Summary
Murine modellen van atherosclerose zijn nuttige instrumenten om te onderzoeken van pathogene trajecten op moleculair niveau, maar vereisen gestandaardiseerde kwantificering van de ontwikkeling van de laesie. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te bepalen van de laesie grootte in de grote arteriële vaten, met inbegrip van de aorta wortel, aortaboog, en brachiocephalische slagader.
Abstract
Hart-en vaatziekten is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld. De onderliggende oorzaak in de meeste gevallen is atherosclerose, die deel uitmaakt van een chronische ontstekingsziekte. Experimentele atherosclerose studies hebben de rol van cholesterol en ontstekingen in het ziekteproces opgehelderd. Dit heeft geleid tot succesvolle klinische proeven met farmaceutische agentia die klinische manifestaties van atherosclerose verminderen. Zorgvuldige en goed gecontroleerde experimenten in muismodellen van de ziekte kunnen verder opheldering van de pathogenese van de ziekte, die niet volledig wordt begrepen. Gestandaardiseerde laesie analyse is belangrijk om de experimentele variabiliteit te verminderen en de reproduceerbaarheid te verhogen. Het bepalen van de laesie grootte in aorta wortel, aortaboog, en brachiocephalische slagader zijn gemeenschappelijke eindpunten in experimentele atherosclerose. Dit protocol biedt een technische beschrijving voor de evaluatie van atherosclerose op al deze sites in een enkele muis. Het protocol is vooral nuttig wanneer het materiaal beperkt is, zoals vaak het geval is wanneer genetisch gemodificeerde dieren worden gekarakteriseerd.
Introduction
Hart-en vaatziekten is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld met ischemische hartziekte en beroerte accounting voor een bij elke vier sterfgevallen1. De meeste gevallen worden veroorzaakt door atherosclerose, een ziekte die wordt gekenmerkt door een langzame ophoping van met vet beladen plaques met tekenen van chronische ontsteking in grote en middelgrote slagaders2. De ziekte blijft meestal onopgemerkt gedurende enkele decennia totdat een breuk of erosie van de plaque een arteriële trombose die leidt tot ischemische weefselschade uitlokken.
Een normale slagader bestaat uit een intima laag met endotheliale cellen en dun verdeelde gladde spiercellen, een medielaag met gladde spiercellen en elastische lamellen, en een omringende adventitiële laag met los bindweefsel3. Een intimale retentie van LDL offsets atherosclerose ontwikkeling4. Accumulatie en modificatie van lipoproteïnen leiden tot aggregatie en Entrapment binnen de arteriële intima5. Een ontstekingsreactie wordt opgeroepen door de gevangen en gemodificeerde lipoproteïnen6. Endotheelcellen beginnen met het uitdrukken van adhesiemoleculen, zoals VCAM-1 op plaatsen in de arteriële boom met turbulente doorbloeding, wat leidt tot rekrutering van circulerende monocyten en andere leukocyten7. De infiltrerende monocyten differentiëren in macrofagen die lipide met daaruit voortvloeiende transformatie naar macrofaag schuim cellen8.
Atherosclerose is bestudeerd in muismodellen met toenemende frequentie sinds het midden van de jaren 1980. C57BL/6 is de meest gebruikte inteelt muis stam voor deze studies, en wordt gebruikt als de genetische achtergrond voor de meerderheid van de genetisch gemodificeerde stammen9. Deze stam werd opgericht in de jaren 192010, en haar genoom werd gepubliceerd in 200211. Experimenten in muismodellen hebben verschillende voordelen: de kolonies reproduceren snel, huisvesting is ruimtebesparend en inteelt vermindert de experimentele variabiliteit. Het model maakt ook genetische manipulaties mogelijk, zoals gerichte gendeleties en het inbrengen van transgenen. Dit heeft geleid tot een nieuw pathofysiologisch begrip van de ziekte en nieuwe therapie targets12.
Wild-type C57BL/6 muizen zijn van nature resistent tegen atherosclerose. Ze hebben het grootste deel van de circulerende cholesterol in HDL, en complexe atherosclerotische laesies worden niet gevormd, zelfs wanneer gevoed een hoog-vet en hoog-cholesterol dieet13. Hypercholesterolemic muizen, zoals ApoE-/- op de C57BL/6-achtergrond, worden daarom gebruikt als experimentele modellen van atherosclerose14,15. Het ontbreken van ApoE schaadt hepatische opname van restant lipoproteïnen en ernstig mensen lipide metabolisme. In ApoE-/- muizen is Circulerend cholesterol overwegend in VLDL-deeltjes en ontwikkelen de muizen complexe atherosclerotische plaques op een regulier Chow-dieet.
Ldlr-/- muizen nabootsen de ontwikkeling van atherosclerose gezien bij mensen met Familiaire hypercholesterolemie16. De ldlr-/- muizen hebben een westers dieet nodig om atherosclerose17te ontwikkelen. Westerse dieet bootst menselijke voedselinname en bevat meestal 0,15% cholesterol. De LDL-receptor herkent ApoB100 en ApoE en bemiddelt de opname van LDL-deeltjes via endocytose. LDL-receptoren zijn fundamenteel voor de klaring van de lever van LDL uit omloop, terwijl de LDL-receptor expressie in hematopoietische cellen dit proces niet beïnvloedt. Dit opent de mogelijkheid voor beenmergtransplantatie van ldlr+/+ cellen in hypercholesterolemic ldlr-/- ontvangers en beoordeling van atherosclerose ontwikkeling. Beenmerg chimeras zijn vaak gebruikt voor het bestuderen van de deelname van hematopoietische cellen in experimentele atherosclerose. Echter, beenmergtransplantatie kan invloed hebben op de grootte en de samenstelling van atherosclerotische plaques, waardoor interpretatie van de resultaten dubbelzinnig.
