Summary
نماذج مورين من تصلب الشرايين هي أدوات مفيدة للتحقيق في المسارات المسببة للأمراض على المستوى الجزيئي، ولكن تتطلب قياس اقاصي موحد لتطوير الآفات. يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة لتحديد حجم الآفة في الأوعية الشريانية الرئيسية بما في ذلك الجذر الأبهري والقوس الأبهري والشريان البشعي.
Abstract
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم. السبب الأساسي في معظم الحالات هو تصلب الشرايين، وهو في جزء منه مرض التهابي مزمن. وقد أوضحت الدراسات التجريبية تصلب الشرايين دور الكوليسترول والالتهاب في عملية المرض. وقد أدى هذا إلى تجارب سريرية ناجحة مع العوامل الصيدلانية التي تقلل من المظاهر السريرية لتصلب الشرايين. يمكن للتجارب المتأنية والخاضعة للرقابة جيدا في نماذج الماوس من المرض مزيد من توضيح مسببات الأمراض من المرض، وهو أمر غير مفهوم تماما. تحليل الآفات موحدة من المهم للحد من التباين التجريبي وزيادة استنساخ. تحديد حجم الآفة في الجذر الأبهري، والقوس الأبهري، والشريان البعية هي نقاط النهاية الشائعة في تصلب الشرايين التجريبية. يوفر هذا البروتوكول وصفًا تقنيًا لتقييم تصلب الشرايين في جميع هذه المواقع في ماوس واحد. ويفيد البروتوكول بشكل خاص عندما تكون المواد محدودة، كما هو الحال في كثير من الأحيان عندما يتم وصف الحيوانات المعدلة وراثيا.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم مع أمراض القلب الإقفارية والسكتة الدماغية التي تمثل واحدة من كل أربع وفيات1. تحدث معظم الحالات بسبب تصلب الشرايين، وهو مرض يتميز بتراكم بطيء لللويحات المحملة بالدهون مع علامات الالتهاب المزمن في الشرايين الكبيرة والمتوسطة الحجم2. يبقى المرض عادة دون أن يلاحظها أحد على مدى عدة عقود حتى تمزق أو تآكل البلاك يثير تجلط الشرايين الذي يؤدي إلى تلف الأنسجة الإقفارية.
يتكون الشريان الطبيعي من طبقة إنتيما مع الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء الموزعة بشكل ضئيل، وطبقة وسائل الإعلام مع خلايا العضلات الملساء وlamellae مرنة، وطبقة adventitial المحيطة مع النسيج الضام فضفاضة3. الاحتفاظ بالقيمة العلفية من LDL يعوض تطور تصلب الشرايين4. تراكم وتعديل البروتينات الدهنية يؤدي إلى التجميع والفخ داخل intima الشرياني5. ويثير استجابة التهابية من قبل البروتينات الدهنية المحاصرين والمعدلة6. الخلايا البطانية تبدأ في التعبير عن جزيئات التصاق، مثل VCAM-1 في مواقع في شجرة الشرايين مع تدفق الدمالمضطرب، مما يؤدي إلى تجنيد الخلايا الأحادية المتداولة وغيرها من الكريات البيض 7. الخلايا الأحادية المتسللة تميز إلى الضامة التي تغمر الدهون مع التحول الذي أعقب ذلك إلى خلايا رغوة الضامة8.
وقد درست تصلب الشرايين في نماذج الماوس مع زيادة وتيرة منذ منتصف الثمانينات. C57BL/6 هو سلالة الماوس الأصيلة الأكثر استخداما لهذه الدراسات، ويستخدم كخلفية وراثية لغالبية السلالات المعدلة وراثيا9. تأسست هذه السلالة في101920 ، ونشرت جينومها في عام 200211. التجارب في نماذج الماوس لها العديد من الفوائد: المستعمرات تتكاثر بسرعة، والإسكان هو الفضاء كفاءة، والتوالد يقلل من التباين التجريبي. ويسمح النموذج أيضا بالتلاعب اتّهاب اتّساهية وراثيّة، مثل حذف الجينات المستهدفة وإدراج الجينات المتحولة. وقد أدى هذا إلى فهم جديد للأمراض الفسيولوجية للمرض وأهداف العلاج الجديد12.
الفئران من النوع البري C57BL/6 مقاومة طبيعية لتصلب الشرايين. لديهم معظم الكولسترول المتداول في HDL، ولا يتم تشكيل الآفات المعقدة تصلب الشرايين حتى عندما تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون والكوليسترول العالي13. الفئران ارتفاع الكوليسترول، مثل Apoe-/- على C57BL/6-الخلفية، وبالتالي تستخدم كنماذج تجريبية من تصلب الشرايين14،15. عدم وجود ApoE يضعف التناول الكبدي من البروتينات الدهنية المتبقية ويزعج بشدة التمثيل الغذائي للدهون. في Apoe-/- الفئران، والكوليسترول المتداولة هو في الغالب في جزيئات VLDL، والفئران تطوير لويحات تصلب الشرايين معقدة على نظام غذائي تشاو العادية.
Ldlr-/- الفئران تحاكي تطور تصلب الشرايين ينظر في البشر مع ارتفاع الكوليسترول العائلي16. ال [لورد]-/- يحتاج فأرات غربيّة نوع حمية أن يطوّر تصلب الشرايين17. النظام الغذائي الغربي يحاكي تناول الطعام البشري وعادة ما يحتوي على الكوليسترول 0.15٪. مستقبلات LDL يعترف ApoB100 وApoE وتوسط في تناول جزيئات LDL من خلال بطانة الرحم. مستقبلات LDL أساسية لإزالة الكبد من LDL من الدورة الدموية، في حين أن التعبير مستقبلات LDL في الخلايا المكونة للدم لا يؤثر على هذه العملية. وهذا يفتح إمكانية زرع نخاع العظم من خلايا Ldlr+/+ إلى اللاوسير الكولسترول الزائد -/- المتلقين وتقييم تطور تصلب الشرايين. وقد استخدمت عادة chimeras نخاع العظام لدراسة مشاركة الخلايا المكونة للدم في تصلب الشرايين التجريبية. ومع ذلك، يمكن أن يؤثر زرع نخاع العظام على حجم وتكوين لويحات تصلب الشرايين، مما يجعل تفسير النتائج غامضاً.
