo1-PP2A beskyttelse på centromeren. Som cellen nærmer MII, Rec8-GFP fokus begynner å forsvinne og er ikke lenger sett rett før anaphase II. (B) kvantifisering av REC8-GFP INTENSITET fra HT til MII. I likhet med det som er sett i A, GFP signalet er høyt gjennom HT og MT, vesentlig AVTAR under mi og helt forsvinne i MII. Dette mønsteret bekrefter cohesin dynamikk på kromosom armer og centromeren, hvor det holder søsteren chromatids bundet til klar til å bli separert i MII. Scale bar = 5 μm i lengde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protein Funksjonen Kommentarer Tag Referanser
Hht1 Histone H3 involvert i DNA-emballasje Brukes til å undersøke kromosom dynamikk Hht1-mRFP 5, 14
Tos4 Tos4-funksjonen oppstår under G1-fasen Ansatt for å studere G1 timing Tos4-GFP 22, 23
Rad21/ Rec8 Cohesin under enheter involvert i å holde søster chromatids sammen etter replikering Brukes til å analysere samhold stabilitet under mitotisk (Rad21) og meiotic segregering (Rec8) Rad21-GFP/Rec8-GFP 6, 24
Rad11 RPA aktivitet oppstår under mitotisk DNA reparasjon, meiotic rekombinasjon, og ender i metafase Ansatt for å studere DNA-reparasjon i mitose og rekombinasjon dynamikk i meiose Rad11-YFP 5, 13
Rad52 Rad52 acivity finner sted under mitotisk av DNA-reparasjon og meiotic rekombinasjon Ansatt for å studere DNA-reparasjon i mitose og rekombinasjon dynamikk i meiose Rad52-CFP 5, 13
Cnp1 Histone H3 CENP-A lokaliseres spesielt ved centromeren Brukes til å følge kromosom segregering dynamikk i mitose og meiose Cnp1-mCherry 13
Swi6 HP1 homolog protein involvert i heterochromatin formasjon Ansatt for å studere heterochromatin mobilisering på centromeren og telomerer Swi6-GFP 13
Sad1 Sad1 er involvert i lokalisere av spindel Pol kroppen til den kjernefysiske konvolutten Ansatt for å analysere kromosom segregering i mitose og meiose Sad1-mCherry 10
STOFFER & MEMBRAN
Atb2 Tubulin Alpha 2 involvert i mikrotubulinettverket cytoskeleton organisasjon Brukes til å undersøke kromosom segregering i mitose og meiose Atb2-mRFP 7, 14
Ync13 Exocytosis og endocytose regulator involvert i vesicle-mediert transport Ansatt for å studere celle-vegg integritet under cytokinesi Ync13-mECitrine 25
Rlc1 Myosin II delenhet involvert i kontraktile ring sammentrekning Brukes til å utforske dynamikken i septum modning og sammentrekning RIc1-mCherry 25
Ccr1 NADPH-cytokrom p450 reduktase som er en del av ER, plasma, og mitochrondrial ytre membran Ansatt for å undersøke membran-assosiert dynamikk som endocytose, exocytosis, og cytokinesi Ccr1N-GFP 5
Gef1 Rho guanyl-nukleotid utvekslings faktor involvert i etablering og vedlikehold av celle polaritet Brukes til å undersøke global, mikrotubulinettverket celle polaritet dynamikk Gef1-mCherry-GBP 26
Fus1 Formin involvert i utgangen Fusion fokus forsamlingen under cytogamy Brukes til å studere Fusion dynamikk forbundet med fisjon gjær mating Fus1-sfGFP 27
Mnn9 Mannolsyltransferase delenhet involvert i protein N-koblet glykosylering i Golgi apparatet Ansatt for å studere Last modning i Golgi som det utvikler seg fra CIS-Golgi til trans-Golgi Mnn9-mCherry 28
Num1 Kortikale forankring faktor for dynein involvert i hest-Tailing Brukes til å undersøke mitokondrier-avhengige dynein forankring under kjernefysisk pendling i meiotic profase jeg Num1-yEGFP 29

Tabell 1: markører for kjernefysisk og cytosolic dynamikk.