Verschillende varianten van ApoE-/- en ldlr-/- muizen met aanvullende genetische veranderingen zijn ontwikkeld om specifieke processen van de ziekte te bestuderen18. Een voorbeeld is de humane APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) muizen die het menselijk APOB100 gen van de volledige lengte19,20dragen. Deze muizen ontwikkelen hypercholesterolemie en atherosclerose op een regelmatige Chow dieet. Echter, de ontwikkeling van complexe atherosclerotische plaques duurt ten minste zes maanden en kortere experimentele protocollen meestal gebruiken westerse dieet21. Een grote fractie van plasma cholesterol circuleert in LDL-deeltjes, wat hubl -muizen een meer mens-achtige dyslipidemische lipoproteïne-profiel geeft in vergelijking met ApoE-/- en ldlr-/- muizen. Hubl muizen laten ook studies van humaan apoB toe als een autoantigen22.
De Muismodellen van atherosclerose ontwikkelen complexe atherosclerotische plaques met gedeelde kenmerken van de menselijke ziekte. Echter, de plaques zijn vrij resistent tegen breuk met daaropvolgende myocardinfarct. Atherotrombose wordt slechts sporadisch gedetecteerd en experimenteel uitdagend om23,24,25te beoordelen. Er zijn speciale modellen van plaque ruptuur ontwikkeld, maar het experimentele veld mist een betrouwbaar en reproduceerbaar model voor de beoordeling van plaque-stabiliserend middelen.
Kwantificering van atherosclerose is gemeld op tal van manieren in de literatuur. Recente inspanningen hebben getracht het experimentele ontwerp, de uitvoering en de rapportering van dierproeven te standaardiseren26. Onderzoekers hebben verschillende voorkeuren en technieken aangepast aan hun laboratoria. De meeste onderzoeksprojecten zijn ook uniek op een manier dat ze een aantal protocol modificaties nodig hebben. Door de multifactoriële aard van de ziekte variëren optimale controles tussen projecten. Lokale omstandigheden en gebrek aan standaardisatie kunnen waargenomen verschillen in ziekte ontwikkeling veroorzaken, wat de vooruitgang van het onderzoeksveld belemmert. Verschillen in experimentele variabiliteit betekent ook dat statistische vermogens berekeningen moeten worden gebaseerd op pilotstudies onder lokale omstandigheden.
Kwantificering van atherosclerose wordt aanbevolen op verschillende locaties in de vasculaire boom. Dit protocol beschrijft hoe u resultaten verkrijgen van de aorta wortel, de aortaboog en de brachiocephalische slagader in één muis, naast het verlaten van de rest van de thoracoabdominale aortvoor andere analyses. En gezichts preparaten maken een snelle kwantificering van met vet beladen plaques in de aortaboog mogelijk. De ziektelast in de brachiocephalische slagader kan ook worden gekwantificeerd als de monsters zorgvuldig worden weergegeven. Hoe meer tijd de kruisingen van de aorta wortel doorkruisen, laat verschillende secties beschikbaar voor een gedetailleerde evaluatie van de plaque samenstelling.
Protocol
Alle dierproeven vereisen goedkeuring door ethische autoriteiten.
1. opoffering van de muis en Microdissectie van aorta
- Offer de muis door CO2 verstikking en record gewicht.
- Spuit de muis met 70% ethanol om bont besmetting van de monsters te voorkomen. Plaats de muis in een liggende positie. Van de halsader inkeping, maak een middenlijn incisie met behulp van Mayo schaar uit te breiden het bijna naar het schaambeen.
Let op: Hoog percentage ethanol is licht ontvlambaar en kan ernstige oogirritatie veroorzaken. Voorzorgsmaatregelen nemen. - Gebruik een naald van 23 G om de muis te exsanguineren door middel van een hart punctie door de thorax wand. Deze procedure levert gewoonlijk 750 μL bloed van een 20 weken oude muis. Meestal, verzamel de helft van het volume in een Tri-kalium EDTA-gecoate buis en de andere helft in een serum of lithium heparine gecoate buis. Draai de buizen voorzichtig om en bewaar ze op kamertemperatuur tot verdere verwerking.
- Gebruik Mayo Scissors om het pariëtale peritoneum in de middellijn te snijden om de buikholte te openen. Houd de xifoïde proces met tissue Tang en snijd Open het peritoneum lateraal aan beide zijden en doorgaan met het openen van het diafragma.
- Gebruik de Mayo-schaar om de borstholte te openen door de ribbenkast zo lateraal mogelijk te snijden. Dit zal grote hoeken voor de instrumenten mogelijk maken terwijl microdissecting de aorta later.
- Maak een incisie in de rechter oorschelp voor perfusie vloeistof drainage. Plaats een naald van 27 G door de Apex van het hart in craniale richting. Houd de naald vast in de linker ventrikel terwijl u langzaam de muis met 10 mL ijskoude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende minimaal 2 min. observeer de lever verschuiving in kleur en het krijgen van paler.
Opmerking: Sommige protocollen gebruiken Paraformaldehyde perfusie, maar dit interfereert met verschillende downstreamtoepassingen, zoals immunohistochemie analyse van lymfocyten. Daarom wordt in dit protocol geen perfusie fixatie met Paraformaldehyde uitgevoerd. - Dissect organen van belang (bv. lymfeklieren, milt, lever, darmen, inguinale vetpads, nieren, enz.) met behulp van anatomische Tang en ontleed schaar.
- Snij luchtpijp en slokdarm aan de rechterkant van het hart zonder beschadiging van de aortaboog. Snijd het diafragma en de structuren die de ingewanden aan retroperitoneum bevestigen, en laat het hart, de aorta en de nieren in situ. Vouw de longen en de ingewanden caudally weg en bedek ze met een servet om retroperitoneale microdissectie van para-aorta lymfeklieren en abdominale aorta te beginnen.
- Start micro dissectie onder een stereomicroscoop bij 6x vergroting. Begin de aorta-bifurcatie te ontleden door het omringende weefsel met de Dumont-Tang te heffen en onder spanning te snijden met Vannas-schaar.
