Summary
Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.
Abstract
Les interactions protéines-acides nucléiques jouent un rôle important dans les processus biologiques tels que la transcription, la recombinaison et le métabolisme de l'ARN. Les méthodes expérimentales d'étude des interactions protéines-acides nucléiques nécessitent l'utilisation d'étiquettes fluorescentes, d'isotopes radioactifs ou d'autres étiquettes pour détecter et analyser des molécules cibles spécifiques. La biotine, une étiquette d'acide nucléique non radioactif, est couramment utilisée dans les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) mais n'a pas été régulièrement employée pour surveiller l'activité de protéine pendant des processus d'acide nucléique. Ce protocole illustre l'utilité de l'étiquetage de la biotine lors des réactions enzymatiques in vitro, démontrant que cette étiquette fonctionne bien avec une gamme d'analyses biochimiques différentes. Plus précisément, en accord avec les résultats antérieurs utilisant des substrats radio-isotopes 32étiquetés P, il est confirmé par l'intermédiaire de l'EMSA étiqueté e de biotine que MEIOB (une protéine spécifiquement impliquée dans la recombinaison méiotique) est une protéine liant l'ADN, que MOV10 (un L'hélivraime d'ARN) résout les structures duplex d'ARN labelmées de biotine, et que MEIOB fend l'ADN mono-stranded de biotine-étiqueté. Cette étude démontre que la biotine est capable de substituer 32P dans divers essais biochimiques liés à l'acide nucléique in vitro.
Introduction
Les interactions protéines-acides nucléiques sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que la réparation de l'ADN, la réplication, la transcription, le traitement de l'ARN et la traduction. Des interactions protéiques avec des séquences d'ADN spécifiques dans la chromatine sont nécessaires pour le contrôle serré de l'expression génique au niveau transcriptionnel1. La régulation posttranscriptionnelle précise de nombreux ARN codants et non codants nécessite des interactions étendues et compliquées entre toute protéine et l'ARN2. Ces couches de mécanisme de régulation de l'expression génique comprennent une cascade d'événements intermoléculaires dynamiques, qui sont coordonnés par des interactions entre facteurs de transcription/épigénétiques ou de protéines liant l'ARN avec leurs cibles d'acide nucléique, ainsi que interactions protéines-protéines. Pour disséquer si les protéines in vivo sont directement ou indirectement associées aux acides nucléiques et comment de telles associations se produisent et culminent, des essais biochimiques in vitro sont effectués pour examiner l'affinité de liaison ou l'activité enzymatique des protéines d'intérêt sur substrats d'ADN et/ou d'ARN.
De nombreuses techniques ont été développées pour détecter et caractériser les complexes acide nucléique-protéine, y compris l'analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), également appelée test de retardement de gel ou test de décalage de bande3,4,5 . EMSA est une méthode biochimique polyvalente et sensible qui est largement utilisée pour étudier la liaison directe des protéines avec des acides nucléiques. EMSA s'appuie sur le changement électrophoretique gel dans les bandes, qui sont régulièrement visualisés en utilisant la chemiluminescence pour détecter les étiquettes de biotine6,7, la fluorescence des étiquettes fluorophore8,9, ou par l'autoradiographie des étiquettes radioactives 32P10,11. D'autres fins des études biochimiques sont l'identification et la caractérisation de l'activité de traitement de l'acide nucléique des protéines, telles que les réactions à base de nucléane pour évaluer les produits de clivage à partir de substrats d'acide nucléique12, 13 (en) , 14 et ADN/ARN structure-déroulant des essais pour évaluer des activités d'hélicase15,16,17.
Dans de tels essais d'activité enzymatiques, les acides nucléiques radio-isotopes ou fluorophore-étiquetés sont souvent employés comme substrats en raison de leur sensibilité élevée. L'analyse des radiographies des réactions enzymatiques impliquant 32radiotracers étiquetés P s'est avérée sensible et reproductible18. Pourtant, dans un nombre croissant de laboratoires dans le monde, l'utilisation de radio-isotopes est limitée, voire interdite en raison des risques pour la santé associés à l'exposition potentielle. En plus des préoccupations en matière de biosécurité, d'autres inconvénients sont l'équipement nécessaire pour effectuer des travaux avec des radio-isotopes, une licence de radioactivité requise, une demi-vie courte de 32P (environ 14 jours) et une détérioration graduelle de la qualité de la sonde en raison de radiolyse. Ainsi, d'autres méthodes non isotopiques ont été développées (c.-à-d., l'étiquetage de la sonde avec des fluorophores permet la détection par imagerie fluorescente19). Cependant, un système d'imagerie haute résolution est nécessaire lors de l'utilisation de sondes étiquetées fluorescentes. La biotine, une étiquette couramment utilisée, se lie facilement aux macromolécules biologiques telles que les protéines et les acides nucléiques. Le système de biotine-streptavidin fonctionne efficacement et améliore la sensibilité de détection sans augmenter le fond non spécifique20,21. Outre EMSA, la biotine est largement utilisée pour la purification des protéines et l'ARN pull-down, entre autres22,23,24.