Movie 1
Film 1: M-å-G1/S overgang viser spindel Pol kropp (Spb; Sad1-DsRed) separasjon forut septation og akkumulering av Tos4-GFP kjernefysisk signal. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 2
Film 2: avslutningen av mitotisk syklus viser det mikrotubulinettverket (Atb2-mRFP) forlengelsen samkjøre med atomer (Hht1-GFP) inndelingen. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Live-celle Imaging under mitose og meiose gir mulighet til å undersøke kjernefysiske dynamikk uten vesentlig forstyrre fisjon gjær fysiologi under datainnhenting. Det må imidlertid utvises forsiktighet for å sikre at cellene vokser til den ønskede tettheten uten miljøbelastninger. og for meiose, at cellene er avbildet i løpet av tidspunktet for Terminal differensiering og ikke for tidlig eller sent. Overflødig cellulær trengsel, sult og upassende vekst temperaturer er vanlige faktorer som bidrar til ved uforklarlige observasjoner. I tillegg, under belastning konstruksjon, er det avgjørende å teste at fluorescerende koder ikke forstyrrer funksjonene til målet gener eller innvirkning generelle celle fitness. Unnlatelse av å undersøke nøye fenotyper av stammer som bærer fluorescerende markører kan resultere i inkonsekvente og uforlignelige resultater på tvers av lignende genotyper.

Selv om mikroskop agarose pads er enkle å montere, kan de også utgjøre et hinder i å skaffe verdifulle bildedata. Opprette agarose pads er så enkelt som å plassere tre mikroskop lysbilder parallelt med hverandre, dosering smeltet agarose på midten lysbildet, og sette et lysbilde som Transverses toppen av de andre lysbildene. Det er nyttig, men å sette sammen en Slide-Maker apparat som gjør det mulig for bredde modifikasjoner for å produsere resistente, situasjon-spesifikke agarose pads. En enkel Slide-Maker som gir puten bredde fleksibilitet består av en plattform (pipette tips holderen eller benken), to mikroskop lysbilder, og Lab tape fungerer som puten-bredde justering mekanisme (figur 1a). Eksakt pad tykkelse vil avhenge Imaging tid krav, agarose merkevare, temperatur, dekkglass tetningsmasse, fordampning rate, etc. Derfor er det viktig å kalibrere avbildnings systemet før datainnhenting for å øke teknisk reproduserbarhet og for å forbedre kvaliteten på Live-Cell Imaging1,2,3. Pad overflate, stivhet, og sammensetning er avgjørende ved langvarig bildeoppkjøp. Agarose har lav bakgrunn fluorescens, kan lett formes, og ved riktig konsentrasjon, tåler strukturelle deformasjon på grunn av fordampning. Videre kombinerer fisjon gjær medier med agarose ikke kompromiss bildekvalitet og gir mulighet for utvidet observasjon av flere mitoses og meiose sykluser. Det er også viktig å unngå eventuelle luftbobler for time-lapse mikroskopi. I agarose pads og i prøven utvides Luftlommene over tid, noe som fører til celle forskyvning og forstyrrer fokal plan. Forutsatt celler er effektivt spres fra hverandre ved dekkglass rotasjon, kan forskerne følge mitotisk prosesser over flere generasjoner og meiotic hendelser fra kjernefysisk fusjon til sporulation. Making og velge riktig pad for Imaging eksperimenter tar tid å mestre, men når oppnådd, kan bidra til svært informative mikroskop observasjoner.

Som tilfellet er med andre metoder, er ikke direkte celle mikroskopi uten tekniske begrensninger. Bruken av fluorescensmerkete proteiner introduserer grenser for eksperimenter som begrenser omfanget av hva som kan bli studert. Foto-bleking og foto-toksisitet er problemer typisk for langvarig bildeoppkjøp. De kan motarbeides ved å ikke utsette celler for korte bølgelengder for lenge eller for ofte. For eksperimenter som involverer GFP, CFP, YFP, mRFP, og DsRed, typiske fluorescerende proteiner som brukes i fisjon gjær Live-celle Imaging, er det vanlig å ansette 5-15% eksitasjon lys og 100-500 MS eksponeringstid for rutinemessige eksperimenter. Disse parametrene endres imidlertid i henhold til de spesifikke eksperiment kravene til forskeren. I tillegg z-stabler består av 9-13 seksjoner med 0,5 μm avstand ved hjelp av en 60x mål er nok til å løse tykkelsen på en fisjon gjær celle. Videre er det viktig å bekrefte at fluorescerende markører ikke forstyrrer riktig regulering eller funksjon av mål proteiner eller genererer falske fenotyper. Derfor er det tilrådelig å konstruere stammer som inneholder ulike fluorescerende og affinitet koder for samme mål genet å bekrefte observasjoner av ulike virkemidler. Videre er det ansvaret til forskere for å sikre at eksperimentelle parametre kan reproduseres på tvers av eksperimenter og at de innsamlede dataene er egnet for nedstrøms analyse1,3. Ingen teknologi kan erstatte tid-testet praksis av omhyggelig validere eksperimentelle systemer ved nøye observasjon og grundig undersøkelse av linearitet i å oppdage fluorescerende signaler.