- Doorgaan dissectie van de abdominale aorta-cranially. Snijd buik takken uit de aorta en vrij de aorta in de proximale door de aorta hiatus in het diafragma.
Opmerking: Micro dissectie vereist nauwkeurige hand-oog coördinatie door middel van de stereomicroscoop, die enige oefening om te beheersen duurt.
- Doorgaan dissectie van de abdominale aorta-cranially. Snijd buik takken uit de aorta en vrij de aorta in de proximale door de aorta hiatus in het diafragma.
- Verwijder het vetweefsel dat de thoracische aorta bedekt. Zorgvuldig ontleden dorsaal van de thymus om de aortaboog met takken vrij te maken. Ga door met het ontleden van de halsslagaders zo deeel mogelijk in de thoracische holte. In speciale gevallen kan nek dissectie worden uitgevoerd om de halsslagader bifurcation op te nemen.
- Reinig de instrumenten door opeenvolgende spoelen in gedeïoniseerd water, RNase decontaminatie oplossing, 70% ethanol, en PBS voordat het daadwerkelijk snijden de aorta. Til het hart door de Apex met de Tang. Snijd de aorta dicht bij het hart en plaats het hele hart in een buis met PBS. Het hart kan worden opgeslagen op ijs voor een paar uur voor voortzetting van de verwerking en cryomverdiscontering van de aorta wortel.
- Snijd de aortaboog volgens Figuur 1a. Plaats de aortaboog in een buisje met 1 mL 4% formaldehyde 's nachts bij 4 °C. Het preparaat kan op deze wijze gedurende enkele jaren worden opgeslagen voordat het wordt vastgestald en geanalyseerd.
Let op: Formaldehyde kan kanker veroorzaken, allergische huidreacties, en is schadelijk bij inslikken. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen zoals vereist. - Ontleden de overgebleven aflopend aorta en zet het in een RNA stabilisatie oplossing of snap het bevriezen voor daaropvolgende RNA analyse of andere toepassing. Het optimaliseren van de werkstroom om dissectie tijd te minimaliseren is cruciaal om overmatige RNA-degradatie te voorkomen.
- Zet de bloedinzamel buisjes (verzameld in stap 1,3) in een centrifuge. Draai de afzonderlijke plasma-en serum buizen op 1.500 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng het plasma en serum voorzichtig over naar micro centrifugebuizen en bewaar bij-80 °C. Het verzamelen van zowel EDTA als gehepariniseerd plasma of serum laat mogelijkheden voor meerdere downstreamtoepassingen.
- Plaats het hart op een kurk bed met de ventrale kant naar boven gericht. Bevestig het hart aan de kurk met een naald door de Apex. Houd de basis van het hart vast met een anatomische Tang.
- Gebruik een scalpel om de apicale 2/3 van het hart weg te knippen met de richting van de snede als een lijn tussen de twee oorschelp met de scalpel haaks 20 ° in het sagittale vlak en 20 ° cranially in het dwarsvlak (Figuur 1b).
- Embed de aorta wortel in de optimale snijtemperatuur (OCT) compound, die omringt, maar niet infiltreren het weefsel. Dompel de basis van het hart in de LGO compound. Knijp zachtjes in het hart met de tang om de aorta wortel met de LGO te vullen en eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Breng het preparaat over naar de onderzijde van een cryomold gevuld met OCT. De aorta wortel moet nu loodrecht op het bodemoppervlak staan. Zet het gemonteerde hart op droogijs om te bevriezen. Bewaar de specimens in zip-lock-zakken in-80 °C totdat de cryosectionering volgens punt 3 van dit protocol is ingeschakeld.
Figuur 1: hart en aortaboog in situ. A) longen, luchtpijp, slokdarm en Thymus worden verwijderd om de aortaboog in situ weer te geven in een 20 weken oude vrouwelijke ApoE-/- muis op normaal Chow dieet in een micro graaf, schaalbalk = 2 mm. De stippellijnen geven aan waar de aortaboog en haar takken moeten worden gesneden. B) een schematische weergave van het hart en de aorta. De gestippelde lijn in het rood geeft aan waar je het hart moet snijden voordat je de aorta wortel gaat cryomteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. en Gezichtsanalyse van aortaboog en Brachiocephalische slagader
- Maak een vastzet bed voor de analyse van aorta bogen. Vouw een segment van paraffinewasfilm acht keer om een plat oppervlak van 25 mm x 25 mm te maken. Wikkel het met zwarte elektrische isolatietape om een donkere achtergrond te maken voor de aorta. Plaats een label op de achterzijde van het vastzet bed en gebruik een lood potlood om het identificatienummer van de muis te schrijven (normale peninkt verdwijnt in het kleuringsproces).
- Breng de aortaboog over naar het vastpinnen en plaats er een druppel PBS bovenop. Begin met het schoonmaken van de aorta van overgebleven periadventitiële vetweefsel onder een stereomicroscoop.
- Gebruik Vannas schaar en Dumont tang om alle omringende vetweefsel voorzichtig weg te pellen zonder de aorta te manipuleren of te beschadigen. Soedan IV vlekken vetweefsel helder en het is van cruciaal belang om te verwijderen van al dergelijke weefsels op dit punt.
Opmerking: Houd de aorta vochtig te allen tijde het toepassen van extra PBS wanneer dat nodig is.
- Gebruik Vannas schaar en Dumont tang om alle omringende vetweefsel voorzichtig weg te pellen zonder de aorta te manipuleren of te beschadigen. Soedan IV vlekken vetweefsel helder en het is van cruciaal belang om te verwijderen van al dergelijke weefsels op dit punt.
- Snijd de aorta in het coronale vlak open door de Vannas-schaar in het aorta lumen te introduceren om het intimale oppervlak bloot te leggen. Begin de buitenste kromming van de stijgende boog in distale richting te knippen en verder te snijden Open de takken met inbegrip van de brachiocephalische slagader. Reserve het ruggedeelte van de afdalende thoracische regio.
- Snijd de kleinere kromming open en vouw de aorta open om de intimale oppervlakte weer te geven.
Opmerking: Deze stap vereist fijne motoriek en heeft wat oefening nodig om te beheersen.
- Snijd de kleinere kromming open en vouw de aorta open om de intimale oppervlakte weer te geven.
- Speld de open boog aan het vastzet bed met het stompe uiteinde van minutien insecten pinnen. Gebruik een micro Castroviejo naald houder om de pinnen op zijn plaats te zetten. Buig de pennen voorzichtig uit de buurt van het preparaat wanneer het op zijn plaats zit. Speld de aorta plat op het bed zonder het specimen te strekken. Bewaar de vastgezette boog naar beneden gericht in een Petri schaaltje gevuld met PBS bij 4 °C.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. - Maak een werkoplossing van Soedan IV. Meng 1 g Soedan IV poeder, 100 mL 70% ethanol, en 100 mL aceton in een donkere fles en roer zachtjes 10 min. Het is niet nodig om de oplossing te filteren en het kan een paar maanden worden gebruikt als het donker wordt gehouden bij kamertemperatuur. Als de kleurings kleur niet bevredigend is, kan een nieuwe oplossing worden gemaakt en worden de specimens weer gekleurd.
Let op: Aceton is een ontvlambare vloeistof die ernstige oogirritatie kan veroorzaken. Bewaar op een goed geventileerde plaats en neem voorzorgsmaatregelen bij het hanteren. - Regel vijf Petri schalen op de labbank: een gevuld met 70% ethanol, één gevuld met Soedan IV werkoplossing, twee gevuld met 80% ethanol, en één gevuld met PBS.
- Begin met het spoelen van het preparaat in 70% ethanol gedurende 5 minuten door het vastzetten bed in de eerste Petri schaal te plaatsen met de boog naar beneden gericht. Breng het preparaat over naar de Sudan IV-werkoplossing en laat het de boog gedurende 7 minuten vlekkenden.
- Spoel vervolgens in 80% ethanol gedurende 3 minuten tweemaal om het normale intimale oppervlak te ontvlekken. De ontkleurings tijd kan worden aangepast om de resultaten te optimaliseren. Spoel ten slotte in PBS voordat u het specimen weer in de originele Petri schaal plaatst.
- Verkrijg micro Foto's met een stereomicroscoop bij een vergroting van 10 keer verbonden met een digitale camera. Maak foto's van de vastgezette boog ondergedompeld in PBS met behulp van kleine metalen gewichten (20 mm x 10 mm x 5 mm) om het vastmaken bed aan de onderkant van een Petri schaaltje te houden. Plaats een liniaal naast de aorta voor kalibratie van de afbeelding.
- Gebruik een beeldanalyse software (bijv. ImageJ) om het laesie gebied en het totale intimale oppervlak te bepalen. Bij gebrek aan anatomische monumenten om de aortaboog te definiëren, wordt de meting meestal uitgevoerd vanaf het begin van de opgaande as tot aan de eerste intercostale tak (Figuur 2a). Gebruik de functie voor gebieds kwantificering in de software om handmatig het totale gebied van de intimiteit te omcirkelen.
Opmerking: de kwantificering van de laesie moet op een blinde manier gebeuren en het is raadzaam dat een tweede onderzoeker de resultaten bevestigt.- Selecteer in ImageJ het gereedschap Veelhoek selecteren en omcirkelt het totale boog gebied door herhaalde klikken. Selecteer vervolgens meten in het menu analyseren om het totale boog gebied in het resultaatvenster weer te geven.
- Omcirkelt vervolgens alle Soedan IV-bevlekte plaques in de boog. Soedan IV is een lysochroom diazoverbinding-kleurstof die lipiden, triglyceriden en lipoproteïnen met een oranje-rode kleur vlekken. Selecteer in ImageJ het gereedschap selectie vrije hand en Omcirkel alle plaques terwijl u op de ALT-toets drukt. Klik op meten in het menu analyseren om een Lesion-vrije boog gebied weer te geven in het resultaatvenster.
- Bereken het relatieve laesie gebied door het laesie vrije gebied af te trekken van het totale boog gebied en vervolgens het resultaat te delen met het totale boog gebied.
- Speld de subclavia en carotis slagaders zorgvuldig aan om de laesie kwantificering in de brachiocephalische slagader mogelijk te maken (Figuur 2a). Kwantificering van laesies in de subclaviaanse slagaders en de gemeenschappelijke carotis slagaders is meestal zeer uitdagend en niet zinvol, respectievelijk.
- In ImageJ omcirkelt u beide delen van de braciocephalic-slagader met behulp van de veelhoek selectietool terwijl u op de Shift-toets drukt. Klik op meten in het menu analyseren om het totale brachiocephalische slagader gebied in het resultaatvenster weer te geven.
- Selecteer vervolgens het gereedschap Vrije hand selectie en Omcirkel alle plaques in brachiocephalische slagader terwijl u op de ALT-toets drukt. Klik op meten in het menu analyseren om het laesie vrije brachiocephalische slagader gebied in het resultaatvenster weer te geven.
- Bereken het relatieve laesie gebied door het laesie vrije gebied af te trekken van het totale brachiocephalische slagader gebied en vervolgens het resultaat te verdelen met het totale brachiocephalische slagader gebied.
Figuur 2: atherosclerotische laesie kwantificering. A) aortaboog van een 20 weken oude mannelijke humane APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) muis gevoed westers dieet voor tien weken vastgemaakt open en gekleurd voor lipide-rijke plaques met Soedan IV. Totale aortaboog oppervlakte wordt geschetst met de gestippelde lijn in het wit in de micro graaf, schaalbalk = 2 mm. De gestippelde lijnen in het geel schetsen de totale oppervlakte van de brachiocephalische slagader. B) aorta wortel doorsnede bij 400 μm van de aorta sinus in een 20 weken oud mannelijk ldlr-/- Mouse gevoed westers dieet gedurende acht weken gevisualiseerd in een micro graaf, schaalbalk = 500 μm. De gestippelde lijnen in het zwart schetsen het totale vaargebied en atherosclerotische laesies gekleurd met olie rood O gelokaliseerd in de arteriële intima. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
3. cryosnijden van de aorta wortel
- Stel de cryostaat temperatuur bij-20 °C en sectie dikte in op 10 μm. Monteer het LGO-blok met de aorta wortel op de preparaathouder met het ventriculaire weefsel naar buiten gericht. Terwijl u begint te knippen, Fine Tune de uitlijning van de sectie oppervlak parallel aan de preparaathouder.
- Verwijder overmatige omringende OCT om het gemakkelijker te maken om secties zonder plooien te verzamelen. De aorta wortel moet nu loodrecht op het mesblad worden geplaatst, aangezien de basis van het hart correct in de mal is geplaatst.
- Verzamel de eerste controle secties op gewone Microscoop-dia's, die zullen worden weggegooid. De eerste secties moeten alleen hartspier weefsel bevatten. Vooruitgang van de snede door 200 μm op het moment. Verzamel een sectie en controleer de voortgang met een lichte Microscoop.
- Bij het dichterbij komen van de linker ventrikel uitstroom tractus, Controleer elke 100 μm onder de Microscoop. Wanneer de eerste indicaties van een wand van het vat worden waargenomen, vertraagt het tempo tot 50 μm.
Opmerking: Wanneer de eerste aorta cusp verschijnt, zal dit punt nul zijn voor het verzamelen van secties. Het kan moeilijk zijn om te zien wanneer de knobbels precies verschijnen, maar een exacte lokalisatie is cruciaal om vergelijkingen van laesies in dezelfde regio uit te voeren. -
Kantel het preparaat naar de punt nul cusp om het sectievlak met de twee andere cusps uit te lijnen. Dit is cruciaal voor het verkrijgen van echte dwarsdoorsneden van de aorta. Maak een tekening van de aorta wortel, met vermelding van de knobbels zoals ze verschijnen, en Tel elke 10 μm sectie die zijn afgesneden van punt nul vanaf.
- Wanneer een tweede cusp verschijnt, kantel je het preparaat lichtjes weer weg van de cusp om het specimen af te stemmen op de derde cusp. Het niveauverschil tussen de knobbels mag niet hoger zijn dan 50 μm. begin met het verzamelen van secties op dia's vanaf niveau 90 μm en hoger.
- Verzamel secties volgens de dia planning in Figuur 3. De verzameling van secties kan worden gestart vanaf 190 μm als de aorta wortel meer dan 50 μm gekanteld is, zodat er meer ruimte is om de wortel in een rechte positie uit te lijnen. Ga door met snijden tot het niveau 800 μm van punt nul is bereikt. Als er op dit niveau nog zichtbare plaques zijn, kan de collectie worden uitgebreid tot 1.000 μm.
Opmerking: Een vereenvoudigde diaorganisatie wordt weergegeven in aanvullend figuur 1, wat de snijsnelheid kan verhogen. De optimale diaplanning moet worden bepaald afhankelijk van het projectplan.
-
Corrigeer de secties na de verzameling.
- Fix de secties verzameld voor olie rode O kleuring en Picrosirius rode kleuring van collageen in 4% formaldehyde gedurende 10 min. Spoel in gedeïoniseerd water, droog, en bewaar op kamertemperatuur tot het nastreven met sectie 4 in dit protocol. Als de dia's direct met olie rood O moeten worden gekleurd en nog steeds nat zijn, plaats ze dan 1 minuut in 60% isopropanol om het droogproces te versnellen.
Let op: Isopropanol is een ontvlambare vloeistof die ernstige oogirritatie kan veroorzaken en slaperigheid of duizeligheid kan veroorzaken. Bewaar op een goed geventileerde plaats en neem voorzorgsmaatregelen bij het hanteren. - Fixeren de secties verzameld voor Immunohistochemie of immunofluorescentie in ijskoud zuiver aceton gedurende 10 min. droog op kamertemperatuur gedurende 30 min. Bewaar secties in-20 °C.
- Fix de secties verzameld voor olie rode O kleuring en Picrosirius rode kleuring van collageen in 4% formaldehyde gedurende 10 min. Spoel in gedeïoniseerd water, droog, en bewaar op kamertemperatuur tot het nastreven met sectie 4 in dit protocol. Als de dia's direct met olie rood O moeten worden gekleurd en nog steeds nat zijn, plaats ze dan 1 minuut in 60% isopropanol om het droogproces te versnellen.
Figuur 3: organisatie van dia's voor seriële secties van de aorta wortel. Tijdens het cryosnijden van de aorta wortel moet elke 10 μm dikke sectie die de eerste 800 μm van de opgaande as beslaat, worden verzameld. Een systematische Slide organisatie is nodig om geschikte secties voor verschillende toepassingen te verkrijgen. Analyse van laesie samenstelling omvat meestal olie rode O kleuring voor lipiden en Picrosirius rode kleuring voor collageen. Overgebleven secties worden verzameld en aceton-vaste voor immunohistochemie en immunofluorescentie kleuring. Dit cijfer is gewijzigd van Gisterå et al30. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
4. olie rode O kleuring en kwantificering van atherosclerose in aorta wortels
- Bereid een verzadigde olie rode O-oplossing door 1 g olie rood O in 100 mL isopropanol op te lossen. Roer de oplossing gedurende 1 uur in een donkere fles bij kamertemperatuur. De verzadigde oplossing kan enkele maanden worden bewaard.
Opmerking: Het is raadzaam om aangewezen laboratoriumapparatuur voor olie rode O-kleuring te hebben, omdat het moeilijk is om apparatuur te reinigen die in contact is geweest met de oplossing. - Bereid een werkoplossing voor door 75 mL van de verzadigde olie rode O-oplossing te mengen met 50 mL gedeïoniseerd water. Laat de kamertemperatuur 10 min. filteren door middel van een kwalitatief filterpapier.
- Plaats de glaasjes in olie rood O werkoplossing gedurende 20 min. Spoel gedurende 5 minuten in kraanwater.
- Om weefsel visualisatie te helpen, beits u gedurende 1 minuut met Mayer's HEMA oxylin. Spoel gedurende 5 minuten in lauw kraanwater. Alle kernen moeten nu worden gekleurd in blauwe kleur, pas de kleurings tijd aan om het resultaat te optimaliseren.
- Monteer de dia's in een waterig afdekmedium (bijv. de Kaiser's glycerolgelatine). Warme Kaiser's glycerolgelatine tot 40 °C om het vloeibaar te maken voor gebruik. Het is niet nodig om de glijbanen te drogen omdat het afdekmedium op waterbasis is. Wees voorzichtig om luchtbel vorming te voorkomen bij het toevoegen van het afdekglas.
Let op: Kaiser's glycerolgelatine bevat fenol, waarvan wordt vermoed dat het genetische defecten veroorzaakt. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen zoals vereist. - Verkrijg digitale micro grafieken met een camera die is aangesloten op een lichte Microscoop. Meestal kan de volledige wand van het vaartuig en de laesie grenzen duidelijk worden gevisualiseerd door 50 keer vergroting. Sla afbeeldingen met hoge resolutie op, bij voorkeur in TIFF (Tagged Image File Format).
- Voer een analyse uit van de grootte van de laesie met behulp van een computerondersteund beeldanalyse software systeem. Oil Red O is een lysochroom diazoverbinding-kleurstof die neutrale lipiden vlekken en atherosclerotische plaques visualiseert met een intense rode kleur, die de kwantificering van de laesie ondersteunt.
Opmerking: de kwantificering van de laesie moet op een blinde manier gebeuren en het is raadzaam dat een tweede onderzoeker de verkregen resultaten bevestigt.- Gebruik de functie voor gebieds kwantificering in de beeldanalyse software om het totale gebied van het vaartuig te definiëren door de uitwendige elastische lamina van de aorta vaten wand te omcirkelen (Figuur 2b). Selecteer in ImageJ het gereedschap Veelhoek selecteren en omcirkelt het gebied door herhaalde klikken. Selecteer vervolgens meten in het menu analyseren. Het totale vaargebied wordt weergegeven in het resultaatvenster.
- Doorgaan met het kwantificeren van de atherosclerotische laesies in de intimiteits laag van het vat, gedefinieerd door de interne elastische lamina en de Luminale grens. Meestal zijn laesies op klep knobbels uitgesloten van de meting27. Selecteer in ImageJ het gereedschap selectie vrije hand en Omcirkel alle plaques terwijl u op de ALT-toets drukt. Selecteer meting in het menu analyseren om de laesie vrije vaar ruimte in het resultaatvenster weer te geven.
- Bereken het relatieve laesie gebied door het laesie vrije gebied af te trekken van het totale vaargebied en vervolgens het resultaat te delen met het totale vaargebied.
Opmerking: Kalibreer de resultaten in de beeldanalyse software volgens de gebruikte vergroting om het absolute laesie gebied in vierkante micrometer te verkrijgen.
- Definieer de olie rood O-gekleurd gebied in de laesies met behulp van een kleur drempel functie in de beeldanalyse software om het percentage olie rood O positief gebied van totale laesie gebied te berekenen.
- In ImageJ, omcirkelt u alle laesie gebied met behulp van de FreeHand Selection Tool terwijl u op de Shift-toets drukt. Selecteer meting in het menu analyseren om het totale laesie gebied weer te geven in het resultaatvenster.
- Selecteer buiten wissen in het menu bewerken. Wijzig het afbeeldingstype in 8-bits in het menu afbeelding.
- Stel een rode drempel in voor olie rood O negatief gebied door drempel te selecteren in het submenu aanpassen van het menu afbeelding. Klik op toepassen. Maak de afbeelding binair door deze optie te selecteren in het binaire submenu van het menu proces.
Opmerking: Meestal olie rood O kleuring varieert tussen batches. Daarom wordt Color drempel Holding alleen aanbevolen binnen dezelfde kleurings batch. Het resultaat moet worden gepresenteerd samen met een beschrijving hoe de drempel werd bepaald en gestandaardiseerd. - Analyseer de afbeelding door deeltjes analyseren te selecteren in het menu analyseren en klik op OK. Totale olie rood O negatieve laesie gebied wordt nu weergegeven in de samenvatting venster. Bereken de relatieve olie rood O positief gebied door de olie rood O negatief gebied af te trekken van het totale laesie gebied en vervolgens te verdelen met het totale laesie gebied.
Representative Results
In muizen modellen van atherosclerose de meest prominente laesies hebben de neiging om te ontwikkelen in de aorta wortel en aortaboog. Dit protocol beschrijft de kwantificering van atherosclerose in de aorta wortel, de aortaboog en de brachiocephalische slagader in één muis. Meetbare laesies in thoracale afdalend aorta en abdominale aorta zijn alleen aanwezig bij dieren met voorschot ziekte. In dit protocol, deze onderdelen worden niet geanalyseerd voor atherosclerotische belasting, maar opgeslagen voor latere analyse van mRNA niveaus of andere analyses. Seriële secties van atherosclerotische laesies in de aorta wortel worden meestal weergegeven in een grafiek met laesie grootte op de y-as en de afstand tot de aorta sinus op de x-as28. Echte dwarsdoorsneden zijn cruciaal voor de kwantificering van de laesie grootte. Schuine secties kunnen de laesie groottes overschatten en een kanteling van slechts 20 ° kan het absolute laesie oppervlak overschatten met 15%29. Het berekenen van de laesie Fractie van het totale vaargebied maakt het resultaat echter minder gevoelig voor mogelijke hoek verschillen tijdens het snijden (figuur 4a). Een geschikte statistische methode voor het opsporen van verschillen tussen groepen is gewoonlijk een reguliere 2-weg variantie-analyse (ANOVA). De post-tests van bonferroni worden vervolgens uitgevoerd om verschillen op bepaalde niveaus op te sporen. Het minst significante verschil van Fisher Investments Europe kan ook worden gebruikt als vervolg test voor ANOVA. Het vermindert de waarschijnlijkheid van type II statistische fouten, maar geen rekening voor meerdere vergelijkingen. Daarnaast kan het illustratief zijn om het gebied onder de curve of de gemiddelde laesie grootte per muis te berekenen en de gegevens in een puntplot te presenteren om de individuele variatie binnen de groepen verder te visualiseren (figuur 4b).
Oil Red O is een in vet oplosbare heldere rode diazoverbinding-kleurstof, die neutrale lipiden vlekken. Polaire lipiden in celmembranen zijn niet bevlekt. Olie rode O-kleuring kan worden uitgevoerd op verse, bevroren of formaline-vaste monsters, maar niet op paraffine-ingesloten monsters als gevolg van het verwijderen van lipiden in het vereiste deparaffinisatie proces. Een kwantificering van lesional lipide accumulatie kan worden uitgevoerd door kleur drempelmethode de olie rood O positief gebied van totale laesie gebied (figuur 4c). Hematoxylin produceert een blauwe kleuring van celkernen, wat nuttig is om plaque morfologie te visualiseren. De rechter en linker coronaire slagaders afwijken meestal van de aorta rond 250 μm van de aorta sinus27, die vaak samenvallen met de meest prominente laesie maten. Dwarsdoorsneden uit deze regio worden vaak weergegeven als representatieve resultaten (figuur 4D).
Figuur 4: atherosclerotische laesies in de aorta wortel. (A) achtentwintig weken oude mannelijke beenmerg chimeras gevoed westerse dieet voor acht weken werden geëvalueerd om te bepalen van het effect van Smad7-deficiënte T cellen op atherosclerose ontwikkeling. Experimentele ldlr-/- chimeras kregen CD4-CRE+Smad7FL/FL beenmerg en controles ontvangen CD4-CRE+Smad7FL/+ beenmerg. De grafiek toont kwantificering van atherosclerotische laesie gebied van acht opeenvolgende secties, 100-800 μm van de aorta sinus weergegeven als laesie Fractie van het totale oppervlak van het vat (Cd4-CRE+Smad7FL/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7FL/FL/ldlr-/- n = 9, 2-weg ANOVA met bonferroni post test, grafiek toont gemiddelde ± SEM, accolades geven significantieniveau aan voor stam vergelijking). B) het gecombineerde dot-plot en staafdiagram toont het gemiddelde atherosclerotische laesie gebied van de aorta wortel secties (CD4-CRE+Smad7FL/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7FL/FL/ Ldlr-/- n = 9, student t-toets) (C) Fractie van olie rood O-gekleurd gebied in de laesies (CD4-CRE+Smad7FL/+/ldlr-/- n = 4, Cd4-CRE+Smad7FL/FL /Ldlr-/- n = 6, student t-toets, NS = niet-significant) (B-C) stippen vertegenwoordigen individuele muizen en staven tonen gemiddelde ± SEM.D) representatieve micro grafieken met olie rode O-kleuring (in rood kleur) van neutrale lipiden in de aorta wortel 300 μm van aorta sinus (50x vergroting), schaalbalk = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van Gisterå et al.31. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Oil Red O kan worden gebruikt voor het verven van en gezicht bereide aorta's, maar dit protocol maakt gebruik van Soedan IV, een andere handige vetoplosbare diazoverbinding-kleurstof. Soedan IV visualiseert duidelijk atherosclerotische plaques in een oranje-rode kleur door kleuring lipiden, triglyceriden, en lipoproteïnen. Het verwijderen van de donkere achtergrond in representatieve beelden van de en gezicht aorta bogen kan de visuele weergave verbeteren (figuur 5a). De grootte van de laesie wordt gewoonlijk binnen groepen verdeeld, waardoor statistische tests met de t-toets van de student tussen groepen mogelijk zijn. Een puntplot dat zowel individuele muizen als het gemiddelde weergeeft, wat wordt vergeleken tussen groepen, is een informatieve manier om de resultaten weer te geven (Figuur 5b-C). Aangezien de variatie binnen groepen typisch verschilt tussen locaties in de vaat boom, zijn er meestal aparte vermogens berekeningen nodig. Onnodige variatie kan worden vermeden door methode vaardigheid en protocol standaardisatie. Het verkrijgen van statistisch significante resultaten is belangrijk, maar de biologische relevantie voor een waargenomen verschil moet altijd ook worden overwogen.
Figuur 5: atherosclerotische laesies in aortaboog en brachiocephalische slagader. A) representatieve en gezicht micro grafieken van aorta bogen met met vet beladen plaques die gekleurd zijn met Soedan IV (in oranje kleur) van 20 weken oude muizen voedden een westers dieet gedurende tien weken, samen gevisualiseerd. Schaalbalk = 2 mm. humane APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) muizen werden gebruikt als controles en de experimentele groep bestond uit TCR-transgene muizen met LDL-reactieve T-cellen (BT1) gefokt tot hubl muizen. B) atherosclerotische laesies in de aortaboog (hubl n = 10, BT1xHuBL n = 12; Student t-toets). C) atherosclerotische laesies in de brachiocephalische slagader (hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, student t-toets). (B-C) Stippen vertegenwoordigen individuele muizen, staven tonen gemiddelde ± SEM. *p ≤ 0,05. Dit cijfer is gewijzigd van Gisterå et al.32. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: alternatieve organisatie van dia's voor seriële secties van de aorta wortel. Een vereenvoudigde systematische dia organisatie voor het verzamelen van secties uit de aorta wortel. De collectie maakt olie rood O kleuring voor lipiden en Immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring mogelijk. Speciale dia's voor Picrosirius rode kleuring van collageen worden weggelaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hart-en vaatziekten is de belangrijkste moordenaar in de wereld en nieuwe preventieve metingen zijn nodig2. Muismodellen van de ziekte bieden een uitgebreid platform voor onderzoek naar pathofysiologie en experimentele behandelingen13. Betrouwbare laesie grootte kwantificering is essentieel voor deze aanpak. De kwantificeringsmethoden verschillen echter tussen laboratoria. Standaardisatie en optimalisatie zijn een doorlopend proces sinds de jaren 198013,27,33,34. Aorta wortels zijn ontstaan als de meest populaire site om experimentele atherosclerose te kwantificeren. Dwarsdoorsneden van plaques maken vergelijking van plaque volume tussen groepen mogelijk. En gezicht preparaten zijn begunstigd voor laesie kwantificering in grotere segmenten van de aorta. De en gezichts methode visualiseert plaque hoeveelheid en maakt kwantificering van plaque gebied dekking mogelijk, maar neem geen plaque dikte in rekening. De biologische relevantie voor waargenomen verschillen wordt onderbouwd door coherente resultaten op verschillende locaties in de vaat boom. Evaluatie van atherosclerose ontwikkeling op verschillende locaties adressen mogelijke site specifieke effecten. Het effect van getransplanteerde hematopoietische cellen op atherosclerose ontwikkeling kan worden beoordeeld in hypercholesterolemic ldlr-/- chimeras. Echter, gehele lichaam bestraling beïnvloedt de atherosclerose proces met site specifieke effecten. Meer prominente atherosclerotische laesies worden ontwikkeld in de aorta wortel, terwijl de verminderde laesie ontwikkeling wordt waargenomen in aorta bogen35.
Belangrijk, niet alleen laesie grootte moet worden aangepakt in studies van experimentele atherosclerose. Samenstelling van de laesie is ook een belangrijke parameter. Verschillende plaque kenmerken zijn in verband gebracht met manifestaties van de ziekte bij de mens36. Seriële snijden van de aorta wortel laat verschillende secties beschikbaar voor zorgvuldige analyse van plaque samenstelling. Plaque ruptuur bij de mens wordt gekenmerkt door een dun vezelkapje met weinig gladde spiercellen, schaars collageengehalte en tekenen van ontsteking in de plaques36. Hoewel plaque ruptuur een zeldzaam voorval is in muizen modellen van atherosclerose, zijn markers voor plaque stabiliteit informatief om te evalueren. Translationele benaderingen kunnen mechanistische bevindingen van Muismodellen bevestigen en belangrijke kenmerken van de ziekte van de mens ontdekken31. Inflammatoire status van atherosclerotische plaques kan worden bepaald door immunohistochemie kleuring van VCAM-1, MHC klasse II, macrofagen, en lymfocyten30. Sommige protocollen gebruiken longitudinale secties in het coronale vlak van de aortaboog of de brachiocephalische slagader voor het meten van atherosclerotische laesie grootte en samenstelling37. Echter, deze alternatieve methode laat slechts enkele secties worden geanalyseerd, die de toepassingen beperkt.
Een eerste kritieke stap in dit protocol is de mogelijkheid om aorta's efficiënt te oogsten. Hand-oog coördinatie onder de Microscoop vereist praktijk en is cruciaal zowel voor de microdissectie en de daaropvolgende vastzetten van de aortaboog. De volgende kritieke stap in dit protocol is de verzameling van seriële secties van de aorta wortel. 80 opeenvolgende secties moeten worden verzameld voor elke muis, die zowel focus en geduld vereist. Methodologische vaardigheid kan de beschreven processen aanzienlijk versnellen. Niettemin, atherosclerotische laesie kwantificering is nog steeds een tijdrovende taak. Nieuwe technologie, geautomatiseerde hantering en beeldvorming bij kleine dieren kunnen de kwantificering van experimentele atherosclerose in de toekomst mogelijk maken. De progressie van atherosclerose is traag en de meeste experimentele protocollen in muismodellen duren meer dan vier maanden om13te voltooien. Daarom moeten aorta's worden verzameld op een geoptimaliseerde manier op eindpunten van de studie. Dit protocol biedt een uitgebreide handleiding om aorta's efficiënt te oogsten en de voorgestelde verwerking bereidt aorta's voor op multifunctioneel gebruik, waaronder de kwantificering van de laesie in aorta wortel, aortaboog en brachiocephalische slagader. Hopelijk kan het protocol verminderen experimentele variabiliteit, verbetering van de betrouwbaarheid van de resultaten, en leiden tot bevindingen die de weg zal effenen voor nieuwe behandelingen tegen atherosclerose.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken alle voormalige leden van de experimentele cardiovasculaire onderzoekseenheid van Göran K Hansson, die dit protocol in de afgelopen kwart eeuw hielp ontwikkelen. We zijn bijzonder dankbaar voor de bijdragen van Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson en Inger Bodin. Dit werk werd ondersteund door project Grant 06816 en Linnaeus support 349-2007-8703 van de Zweedse Onderzoeksraad, en door subsidies van de Zweedse Heart-Lung Foundation, Stockholm County Council, professor Nanna Svartz Foundation, Loo en Hans Osterman Stichting voor medisch onderzoek, de onderzoeksstichting van Karolinska Institutet en de Stichting voor geriatrische ziekten bij Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
| Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | - | To create pinning beds for aortic arches. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
| Cork board | Any specialized retailer | - | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
| Deionized water | - | - | For rinsing and preparation of solutions. |
| Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
| Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
| Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
| Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
| Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
| Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| ImageJ | NIH | - | Image analysis software. |
| Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
| Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
| Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
| Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
| Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
| Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
| Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
| Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
| Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
| Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
| Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
| Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
| Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
| Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
| Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Any cell culture supplier | - | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | - | - | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
| Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
| Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
| Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
| Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
| Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
| Tissue-Tek cryomolds (10 mm x 10 mm x 5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Gistera, A., Hansson, G. K.
- Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
- Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
- Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
- Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
- Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
- Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
- Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
- Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
- Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
- Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J.
- Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
- Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
- Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
- Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
- Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
- Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
- Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
- Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
- Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
- Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
- Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
- Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
- Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
- Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
- Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).
- Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
- Daugherty, A., Whitman, S. C.
- Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
- Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
- Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
- Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).