Ce protocole utilise avec succès les acides nucléiques étiquetés biotine comme substrats pour les essais biochimiques in vitro qui incluent EMSA, en plus des réactions enzymatiques dans lesquelles la biotine n'a pas été couramment utilisée. Le domaine OB MEIOB est construit et deux mutants (truncation et mutation ponctuelle) sont exprimés sous forme de protéines de fusion de TPS25,26,27, ainsi que la souris MOV10 protéine de fusion FLAG recombinant16 . Ce rapport souligne l'efficacité de ce protocole combiné pour la purification des protéines et les essais étiquetés biotine à des fins expérimentales diverses.
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Protocol
1. Préparation des protéines
- Constructions d'expression MEIOB et MOV10
- Générer l'expression cDNA construit l'encodage de souris MEIOB-A, C, et E (Figure 1A) et MOV10.
- Configurez les réactions de réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour chaque fragment. Mélanger 1 l d'adjudant de souris (à partir de c57BL/6 testis de souris), 1 l de dNTP, 2 l d'apprêt avant de 10 M, 2 l de 10 'M amorce inverse, 1 'L de polymérase d'ADN, 25 'L de 2x tampon PCR, et 18 'L de Double distillé H2O (ddH2O) dans une finale finale volume de 50 L.
REMARQUE : Les amorces pour l'amplification des fragments de gènes Meiob et Mov10 sont énumérées dans le tableau 1. - Effectuer des réactions PCR à l'aide des programmes suivants : 95 oC pour 5 min, 35 cycles de chauffage à 95 oC pour 15 s, annealing à 64 oC pour 15 s, extension à 72 oC pour 20 s (2 min pour l'extension de la pleine longueur MOV10), et extension finale à 68 oC pour 7 min.
REMARQUE : Utilisez la paire d'amorces MEIOB-E (F1) et MEIOB-E-mut (R1) et MEIOB-E-mut (F2) et MEIOB-E (R2) pour amplifier deux segments qui contiennent la séquence mutante dans une séquence qui se chevauche aux extrémités 3' et 5', respectivement, pour générer un modèle PCR mutant.
- Configurez les réactions de réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour chaque fragment. Mélanger 1 l d'adjudant de souris (à partir de c57BL/6 testis de souris), 1 l de dNTP, 2 l d'apprêt avant de 10 M, 2 l de 10 'M amorce inverse, 1 'L de polymérase d'ADN, 25 'L de 2x tampon PCR, et 18 'L de Double distillé H2O (ddH2O) dans une finale finale volume de 50 L.
- Analyser l'ADN PCR amplifié par électrophorèse de gel, couper la bande de la taille requise du gel rapidement sous une lampe UV, et placer dans un tube de centrifugeuse.
REMARQUE: Les tailles de produits attendus visibles sur le gel d'agarose pour MEIOB-A est de 536 bp, MEIOB-C est de 296 bp, MEIOB-E sont 312 bp et 229 bp, et MOV10 est 3015 bp. - Purifie l'ADN PCR avec un kit d'extraction de gel suivant le protocole du fabricant.
- Ajouter un volume égal de tampon de dissolution dans le tube de centrifugeuse à partir de l'étape 1.1.2 et faire fondre le gel dans un bain d'eau de 50-55 oC pendant 5-10 min, en veillant à ce que les morceaux de gel fondent complètement. Centrifugeuse brièvement pour recueillir les gouttelettes de la paroi du tube.
REMARQUE : La concentration de masse/volume du gel et du tampon de dissolution est de 1 mg/L. - Placez la colonne d'adsorption dans le tube de collecte, transférez la solution contenant le fragment de gel dissous à la colonne d'adsorption, et centrifugeuse à 12 000 x g pendant 2 min.
- Jeter le filtrate au fond des tubes de collecte. Ajouter 600 l de tampon de lavage à la colonne, centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 min, et jeter le filtrate.
- Répétez l'étape 1.1.3.3 une fois.
- Remettre la colonne dans le tube de collecte et la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 2 min pour enlever tout le tampon de lavage restant.
- Placez la colonne d'adsorption dans un tube de centrifugeuse stérilisée de 1,5 mL, ajoutez 50 l de ddH2O au centre de la colonne d'adsorption et centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 min. Mesurer la concentration d'ADN de l'éluate à l'aide d'un spectrophotomètre.