Til slutt er det avgjørende å analysere mikroskopi data i formater som ikke endrer RAW-bilder. Fiji gir utmerket dokumentasjon verktøy for å holde styr på rådata målinger og gjør forskerne til å undersøke ulike celle parametre i en enkelt økt. Disse funksjonene, så vel som sin rikdom av online opplæringsprogrammer og omfattende litteratur dekning, gjør Fiji et viktig verktøy for å måle, analysere og presentere Live Cell Imaging data som beskriver kjernefysiske dynamikken i fisjon gjær i mitose og meiose.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Natalia la Fourcade og Mon LaFerte for å gjøre utarbeidelsen av dette manuskriptet en morsommere oppgave. Takket være medlemmer av Forsburg Lab som bidro til fullføringen av dette arbeidet med sin innsikt, eksperiment ideer, og moralsk støtte. Dette prosjektet ble støttet av NIGMS R35 GM118109 til SLF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60x Plan Apochromat objective lens Olympus AMEP4694
Adenine Sigma A-8751
Agar 7558B IB4917-10 kg
Agarose Sigma A9539-500g
Belly Dancer rotator Stovall US Patent #4.702.610
Biotin Sigma B-4501
Boric acid Sigma B-6768-5kg
CaCl2·2H20, Sigma C3306-500G
Citric acid Sigma C-0759
Convolve 3D software plug-in OptiNav, Inc. n/a
CoolSnap HQ CCD camera Roper n/a
Cover slip VWR 16004-302
CuSO4·5H20, END CX-2185-1
DeltaVision deconvolution fluorescence microscope GE Healthcare/Applied Precision n/a
Diffraction PSF 3D software plug-in OptiNav, Inc. n/a
Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen Sunrise 2023;1kg
FeCl2·6H2O END FX9259-04
Glucose Sigma G-7021
Heat plate Barnstead Thermo Lyne
Histidine Sigma H8125-100g
Huygens deconvolution software SVI n/a
Imaris deconvolution software Bitplane n/a
Incubator Shell lab #3015
Inositol Sigma I-5125
Iterative Deconvolve 3D software plug-in OptiNav, Inc. n/a
KCl Mallinckvadt 6858-04
Lanolin Sigma L7387-1kg
Leucine Sigma L8912-100g
Lysine Sigma L5626-500g
Malt extract (ME) MP 4103-032
MgCl2·6H20 AMRESCO 0288-500G
MetaMorph Molecular Devices n/a
Microscope slides VWR 16004-422
MnSO4, Mallinckvadt 6192-02
Molybdic acid Sigma M-0878
Na2S04 Mallinckvadt 8024-03
Nicotinic acid, Sigma N-4126
Pantothenic acid Sigma P-5161
Paraffin wax Fisher s80119WX
Pombe glutamate medium (PMG) Sunrise 2060-250
softWorx v3.3 image processing software GE Healthcare n/a
Sporulation Medium powder Sunrise 1821-500
Temperature controlled centrifuge Beckman Allwgra 6KR xentrifuge
Uracil AMRESCO 0847-500g
Vaseline Equaline F79658
Yeast extract EMD 1.03753.0500
Yeast extract plus supplements (YES) Sunrise 2011-1kg
ZnSO4·7H2O J.T.Baker 4382-04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy–tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  2. Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. DNA Replication. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).
  3. Lee, J. Y., Kitaoka, M. A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).
  4. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859 (2015).
  5. Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast. Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).
  6. Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe. Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).
  7. Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
  8. Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly. Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).
  9. Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates. PloS One. 7 (1), e30622 (2012).
  10. Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination. Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).
  11. Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction. Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).
  12. Mastro, T. L., Forsburg, S. L. Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF). Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).
  13. Escorcia, W., Forsburg, S. L. Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).
  14. Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation. Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).
  15. Forsburg, S. L., Rhind, N. Basic methods for fission yeast. Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).
  16. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in enzymology. 470, Academic Press. 759-795 (2010).
  17. Diffraction PSF 3D. , Available from: http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm (2019).
  18. Optinav.info. Convolve ED. , Available from: http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm (2019).
  19. Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from: http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm (2019).
  20. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2019).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes. The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).
  23. Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae. PLoS One. 7 (9), e45895 (2012).
  24. Watanabe, Y., Nurse, P. Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis. Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).
  25. Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).
  26. Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis. Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580 (2018).
  27. Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).
  28. Kurokawa, K., et al. Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).
  29. Kraft, L. M., Lackner, L. L. A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring. Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).

Tags

Biologi fisjon gjær mitose meiose DNA-replikering kromosom segregering celledeling Live-celle mikroskopi
Undersøkelse av mitotisk og Meiotic fisjon gjær Nuclear Dynamics av fluorescens Live-Cell mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Escorcia, W., Shen, K. F., Yuan, J.… More

Escorcia, W., Shen, K. F., Yuan, J. P., Forsburg, S. L. Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59822, doi:10.3791/59822 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter