Summary
Здесь представлены протоколы для биохимических анализов in vitro с использованием этикеток биотина, которые могут быть широко применимы для изучения белково-нуклеиновых кислотных взаимодействий.
Abstract
Белково-нуклеиновые кислоты взаимодействия играют важную роль в биологических процессах, таких как транскрипция, рекомбинация, и метаболизм РНК. Экспериментальные методы изучения белково-нуклееновых кислотных взаимодействий требуют использования флуоресцентных меток, радиоактивных изотопов или других меток для обнаружения и анализа конкретных молекул-мишеней. Биотин, нерадиоактивный ярлык нуклеиновой кислоты, обычно используется в электрофоретической перекосной анализов (EMSA), но не регулярно используется для мониторинга активности белка во время нуклеиновых процессов. Этот протокол иллюстрирует полезность маркировки биотина во время ферментативных реакций in vitro, демонстрируя, что эта этикетка хорошо работает с целым рядом различных биохимических анализов. В частности, в соответствии с предыдущими выводами с использованием радиоизотопа 32P-маркированных субстратов, это подтверждается с помощью биотина помечены EMSA, что MEIOB (белок, специально участвующих в мейотической рекомбинации) является ДНК-связывающей белка, что MOV10 (an Рнк helicase) разрешает биотин-маркированные структуры дуплекса РНК, и что MEIOB расщепляет биотин-маркированную одноцепочечную ДНК. Это исследование показывает, что биотин способен заменить 32P в различных нуклеиновой кислоты связанных биохимических анализов в пробирке.
Introduction
Белково-ядерные кислоты взаимодействия участвуют во многих важных клеточных процессов, таких как ремонт ДНК, репликация, транскрипция, обработка РНК, и перевод. Белковые взаимодействия с конкретными последовательностями ДНК в хроматине необходимы для жесткогоконтроля экспрессии генов на транскрипционном уровне 1. Точная посттрансконсальная регуляция многочисленных кодирования и некодирования РНК требует обширных и сложных взаимодействий между любым белком и РНК2. Эти слои регулятивного механизма экспрессии генов составляют каскад динамических межмолекулярных событий, которые координируются взаимодействием транскрипционных/эпигенетических факторов или РНК-связывающих белков с их целями нуклеиновой кислоты, а также белково-белковых взаимодействий. Чтобы вскрыть ли белки in vivo прямо или косвенно связаны с нуклеиновыми кислотами и как такие ассоциации происходят и завершаются, в пробирке проводятся биохимические анализы для изучения связывающей сродства или ферментативной активности белков, представляющих интерес, разработанные субстраты ДНК и/или РНК.
Многие методы были разработаны для обнаружения и характеристики нуклеиновых кислотно-белковых комплексов, в том числе электрофоретической перекос асссепования (EMSA), также называют сярприг отсталости геля или перекладину полосы анализ3,4,5 . EMSA является универсальным и чувствительным биохимическим методом, который широко используется для изучения прямого связывания белков с нуклеиновыми кислотами. EMSA опирается на гель электрофоретический сдвиг в диапазонах, которые регулярно визуализированы с помощью хемилюминесценции для обнаружения биотина этикетки6,7, флуоресценция флюорофор этикетки8,9, или авторадиография радиоактивных 32P этикетки10,11. Другие цели биохимических исследований являются выявление и характеристика нуклеиновой кислоты обработки деятельности белков, таких как нуклеаза основе реакций для оценки декольте продуктов из нуклеиновой кислоты субстратов12, 13 Год , 14 и ДНК / РНК структуры раскручивания анализы для оценки деятельности геликей15,16,17.
В таких ферментативных анализов деятельности, радиоизотоп-маркированных или фторофора помечены нуклеиновые кислоты часто используются в качестве субстратов из-за их высокой чувствительности. Анализ радиографов ферментативных реакций с участием 32P помеченных радиотрафов было установлено, чувствительны и воспроизводимых18. Тем не менее, во все большем числе лабораторий в мире использование радиоизотопов ограничено или даже запрещено из-за рисков для здоровья, связанных с потенциальным воздействием. В дополнение к проблемам биобезопасности, другими недостатками являются необходимое оборудование для проведения работы с радиоизотопами, требуемая лицензия на радиоактивность, короткий период полураспада 32P (около 14 дней) и постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза. Таким образом, были разработаны альтернативные неизотопные методы (т.е. маркировка зонда флюорофорами позволяет обнаружить с помощью флуоресцентной визуализации19). Тем не менее, система визуализации с высоким разрешением необходима при использовании флуоресцентно помеченных зондов. Биотин, широко используемый ярлык, легко связывает к биологическим макромолекулам such as протеины и нуклеиновые кислоты. Система Biotin-streptavidin работает эффективно и улучшает чувствительность обнаружения без увеличения неспецифического фона20,21. Помимо EMSA, биотин широко используется для очистки белка и РНК выдвижной, среди прочего22,23,24.
Этот протокол успешно использует биотин-маркированные нуклеиновые кислоты как субстраты для биохимических анализов in vitro которые включают EMSA, в дополнение к enzymatic реакциям в которых биотин обыкновенно не был использован. MEIOB OB домен построен и два мутанта (усечение и точка мутации) выражаются как GST синтез атомиибелков 25,26,27, а также мыши MOV10 рекомбинантный белок слияния FLAG16. В этом докладе подчеркивается эффективность этого комбинированного протокола для очистки белка и биотин-маркированных анализов для различных экспериментальных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Препарат протеина
- Конструкции экспрессий MEIOB и MOV10
- Создание cDNA-выражении конструирует кодирующую мышь MEIOB-A, C и E(рисунок 1A)и MOV10.
- Нарань реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждого фрагмента. Смешайте 1 кДНК мыши (от C57BL/6 мыслят testis), 1 л dNTP, 2 Зл из 10 мкм вперед грунтовка, 2 Зл из 10 ММ обратной грунтовки, 1 л ПОЛимеразы ДНК, 25 л 2x буфера ПЦР, и 18 л двойной дистиллированной H2O (ddH2O) в финале объемом 50 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для усиления фрагментов генов Meiob и Mov10 перечислены в таблице 1. - Выполните ПЦР реакции с использованием следующих программ: 95 кв. c в течение 5 мин, 35 циклов нагрева при 95 градусах по Цельсию для 15 с, аннулирование при 64 КС на 15 с, расширение на 72 градусов по Цельсию на 20 с (2 мин для расширения полной длины MOV10), и окончательное расширение на 68 градусов по Цельсию в течение 7 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте грунтовую пару MEIOB-E (F1) и MEIOB-E-mut (R1) и MEIOB-E-mut (F2) и MEIOB-E (R2), чтобы усилить два сегмента, которые содержат последовательность мутантов в пределах перекрывающейся последовательности на 3' и 5 'концах, соответственно, для создания шаблона мутантов ПЦР.
- Нарань реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждого фрагмента. Смешайте 1 кДНК мыши (от C57BL/6 мыслят testis), 1 л dNTP, 2 Зл из 10 мкм вперед грунтовка, 2 Зл из 10 ММ обратной грунтовки, 1 л ПОЛимеразы ДНК, 25 л 2x буфера ПЦР, и 18 л двойной дистиллированной H2O (ddH2O) в финале объемом 50 л.
- Проанализируйте усиленную ПЦР ДНК с помощью геля электрофорез, вырежьте полосу требуемого размера из геля быстро под ультрафиолетовую лампу и поместите в центрифужную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемые размеры продукта, видимые на геле агарозы для MEIOB-A, составляют 536 б.п., MEIOB-C - 296 б.п., MEIOB-E - 312 б.п. и 229 б.п., а MOV10 - 3015 б.п. - Очистите ДНК ПЦР с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с протоколом производителя.
- Добавьте равный объем растворения буфера в центрифужную трубку со ступени 1.1.2 и расплава гель в 50-55 градусов по Цельсию водяной бане в течение 5-10 минут, гарантируя, что части геля полностью расплавятся. Центрифуга кратко собрать любые капли со стены трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация массы/объема геля и растворяющийся буфер составляет 1 мг/Л. - Поместите столбец адсорбции в трубку сбора, перенесите раствор, содержащий раствор, содержащий фрагмент растворенного геля, в столбец адсорбции и центрифугу на 12 000 х г в течение 2 мин.
- Отбросьте фильтррат в нижней части коллекторских трубок. Добавьте 600 кл.с буфера для мытья в столбец, центрифугу при 12 000 х г в течение 1 мин и отбросьте фильтррат.
- Повторите шаг 1.1.3.3 один раз.
- Поместите колонку обратно в трубку сбора, и центрифуги на 12000 х г в течение 2 минут, чтобы удалить все оставшиеся буфера стирки.
- Поместите столбец адсорбции в стерилизованные центрифуги 1,5 мл, добавьте 50 кЛ ddH2O в центр столбца адсорбции и центрифугу на 12000 х г в течение 1 мин. Измерьте концентрацию ДНК элуата с помощью спектрофотометра.
- Добавьте равный объем растворения буфера в центрифужную трубку со ступени 1.1.2 и расплава гель в 50-55 градусов по Цельсию водяной бане в течение 5-10 минут, гарантируя, что части геля полностью расплавятся. Центрифуга кратко собрать любые капли со стены трубки.
- Ограничение пищеварения плазмидов
- Дайджест вектора pGEX-4T-1 с BamHI и NotI. Для этого смешайте 4 мкг вектора pGEX-4T-1, 5 qL 10x буфера дайджеста, 1 зл Бамхи и 1 Зл NotI и ddH2O до конечного объема реакции 50 зл. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
- Дайджест вектора pRK5 с BamHI и XhoI путем смешивания 4 мкг вектора pRK5, 5 л 10x буфера дайджеста, 1 зл Бакхи и 1 Зл КхоИ и ddH2O до окончательного объема реакции 50 ЗЛ. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
- Проанализируйте вектор ДНК с помощью геля электрофорез, вырежьте желаемый размер полосы из геля быстро скальпелем под ультрафиолетовой лампой и поместите его в центрифугу трубки.
- Очистите вектор ДНК с комплектом извлечения геля как 1.1.3 после инструкции производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина линейных плазмидов: pGEX-4T-1, 4,4 кб; pRK5, 4,7 кб. - Навяжгите стандартную рекомбинантную реакцию перегазации, объединив 0,03 пм. моль линейного вектора, 0,06 пм. м. фрагмента кДНК, 2 л лигазе и 4 л 5-кратного буфера лигазэ и ddH2O в окончательном объеме реакции 10 зл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клон MEIOB-A, C и E в вектором pGEX-4T-1 и MOV10 в вектор pRK5. - Инкубировать смесь при 37 градусах По цельсии в течение 30 мин, а затем охладить реакцию сразу в течение 5 минут на льду. Преобразуйте рекомбинантные плазмиды MEIOB в бактерии BL21 и рекомбинантные плазмиды MOV10 в бактерии DH5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте все рекомбинантные конструкции секвенированием Sanger. - Подготовка глицерола запасов бактериальных культур, содержащих проверенные рекомбинантные плазмиды, добавив равный объем 50% глицерола в жидких культур, и хранить при -80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого последующего эксперимента, полоса из бактерий из запасов глицерола на свежие агар пластины и использовать одну колонию для расширения, как описано в шаге 1.2.
- Создание cDNA-выражении конструирует кодирующую мышь MEIOB-A, C и E(рисунок 1A)и MOV10.
- Экстракт белка MEIOB из бактерий
- Выберите одну колонию каждого штамма BL21, трансфицируемого пустым или рекомбинантным плазмидом pGEX-4T-1, проверенным путем секвенирования и прививания в 3 мл LB, содержащего 100 мкг/мл ампициллин. Выращивайте всю ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 220 об/мин.
- Прививать 300 мл ЛБ, содержащий 100 мкг/мл ампициллин из 3 мл ночной культуры (от шага 1.2.1). Выращивайте культуры с тряской при 37 градусах по Цельсию в течение 2 ч, пока OD600 не достигнет 0,5-1,0.
- Побудить выражение белка, добавив изопропил бета-D-thiogalactopyranoside (IPTG) до конечной концентрации 0,2 мМ. Инкубировать культуры для дополнительных 3 ч с встряхиванием при 180 об/мин и 18 градусов по Цельсию.
- Центрифуги бактериальной культуры на 3500 х г и 4 кв кв 20 мин.
- Отрежь гранулу в 20 мл фосфатного сольного сольного буфера Dulbecco (DPBS). Сноуcate бактериальной подвески на льду в течение 25 циклов в короткие 10 с очередей (мощность выхода 20%) затем 2-3 s отдыхана на льду.
- Центрифуга лизат на 12000 х г и 4 кв кв в течение 15 мин. Перенесите все супернатанты в свежую трубку.
- Предварительно мыть бисер.
- Добавьте 300 л из пролейкотион-сефарозного бисера в свежую трубку 15 мл и промойте бисер 10 мл ледяного буфера PBS.
- Центрифуга при 750 х г и 4 кв. м в течение 1 мин, чтобы гранулы бисера и отказаться от раствора для мытья.
- Добавить лизат в промытые бусы и инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 2 ч. Центрифуга при 750 х г и 4 кв. м в течение 1 мин, чтобы гранулы шарики. Промыть бисер в 10 мл ледяного PBS 8x.
- Выладоте бусинки с 1 мл элютионного буфера (10 мМ глутатиона в 50 мм Tris-HCl при pH 8.0) 6x, инкубируя при 4 кв кв 10 минут до каждого шага elution. Центрифуга при 750 х г и 4 кв 1 мин, чтобы гранулы бисера. Соберите и объедините 6 фракций.
- Перенесите элютированные белки в центробежный фильтр и концентрируйте центробежугирование при 7500 х г, чтобы получить окончательный объем 100-200 л.
- Экстракт белка MOV10 из клеток HEK293T
- Переходно ездо выражайте белки MOV10 в культивированных клетках HEK293T.
- Приготовьте плазмид MOV10-pRK5 при концентрации йgt;500 нг/Зл.
- Семена HEK293T клетки в 15 см блюд. Когда плотность клеток достигает 70%-90%, замените среду клеточной культуры свежим модифицированным орел-медиумом Dulbecco (DMEM), содержащим 10% сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина.
- Для одного трансфекции, разбавить 60 мкг MOV10-pRK5 плазмид ДНК в 3 мл пониженной среде сыворотки, затем добавить 120 мл трансфекционного усилитель реагента, и хорошо перемешать.
- В отдельной трубке разбавить 90 л трансфекционного реагента с 3 мл пониженной сыворотки среды (без пенициллина-стрептомицина) и хорошо перемешать.
- Добавьте разбавленную ДНК к каждой трубке разбавленного трансфекционного реагента. Инкубировать при комнатной температуре 15 мин.
- Добавьте трансфекционную смесь в клеточную культуру, а культурные клетки – 36-48 ч.
- После 36-48 ч соберите клетки с каждой пластины в трубке 50 мл. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Вымойте каждый гранулы с 10 мл ледяной PBS, и собирать клетки центрифугирования при 500 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
- Приостановите гранулы в 3 мл клеточного лисисового буфера, содержащего полный ehylenediaminetetraacetic кислоты (ЭДТА) без протеазы ингибитор коктейль. Инкубировать 30 мин на льду. Центрифуге лизат на 20000 х г и 4 кв кв 20 мин.
- Добавьте 100 л магнитных бусин анти-FLAG на блюдо клеток в трубке 1,5 мл.
- Вымойте магнитные бусы 2x с буфером K150 (50 мМ HEPES при рН 7,5, 150 мм КоАК, 1 мМ DTT, 0,1% NP-40).
- Приостановите магнитные бусы в 1 мл ледяного буфера K150.
- Инкубировать магнитные бусы в течение 2 мин при 4 градусах Цельсия с нежным вращением и гранулы магнитные бусы с помощью магнита. Удалите и отбросьте супернатант.
- Добавьте магнитные бусы в супернатант клеточного лизата со ступени 1.3.3 и инкубируйте при 4 градусах По цельсию на 2 ч.
- Вымойте белок связаны магнитные бусы 3x с K150 буфера, то 2x с K150, содержащий 250 мМ NaCl, то 3x с K150 буфера как 1.3.5.
- Приостановить бусы в 300 qL буфера элуции FLAG (100 мм NaCl, 20 мМ Tris-HCl при рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 10% глицерола), добавить пептид FLAG к окончательной концентрации 0,5 мкг/л, и инкубировать бисером на ротаторе на 4 , затем гранулы магнитные бусы с помощью магнита.
- Соберите супернатант, который содержит eluted MOV10 белков, определить концентрацию, и хранить на -80 градусов по Цельсию для использования в будущем.
- Переходно ездо выражайте белки MOV10 в культивированных клетках HEK293T.
2. Препарат нуклеиновой кислоты
- Приобретите ДНК и РНК олигонуклеотиды (олигос) с этикетками биотина или без нее из подходящего источника. Разбавить каждый олиго в RNase-бесплатно ddH2O до 20 ММ и держать его на -80 градусов по Цельсию для будущего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Олиго последовательности ДНК / РНК субстратов, используемых в этом исследовании перечислены в таблице 2. - Подготовка следующей смеси для двухцепочечной РНК (dsRNA) annealing реакции для MOV10 геликейс деятельности асссе: смесь 60 мМ ММ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-этан-сульфоновая кислота (HEPES) на рН 7,5, 6 мМ KCl, 0,2 мМ MgCl2 и RNase-free dH2 O в окончательном объеме реакции 20 Л.
- Аннеал РНК олиго для формирования РНК дуплекс путем нагрева смеси биотина помечены верхней нити (2 ММ, конечная концентрация) и 1,5 раза его немаркированной дополнительной нижней нити в буфере annealing (шаг 2.2) при 95 C в течение 5 минут, а затем медленно охладить его в комнату температуры (RT).
3. Биохимические анализы in vitro
- EMSA и ферментативные реакции
- Для meIOB EMSA анализ, смесь 50 мМ Tris HCl на рН 7,5, 2 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 10 мМ EDTA, 2 ММ дитиотрейтол (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 мм (или других соответствующих концентраций, как показано на рисунке 2 и Рисунок3) биотин-маркированные олигонуклеотиды и ddH2O в окончательном объеме реакции 20 Зл. Инкубировать на RT в течение 30 минут, и добавить 5x стоп-буфер (125 мМ EDTA, 50% глицерола), чтобы остановить реакцию.
- Навлажив аклетисы активности MEIOB, описанные в шаге 3.1.1, но без добавления 10 мМ EDTA.
- Для проведения асссеа активности геликей MOV10 смешайте 50 мМ Tris-HCl при рН 7.5, 20 мМ КоАК, 2 мМ MgCl2, 0,01% NP-40, 1 мМ DTT, 2 U / Л L РНКингинг ингибитор, 10 нм биотин-маркированных РНК субстрата, 2 мМ аденозин трифосфат (АТФ), 100 НМ РНК-ловушку, и 20 нг белка MOV10 2O в окончательном объеме реакции 20 Зл. Инкубировать реакционную смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 10 мин, 30 мин и 60 мин. Добавьте 5x стоп-буфер, чтобы остановить реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-ловушка, биотин-немаркированных олиго с последовательностью, дополняют помечены олиго, что предотвращает растяжек dsRNA от annealing снова.
- Полякриламидгели
- Вымойте гелевые пластины (16 см х 16 см) и 1,5 мм гребни. Соберите гелевые электрофорусные агрегаты.
- Для приготовления 10% родного полиакриламидного геля, смесь 14 мл ddH2O, 1,25 мл 10x Tris-бориновая кислота-EDTA (TBE), 8,3 мл 30% акриламида, 1,25 мл 50% глицерола, 187,5 л 10% свежеприготовленного аммония persulfate (APS), и 12,5 л из йл из 50% глицерола, 187,5 л из 10% свежеприготовленного аммония persulfate (APS), и 12,5 л тетраметилэтилендиамин (TEMED).
- Для приготовления 20% родного полиакриламидного геля смешайте 5,5 мл ddH2O, 1,25 мл 10x TBE, 1,25 мл 50% глицерола, 16,7 мл 30% акриламида, 187,5 л 10% APS и 12,5 л TEMED.
- Налейте раствор акриламида немедленно гель и вставьте гребень. Пусть смесь полимеризации в течение примерно 30 мин.
- Гель работает
- Снимите гребень, заполните баки электронным буфером работает (0,5x TBE).
- Промыть образец скважин с 0,5x TBE буфера, а затем предварительно запустить гель на 100 В на льду в течение 30 минут. Заменить работает буфер с свежим 0,5x TBE.
- Загрузите 20-25 образцов Л в каждую скважину.
- Используйте 10% родной гель акриламида для ассеа ассеа и 20% родной гель акриламида для ферментативных анализов. Запуск электрофореза при 100 В на ледяной ванне, пока бромофенол синий маркер мигрировал в нижней четверти геля.
- Разберите гелевые пластины, обрезать гель, удалив погрузочные колодцы и неиспользованные полосы. Поместите гель в буфер TBE 0.5x.
- Вырежьте фильтровальную бумагу и нейлоновую мембрану до размера геля. Предварительно промокните чистую фильтровальную бумагу и нейлоновую мембрану.
- Соберите стек для передачи.
- Поместите предварительно влажную мембрану на предварительно влажную фильтровальную бумагу.
- Поместите гель на мембрану.
- Накройте гель еще одним слоем предварительно влажной фильтровальной бумаги.
- Удалите все пузырьки воздуха, прокатки чистой пипетки от центра до края.
- Перенос образцов из геля на мембрану в полусухом электрофоретике при 90 мА за 20 мин.
- Остановить передачу, а затем высушить мембрану на новой фильтровальной бумаге в течение 1 мин.
- Crosslink образцы путем облучения мембраны на 120 мДж/см2 для 45-60 с в УФ-свет кросслинкер оснащен 254 нм лампы (авто кросслинк функции). Воздух сушит мембрану на РТ в течение 30 мин.
- Обнаружение хемилюминесценции
- Протокол 1: Используйте стандартный объем коммерческого химилюминесцентного комплекта для обнаружения нуклеиновой кислоты.
- Добавьте 20 мл блокирующего буфера в мембрану и насигните 15-30 мин с нежной тряской на ротаторе при 20-25 об/мин.
- Подготовка конъюгировать / блокирующий буферный раствор, добавив 66,7 л стабилизированного стрептавидина-хондрада пероксидазы конъюгированного до 20 мл блокирующего буфера.
- Аккуратно удалите блокирующий буфер и замените его конъюгировать/блокирующим буфером. Инкубировать 15 мин на ротаторе при 20-25 об/мин.
- Вымойте мембрану 4x с встряхиванием при 40-45 об/мин в течение 5 мин каждый.
- Добавьте в мембрану 30 мл буфера равновесия субстрата. Инкубировать мембрану в течение 5 мин с встряхиванием при 20-25 об/мин.
- Подготовьте рабочий раствор субстрата, добавив 6 мл раствора люминола/усилителя к 6 мл стабильного раствора перекиси. Избегайте света.
- Накройте всю поверхность мембраны рабочим раствором субстрата и инкубировать в течение 5 мин.
- Сканирование мембраны в химилюминесцентной системе визуализации на 1-3 с.
- Протокол 2: Используйте 2x разбавленный коммерческий комплект обнаружения хемиловых кислот и выполните шаги 3.10.1.1.1.1.8.
- Протокол 3: Используйте самодельные реагенты6.
- Подготовка блокирующий буфер: смесь 0.1 M Tris-HCl на рН 7,5, 0,1 M NaCl, 2 мМ MgCl2, и 3% бычьего сыворотки альбумина Фракция V. AP 7,5 буфер: смесь 0.1 M Tris-HCl на рН 7,5, 0,1 М NaCl, и 2 мМ MgCl2. AP 9.5 буфер: смесь 0.1 M Tris-HCl на pH 9.5, 0.1 M NaCl, и 50 mM MgCl2. TE буфер: смесь 10 мМ Tris-HCl на pH 8.0, 1 mM EDTA на pH 8.0.
- Замочите мембрану в блокирующем буфере при 30 градусах по Цельсию в течение 1 ч.
- Добавьте 8,5 л стрептавидина щелочной фосфатазы до 10 мл AP 7,5 буфера. Встряхните мембрану осторожно в этом растворе на RT в течение 10 мин. Затем промойте мембрану 2x в 15 мл AP 7,5 буфера в течение 10 минут.
- Вымойте мембрану еще раз в 20 мл AP 9.5 буфера в течение 10 мин. Добавить 20 мл TE буфера, чтобы остановить реакцию.
- Добавьте 7,5 мл раствора развития на мембрану и сканируют мембрану в химилюминесцентной системе визуализации на 1-3 с.
- Протокол 1: Используйте стандартный объем коммерческого химилюминесцентного комплекта для обнаружения нуклеиновой кислоты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Белковая структура MEIOB и выражения конструкций, используемых в этом исследовании иллюстрируются на рисунке 1A. OB складки в MEIOB являются компактными баррель-подобных структур, которые могут распознавать и взаимодействовать с одноцепочечными нуклеиновой кислоты. Один из областей ОБ (aa 136-307, построить) связывает одной мель ДНК (ssDNA), усеченный белок (аа 136-178 усечения, построить C) и точка мутантформе (R235A мутации, построить E) MEIOB. Белки синтеза GST-MEIOB были переэкспрессированы в бактериях BL21, с последующими шагами изоляции, приводящими к очищенным белкам, показанным голубым окрашиванием Coomassie и западным анализом поблу(рисунок 1B). Субстраты нуклеиновой кислоты в различных концентрациях иллюстрируют высокую чувствительность сигнала биотина, с обнаруживаемым сигналом 1 нМ олиго после относительно короткого времени воздействия на 1-3 с (Рисунок 2A). Дикий тип MEIOB-A белка, но не мутант MEIOB-E и MEIOB-C белки, сильно связываться с 36 nt биотин-маркированных субстратов ssDNA (такая же длина и последовательность, как используется ранее26) (Рисунок 2B) и расщепляет субстраты в лестницы(рисунок 2C).
Анализ in vitro белков MEIOB с олигосами РНК той же последовательности, что и субстраты ssDNA, используемые на рисунке 2B,C, иллюстрирует связывающую способность и экзонуклеизирующую активность MEIOB на 36 nt одноцепочечной РНК (ssRNA) (рисунок3A,B ). Связь деятельности MEIOB с ДНК и РНК была дополнительно количественно проанализирована(рисунок 3C). Кроме того, белок MOV10, отмеченные FLAG, были очищены от клеток HEK293T(рисунок 4A). Для измерения активности геликей MOV10 была разработана дуплексная РНК (та же длина, но разная последовательность, чем раньше16),несущая 18 nt 5' свес (рисунок4B). Когда биотин-маркированный дуплекс РНК был инкубирован с MOV10 в присутствии АТФа, нижняя полоса, соответствующая выпущенной одноцепочечной биотиной маркировке РНК появился с увеличением времени, отражающий функцию MOV10 как гелик. Наконец, для сокращения расходов была предпринята попытка оптимизировать использование реагентов для обнаружения хемилюминесценции метки биотина. Выяснилось, что двукратное разбавление хемилюнесцентных нуклеиновых кислот не оказало негативного влияния на хромогенную чувствительность биотин-стрептавидина, и, что интересно, самодельные реагенты работали почти одинаково хорошо(рисунок 5 ).
Рисунок 1 : Очищение Белки MEIOB. (A) Схематическое представление конструкций MEIOB, используемых в этом исследовании26. MEIOB содержит домен OB. Все конструкции MEIOB (A, C, E) были выражены как белки синтеза GST. (B) Coomassie синий окрашивания и западного анализа пятно MEIOB белков очищены с помощью системы GST-бактерий. Красные стрелки указывают на положение очищенных белков MEIOB. Полосы примерно на 26 KDa соответствуют глутатиону. Для западного подавили, анти-GST антитела были использованы с 1:6000 разбавления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : In vitro анализы meIOB-ssDNA взаимодействий . (A) Испытание прочности сигнала различных концентраций 36 nt биотин-маркированных ssDNA. (B) РЕЗУЛЬТАТ связывания белка MEIOB к биотин5' конец маркировки субстратов ДНК (10% родной гель). (C) MEIOB-опосредованного расщепления биотин 5 ' конец маркировки ДНК субстратов (20% родной гель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : In vitro анализы взаимодействий MEIOB-ssRNA. (A) результат связывания белка MEIOB к биотину 5' конечным маркировке РНК субстратов (10% родной гель). (B) MEIOB-опосредованного расщепления биотин 5 ' конец маркировки РНК субстратов (20% родной гель). (C) Участок процент ДНК / РНК-связанных против MEIOB-A концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Очищенный белок MOV10 и его раскручивание 5' хвостатых dsRNA in vitro. (A) Coomassie синий окрашивание белка MOV10 очищены с помощью системы FLAG-HEK293T. Красные стрелки указывают на положение очищенного белка MOV10. Полосы на геле Coomassie с молекулярным весом около 55 kDa соответствуют тяжелой цепи иммуноглобулина (IgG) из антитела FLAG. (B) MOV10 раскручивается 5' хвостатый dsRNA с увеличением времени (10, 30, 60 мин) при 37 градусах Цельсия. ssRNA 18 nt одноцепочечная РНК, dsRNA 54 nt двухцепочечная РНК с 18 nt 5' хвост (20% родной гель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Альтернатива методы из с помощью биотина хромогенные реагент s о meIOB асссее. Коммерческий стандартный объем: инструктируется хемилесцентным набором обнаружения нуклеиновой кислоты; 2x разбавленный коммерческий объем: двукратное разбавление каждого буфера в хемилесцентном комплекте обнаружения нуклеиновых кислот, самодельные реагенты: см. детали в шаге 3.7.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Праймеры, используемые для ПЦР, усиливают ген фрагменты Мейоб и Mov10. Смелые буквы в вперед и обратном грунтовки BamHI и NotI резки сайтов; курсивные смелые буквы в обратном грунтовке являются XhoI резки сайтов; жирные буквы в коробках указывают нуклеотиды, соответствующие точечной мутации R235A.
Таблица 2: Последовательности субстратов ДНК/РНК, используемых в этой работе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследование взаимодействия белково-нуклеиновой кислоты имеет решающее значение для нашего понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе различных биологических процессов. Например, MEIOB является яичка конкретных белка, необходимого для мейоза и плодородия у млекопитающих25,26,27. MEIOB содержит OB домен, который связывается с одноцепочечной ДНК и экспонатов от 3'до 5' экзонуклизировать деятельности26, который непосредственно относится к его физиологической значимости во время meiotic рекомбинации. В качестве еще одного примера, MOV10 является рнк геликс с вездесущей функции, которые могут ассоциироваться с РНК вторичных структур16. Соответственно, MOV10 отображает широкие СВОЙСТВА РНК-связывания и 5'к 3' РНК дуплекс раскручивания деятельности16. Исследования, сообщающие о вышеупомянутой биохимической деятельности этих белков, опирались на использование 32изотопа P для обозначения нуклеиновых кислот для анализа in vitro. В настоящем исследовании мы установили протоколы для серии биотинов с маркировкой in vitro экспериментов функции MEIOB и MOV10. Эти протоколы начинаются с подготовки активных белков и заканчиваются визуализацией сигналов биотина.
В частности, в соответствии с предыдущими исследованиями25,26, MEIOB белки были overexpressed в бактериях с и очистки дали одну одну полосу с сильным Coomassie окрашивающий сигнал после геля электрофорез. Тем не менее, очистка полноразмерного белка MOV10 была более эффективной, когда переэкспрессия, как FLAG-тег слитого белка в клетках HEK293T, чем в качестве GST-слитого белка в бактериях (данные не показаны). Для получения достаточного количества белка при адекватной чистоте для последующих реакций, эти две системы очистки белка должны быть сопоставлены, чтобы определить наиболее подходящий метод для белков с различными размерами и /или свойствами. Нуклеиновые кислоты затем помечены с использованием биотина вместо 32P в качестве субстрата и получили надежный сигнал при изучении нуклеиновой кислоты связывающей сродство или нуклеиновой кислоты обработки деятельности обоих белков. Однако, поскольку белки, очищенные от бактерий, часто загрязнены RNase, трудно исключить возможность того, что активность расщепления, наблюдаемая во время реакции in vitro, может частично возникнуть в результате загрязнения RNase. В пробирке анализы с мутантами MEIOB с пониженной каталитической активностью (усеченный и точечный мутант) показали существенное ухудшение обработки субстрата РНК, но возможное загрязнение RNase нельзя исключать. Результаты, полученные с каждым из meIOB конструкций, действующих на ssDNA и MOV10 раскручивания dsRNA аналогичны тем, полученные в предыдущем исследовании16,26. Тем не менее, MEIOB обрабатывает ДНК для генерации мазка, в то время как более дискретная полоса видна с РНК в соответствии с экспериментальными результатами(Рисунок 2C и Рисунок 3B). Возможно, MEIOB обладает дифференцальными связывающими способностями к ДНК и РНК-субстрату(рисунок 2B, рисунок 3A,C),что приводит к разнице в их продуктах расщепления. Возможно также, что MEIOB расщепляет ДНК и РНК в определенной форме. Точная роль MEIOB в обработке РНК еще предстоит изучить (например, с использованием белока MEIOB, смешаемым с ФЛАГ-тегом, выраженным в клетках HEK293T).
Биотин-маркированные зонды нуклеиновой кислоты выгодны над 32P-маркированными зондами в что они не требуют специфической предохранения и избавления отхода. Во-вторых, биотин-маркированные зонды могут быть стабонены в течение по крайней мере 1 года при -20 градусах По Цельсию, в то время как 32зонда с маркировкой P длятся только 2 недели. Таким образом, та же партия биотин-маркированных нуклеиновых кислот может быть использована в течение длительного периода времени, сохраняя воспроизводимость экспериментов. Наконец, быстрая авториграфия радиоактивных зондов может зависеть от дорогостоящих приборов, таких как фосфорный экран. В отличие от этого, все биотин-маркированные анализы, описанные здесь, могут быть выполнены в течение дня и не требуют специального оборудования. Недостатки маркировки биотина охватывают главным образом дополнительные экспериментальные шаги, включая передачу геля и хемилюминесценцию, которые необходимы для обнаружения субстратов с меткой биотина, но могут дополнительно потребовать оптимизации или устранения неполадок. Другим общим недостатком является относительно низкая чувствительность к маркировке биотина по сравнению с радиоизотопной маркировкой. В этих анализов, тем не менее, хорошо видно обнаружение очень низкой концентрации нуклеиновой кислоты было достигнуто(рисунок 2A).
Кроме того, полусухой гель-аппарат подходит для переноса более длинных, чем обычных гелей, в мембраны. По сравнению с влажной передачей, полусухая передача быстрее, особенно для нуклеиновых кислот, и дает низкий фоновый сигнал. Кроме того, затраты на хромогенную реакцию биотин-стрептавидина системы были сокращены либо за счет разбавления коммерческих реагентов, либо за счет создания собственных, оба из которых достигли аналогичных сигналов. Чувствительность обнаружения самодельных реагентов может показаться не такой высокой, хотя и достаточной здесь(рисунок 5C),но она может быть повышена за счет продления времени блокировки (неопубликованные данные). Кроме того, сигналы могут быть повышены с повышенной концентрацией нуклеиновой кислоты зонд, используемый для анализов. Учитывая вышеприведенные экспериментальные доказательства, этикетка биотина может быть выгодной заменой 32P в нескольких биохимических анализов in vitro.
В совокупности этот протокол предлагает платформу с маркировкой биотина для изучения белково-нуклеиновых кислотных взаимодействий, которая оказывается надежной, надежной, эффективной и доступной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не декларируются.
Acknowledgments
Мы благодарим. Джереми Вана (Университет Пенсильвании) за полезные edits и обсуждения. Мы также благодарим Сигрид Экардт за редактирование языка. К. З. была поддержана Национальной программой исследований и разбироков Китая (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) и Национальным фондом естественных наук Китая (31771653). Л. Я. был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (81471502, 31871503) и инновационной и предпринимательской программой провинции Цзянсу. J. N. была поддержана Чжэцзянской медицинской научно-технической проекта (2019KY499). М.Л. был поддержан грантами Национального фонда естественных наук Китая (31771588) и планом 1000 молодежных талантов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
- Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
- Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
- Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).
- Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
- Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
- Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
- Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).
- Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
- Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
- Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
- Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
- Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
- Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
- Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
- Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
- Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
- Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
- Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
- Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
- Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).