- Ajouter un volume égal de tampon de dissolution dans le tube de centrifugeuse à partir de l'étape 1.1.2 et faire fondre le gel dans un bain d'eau de 50-55 oC pendant 5-10 min, en veillant à ce que les morceaux de gel fondent complètement. Centrifugeuse brièvement pour recueillir les gouttelettes de la paroi du tube.
- Restriction de la digestion des plasmides
- Digest pGEX-4T-1 vector avec BamHI et NotI. Pour ce faire, mélanger 4 g de vecteur pGEX-4T-1, 5 'L de 10x tampon de digestion, 1 'L de BamHI, et 1 'L de NotI et ddH2O à un volume de réaction final de 50 'L. Incuber à 37 oC pendant 2 h.
- Dig pRK5 vector avec BamHI et XhoI en mélangeant 4 g de vecteur pRK5, 5 'L de tampon de digestion 10x, 1 'L de BamHI, et 1 'L de XhoI et ddH2O à un volume de réaction final de 50 'L. Incuber à 37 oC pendant 2 h.
- Analyser l'ADN vectoriel par électrophorèse de gel, couper la bande de taille désirée du gel rapidement avec un scalpel sous une lampe UV et le placer dans un tube de centrifugeuse.
- Purifez l'ADN vectoriel avec un kit d'extraction de gel comme 1.1.3 suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE : La longueur des plasmides linéaires : pGEX-4T-1, 4,4 kb ; pRK5, 4,7 kb. - Mettre en place une réaction de ligature recombinante standard en combinant 0,03 pmol de vecteur linéaire, 0,06 pmol de fragment d'ADNc, 2 l de ligase, et 4 l de tampon de ligase 5x et ddH2O dans un volume de réaction final de 10 l.
REMARQUE : Clone MEIOB-A, C et E dans un vecteur pGEX-4T-1 et MOV10 dans un vecteur pRK5. - Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min, puis refroidir la réaction immédiatement pendant 5 min sur glace. Transformez les plasmides recombinants MEIOB en bactéries BL21 et les plasmides recombinants MOV10 en bactéries DH5MD.
REMARQUE : Vérifier toutes les constructions recombinantes par séquençage de Sanger. - Préparer les stocks de glycérol des cultures bactériennes contenant des plasmides recombinants vérifiés en ajoutant un volume égal de 50 % de glycérol aux cultures liquides, et les stocker à -80 oC.
REMARQUE : Pour chaque expérience subséquente, éliminer les bactéries des stocks de glycérol sur une plaque d'agar fraîche et utiliser une seule colonie pour l'expansion décrite à l'étape 1.2.
- Générer l'expression cDNA construit l'encodage de souris MEIOB-A, C, et E (Figure 1A) et MOV10.
- Extraits de protéines MEIOB des bactéries
- Choisissez une colonie de chaque souche BL21 transfectée avec le plasmide pGEX-4T-1 vide ou recombinant vérifié par séquençage et inoculat dans une LB de 3 ml contenant 100 g/mL d'ampicilline. Cultivez toute la nuit à 37 oC en secouant à 220 tr/min.
- Inoculer 300 mL LB contenant 100 ampicilline de 3 ml de culture de nuit de 3 ml (à partir de l'étape 1.2.1). Cultivez les cultures en secouant à 37 oC pendant 2 h jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 0,5-1,0.
- Induire l'expression protéique en ajoutant l'isopropyl bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,2 mM. Incuber les cultures pendant 3 h supplémentaires en secouant à 180 tr/min et à 18 oC.
- Centrifuger la culture bactérienne à 3 500 x g et 4 oC pendant 20 min.
- Resuspendre le granule dans 20 ml de tampon salin tampon tampon de phosphate (DPBS) de Dulbecco. Sonicate la suspension bactérienne sur la glace pendant 25 cycles en courtes rafales de 10 s (puissance de sortie 20%) suivi de 2-3 s reposant sur la glace.
- Centrifuger le lysate à 12 000 x g et 4 oC pendant 15 min. Transférer tout le supernatant dans un tube frais.
- Prélaver les perles.
- Ajouter 300 l de perles de glutathion-sépharose dans un tube frais de 15 ml et laver les perles avec 10 ml de tampon PBS glacé.
- Centrifugeuse à 750 x g et 4 oC pendant 1 min pour granuler les perles et jeter la solution de lavage.
- Ajouter le lysate aux perles lavées et couver à 4 oC pendant 2 h. Centrifugeuse à 750 x g et 4 oC pendant 1 min pour granuler les perles. Rincer les perles dans 10 ml de PBS 8x glacé.
- Éluter les perles avec 1 ml de tampon d'élution (10 mM de glutathion en 50 mM Tris-HCl au pH 8,0) 6x, en couve à 4 oC pendant 10 min avant chaque étape d'élution. Centrifugeuse à 750 x g et 4 oC pendant 1 min pour granuler les perles. Recueillir et mettre en commun les 6 fractions.