وقد تم تطوير متغيرات مختلفة من Apoe-/- وLdlr-/- الفئران مع تغييرات وراثية إضافية لدراسة عمليات محددة من المرض18. ومن الأمثلة على ذلك الفئران البشرية APOB100-المعدلة وراثيا ً Ldlr -/- (HuBL) التي تحمل جين APOB100 البشري الكاملالطول 19و20. هذه الفئران تطوير ارتفاع الكوليسترول في الدم وتصلب الشرايين على نظام غذائي تشاو العادية. ومع ذلك، فإن تطوير لويحات تصلب الشرايين المعقدة يستغرق ما لا يقل عن ستة أشهر والبروتوكولات التجريبية أقصر عادة ما تستخدم النظام الغذائي الغربي21. يتم تداول جزء كبير من الكوليسترول في البلازما في جزيئات LDL، مما يعطي الفئران HuBL أكثر الإنسان مثل البروتين الدهني مثل الإنسان مقارنة مع Apoe-/- وLdlr -/- الفئران. الفئران HuBL تسمح أيضا دراسات apoB الإنسان كمستضد ذاتي22.
نماذج الماوس من تصلب الشرايين تطوير لويحات تصلب الشرايين معقدة مع السمات المشتركة للمرض البشري. ومع ذلك، فإن لويحات مقاومة إلى حد ما لتمزق مع احتشاء عضلة القلب التي تلت ذلك. يتم الكشف عن Atherothrombosis فقط بشكل متقطع وتحديا تجريبيا لتقييم23،24،25. وقد وضعت نماذج خاصة من تمزق البلاك، ولكن المجال التجريبي يفتقر إلى نموذج موثوق واستنساخ لتقييم عوامل استقرار البلاك.
وقد تم الإبلاغ عن القياس الكمي لتصلب الشرايين بطرق عديدة في الأدب. وقد حاولت الجهود الأخيرة توحيد التصميم التجريبي، والتنفيذ، والإبلاغ عن الدراسات الحيوانية26. وللمحققين أفضليات وتقنيات مختلفة تتكيف مع مختبراتهم. كما أن معظم المشاريع البحثية فريدة من نوعها بطريقة تتطلب بعض التعديلات البروتوكولية. بسبب الطبيعة المتعددة العوامل للمرض ، تختلف الضوابط المثلى بين المشاريع. وقد تتسبب الظروف المحلية وعدم التوحيد القياسي في حدوث اختلافات ملحوظة في تطور الأمراض، مما يعوق التقدم في مجال البحوث. وتعني الاختلافات في التغير التجريبي أيضا أن حسابات الطاقة الإحصائية ينبغي أن تستند إلى دراسات تجريبية في ظل الظروف المحلية.
ينصح بالقياس الكمي لتصلب الشرايين في عدة مواقع في شجرة الأوعية الدموية. يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على نتائج من الجذر الأبهري، والقوس الأبهري، والشريان البشّيق في فأر واحد، بالإضافة إلى ترك بقية الشريان الأبهري البطني للتحليلات الأخرى. في مواجهة الاستعدادات تسمح التحديد الكمي السريع لللويحات المحملة بالدهون في القوس الأبهري. يمكن أيضًا تحديد عبء المرض في الشريان العضدي الرأسي كمياً إذا تم عرض العينات بعناية. أكثر تستغرق وقتا ً طويلاً المقطع العرضي للجذر الأبهري يترك عدة أقسام متاحة للتقييم التفصيلي لتكوين البلاك.
Protocol
وتتطلب جميع التجارب الحيوانية موافقة السلطات الأخلاقية.
1. الماوس التضحية وmicrodissection من الأبهر
- التضحية الماوس عن طريق CO2 الاختناق والوزن القياسي.
- رش الماوس مع الإيثانول 70٪ لتجنب تلوث الفراء من العينات. ضع الماوس في وضع supine. من الشق الوداجي، قم بعمل شق خط الوسط باستخدام مقص Mayo (مايو) الذي يمتد إلى أسفل عظم العانة تقريبًا.
تحذير: ارتفاع نسبة الإيثانول قابلة للاشتعال للغاية ويمكن أن يسبب تهيج العين خطيرة. اتخاذ تدابير وقائية. - استخدام إبرة 23 G لexsanguinate الماوس عن طريق ثقب القلب من خلال جدار الصدر. هذا الإجراء عادة ما ينتج 750 درجة مئوية من الدم من فأر ة يبلغ من العمر 20 أسبوعا. عادة، جمع نصف حجم في أنبوب EDTA المغلفة ثلاثي البوتاسيوم والنصف الآخر في مصل أو أنبوب الليثيوم المغلفة الهيبارين. تحويل بلطف الأنابيب والحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة حتى مزيد من المعالجة.
- استخدم مقص Mayo (مايو) لقطع الصفاق الجداري في خط الوسط لفتح تجويف البطن. عقد عملية xiphoid مع ملقط الأنسجة وقطع فتح العاب أفقيا على كلا الجانبين والاستمرار في فتح الحجاب الحاجز.
- استخدم مقص Mayo (مايو) لفتح تجويف الصدر عن طريق قطع القفص الصدري في أقرب وقت ممكن. وهذا سيمكن زوايا واسعة للأدوات في حين تشريح الأبهر في وقت لاحق.
- قم بعمل شق في الأوريكل الأيمن لتصريف السوائل التسريبية. أدخل إبرة 27 G من خلال قمة القلب في اتجاه الجمجمة. الحفاظ على الإبرة ثابتة في البطين الأيسر في حين يفرز ببطء الماوس مع 10 مل الجليد البارد الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) خلال الحد الأدنى 2 دقيقة.
ملاحظة: بعض البروتوكولات استخدام البارافورمالهايد التسريب، ولكن هذا يتداخل مع العديد من التطبيقات المصب، مثل تحليل الكيمياء المناعية للخلايا الليمفاوية. لذلك، لا يتم تنفيذ تثبيت التسريب مع البارافورمالهايد في هذا البروتوكول. - تشريح الأعضاء ذات الاهتمام (مثل العقد الليمفاوية والطحال والكبد والأمعاء ومنصات الدهون الأربية والكلى، وما إلى ذلك) باستخدام ملقط تشريحي ومقص تشريح.
- قطع القصبة الهوائية والمريء على الجانب الأيمن من القلب دون الإضرار القوس الأبهري. قطع الحجاب الحاجز والهياكل التي تعلق الحشوة إلى الرجعية، وترك القلب والأبهر والكلى في الموقع. أضعاف بعيدا الرئتين وviscera caudally وتغطية لهم مع منديل لبدء قسم الميكروديس خلف العين من العقد الليمفاوية شبه الأبهرية والأبهر البطني.
- بدء microdissection تحت مجهر مجسم في التكبير 6X. ابدأ بتشريح التبذير الأبهري عن طريق رفع الأنسجة المحيطة بملقط دومون وقطع التوتر مع مقص فاناس.
- استمر في تشريح الشريان الأبهري البطني القحفي. قطع فروع البطن من الشريان الأبهري وتحرير الشريان الأبهري القريب من خلال توقف الأبهر في الحجاب الحاجز.
ملاحظة: يتطلب قسم الميكروسيرسي تنسيقًا دقيقًا بين اليد والعين من خلال المجهر المجسم، والذي يتطلب بعض الممارسة لإتقانها.
- استمر في تشريح الشريان الأبهري البطني القحفي. قطع فروع البطن من الشريان الأبهري وتحرير الشريان الأبهري القريب من خلال توقف الأبهر في الحجاب الحاجز.
- إزالة الأنسجة الدهنية التي تغطي الأبهر الصدري. تشريح بعناية دورسالي من الغدة الصعترية لتحرير القوس الأبهري مع الفروع. الاستمرار في تشريح الشرايين السباتية بحالة من التهم قدر الإمكان في تجويف الصدر. في حالات خاصة، يمكن إجراء تشريح الرقبة لتشمل الانقسام السباتي.
- تنظيف الأدوات عن طريق شطف على التوالي في الماء منزوع الأيونات، RNase حل إزالة التلوث، 70٪ الإيثانول، وPBS قبل قطع فعلا الأبهر. رفع القلب من قمة مع ملقط. قطع الأبهر على مقربة من القلب ووضع القلب كله في أنبوب مع PBS. يمكن تخزين القلب على الجليد لبضع ساعات قبل مواصلة المعالجة والبرد الجذر الأبهري.
- قطع القوس الأبهري وفقا للالشكل 1A. وضع القوس الأبهري في أنبوب يحتوي على 1 مل من 4٪ الفورمالديهايد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ويمكن تخزين العينة بهذه الطريقة لعدة سنوات قبل الغزل والتحليل.
تحذير: الفورمالديهايد قد يسبب السرطان، وردود الفعل الجلدية التحسسية، وضارة إذا ابتلع. استخدام معدات الحماية الشخصية حسب الاقتضاء. - تشريح الأبهر تنازلي المتبقية ووضعها في حل تثبيت الحمض النووي الريبي أو تجميد المفاجئة لتحليل الحمض النووي الريبي اللاحقة أو تطبيق آخر. تحسين تدفق العمل لتقليل وقت التشريح أمر بالغ الأهمية لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي المفرط.
- وضع أنابيب جمع الدم (التي تم جمعها في الخطوة 1.3) في جهاز طرد مركزي. تدور أسفل البلازما منفصلة وأنابيب المصل في 1500 × ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل بعناية البلازما والمصل إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق وتخزينها في -80 درجة مئوية. جمع كل من EDTA والبلازما heparinized أو المصل يترك إمكانيات لتطبيقات المصب متعددة.
- ضع القلب على سرير من الفلين مع الجانب البطني الذي يواجه. إصلاح القلب إلى الفلين مع إبرة من خلال قمة. عقد قاعدة القلب مع ملقط التشريحية.
- استخدام مشرط لقطع بعيدا 2/3 apical من القلب مع اتجاه قطع يجري كخط بين اثنين من الأوريكلات مع مشرط زاوية 20 درجة caudally في الطائرة المترهلة و 20 درجة الجمجمة في الطائرة عبر الحوادث (الشكل1B).
- تضمين الجذر الأبهري في درجة حرارة القطع المثلى (OCT) المركب، الذي يحيط، ولكن لا تتسلل إلى الأنسجة. تزج قاعدة القلب في مجمع OCT. اضغط بلطف على القلب مع ملقط لملء الجذر الأبهري مع OCT وإزالة أي فقاعات الهواء.
- نقل العينة إلى الجزء السفلي من cryomold مليئة OCT. يجب أن يكون الجذر الأبهري الآن عموديًا على السطح السفلي. وضع القلب شنت على الجليد الجاف لتجميد. تخزين العينات في أكياس قفل الرمز البريدي في -80 درجة مئوية حتى متابعة الاستئصال بالتبريد وفقا للقسم 3 في هذا البروتوكول.
الشكل 1: القلب والقوس الأبهري في الموقع. (أ) تتم إزالة الرئتين والقصبة الهوائية والمريء والغدة الصعترية لعرض القوس الأبهري في الموقع في Apoe الإناث البالغة من العمر 20 أسبوعا -/- الماوس على نظام غذائي تشاو العادية في ميكروجراف، شريط مقياس = 2 ملم. تشير الخطوط المنقطة إلى مكان قطع القوس الأبهري وفروعه. (ب) تصوير تخطيطي للقلب والأبهر. يشير الخط المنقط باللون الأحمر إلى مكان قطع القلب قبل تركيب الجذر الأبهري بالتبريد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. تحليل الوجه من القوس الأبهري والشريان البشّاط
- إعداد أسرة الغزل لتحليل الوجه en من الأقواس الأبهرية. أضعاف جزء من فيلم الشمع البارافين ثماني مرات لجعل شقة 25 مم × 25 مم السطح. التفاف مع الشريط العزل الكهربائي الأسود لجعل خلفية داكنة للأبهر. وضع تسمية على الجانب الخلفي من السرير الغزل واستخدام قلم رصاص لكتابة رقم تعريف الماوس (الحبر القلم العادي سوف تختفي في عملية تلطيخ).
- نقل القوس الأبهري إلى السرير الغزل ووضع قطرة من PBS على أعلى من ذلك. ابدأ بتنظيف الأبهر من الأنسجة الدهنية المحيطة المتبقية تحت مجهر مجسم.
- استخدم مقص فاناس وملقط دومون لتقشير جميع الأنسجة الدهنية المحيطة بلطف دون التلاعب أو إتلاف الأبهر. السودان الرابع سوف وصمة عار الأنسجة الدهنية الزاهية، وأنه من الأهمية بمكان لإزالة كل هذه الأنسجة في هذه المرحلة.
ملاحظة: الحفاظ على الأبهر رطبة في جميع الأوقات تطبيق PBS إضافية عند الحاجة.
- استخدم مقص فاناس وملقط دومون لتقشير جميع الأنسجة الدهنية المحيطة بلطف دون التلاعب أو إتلاف الأبهر. السودان الرابع سوف وصمة عار الأنسجة الدهنية الزاهية، وأنه من الأهمية بمكان لإزالة كل هذه الأنسجة في هذه المرحلة.
- قطع فتح الأبهر في الطائرة الإكليلية عن طريق إدخال مقص فاناس في التجويف الأبهري لفضح السطح اللاإتيم. البدء في قطع انحناء الخارجي للقوس الصاعد في اتجاه القاصي والاستمرار في قطع فتح الفروع بما في ذلك الشريان brachiocephalic. وفر الجزء الظهري من المنطقة الصدرية المنحدرة.
- قطع فتح انحناء أقل وأضعاف فتح الأبهر لعرض السطح المبلل.
ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب مهارات الحركية الدقيقة وتحتاج إلى بعض الممارسة لإتقان.
- قطع فتح انحناء أقل وأضعاف فتح الأبهر لعرض السطح المبلل.
- دبوس القوس المفتوح إلى السرير الغزل باستخدام نهاية حادة من دبابيس الحشرات minutien. استخدام حامل إبرة كاستروفيجو الصغيرة لوضع دبابيس في مكانها. ثني بلطف دبابيس بعيدا عن العينة عندما في المكان. دبوس شقة الأبهر على السرير دون تمديد العينة. تخزين القوس المثبتة التي تواجه أسفل في طبق بيتري مليئة PBS في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. - إعداد حل عملي للسودان الرابع. اخلط 1 غرام من مسحوق السودان الرابع، 100 مل من الإيثانول بنسبة 70٪، و 100 مل من الأسيتون في زجاجة داكنة وحرّك بلطف لمدة 10 دقائق. ليست هناك حاجة لتصفية الحل ويمكن استخدامه لبضعة أشهر إذا أبقى الظلام في درجة حرارة الغرفة. إذا كان لون تلطيخ ليست مرضية، يمكن إجراء حل جديد والعينات ملطخة مرة أخرى.
تحذير: الأسيتون هو سائل قابل للاشتعال يمكن أن يسبب تهيج العين خطيرة. تخزين في مكان جيد التهوية واتخاذ تدابير وقائية عند التعامل معها. - ترتيب خمسة أطباق بيتري على مقاعد البدلاء المختبر: واحد مليئة 70٪ الإيثانول، واحد مليئة السودان الرابع حل العمل، واثنين مليئة الإيثانول 80٪، وواحدة مليئة PBS.
- تبدأ مع الرينينغ العينة في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق عن طريق وضع السرير الغزل في طبق بيتري الأول مع القوس التي تواجه إلى أسفل. نقل العينة إلى السودان الرابع حل العمل والسماح لها وصمة عار القوس لمدة 7 دقائق.
- بعد ذلك، شطف في الإيثانول 80٪ لمدة 3 دقائق مرتين لإزالة وصمة عار السطح العام. ويمكن تعديل وقت إزالة البقع لتحسين النتائج. وأخيرا، شطف في PBS قبل وضع العينة مرة أخرى في طبق بيتري الأصلي.
- الحصول على الميكروغراف باستخدام مجهر مجسم في التكبير 10 مرات متصلة بكاميرا رقمية. التقاط صور للقوس المثبتالمغمورة في PBS باستخدام الأوزان المعدنية الصغيرة (20 مم × 10 مم × 5 مم) لعقد السرير الغزل إلى الجزء السفلي من طبق بيتري. ضع مسطرة بجوار الأبهر لمعايرة الصورة.
- استخدم برنامج تحليل الصورة (على سبيل المثال ImageJ) لتحديد منطقة الآفة والسطح الكلي. في عدم وجود معالم تشريحية لتحديد القوس الأبهري، يتم إجراء القياس عادة من بداية الأبهر الصاعد وصولاً إلى الفرع الوربي الأول (الشكل2A). استخدم ميزة القياس الكمي للمنطقة في البرنامج لتطويق منطقة القوس الألفي الإجمالي يدويًا.
ملاحظة: يجب أن يتم القياس الكمي للآفة بطريقة عمياء ومن المستحسن أن يؤكد محقق ثان النتائج.- في ImageJ، حدد أداة تحديد المضلع وقم بتطويق منطقة القوس الإجمالية بالنقرات المتكررة. ثم حدد المقياس في القائمة تحليل لعرض إجمالي مساحة القوس في إطار النتيجة.
- بعد ذلك، تطوق جميع لوحات السودان الملطخة IV في القوس. السودان الرابع هو صبغة الديازو الليسوكروم التي تلطيخ الدهون، والدهون الثلاثية، والبروتينات الدهنية مع اللون البرتقالي والأحمر. في ImageJ، حدد أداة التحديد الحر وحاصر جميع اللوحات أثناء الضغط على مفتاح Alt. انقر فوق قياس في القائمة تحليل لعرض منطقة قوس خالية من الآفات في إطار النتيجة.
- حساب منطقة الآفة النسبية عن طريق طرح منطقة خالية من الآفات من منطقة القوس الكلي ومن ثم تقسيم النتيجة مع منطقة القوس الكلي.
- قم بدبوس الشرايين تحت الترقوة والسباتي ة بعناية لتمكين تكوّن الآفة في الشريان البشاخيوسي (الشكل 2A). القياس الكمي للآفات في الشرايين تحت الترقوة والشرايين السباتية الشائعة عادة ما تكون صعبة جدا وغير ذات مغزى، على التوالي.
- في ImageJ، تطوق كلا القطعين من الشريان البراكوسيفاليك باستخدام أداة اختيار المضلع مع الضغط على مفتاح التحول. انقر فوق قياس في القائمة تحليل لعرض إجمالي منطقة الشريان القدري الرأسي في نافذة النتيجة.
- بعد ذلك، حدد أداة الاختيار الحر وتطويق جميع اللويحات في الشريان العضدي الدماغي أثناء الضغط على مفتاح Alt. انقر فوق قياس في القائمة تحليل لعرض منطقة الشريان brachiocephalic خالية من الآفات في نافذة النتيجة.
- حساب منطقة الآفة النسبية عن طريق طرح منطقة خالية من الآفة من إجمالي منطقة الشريان brachiocephalic ومن ثم تقسيم النتيجة مع منطقة الشريان brachiocephalic الكلي.
الشكل 2: تكوّن الآفة تصلب الشرايين. (أ) قوس الأبهر من 20 أسبوعا من العمر الذكور الإنسان APOB100-المعدلة وراثيا Ldlr-/- (HuBL) الفأر تغذية النظام الغذائي الغربي لمدة عشرة أسابيع معلقة مفتوحة وملطخة للويحات غنية بالدهون مع السودان الرابع. يتم تحديد إجمالي مساحة سطح القوس الأبهري مع خط منقط باللون الأبيض في الميكروجراف، شريط مقياس = 2 ملم. الخطوط المنقطة باللون الأصفر تحدد المساحة الإجمالية للشريان البشخيوسيفالي. (ب) الجذر الأبهري المقطع العرضي في 400 ميكرومتر من الجيوب الأبهرية في 20 أسبوعا من العمر ذكر Ldlr-/- الماوس تغذية النظام الغذائي الغربي لمدة ثمانية أسابيع تصور في ميكروغراف، مقياس بار = 500 ميكرومتر. الخطوط المنقطة باللون الأسود تحدد إجمالي مساحة السفينة والآفات التصلب التأينية الملطخة بالزيت الأحمر O المترجمة في intima الشرياني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. الاستئصال بالتبريد من الجذر الأبهري
- تعيين درجة حرارة cryostat في -20 درجة مئوية وسمك القسم إلى 10 درجة مئوية. في حين بدأت في خفض، وصقل محاذاة سطح القسم لتكون موازية لحامل العينة.
- إزالة الإفراط المحيطة OCT لتسهيل جمع المقاطع دون طيات. يجب الآن وضع الجذر الأبهري عمودياً على شفرة السكين نظراً لأن قاعدة القلب وضعت بشكل صحيح في القالب.
- جمع أقسام التحكم الأولية على الشرائح المجهر العادي، والتي سيتم تجاهلها. يجب أن تحتوي الأقسام الأولى على أنسجة عضلة القلب فقط. تقدم في القسم بمقدار 200 درجة مئوية في ذلك الوقت. جمع قسم والتحقق من التقدم مع المجهر الخفيفة.
- عند الاقتراب من مسار تدفق البطين الأيسر، تحقق من كل 100 ميكرومتر تحت المجهر. عندما يتم ملاحظة المؤشرات الأولية لجدار السفينة، إبطاء وتيرة إلى 50 ميكرومتر.
ملاحظة: عندما يظهر الأوج الأبهري الأول، سيكون هذا نقطة الصفر لجمع المقاطع. قد يكون من الصعب معرفة متى تظهر الأوبس بالضبط، ولكن التعريب الدقيق أمر بالغ الأهمية لإجراء مقارنات بين الآفات في نفس المنطقة. -
إمالة العينة نحو نقطة الصفر cusp لمحاذاة مستوى القسم مع اثنين من الأوباب الأخرى. وهذا أمر بالغ الأهمية للحصول على مقاطع عرضية حقيقية من الأبهر. قم بإجراء رسم للجذر الأبهري، مما يشير إلى الأوعية كما تظهر، وعد كل مقطع 10 ميكرومتر التي يتم قطعها من النقطة صفر فصاعداً.
- عندما يظهر الأوب الثاني، إمالة قليلا العينة مرة أخرى بعيدا عن cusp لمحاذاة العينة مع الأوب الثالث. يجب ألا يتجاوز الفرق في المستوى بين الأوج 50 ميكرومتر.
- جمع المقاطع وفقا لتخطيط الشرائح في الشكل 3. قد تبدأ مجموعة المقاطع من 190 ميكرومتر إذا كان الجذر الأبهري يميل أكثر من 50 ميكرومتر، للسماح بمساحة أكبر لمحاذاة الجذر في وضع مستقيم. استمر في التقسم حتى الوصول إلى مستوى 800 ميكرومتر من النقطة الصفر. إذا كانت لا تزال هناك لويحات مرئية في هذا المستوى، يمكن توسيع المجموعة إلى 1000 ميكرومتر.
ملاحظة: يتم عرض منظمة شرائح مبسطة في الشكل التكميلي 1، والتي يمكن أن تزيد من سرعة القسم. وينبغي تحديد التخطيط الأمثل للشرائح حسب خطة المشروع.
-
إصلاح المقاطع بعد المجموعة.
- إصلاح الأقسام التي تم جمعها لزيت أحمر O تلطيخ وPicrosirius الأحمر تلطيخ الكولاجين في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقيقة. إذا كان يجب أن تكون ملطخة الشرائح مع النفط الأحمر O على الفور، وأنها لا تزال رطبة، ووضعها في 60٪ isopropanol لمدة 1 دقيقة لتسريع عملية التجفيف.
تحذير: Isopropanol هو سائل قابل للاشتعال يمكن أن يسبب تهيج العين خطيرة ويمكن أن يسبب النعاس أو الدوخة. تخزين في مكان جيد التهوية واتخاذ تدابير وقائية عند التعامل معها. - تثبيت الأقسام التي تم جمعها لالكيمياء المناعية أو الفلورة المناعية في الأسيتون النقي البارد الثلجي لمدة 10 دقائق.
- إصلاح الأقسام التي تم جمعها لزيت أحمر O تلطيخ وPicrosirius الأحمر تلطيخ الكولاجين في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 10 دقيقة. إذا كان يجب أن تكون ملطخة الشرائح مع النفط الأحمر O على الفور، وأنها لا تزال رطبة، ووضعها في 60٪ isopropanol لمدة 1 دقيقة لتسريع عملية التجفيف.
الشكل 3: تنظيم شرائح للمقاطع التسلسلية للجذر الأبهري. أثناء الاستئصال بالتبريد من الجذر الأبهري كل 10 ميكرومتر قسم سميك ة تمتد على أول 800 ميكرومتر من الأبهر الصاعد ينبغي جمعها. وهناك حاجة إلى تنظيم شرائح منهجي للحصول على أقسام مناسبة لمختلف التطبيقات. تحليل تكوين الآفة عادة ما يشمل النفط الأحمر يا تلطيخ للدهون وPicrosirius الأحمر تلطيخ للكولاجين. يتم جمع الأقسام المتبقية والأسيتون ثابتة لالكيمياء المناعية وتلطيخ المناعة. تم تعديل هذا الرقم من Gisterå وآخرون30. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. النفط الأحمر يا تلطيخ والقياس الكمي من تصلب الشرايين في الجذور الأبهرية
- إعداد محلول النفط المشبعة الأحمر O عن طريق حل 1 غرام من النفط الأحمر O في 100 مل من إيزوبروبانول. حرّك الحل في زجاجة داكنة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يمكن الاحتفاظ بالحل المشبعة لعدة أشهر.
ملاحظة: فمن المستحسن أن يكون قد تم تعيين معدات مختبر ية لتلطيخ النفط الأحمر O لأنه من الصعب تنظيف المعدات التي كانت على اتصال مع الحل. - إعداد حل العمل عن طريق خلط 75 مل من النفط المشبعة الأحمر O الحل مع 50 مل من الماء منزوع الأيونات. اسمحوا الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة تصفية من خلال ورقة مرشح نوعية.
- ضع الشرائح في محلول عمل زيت أحمر O لمدة 20 دقيقة.
- للمساعدة في تصور الأنسجة، وصمة عار مع هيماتوإكسيلين ماير لمدة 1 دقيقة. يجب أن تكون ملطخة الآن جميع النوى في اللون الأزرق، وضبط الوقت تلطيخ لتحسين النتيجة.
- جبل الشرائح في وسط تصاعد مائي (على سبيل المثال، الجيلاتين الجلسرين كايزر). الجيلاتين الجلسرول الحار من كايزر إلى 40 درجة مئوية لجعله سائلًا قبل الاستخدام. ليس من الضروري لتجفيف الشرائح منذ المتوسطة المتصاعدة هي المياه القائمة. كن حذرا لتجنب تشكيل فقاعة الهواء عند إضافة الزجاج الغطاء.
تحذير: يحتوي الجيلاتين الجلسرول كايزر الفينول، الذي يشتبه في التسبب في عيوب وراثية. استخدام معدات الحماية الشخصية حسب الاقتضاء. - الحصول على الميكروغرافيا الرقمية باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر الضوئي. عادة ما يمكن تصور جدار السفينة الكامل وحدود الآفة بوضوح من قبل التكبير 50 مرة. حفظ الصور عالية الدقة، ويفضل في تنسيق ملف الصورة ذات العلامات (TIFF).
- إجراء تحليل لحجم الآفة باستخدام نظام برامج تحليل الصور بمساعدة الكمبيوتر. زيت أحمر O هو صبغة ديازو الليسوكروم التي تلطيخ الدهون المحايدة وتصور لويحات تصلب الشرايين مع لون أحمر مكثف، مما يساعد على قياس الآفة.
ملاحظة: يجب أن يتم القياس الكمي للآفة بطريقة عمياء ومن المستحسن أن يؤكد محقق ثان النتائج التي تم الحصول عليها.- استخدم ميزة القياس الكمي للمنطقة في برنامج تحليل الصورة لتحديد إجمالي مساحة السفينة من خلال تطويق اللامينا المرنة الخارجية لجدار السفينة الأبهري (الشكل2B). في ImageJ، حدد أداة تحديد المضلع وحاصر المنطقة بالنقرات المتكررة. ثم حدد المقياس في القائمة تحليل. يتم عرض إجمالي مساحة السفينة في إطار النتائج.
- الاستمرار في قياس الآفات تصلب الشرايين في الطبقة الإيحاءية للوعاء، التي تحددها لامينا مرنة الداخلية والحدود الإنارة. عادة ما يتم استبعاد الآفات على الأوج صمام من قياس27. في ImageJ، حدد أداة التحديد الحر وحاصر جميع اللوحات أثناء الضغط على مفتاح Alt. حدد قياس في القائمة تحليل لعرض منطقة السفينة خالية من الآفات في نافذة النتيجة.
- حساب منطقة الآفة النسبية عن طريق طرح منطقة خالية من الآفات من إجمالي مساحة السفينة ومن ثم تقسيم النتيجة مع إجمالي مساحة السفينة.
ملاحظة: معايرة النتائج في برنامج تحليل الصورة وفقا للتكبير المستخدمة للحصول على منطقة الآفة المطلقة في ميكرومتر مربع.
- تحديد منطقة النفط الأحمر O ملطخة في الآفات باستخدام ميزة عتبة اللون في برنامج تحليل الصورة لحساب النسبة المئوية للنفط الأحمر O المنطقة الإيجابية من إجمالي منطقة الآفة.
- في ImageJ، قم بتطويق منطقة كافة الآفات باستخدام أداة التحديد الحر أثناء الضغط على مفتاح التحول. حدد قياس في القائمة تحليل لعرض إجمالي ناحية الآفة في إطار النتيجة.
- حدد مسحًا في الخارج في قائمة تحرير. تغيير نوع الصورة إلى 8 بت في قائمة الصور.
- قم بتعيين عتبة حمراء لمنطقة النفط الأحمر O السالبة عن طريق تحديد العتبة في القائمة الفرعية ضبط قائمة الصورة. انقر فوق تطبيق. جعل الصورة ثنائية عن طريق تحديد هذا الخيار في القائمة الفرعية الثنائية من قائمة العملية.
ملاحظة: عادة النفط الأحمر يا تلطيخ يختلف بين دفعات. وبالتالي، ينصح عتبة اللون فقط داخل نفس دفعة تلطيخ. وينبغي عرض النتيجة إلى جانب وصف لكيفية تحديد العتبة وتوحيدها. - تحليل الصورة عن طريق تحديد تحليل الجسيمات في القائمة تحليل وانقر فوق موافق. يتم الآن عرض إجمالي النفط الأحمر O منطقة الآفة السلبية في إطار ملخص. حساب النسبية النفط الأحمر O المنطقة الإيجابية عن طريق طرح النفط الأحمر س منطقة سلبية من منطقة الآفة الإجمالية ومن ثم تقسيم مع منطقة الآفة الإجمالية.
Representative Results
في نماذج الماوس من تصلب الشرايين الآفات الأكثر بروزا تميل إلى التطور في الجذر الأبهري والقوس الأبهري. يصف هذا البروتوكول التحديد الكمي لتصلب الشرايين في الجذر الأبهري، والقوس الأبهري، والشريان البشّع في فأر واحد. الآفات القابلة للقياس في الشريان الأبهر الصدري التنازلي والشريان الأبهري البطني موجودة فقط في الحيوانات التي توجد فيها أمراض متقدمة. في هذا البروتوكول، لا يتم تحليل هذه الأجزاء لعبء تصلب الشرايين، ولكن حفظها للتحليل اللاحق لمستويات mRNA أو تحليلات أخرى. عادة ما يتم عرض المقاطع التسلسلية للآفات التصلب الشرايين في الجذر الأبهري في رسم بياني مع حجم الآفة على محور yوالمسافة إلى الجيوب الأبهرية على محورx-محور28. المقاطع المتقاطعة الحقيقية حاسمة لحجم الآفة. يمكن للأقسام المائلة المبالغة في تقدير أحجام الآفات وإمالة 20 درجة فقط يمكن أن تبالغ في تقدير سطح الآفة المطلقة بنسبة 15٪29. ومع ذلك، فإن حساب جزء الآفة من إجمالي مساحة السفينة يجعل النتيجة أقل حساسية للاختلافات المحتملة في الزاوية أثناء القسم (الشكل4A). وعادة ما تكون الطريقة الإحصائية المناسبة للكشف عن الاختلافات بين المجموعات هي تحليل منتظم للتباين في اتجاهين (ANOVA). ثم يتم إجراء اختبارات ما بعد بونفيرونى للكشف عن الاختلافات على مستويات معينة. ويمكن أيضا استخدام الفرق الأقل أهمية فيشر كاختبار متابعة لANOVA. فهو يقلل من احتمال حدوث أخطاء إحصائية من النوع الثاني، ولكنه لا يفسر المقارنات المتعددة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من التوضيح لحساب المنطقة تحت المنحنى أو متوسط حجم الآفة لكل ماوس وتقديم البيانات في مؤامرة نقطة لمزيد من تصور التباين الفردي داخل المجموعات (الشكل4B).
زيت أحمر O هو صبغة ديازو حمراء زاهية قابلة للذوبان في الدهون، والتي تلطيخ الدهون المحايدة. الدهون القطبية في أغشية الخلايا ليست ملطخة. يمكن إجراء تلطيخ الزيت الأحمر O على عينات طازجة أو مجمدة أو ثابتة فورمالين، ولكن ليس على عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين بسبب إزالة الدهون في عملية إزالة البارافينية المطلوبة. ويمكن إجراء تحديد كمية من تراكم الدهون الآفات عن طريق عتبة اللون النفط الأحمر O المنطقة الإيجابية من إجمالي منطقة الآفة (الشكل4C). ينتج الهيماتوكسيلين تلطيخ أزرق لنواية الخلايا، وهو أمر مفيد لتصور مورفولوجيا البلاك. الشرايين التاجية اليمنى واليسرى عادة ما تختلف عن الشريان الأبهري حوالي 250 ميكرومتر من الجيوب الأبهرية27، والتي غالبا ما تتزامن مع أحجام الآفات الأكثر بروزا. غالبًا ما يتم عرض المقاطع العرضية من هذه المنطقة كنتائج تمثيلية (الشكل4D).
الشكل 4: الآفات تصلب الشرايين في الجذر الأبهري. (أ) تم تقييم 28 أسبوعا من العمر الذكور نخاع العظام chimeras تغذية النظام الغذائي الغربي لمدة ثمانية أسابيع لتحديد تأثير Smad7 نقص الخلايا T على تطوير تصلب الشرايين. [لورد] تجريبيّة -/- استلم [شمرس] [كد4-كر]+[سمد7][فل/فل] عظمة نخاع وتحكمات يستلم [كد4-كر]+[سمد7][فل/غ] عظمة نخاع. يظهر الرسم البياني القياس الكمي لمنطقة الآفة تصلب الشرايين من ثمانية أقسام متتالية، 100 - 800 ميكرومتر من الجيوب الأبهرية المعروضة كجزء آفة من سطح السفينة الكلي(Cd4-Cre+Smad7فلوريدا / +/ Ldlr-/- n = 6، Cd4-Cre+Smad7فلوريدا / فلوريدا/ Ldlr-/- ن = 9، 2-طريقة ANOVA مع اختبار آخر بونفيرونى، ويبين الرسم البياني يعني ± SEM، الأقواس تشير إلى مستوى الأهمية لمقارنة سلالة). (B) رسم نقطة مجتمعة وشريط الرسم البياني يظهر متوسط منطقة الآفة تصلب الشرايين من أقسام الجذر الأبهري (Cd4-Cre+Smad7فلوريدا / +Ldlr-/- ن = 6، Cd4-Cre+Smad7 فلوريدا / فلوريدا /فلوريدا/ Ldlr-/- n = 9، الطالب t-test) (C) جزء من النفط الأحمر O-ملطخة المنطقة في الآفات (Cd4-Cre+Smad7فلوريدا / +/ Ldlr-/- ن = 4، Cd4-Cre+Smad7 فلوريدا/ فلوريدا /Ldlr-/- n = 6، الطالب ر-اختبار، ns = غير الهامة) (B -C)النقاط تمثل الفئران الفردية والحانات تظهر يعني ± SEM. (D) الميكروغرافيا التمثيلية التي تظهر النفط الأحمر O تلطيخ (باللون الأحمر اللون) من الدهون المحايدة في الجذر الأبهري 300 ميكرومتر من الجيوب الأبهرية (التكبير 50X)، شريط مقياس = 500 ميكرومتر. *ع ≤ 0.05، ***ف ≤ 0.001. وقد تم تعديل هذا الرقم من Gisterå وآخرون31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن استخدام النفط الأحمر O لتلطيخ الأبهر المعدة للوجه، ولكن هذا البروتوكول يستخدم السودان الرابع، آخر صبغة ديازو مريحة قابلة للذوبان في الدهون. السودان الرابع تصور بوضوح لويحات تصلب الشرايين في اللون البرتقالي والأحمر عن طريق تلطيخ الدهون، والدهون الثلاثية، والبروتينات الدهنية. إزالة الخلفية الداكنة في الصور التمثيلية للأقواس الأبهرية الوجه en يمكن أن تعزز العرض البصري (الشكل5A). عادة ما يتم توزيع حجم الآفة داخل المجموعات، مما يسمح بإجراء اختبار إحصائي مع اختبار t-test بين المجموعات. مؤامرة نقطة التي تظهر كل من الفئران الفردية والمتوسط، والتي يتم مقارنتها بين المجموعات، هو وسيلة مفيدة لعرض النتائج (الشكل5B-C). وبما أن التباين داخل المجموعات يختلف عادة بين المواقع في شجرة الأوعية الدموية، عادة ما تكون هناك حاجة إلى حسابات طاقة منفصلة. ويمكن تجنب الاختلاف غير الضروري عن طريق إتقان الأساليب وتوحيد البروتوكولات. ومن المهم الحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، ولكن الأهمية البيولوجية للفرق الملاحظ تحتاج دائما إلى النظر فيها أيضا.
الشكل 5: الآفات التصلب الشرايين في القوس الأبهري والشريان الصدري. (أ) ممثل في وجه الميكروغرافيا من الأقواس الأبهرية مع لويحات محملة بالدهون ملطخة بالسودان الرابع (باللون البرتقالي) من 20 أسبوعا الفئران القديمة تغذية النظام الغذائي الغربي لمدة عشرة أسابيع، تصور معا. شريط مقياس = 2 ملم. (B) الآفات تصلب الشرايين في القوس الأبهري (HuBL n = 10، BT1xHuBL ن = 12؛ اختبار الطالب. (C) الآفات تصلب الشرايين في الشريان العضدي (HuBL n = 8، BT1xHuBL ن = 9، الطالب t-اختبار). (باء-جيم) النقاط تمثل الفئران الفردية، وتظهر الحانات يعني ± SEM. *ع ≤ 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من Gisterå وآخرون32. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التنظيم البديل للشرائح للمقاطع التسلسلية من الجذر الأبهري. تنظيم شرائح منهجي مبسط لجمع المقاطع من الجذر الأبهري. تمكن المجموعة من تلطيخ الزيت الأحمر O للدهون والكيمياء المناعية أو تلطيخ الفلورة المناعية. يتم حذف الشرائح المخصصة لتلطيخ الأحمر Picrosirius من الكولاجين. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
أمراض القلب والأوعية الدموية هو القاتل الرئيسي في العالم وهناك حاجة إلى قياسات وقائية جديدة2. نماذج الماوس من المرض توفر منصة شاملة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية والعلاجات التجريبية13. يمكن الاعتماد عليها حجم الآفة القياس الكمي ضروري لهذا النهج. غير أن أساليب القياس الكمي تختلف بين المختبرات. التوحيد والتحسين كانت عملية مستمرة منذ 198013،27،33،34. ظهرت جذور الأبهر كالموقع الأكثر شعبية لتحديد كمية تصلب الشرايين التجريبية. تتيح المقاطع العرضية من اللويحات مقارنة حجم البلاك بين المجموعات. ويفضل En الاستعدادات الوجه للقياس الكمي الآفة في قطاعات أكبر من الأبهر. طريقة أون الوجه تصور كمية البلاك وتمكن من القياس الكمي لتغطية منطقة البلاك، ولكن لا تأخذ سمك البلاك في الاعتبار. وتُدعم الأهمية البيولوجية للاختلافات الملاحظة بنتائج متسقة في مواقع مختلفة في شجرة الأوعية الدموية. تقييم تطوير تصلب الشرايين في مواقع مختلفة يعالج الآثار المحتملة للموقع. يمكن تقييم تأثير الخلايا المكونة للدم المزروعة على تطور تصلب الشرايين في اللاوسير ة فرط الكوليسترول -/- تشيميراس. ومع ذلك، يؤثر التشعيع لكامل الجسم على عملية تصلب الشرايين مع تأثيرات محددة للموقع. يتم تطوير الآفات التصلب الشرايين أكثر بروزا في الجذر الأبهري ، في حين لوحظ انخفاض تطور الآفة في الأقواس الأبهرية35.
الأهم من ذلك، ليس فقط حجم الآفة يحتاج إلى معالجة في دراسات تصلب الشرايين التجريبية. تكوين الآفة هو أيضا معلمة رئيسية. وقد ارتبطت العديد من ملامح البلاك مع مظاهر المرض في البشر36. المقطع التسلسلي للجذر الأبهري يترك عدة أقسام متاحة لتحليل دقيق لتكوين البلاك. يتميز تمزق البلاك في البشر بغطاء ليفي رفيع مع عدد قليل من خلايا العضلات الملساء، ومحتوى الكولاجين المتناثر وعلامات الالتهاب في لويحات36. على الرغم من أن تمزق البلاك هو حدث نادر في نماذج الماوس من تصلب الشرايين، وعلامات لاستقرار البلاك هي مفيدة لتقييم. يمكن للنهج المترجمة تأكيد النتائج الميكانيكية من نماذج الماوس وكشف السمات الهامة للأمراض البشرية31. يمكن تحديد الحالة الالتهابية لللويحات تصلب الشرايين عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية من VCAM-1، MHC الفئة الثانية، الضامة، والخلايا الليمفاوية30. بعض البروتوكولات استخدام المقاطع الطولية في الطائرة الإكليلية من القوس الأبهري أو الشريان الصدري لقياس حجم الآفة تصلب الشرايين وتكوين37. ومع ذلك، يترك هذا الأسلوب البديل مقاطع قليلة فقط لتحليلها، مما يحد من تطبيقاته.
وتتمثل الخطوة الحاسمة الأولية في هذا البروتوكول في القدرة على حصاد الأبهر بكفاءة. التنسيق بين اليد والعين تحت المجهر يتطلب الممارسة وهو أمر بالغ الأهمية لكل من الاستئصال الجزئي والغزل اللاحق للقوس الأبهري. الخطوة الهامة التالية في هذا البروتوكول هي مجموعة المقاطع التسلسلية من الجذر الأبهري. وينبغي جمع ثمانين قسما ً متتالياً لكل فأر، الأمر الذي يتطلب التركيز والصبر على حد سواء. ويمكن أن تؤدي الكفاءة المنهجية إلى تسريع العمليات الموصوفة إلى حد كبير. ومع ذلك، لا يزال تحديد كمية الآفات تصلب الشرايين مهمة تستغرق وقتا طويلا. قد تسهل التكنولوجيا الجديدة والمناولة الآلية والتصوير الحيواني الصغير التحديد الكمي لتصلب الشرايين التجريبية في المستقبل. تطور تصلب الشرايين بطيء ومعظم البروتوكولات التجريبية في نماذج الماوس يستغرق أكثر من أربعة أشهر لإكمال13. لذلك، يجب جمع الأبهر بطريقة مثلى في نقاط نهاية الدراسة. يوفر هذا البروتوكول دليلشامل لحصاد الأبهر بكفاءة، كما أن المعالجة المقترحة تعد الأبهر للاستخدام متعدد الأغراض بما في ذلك تحديد كمية الآفات في الجذر الأبهري والقوس الأبهري والشريان البعية. نأمل أن البروتوكول يمكن أن تقلل من التباين التجريبي، وتعزيز موثوقية النتائج، ويؤدي إلى نتائج من شأنها أن تمهد الطريق لعلاجات جديدة ضد تصلب الشرايين.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر جميع الأعضاء السابقين في وحدة أبحاث القلب والأوعية الدموية التجريبية في غوران ك هانسون التي ساعدت في تطوير هذا البروتوكول على مدى ربع القرن الماضي. ونحن ممتنون بصفة خاصة للمساهمات التي قدمها أنتونيو نيكوليتي، وشينغهوا تشو، وآنا كارين روبرتسون، وإينغر بودين. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة المشروع 06816 ودعم Linnaeus 349-2007-8703 من مجلس البحوث السويدي، ومن خلال منح من مؤسسة القلب والرئة السويدية، ومجلس مقاطعة ستوكهولم، ومؤسسة البروفيسور نانا سفارتز، ولو وهانز أوسترمان مؤسسة البحوث الطبية، مؤسسة بحوث معهد كارولينسكا ومؤسسة أمراض الشيخوخة في معهد كارولينسكا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
| Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | - | To create pinning beds for aortic arches. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
| Cork board | Any specialized retailer | - | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
| Deionized water | - | - | For rinsing and preparation of solutions. |
| Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
| Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
| Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
| Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
| Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
| Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| ImageJ | NIH | - | Image analysis software. |
| Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
| Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
| Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
| Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
| Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
| Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
| Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
| Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
| Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
| Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
| Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
| Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
| Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
| Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
| Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Any cell culture supplier | - | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | - | - | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
| Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
| Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
| Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
| Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
| Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
| Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Gistera, A., Hansson, G. K.
- Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
- Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
- Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
- Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
- Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
- Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
- Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
- Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
- Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
- Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J.
- Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
- Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
- Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
- Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
- Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
- Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
- Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
- Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
- Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
- Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
- Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
- Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
- Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
- Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
- Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).
- Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
- Daugherty, A., Whitman, S. C.
- Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
- Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
- Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
- Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).