- Transférer les protéines élucées dans un filtre centrifuge et concentrer par centrifugation à 7 500 x g pour obtenir un volume final de 100 à 200 l.
- MOV10 extraits de protéines des cellules HEK293T
- Exprimez transitoirement les protéines MOV10 dans les cellules HEK293T cultivées.
- Préparer le plasmide MOV10-pRK5 à une concentration à l'aide d'un plasmide movaillis à l'aide d'une concentration de 500 ng/L.
- Seed HEK293T cellules dans des plats de 15 cm. Lorsque la densité cellulaire atteint 70 %-90 %, remplacez le milieu de culture cellulaire par le milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) et 1 % de pénicilline-streptomycine.
- Pour une transfection, diluer 60 g d'ADN plasmide MOV10-pRK5 dans 3 ml du milieu sérique réduit, puis ajouter 120 oL du réactif de l'améliorateur de transfection, et bien mélanger.
- Dans un tube séparé diluer 90 'L du réactif de transfection avec 3 ml de milieu sérique réduit (sans pénicilline-streptomycine) et bien mélanger.
- Ajouter l'ADN dilué à chaque tube de réactif de transfection dilué. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Ajoutez le mélange de transfection à la culture cellulaire et aux cellules de culture pour 36-48 h.
- Après 36-48 h, recueillir les cellules de chaque plaque dans un tube de 50 ml. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 oC. Laver chaque granule avec 10 ml de PBS glacé et recueillir les cellules par centrifugation à 500 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Resuspendre la pastille dans 3 ml de tampon de lyse cellulaire contenant l'acide ehylenediaminetetraacetic acide (EDTA)-libre cocktail d'inhibiteur de protéase. Incuber 30 min sur glace. Centrifuger le lysate à 20 000 x g et 4 oC pendant 20 min.
- Ajouter 100 l de perles magnétiques anti-FLAG par plat de cellules dans un tube de 1,5 ml.
- Laver les perles magnétiques 2x avec un tampon K150 (50 mM HEPES au pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
- Resuspendre les perles magnétiques dans 1 ml de tampon K150 glacé.
- Incuber les perles magnétiques pendant 2 min à 4 oC avec une rotation douce et granuler les perles magnétiques à l'aide d'un aimant. Retirez et jetez le supernatant.
- Ajouter les perles magnétiques au lysate cellulaire supernatant à partir de l'étape 1.3.3 et incuber à 4 oC pendant 2 h.
- Laver les perles magnétiques liées aux protéines 3x avec tampon K150, puis 2x avec K150 contenant 250 mM NaCl, puis 3x avec tampon K150 comme 1.3.5.
- Resuspendre les perles dans 300 oL de tampon d'élution FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl à pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 % de glycérol), ajouter le peptide FLAG à une concentration finale de 0,5 g/L, et incuber avec des perles sur un rotateur à 4 o C pour 1 h , puis granule les perles magnétiques à l'aide d'un aimant.
- Recueillir le supernatant qui contient les protéines MOV10 élucées, déterminer la concentration, et stocker à -80 oC pour une utilisation future.
- Exprimez transitoirement les protéines MOV10 dans les cellules HEK293T cultivées.
2. Préparation à l'acide nucléique
- Achetez des oligonucléotides d'ADN et d'ARN (oligos) avec ou sans étiquettes de biotine à partir d'une source appropriée. Diluer chaque oligo dans le ddH2O à 20 M sans RNase et le garder à -80 oC pour une utilisation future.
REMARQUE : Les séquences d'oligo des substrats d'ADN et d'ARN utilisés dans cette étude sont énumérées dans le tableau 2. - Préparer le mélange suivant pour la réaction d'annealing à double brin d'ARN (dsRNA) pour l'essai d'activité de l'hélice MOV10 : mélanger 60 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonic acid (HEPES) à pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 et RNase-free ddH2 O dans un volume de réaction final de 20 l.
- Oligos d'ARN anneaux pour former duplex à ARN en chauffant un mélange du brin supérieur étiqueté biotine (2 M, concentration finale) et un 1,5 fois de son brin de fond complémentaire non étiqueté dans le tampon annealing (étape 2.2) à 95 oC pendant 5 min, puis le refroidir lentement à la pièce température (RT).
3. Essais biochimiques in vitro
- Réactions emsimatiques et enzymatiques
- Pour l'étude MEIOB EMSA, mix 50 mM Tris HCl au pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mM (ou d'autres concentrations pertinentes comme indiqué dans la figure 2 et la figure 3) la protéine MEIOB, et 10 nM oligonucléotides et ddH2O étiquetés biotine dans un volume de réaction final de 20 L. Incuber à RT pendant 30 min, et ajouter 5x stop buffer (125 mM EDTA, 50% de glycérol) pour arrêter la réaction.
- Configurez les réactions d'activité nucléane MEIOB telles que décrites à l'étape 3.1.1 mais sans l'ajout de 10 mM EDTA.
- Pour l'exemple d'activité de l'hélicase MOV10, mélangez 50 mM Tris-HCl au pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01 % NP-40, 1 mM DTT, 2 inhibiteurs de la RNase U/L, 10 nM substrat d'ARN étiqueté biotine, 2 mM adénosine triphosphate (ATP), 100 nM RNA trap, et 20 ng de protéine MOV10 et ddH 2O dans un volume de réaction final de 20 l. Incuber le mélange de réaction à 37 oC pendant 10 min, 30 min et 60 min. Ajouter le tampon d'arrêt 5x pour arrêter la réaction.
REMARQUE : Le piège d'ARN, un oligo biotin-non étiqueté avec la séquence, complémentarité à l'oligo étiqueté, qui empêche le dsRNA unwound d'annexer encore.
- Gels Polyacrylamide
- Laver les plaques de gel (16 cm x 16 cm) et les peignes de 1,5 mm. Assembler les unités d'électrophoresis de gel.
- Pour préparer un gel polyacrylamide indigène de 10 %, mélanger 14 ml de ddH2O, 1,25 mL de 10x Tris-boric acid-EDTA (TBE), 8,3 mL de 30 % d'acrylamide, 1,25 mL de glycérol à 50 %, 187,5 l de 10 % de persulfate d'amsulium fraîchement préparé (APS) et 12,5 mL de tetramethylethylenediamine (TEMED).
- Pour préparer un gel polyacrylamide indigène de 20 %, mélanger 5,5 mL de ddH2O, 1,25 mL de 10 x TBE, 1,25 ml de glycérol à 50 %, 16,7 mL d'acrylamide de 30 %, 187,5 l de 10 % d'APS et 12,5 L de TEMED.
- Verser la solution d'acrylamide immédiatement sur le gel et insérer le peigne. Laisser le mélange polymériser environ 30 min.
- Gel en cours d'exécution
- Retirez le peigne, remplissez les réservoirs avec le tampon de fonctionnement de l'électrophorese (0,5x TBE).
- Rincer les puits d'échantillon avec un tampon TBE de 0,5 x, puis pré-exécuter le gel à 100 V sur la glace pendant 30 min. Remplacer le tampon de fonctionnement par du TBE frais de 0,5x.
- Chargez 20 à 25 échantillons de L dans chaque puits.
- Utilisez un gel d'acrylamide indigène de 10 % pour l'analyse DE l'EMSA et un gel d'acrylamide indigène de 20 % pour les essais enzymatiques. Exécuter l'électrophoresis à 100 V sur le bain de glace jusqu'à ce que le marqueur bleu bromophénol a migré vers le quart inférieur du gel.
- Démonter les plaques de gel, couper le gel en enlevant les puits de chargement et les voies inutilisées. Placez le gel dans un tampon TBE de 0,5x.
- Couper le papier filtre et la membrane de nylon à la taille du gel. Prémouiller le papier filtre propre et la membrane en nylon.
- Assembler la pile pour le transfert.
- Placez la membrane préhumide sur le papier filtre préhumide.
- Placer le gel sur la membrane.
- Couvrir le gel d'une autre couche de papier filtre préhumide.
- Retirez toutes les bulles d'air en roulant une pipette propre du centre au bord.
- Transférer les échantillons du gel à la membrane dans un appareil électrophoretique semi-sec à 90 mA pendant 20 min.
- Arrêter le transfert, puis sécher la membrane sur un nouveau papier filtre pendant 1 min.
- Traversez les échantillons en irradiant la membrane à 120 mJ/cm2 pour 45-60 s dans un lien transversal à lumière UV équipé d'ampoules de 254 nm (fonction de liaison transversale automatique). Sécher la membrane à RT pendant 30 min.
- Détection de la chemiluminescence
- Protocole 1 : Utilisez un volume standard de kit commercial de détection d'acide nucléique chemiluminescent.
- Ajouter 20 ml de tampon de blocage à la membrane et couver pendant 15-30 min avec des secousses douces sur un rotateur à 20-25 tr/min.
- Préparer la solution tampon conjuguée/blocage en ajoutant 66,7 L de peroxidase streptavidin-raifort stabiliséàe à 20 ml de tampon de blocage.
- Retirez délicatement le tampon de blocage et remplacez-le par un tampon conjugué/bloquant. Incuber 15 min sur un rotateur à 20-25 tr/min.
- Laver la membrane 4x en secouant à 40-45 tr/min pendant 5 min chacun.
- Ajouter 30 ml de tampon d'équilibre de substrat à la membrane. Incuber la membrane pendant 5 min en secouant à 20-25 tr/min.
- Préparer la solution de travail de substrat en ajoutant 6 ml de solution luminol/enhancer à 6 ml de solution stable de peroxyde. Évitez la lumière.
- Couvrir toute la surface de la membrane avec une solution de travail du substrat et incuber pendant 5 min.
- Scanner la membrane dans un système d'imagerie chemiluminescente pour 1-3 s.
- Protocole 2 : Utilisez 2x kit commercial dilué de détection d'acide nucléique chemiluminescent et suivez les étapes 3.10.1.1-3.10.1.8.
- Protocole 3 : Utilisez des réactifs auto-fabriqués6.
- Préparer le tampon de blocage : mélanger 0,1 M Tris-HCl au pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2, et 3 % d'albumine de sérum bovin Fraction V. AP 7,5 tampon : mix 0,1 M Tris-HCl à 7,5 pH, 0,1 M NaCl, et 2 m MgCl2. AP 9.5 tampon: mélanger 0.1 M Tris-HCl au pH 9.5, 0.1 M NaCl, et 50 mM MgCl2. TAMPON TE : mélanger 10 mM Tris-HCl au pH 8,0, 1 mM EDTA au pH 8,0.
- Faire tremper la membrane en bloquant le tampon à 30 oC pendant 1 h.
- Ajouter 8,5 l de phosphatase alcaline streptavidine à 10 ml de tampon AP 7.5. Secouez doucement la membrane dans cette solution à RT pendant 10 min. Ensuite, lavez la membrane 2x en 15 ml de tampon AP 7.5 pendant 10 min.
- Laver la membrane une fois de plus dans 20 ml de tampon AP 9.5 pendant 10 min. Ajouter 20 ml de tampon TE pour arrêter la réaction.
- Ajoutez 7,5 ml de solution de développement sur la membrane et scannez la membrane dans un système d'imagerie chemiluminescent e pour 1-3 s.
- Protocole 1 : Utilisez un volume standard de kit commercial de détection d'acide nucléique chemiluminescent.
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Representative Results
La structure protéique du MEIOB et les constructions d'expression utilisées dans cette étude sont illustrées dans la figure 1A. Les plis OB de MEIOB sont des structures compactes en forme de tonneau qui peuvent reconnaître et interagir avec les acides nucléiques à brin unique. L'un des domaines OB (aa 136-307, construction A) lie l'ADN échoué unique (DNA), la protéine tronquée (aa 136-178 troncations, construction C) et la forme mutante point (mutation R235A, construction E) de MEIOB n'ont pas d'activité liant l'ADN26. Les protéines de fusion GST-MEIOB ont été surexprimées chez les bactéries BL21, et les étapes d'isolement subséquentes ont entraîné la purification des protéines par la coloration bleue de Coomassie et l'analyse de la tache occidentale (figure1B). Les substrats d'acide nucléique à différentes concentrations illustrent la sensibilité élevée du signal de biotine, avec un signal détectable de 1 nM oligo après un temps d'exposition relativement court pour 1-3 s (Figure 2A). La protéine MEIOB-A de type sauvage, mais pas les protéines mutantes MEIOB-E et MEIOB-C, se lient fortement à 36 substrats d'ADNs étiquetés par biotine (la même longueur et la même séquence qu'auparavant26) (Figure 2B) et contaillent les substrats en échelles(figure 2C).
L'analyse in vitro des protéines MEIOB avec des oligos d'ARN de la même séquence que les substrats d'ADNs utilisés dans la figure 2B,C illustre la capacité de liaison et l'activité d'exonuclation de MEIOB sur 36 nt ARN à brin unique (ssRNA) (Figure3A,B ). L'activité de liaison du MEIOB avec l'ADN et l'ARN a été analysée plus en détail (figure 3C). De plus, les protéines MOV10 étiquetées FLAG ont été purifiées à partir de cellules HEK293T (Figure 4A). Pour mesurer l'activité de l'hélice de MOV10, un ARN en duplex a été conçu (même longueur mais séquence différente de celle utilisée précédemment16) portant un surplomb de 18 nt 5 ' (Figure 4B). Lorsque le duplex d'ARN étiqueté biotine a été incubé avec MOV10 en présence de l'ATP, une bande inférieure correspondant à l'ARN étiqueté biotine à brin unique est apparu avec un temps croissant, reflétant la fonction du MOV10 en tant qu'hélice d'ARN. Enfin, pour réduire les coûts, il a été tenté d'optimiser l'utilisation de réactifs pour la détection de la chimie de l'étiquette de biotine. On a constaté qu'une dilution double du kit de détection de l'acide nucléique chemiluminescent n'a pas affecté négativement la sensibilité chromogénique du système de biotine-streptavidin, et excitant, les réactifs self-made ont fonctionné presque aussi bien (figure5 ).
Figure 1 : Purification de protéines MEIOB. (A) Représentation schématique des constructions MEIOB utilisées dans cette étude26. MEIOB contient un domaine OB. Toutes les constructions MEIOB (A, C, E) ont été exprimées en protéines de fusion de tPS. (B) La coloration bleue de Coomassie et l'analyse occidentale des protéines MEIOB purifiées à l'aide du système tPS-bactéries. Les flèches rouges indiquent les positions des protéines MEIOB purifiées. Les bandes à environ 26 KDa correspondent au glutathion. Pour western blot, l'anticorps anti-TPS a été utilisé avec 1:6000 dilution. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Essais in vitro des interactions MEIOB-ssDNA . (A) Test de résistance au signal de différentes concentrations d'ADN ssadain étiqueté par biotine de 36 nt. (B) Résultat DE l'EMSA de la liaison de protéines MEIOB aux substrats d'ADN finis de biotine 5' (10% de gel indigène). (C) Clivage meIOB-négocié des substrats d'ADN finis de biotine 5' (20% gel indigène). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Essais in vitro des interactions MEIOB-ssRNA. (A) résultat EMSA de la liaison de protéine MEIOB aux substrats d'ARN finis de biotine 5' (10% gel indigène). (B) Clivage meIOB-négocié des substrats d'ARN finis de biotine 5' (20% gel indigène). (C) Parcelle du pourcentage de concentration d'ADN/ARN-lié par rapport à la concentration meIOB-A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Protéine MOV10 purifiée et son dénouement de 5' dsRNA à queue in vitro. (A) Coloration bleue Coomassie de protéine MOV10 purifiée à l'aide du système FLAG-HEK293T. Les flèches rouges indiquent les positions de la protéine MOV10 purifiée. Les bandes sur le gel Coomassie avec un poids moléculaire d'environ 55 kDa correspondent à la chaîne d'immunoglobuline lourde (IgG) de l'anticorps FLAG. (B) MOV10 déroule 5' dsRNA à queue avec un temps croissant (10, 30, 60 min) à 37 oC. ssRNA 18 nt ARN simple brin, dsRNA 54 nt ARN double brin avec une queue de 18 nt 5 ' (20% gel indigène). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Alternative MÉTHODES de utilisation de la biotine chromogénique réactif s (en) sur l'assay MEIOB. Volume standard commercial : instruit par le kit de détection d'acide nucléique chemiluminescent ; 2x volume commercial dilué : dilution double de chaque tampon dans le kit de détection d'acide nucléique chemiluminescent, réactifs auto-faits : voir les détails à l'étape 3.7.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1 : Les amorces utilisées pour amplifier le gène fragments de Meiob et Mov10. Les lettres en gras dans les amorces avant et inverses sont BamHI et NotI sites de coupe; les lettres en gras italiques dans une amorce inversée sont des sites de coupe XhoI; les lettres en gras dans les boîtes indiquent les nucléotides correspondant à la mutation ponctuelle R235A.
Tableau 2 : Séquences de substrats d'ADN et d'ARN utilisés dans ce travail.
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Discussion
L'étude des interactions protéine-acide nucléique est essentielle à notre compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à divers processus biologiques. Par exemple, MEIOB est une protéine spécifique aux testicules essentielle à la méiose et à la fertilité chez les mammifères25,26,27. MEIOB contient un domaine OB qui se lie à l'ADN à brin unique et présente 3' à 5' activité d'exonuclease26, qui se rapporte directement à sa pertinence physiologique lors de la recombinaison méiotique. Comme autre exemple, MOV10 est une hélice d'ARN avec la fonction omniprésente qui peut s'associer aux structures secondaires d'ARN16. En conséquence, MOV10 affiche de larges propriétés liant l'ARN et 5' à 3' RNA duplex déroulement activité16. Les études faisant état des activités biochimiques susmentionnées de ces protéines reposaient sur l'utilisation d'isotopes 32P pour étiqueter les acides nucléiques pour les essais in vitro. Dans la présente étude, nous avons établi des protocoles pour une série d'expériences in vitro étiquetées biotine de la fonction MEIOB et MOV10. Ces protocoles commencent par la préparation de protéines actives et se terminent par l'imagerie des signaux de biotine.
Plus précisément, en ligne avec les études précédentes25,26, protéines MEIOB ont été surexprimées dans les bactéries avec et la purification a donné une seule bande avec le signal de coloration Coomassie forte après l'électrophorèse gel. Cependant, la purification de la protéine MOV10 pleine longueur était plus efficace lorsqu'elle était surexprimée en tant que protéine FLAG-tag-fused dans les cellules HEK293T que comme protéine TPS-fusionnée dans les bactéries (données non montrées). Pour obtenir des quantités suffisantes de protéines à une pureté suffisante pour les réactions ultérieures, ces deux systèmes de purification des protéines doivent être comparés pour déterminer la méthode la plus appropriée pour les protéines de différentes tailles et/ou propriétés. Les acides nucléiques ont ensuite été étiquetés à l'aide de biotine au lieu de 32P comme substrat et ont obtenu un signal robuste lors de l'examen de l'affinité acide nucléique-liaison ou des activités de traitement de l'acide nucléique des deux protéines. Cependant, comme les protéines purifiées par les bactéries sont fréquemment contaminées par la RNase, il est difficile d'exclure la possibilité que l'activité de clivage observée lors de la réaction in vitro puisse en partie résulter de la contamination de la RNase. Les essais in vitro avec des mutants MEIOB avec l'activité catalytique réduite (mutant tronqué et point) ont montré l'affaiblissement substantiel du traitement de substrat d'ARN, mais la contamination possible de RNase ne peut pas être exclue. Les résultats obtenus avec chacune des constructions MEIOB agissant sur ssDNA et MOV10 dsRNA déroulement sont semblables à ceux obtenus dans l'étude précédente16,26. Cependant, MEIOB traite l'ADN pour générer un frottis, tandis qu'une bande plus discrète est vue avec de l'ARN selon les résultats expérimentaux (figure2C et figure 3B). Peut-être, MEIOB a des capacités de liaison différentielles à l'ADN et le substrat d'ARN (Figure 2B, Figure 3A,C), qui conduit à la différence dans leurs produits de clivage. Il peut également être possible que MEIOB fend l'ADN et l'ARN d'une manière distincte. Le rôle exact de MEIOB dans le traitement de l'ARN reste à étudier plus avant (par exemple, en utilisant la protéine MEIOB à étiquette FLAG exprimée dans les cellules HEK293T).
Les sondes d'acide nucléique étiquetées biotine sont avantageuses par-dessus les sondes étiquetées P32 en ce qu'elles ne nécessitent pas de protection spécifique et d'élimination des déchets. Deuxièmement, les sondes étiquetées biotine peuvent être conservées de façon stable pendant au moins 1 an à -20 oC, alors que 32sondes étiquetées P ne durent que 2 semaines. Par conséquent, le même lot d'acides nucléiques étiquetés biotine peut être utilisé sur une longue période de temps, en maintenant la reproductibilité des expériences. Enfin, l'autoradiographie rapide des sondes radioactives peut dépendre d'instruments coûteux tels que l'écran de phosphore. En revanche, tous les essais étiquetés biotine décrits ici peuvent être effectués dans un délai d'une journée et ne nécessitent pas d'équipement spécial. Les inconvénients de l'étiquetage de la biotine englobent principalement d'autres étapes expérimentales, y compris le transfert de gel et la chemiluminescence qui sont nécessaires pour détecter les substrats étiquetés biotine, mais peuvent en outre nécessiter une optimisation ou un dépannage. Une autre faiblesse générale est la sensibilité relativement faible de l'étiquetage des biotines par rapport à celle de l'étiquetage des radio-isotopes. Dans ces essais, néanmoins, la détection bien visible de la très faible concentration d'acides nucléiques a été réalisée (figure 2A).
En outre, l'appareil semi-sec de transfert de gel est approprié pour transférer des gels plus longs que réguliers aux membranes. Comparé au transfert humide, le transfert semi-sec est plus rapide surtout pour les acides nucléiques, et donne un signal de fond faible. En outre, les coûts de la réaction chromogénique du système de biotine-streptavidin ont été coupés en diluant les réactifs commerciaux ou en faisant notre propre, qui ont tous deux atteint des signaux semblables. La sensibilité à la détection des réactifs auto-faits peut ne pas sembler si élevée, quoique suffisante dans les présentes (figure 5C), mais elle peut être améliorée en prolongeant le temps de blocage (données non publiées). En outre, les signaux peuvent être améliorés avec une concentration accrue de la sonde d'acide nucléique utilisé pour les essais. Compte tenu des preuves expérimentales ci-dessus, l'étiquette de biotine peut être un substitut avantageux pour 32P dans les essais biochimiques in vitro multiples.
Collectivement, ce protocole offre une plate-forme étiquetée biotine pour l'étude des interactions protéines-acides nucléiques qui s'avère robuste, fiable, efficace et abordable.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts n'est déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions P. Jeremy Wang (Université de Pennsylvanie) pour les modifications et les discussions utiles. Nous remercions également Sigrid Eckardt pour l'édition linguistique. K. Z. a reçu l'appui du National Key R-D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) et de la National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. a reçu le soutien de la National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) et du Programme d'innovation et d'entrepreneuriat de la province du Jiangsu. J. N. a reçu le soutien du Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. a reçu l'appui de la National Natural Science Foundation of China (31771588) et du 1000 Youth Talent Plan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
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