Summary
Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.
Abstract
Le interazioni tra acido proteina-nucleico svolgono un ruolo importante nei processi biologici come la trascrizione, la ricombinazione e il metabolismo dell'RNA. I metodi sperimentali per studiare le interazioni tra proteine-nucleici con acido richiedono l'uso di tag fluorescenti, isotopi radioattivi o altre etichette per rilevare e analizzare molecole bersaglio specifiche. La biotina, un'etichetta di acido nucleico non radioattivo, è comunemente usata nei saggi di mobilità elettroforici (EMSA), ma non è stata regolarmente impiegata per monitorare l'attività delle proteine durante i processi dell'acido nucleico. Questo protocollo illustra l'utilità dell'etichettatura della biotina durante le reazioni enzimatiche in vitro, dimostrando che questa etichetta funziona bene con una serie di diversi saggi biochimici. In particolare, in linea con i precedenti risultati ottenuti utilizzando substrati con etichetta a radioisotopi 32P, è confermato tramite EMSA con etichetta biotina che IL MEIOB (una proteina specificamente coinvolta nella ricombinazione meiotica) è una proteina legante al DNA, che MOV10 (un RNA helicase) risolve le strutture in base al polpa di RNA etichettate con biotina, e quel MEIOB fende il DNA a filamento singolo etichettato con biotina. Questo studio dimostra che la biotina è in grado di sostituendo 32P in vari saggi biochimici correlati all'acido nucleico in vitro.
Introduction
Le interazioni tra acido proteina-nucleico sono coinvolte in molti processi cellulari essenziali come la riparazione del DNA, la replicazione, la trascrizione, l'elaborazione dell'RNA e la traduzione. Le interazioni proteiche con sequenze specifiche di DNA all'interno della cromatina sono necessarie per uno stretto controllo dell'espressione genica a livello tracscrivionale1. Una precisa regolazione posttrapescrittiva di numerosi RNA codificanti e non codificanti richiede interazioni estese e complicate tra qualsiasi proteina e RNA2. Questi strati del meccanismo regolatore dell'espressione genica comprendono una cascata di eventi intermolecolari dinamici, coordinati da interazioni di trancilazione/fattori epigenetici o proteine che legano l'RNA con i loro bersagli di acido nucleico, nonché interazioni proteina-proteina. Per sezionare se le proteine in vivo sono direttamente o indirettamente associate agli acidi nucleici e come tali associazioni si verificano e culminano, vengono condotte analisi biochimiche in vitro per esaminare l'affinità legante o l'attività enzimatica delle proteine di interesse sussidi progettati di DNA e/o RNA.
Sono state sviluppate molte tecniche per rilevare e caratterizzare i complessi nucleo-acido-proteina, tra cui l'analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del ritardo del gel o analisi dello spostamento della banda3,4,5 . L'EMSA è un metodo biochimico versatile e sensibile che è ampiamente utilizzato per studiare il legame diretto delle proteine con gli acidi nucleici. L'EMSA si basa sullo spostamento elettroforetico del gel nelle bande, che vengono regolarmente visualizzate utilizzando la chemiluminescenza per rilevare le etichette di biotina6,7, la fluorescenza delle etichette fluoroforiche8,9o autoradiografia delle etichette radioattive 32P10,11. Altri scopi degli studi biochimici sono l'identificazione e la caratterizzazione dell'attività di elaborazione dell'acido nucleico delle proteine, come le reazioni basate sulla nuclea per valutare i prodotti di scissione da substrati di acido nucleico12, 13 del sistema , 14 e analisi di rimozione della struttura del DNA/RNA per valutare le attività elicasise15,16,17.
In questi saggi di attività enzimatica, gli acidi nucleici etichettati al radioisotolo o al fluoroforo sono spesso utilizzati come substrati a causa della loro elevata sensibilità. L'analisi delle radiografie delle reazioni enzimatiche che coinvolgono radiotracciatori con etichetta 32P è risultata sensibile e riproducibile18. Tuttavia, in un numero crescente di laboratori nel mondo, l'uso di radioisotopi è limitato o addirittura vietato a causa dei rischi per la salute associati alla potenziale esposizione. Oltre ai problemi di biosicurezza, altri inconvenienti sono l'attrezzatura necessaria per condurre il lavoro con i radioisotopi, la licenza di radioattività richiesta, l'emivita breve di 32P (circa 14 giorni) e il graduale deterioramento della qualità della sonda a causa radiolisi. Pertanto, sono stati sviluppati metodi alternativi non isotopici (cioè, l'etichettatura della sonda con fluorofori consente il rilevamento mediante imaging fluorescente19). Tuttavia, quando si utilizzano sonde con etichetta fluorescente, è necessario un sistema di imaging ad alta risoluzione. La biotina, un'etichetta comunemente usata, si lega prontamente alle macromolecole biologiche come proteine e acidi nucleici. Il sistema Biotin-streptavidin funziona in modo efficiente e migliora la sensibilità di rilevamento senza aumentare lo sfondo non specifico20,21. Oltre all'EMSA, la biotina è ampiamente utilizzata per la purificazione delle proteine e l'RNA pull-down, tra gli altri22,23,24.
Questo protocollo utilizza con successo gli acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per analisi biochimiche in vitro che includono EMSA, oltre a reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata. Il dominio MEIOB OB è costruito e due mutanti (troncamento e mutazione puntiforme) sono espressi come proteine di fusione GST25,26,27, così come il topo MOV10 ricombinante proteina di fusione FLAG16. La relazione mette in evidenza l'efficacia di questo protocollo combinato per la purificazione delle proteine e i saggi etichettati con biotina per vari scopi sperimentali.
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Protocol
1. Preparazione delle proteine
- Costrutti di espressione MEIOB e MOV10
- Generare costrutti di espressione cDNA codificando mouse MEIOB-A, C ed E (Figura 1A) e MOV10.
- Impostare le reazioni a catena di polimerasi (PCR) per ogni frammento. Mescolare 1 l di cDNA di topo (da C57BL/6 testi topo), 1 "L of dNTP", 2 -L di 10 - L di 10 M in avanti, 2 L di 10 M inverso, 1 l of DNA polymerase, 25 litri di 2x buffer PCR e 18 l di doppio distillato H2O (ddH2O) in un finale volume di 50 l.
NOTA: I primer per l'amplificazione dei frammenti di geni Meiob e Mov10 sono elencati nella Tabella 1. - Eseguire reazioni PCR utilizzando i seguenti programmi: 95 s per 5 min, 35 cicli di riscaldamento a 95 gradi centigradi per 15 s, annealing a 64 s per 15 s, estensione a 72 s per 20 s (2 min per estendere la lunghezza completa MOV10), e l'estensione finale a 68 s per 7 min.
NOTA: utilizzare la coppia di primer MEIOB-E (F1) e MEIOB-E-mut (R1) e MEIOB-E-mut (F2) e MEIOB-E (R2) per amplificare due segmenti che contengono la sequenza mutante all'interno di una sequenza sovrapposta alle estremità 3' e 5 ', rispettivamente, per generare un modello PCR mutante.
- Impostare le reazioni a catena di polimerasi (PCR) per ogni frammento. Mescolare 1 l di cDNA di topo (da C57BL/6 testi topo), 1 "L of dNTP", 2 -L di 10 - L di 10 M in avanti, 2 L di 10 M inverso, 1 l of DNA polymerase, 25 litri di 2x buffer PCR e 18 l di doppio distillato H2O (ddH2O) in un finale volume di 50 l.
- Analizzare il DNA PCR amplificato mediante elettroforesi gel, tagliare rapidamente la banda delle dimensioni richieste dal gel sotto una lampada UV e posizionarla in un tubo centrifuga.
NOTA: le dimensioni dei prodotti previste visibili sul gel agarose per MEIOB-A sono 536 bp, MEIOB-C è 296 bp, MEIOB-E 312 bp e 229 bp e MOV10 è 3015 bp. - Purificare il DNA PCR con un kit di estrazione gel seguendo il protocollo del produttore.
- Aggiungere un volume uguale di tampone di dissoluzione nel tubo di centrifuga dal passo 1.1.2 e sciogliere il gel in un bagno d'acqua 50-55 gradi per 5-10 min, assicurando che i pezzi di gel si sciolgano completamente. Centrifuga brevemente per raccogliere eventuali goccioline dalla parete del tubo.
NOTA: La concentrazione massa/volume del gel e del buffer di dissoluzione è di 1 mg/L. - Posizionare la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta, trasferire la soluzione contenente il frammento di gel disciolto nella colonna adsorbiente e centrifugare a 12.000 x g per 2 min.
- Eliminare il filtrato nella parte inferiore dei tubi di raccolta. Aggiungere 600 l buffer di lavaggio alla colonna, centrifugare a 12.000 x g per 1 min, e scartare il filtrato.
- Ripetere il passaggio 1.1.3.3 una volta.
- Posizionare nuovamente la colonna nel tubo di raccolta e centrifugare a 12.000 x g per 2 min per rimuovere tutto il buffer di lavaggio rimanente.
- Posizionare la colonna di adsorbimento in un tubo di centrifuga sterilizzato da 1,5 mL, aggiungere 50 -L di ddH2O al centro della colonna di adsorbimento e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. Misurare la concentrazione di DNA dell'eluato utilizzando lo spettrometro.
- Aggiungere un volume uguale di tampone di dissoluzione nel tubo di centrifuga dal passo 1.1.2 e sciogliere il gel in un bagno d'acqua 50-55 gradi per 5-10 min, assicurando che i pezzi di gel si sciolgano completamente. Centrifuga brevemente per raccogliere eventuali goccioline dalla parete del tubo.
- Restrizione di digestione di plasmidi
- Vettore pGEX-4T-1 digest con BamHI e NotI. A tale scopo, mescolare 4 g di vettore pGEX-4T-1, 5 luna di 10x buffer digest, 1 L di BamHI e 1 -L di NotI e ddH2O ad un volume di reazione finale di 50. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 ore.
- Vettore di pRK5 digest con BamHI e XhoI mescolando 4 g di vettore pRK5, 5 l di 10 volte il buffer del digest, 1 l of BamHI e 1 L di XhoI e ddH2O a un volume di reazione finale di 50.L. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 ore.
- Analizzare il DNA vettoriale mediante elettroforesi gel, tagliare rapidamente la fascia di dimensioni desiderata dal gel con un bisturi sotto una lampada UV e inserirlo in un tubo di centrifuga.
- Purificare il DNA vettoriale con un kit di estrazione gel come 1.1.3 seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: la lunghezza dei plasmidi linearizzati: pGEX-4T-1, 4,4 kb; pRK5, 4,7 kb. - Impostare una reazione di legatura ricombinante standard combinando 0,03 pmol di vettore linearizzato, 0,06 pmol di frammento di cDNA, 2 -L di ligase e 4 - L di 5x buffer di ligase e ddH2O in un volume di reazione finale di 10 .
NOTA: clonare MEIOB-A, C ed E in un vettore pGEX-4T-1 e MOV10 in un vettore pRK5. - Incubare il composto a 37 gradi centigradi per 30 min, quindi raffreddare immediatamente la reazione per 5 min sul ghiaccio. Trasforma i plasmidi ricombinanti MEIOB in batteri BL21 e i plasmidi ricombinanti MOV10 in batteri DH5.
NOTA: verificare tutti i costrutti ricombinanti mediante il sequenziamento di Sanger. - Preparare gli stock di glicerolo di colture batteriche contenenti plasmidi ricombinanti verificati aggiungendo un volume uguale del 50% glicerolo alle colture liquide, e conservare a -80 gradi centigradi.
NOTA: Per ogni esperimento successivo, sfilare i batteri dalle scorte di glicerolo su una piastra di agar fresco e utilizzare una singola colonia per l'espansione come descritto nel passaggio 1.2.
- Generare costrutti di espressione cDNA codificando mouse MEIOB-A, C ed E (Figura 1A) e MOV10.
- Estratti di proteine MEIOB da batteri
- Scegli una colonia di ogni ceppo BL21 trasinfezione dal plasmid e il plasmide vuoto o ricombinante di pGEX-4T-1 verificato dal sequenziamento e inoculare in 3 mL lB contenente 100 ampicillina. Coltivare per una notte a 37 gradi centigradi con agitazione a 220 giri/min.
- Inoculare 300 mL LB contenente 100 g/mL di ampicillina da 3 mL di coltura notturna (dal punto 1.2.1). Coltivare le colture a tremare a 37 gradi centigradi per 2 h fino a quando OD600 raggiunge 0,5-1,0.
- Indurre l'espressione proteica aggiungendo isopropile beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,2 mM. Incubare le colture per ulteriori 3 h con agitazione a 180 giri/min e 18 gradi centigradi.
- Centrifugare la coltura batterica a 3.500 x g e 4 gradi centigradi per 20 min.
- Risospendere il pellet in 20 mL di tampone salina tampone salina tampone tampone (DPBS) a cubetto del ghiaccio Dulbecco. Sonicare le sospensioni batteriche sul ghiaccio per 25 cicli in brevi raffiche 10 s (potenza di uscita 20%) seguito da 2-3 s appoggiato sul ghiaccio.
- Centrifugare il lisato a 12.000 x g e 4 gradi centigradi per 15 min. Trasferire tutto il supernatante in un tubo fresco.
- Perline pre-lavaggio.
- Aggiungere 300 ll di perline glutatione-sepharose in un tubo fresco da 15 mL e lavare le perline con 10 mL di tampone PBS ghiacciato.
- Centrifuga a 750 x g e 4 gradi centigradi per 1 min per pellet le perline e scartare la soluzione di lavaggio.
- Aggiungere il lisato alle perline lavate e incubare a 4 gradi centigradi per 2 h. Centrifugare a 750 x g e 4 gradi C per 1 min a pellet le perline. Sciacquare le perline in 10 mL di PBS 8x ghiacciato.
- Elutare le perline con 1 mL del tampone di eluizione (10 mm glutathione in 50 mM Tris-HCl a pH 8.0) 6x, incubando a 4 mL per 10 minuti prima di ogni passo di eluizione. Centrifuga a 750 x g e 4 gradi centigradi per 1 min per pellet le perline. Raccogliere e mettere in comune le 6 frazioni.
- Trasferire le proteine eluite in un filtro centrifugo e concentrarsi per centrifugazione a 7.500 x g per ottenere un volume finale di 100-200 l.
- Estratti di proteine MOV10 da cellule HEK293T
- Esprimere temporaneamente le proteine MOV10 nelle cellule HEK293T coltivate.
- Preparare il plasmide MOV10-pRK5 ad una concentrazione >500 ng/L.
- Semi HEK293T cellule in piatti 15 cm. Quando la densità cellulare raggiunge il 70%-90%, sostituire il mezzo di coltura cellulare con il fresco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomiacina.
- Per una trasfezione, diluire 60 g di DNA plasmide MOV10-pRK5 in 3 mL del mezzo siero ridotto, quindi aggiungere 120 L del reagente dell'esaltatore di trasfezione e mescolare bene.
- In un tubo separato diluire 90 - L del reagente di trasfezione con 3 mL di ridotto mezzo di siero (senza penicillina-streptomica) e mescolare bene.
- Aggiungere il DNA diluito ad ogni tubo di reagente diluito della trasparenza. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere la miscela di trasfezione alla coltura cellulare e le celle di coltura per 36-48 h.
- Dopo 36-48 h, raccogliere le cellule da ogni piastra in un tubo da 50 mL. Centrifuga a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Lavare ogni pellet con 10 mL di PBS ghiacciato e raccogliere le cellule con centrifugazione a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Risospendere il pellet in 3 mL di buffer di lisi cellulare contenente cocktail completo di acido proteasi senza ehylenediaminetra (EDTA). Incubare per 30 min sul ghiaccio. Centrifugare il lisato a 20.000 x g e 4 gradi centigradi per 20 min.
- Aggiungere 100 lofan di perline magnetiche anti-FLAG per piatto di cellule in un tubo da 1,5 mL.
- Lavare le perline magnetiche 2x con buffer K150 (50 m HePES a pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0.1% NP-40).
- Risospendere le perline magnetiche in 1 mL di tampone K150 ghiacciato.
- Incubare le perline magnetiche per 2 min a 4 gradi centigradi con una leggera rotazione e pellet le perline magnetiche con l'aiuto di un magnete. Rimuovere e scartare il super-natante.
- Aggiungere le perline magnetiche al supernnata di lisate cellulare dal passo 1.3.3 e incubare a 4 gradi centigradi per 2 h.
- Lavare la proteina legata perline magnetiche 3x con tampone K150, quindi 2x con K150 contenente 250 mM NaCl, quindi 3x con buffer K150 come 1.3.5.
- Risospendere le perline in 300 gradi l di tampone di eluizione FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerol), aggiungere il peptide FLAG ad una concentrazione finale di 0,5 g/l, e incubare con talloni su un rotatore a 4 gradi centigradi , quindi pellet le perline magnetiche con l'aiuto di un magnete.
- Raccogliere il supernatante che contiene le proteine MOV10 eluite, determinare la concentrazione e conservare a -80 gradi centigradi per un uso futuro.
- Esprimere temporaneamente le proteine MOV10 nelle cellule HEK293T coltivate.
2. Preparazione dell'acido nucleico
- Acquistare OLIgonucleotidi di DNA e RNA (oligos) con o senza etichette di biotina da una fonte adatta. Diluire ogni oligo in ddH senza RNaseda 2a 20 M e mantenerlo a -80 gradi centigradi per un uso futuro.
NOTA: Le sequenze di oligo dei substrati DNA/RNA utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella 2. - Preparare la seguente miscela per la reazione di annealing dell'RNA a doppio filamento (dsRNA) per il test di attività dell'elipo MOV10: mescolare 60 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N-ethane-sulfonico acido (HEPES) a pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 e RNase-free ddH2 O in un volume di reazione finale di 20 l.
- Anneal RNA oligos to forma RNA duplex riscaldando una miscela del filamento superiore con etichettatura biotina (2 m, concentrazione finale) e una 5 volte del suo filamento inferiore complementare senza etichettatura nel buffer di annessione (passaggio 2.2) a 95 gradi centigradi per 5 min, e poi lentamente raffreddarlo in camera temperatura (RT).
3. Saggi biochimici in vitro
- Reazioni EMSA ed enzimatiche
- Per il saggio MEIOB EMSA, mix 50 mM Tris HCl al pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% NP-40, 0.8 mM (o altre concentrazioni rilevanti come mostrato nella Figura 2 e Figura 3 ) proteina MEIOB e 10 nM oligonucleotidi etichettati biotina e ddH2O in un volume di reazione finale di 20 l. Incubare a RT per 30 min, e aggiungere 5x stop buffer (125 mM EDTA, 50% glicerolo) per fermare la reazione.
- Impostare le reazioni di attività di nucleato MEIOB come descritto al passaggio 3.1.1, ma senza l'aggiunta di 10 mEdTA.
- Per il test dell'attività della neo-eliata MOV10, mescolare 50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 inibitore U/L RNase, 10 nM substrato di RNA con etichetta biotina, 2 mM di triposina di adenosina (ATP), 100 nM RNA trap, e 20 ng di proteine MOV10 e ddH >2O in un volume di reazione finale di 20 .L. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi centigradi per 10 min, 30 min e 60 min. Aggiungere il buffer di stop 5x per fermare la reazione.
NOTA: Trappola di RNA, un oligo senza etichetta biotina con sequenza, complementarità all'oligo etichettato, che impedisce al dsRNA non avvolto di annealing di nuovo.
- Gel di poliacrilammide
- Lavare le piastre di gel (16 cm x 16 cm) e i pettini da 1,5 mm. Assemblare le unità di elettroforesi gel.
- Per preparare un gel di poliacrilammide nativo al 10%, mescolare 14 mL di ddH2O, 1,25 mL di 10x Tris-boric acid-EDTA (TBE), 8,3 mL di 30% acrilammide, 1,25 mL del 50% glicerol, 187,5 : L del 10% di ammonio appena preparato persulfato (APS) e 12,5 l di tetrametileleleneamina (TEMED).
- Per preparare un gel di poliacrilammide nativo del 20%, mescolare 5,5 mL di ddH2O, 1,25 mL di 10x TBE, 1,25 mL del 50% di glicerolo, 16,7 mL del 30% di acrilammide, 187,5 di 10% APS e 12,5 l di TEMED.
- Versare immediatamente la soluzione di acrilammide al gel e inserire il pettine. Lasciare il composto polimerizzare per circa 30 min.
- Gel in esecuzione
- Rimuovere il pettine, riempire i serbatoi con il tampone di funzionamento elettroforesi (0.5x TBE).
- Risciacquare i pozzetti con buffer TBE 0,5x, quindi pre-eseguire il gel a 100 V sul ghiaccio per 30 min. Sostituire il buffer in esecuzione con fresco 0.5x TBE.
- Caricare in ogni pozzo 20-25 campioni.
- Utilizzare un gel acrilamide nativo 10% per il saggio EMSA e un gel acrilammide nativo del 20% per i saggi ezimatici. Eseguire l'elettroforesi a 100 V sul bagno di ghiaccio fino a quando il marcatore blu bromofenolo è migrato al quarto inferiore del gel.
- Smontare le piastre di gel, tagliare il gel rimuovendo i pozzi di carico e le corsie inutilizzate. Posizionare il gel nel buffer TBE 0,5x.
- Tagliare la carta da filtro e la membrana in nylon alle dimensioni del gel. Pre-bagnato la carta da filtro pulita e la membrana in nylon.
- Assemblare lo stack per il trasferimento.
- Posizionare la membrana pre-bagnata sulla carta da filtro pre-bagnato.
- Posizionare il gel sulla membrana.
- Coprire il gel con un altro strato di carta da filtro pre-bagnato.
- Rimuovere tutte le bolle d'aria rotolando una pipetta pulita dal centro al bordo.
- Trasferire i campioni dal gel alla membrana in un apparato elettroforetico semi-secco a 90 mA per 20 min.
- Interrompere il trasferimento, quindi asciugare la membrana su una nuova carta da filtro per 1 min.
- Collegare i campioni irradiando la membrana a 120 mJ/cm2 per 45-60 s in un paraspito UV-luce dotato di lampadine da 254 nm (funzione crosslink automatico). Asciugare ad aria la membrana a RT per 30 min.
- Rilevamento della chemiluminescenza
- Protocollo 1: Utilizzare un volume standard di kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente commerciale.
- Aggiungere 20 mL di buffer di blocco alla membrana e incubare per 15-30 min con agitazione delicata su un rotatore a 20-25 giri.
- Preparare la soluzione di tampone coniugato/bloccante aggiungendo un coniugato/blocco di tamponamento a 20 mL di buffer di blocco stabilizzato a 20 mL.
- Rimuovere delicatamente il buffer di blocco e sostituirlo con coniugato/buffer di blocco. Incubare per 15 min su un rotatore a 20-25 rpm.
- Lavare la membrana 4x con agitazione a 40-45 giri/m per 5 min ciascuno.
- Aggiungere 30 mL di cuscinetto di equilibratore del substrato alla membrana. Incubare la membrana per 5 min con agitazione a 20-25 rpm.
- Preparare la soluzione di lavoro del substrato aggiungendo 6 mL di soluzione luminol/enhancer a 6 mL di soluzione stabile perossido. Evitare la luce.
- Coprire l'intera superficie della membrana con la soluzione di lavoro del substrato e incubare per 5 min.
- Scansiona la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per 1-3 s.
- Protocollo 2: Utilizzare 2 volte il kit di rilevazione dell'acido nucleico nucleico commerciale diluito 2x e seguire i passaggi 3.10.1.1-3.10.1.8.
- Protocollo 3: Utilizzare reagenti self-made6.
- Preparare il buffer di blocco: mix 0.1 M Tris-HCl a pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 mM MgCl2e 3% di album del siero bovino Fraction V. AP 7.5 buffer: mix 0.1 M Tris-HCl a pH 7.5, 0.1 M NaCl e 2 mM MgCl2. Buffer AP 9.5: mix 0,1 M Tris-HCl a pH 9,5, 0,1 M NaCl e 50 mM MgCl2. TE buffer: mix 10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 1 mM EDTA a pH 8.0.
- Immergere la membrana nel buffer di blocco a 30 gradi centigradi per 1 h.
- Aggiungete 8,5 l di fosfofosate streptavidina alcalina a 10 mL di Buffer AP 7.5. Agitare delicatamente la membrana in questa soluzione a RT per 10 min. Quindi, lavare la membrana 2x in 15 mL di tampone AP 7.5 per 10 min.
- Lavare la membrana ancora una volta in 20 mL di buffer AP 9.5 per 10 min. Aggiungere 20 mL di buffer TE per arrestare la reazione.
- Aggiungere 7,5 mL di soluzione di sviluppo sulla membrana e scansionare la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per 1-3 s.
- Protocollo 1: Utilizzare un volume standard di kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente commerciale.
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Representative Results
La struttura proteica di MEIOB e i costrutti di espressione utilizzati in questo studio sono illustrati nella Figura 1A. Le pieghe OB in MEIOB sono strutture compatte simili a botte in grado di riconoscere e interagire con gli acidi nucleici a filamento singolo. Uno dei domini OB (aa 136-307, costrutto A) lega il DNA a singolo filamento (ssDNA), la proteina troncata (troncamento aa 136-178, costrutto C) e la forma mutante a punti (R235A, costrutto E) di MEIOB non hanno attività di legame del DNA26. Le proteine di fusione GST-MEIOB erano sovraespresse nei batteri BL21, con successive fasi di isolamento con conseguente proteine purificate mostrate dalla colorazione blu Coomassie e dall'analisi delle macchie occidentali (Figura 1B). I substrati dell'acido nucleico a diverse concentrazioni illustrano l'elevata sensibilità del segnale di biotina, con un segnale rilevabile di 1 oligo nM dopo un tempo di esposizione relativamente breve per 1-3 s (Figura 2A). La proteina MEIOB-A di tipo selvatico, ma non le proteine mutanti MEIOB-E e MEIOB-C, si legano fortemente ai substrati ssDNA con etichettatura biotina a 36 nt (la stessa lunghezza e sequenza utilizzata in precedenza26) (Figura 2B) e scale (Figura 2C).
L'analisi in vitro delle proteine MEIOB con oligoRNA della stessa sequenza dei substrati ssDNA utilizzati nella Figura 2B,C illustra la capacità di legame e l'attività di esonucaleatura di MEIOB su RNA a filamento singolo 36 nt (ssRNA) (Figura 3A,B ). L'attività di legame del MEIOB con DNA e RNA è stata ulteriormente analizzata quantitativamente (Figura3C). Inoltre, le proteine MOV10 con etichettatura FLAG sono state purificate dalle cellule HEK293T (Figura 4A). Per misurare l'attività di elicasi di MOV10, è stato progettato un RNA duplex (stessa lunghezza ma sequenza diversa da quella usata in precedenza16) recante una sporgenza di 18 nt 5' (Figura 4B). Quando l'RNA duplex etichettato in biotina è stato incubato con MOV10 in presenza di ATP, una banda inferiore corrispondente all'RNA con etichettatura biotina a filamento singolo è apparsa con un tempo crescente, riflettendo la funzione del MOV10 come elicasi di RNA. Infine, per ridurre i costi, si è cercato di ottimizzare l'utilizzo di reagenti per il rilevamento della chemiluminescenza dell'etichetta biotina. Si è scoperto che una diluizione duplice del kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente non ha influenzato negativamente la sensibilità cromagenica del sistema biotina-streptavidina e, in modo eccitante, i reagenti autoprodotti hanno funzionato quasi altrettanto bene (Figura5 ).
Figura 1 : Purificazione di proteine MEIOB. (A) Rappresentazione schematica dei costrutti MEIOB utilizzati nel presente studio26. MEIOB contiene un dominio OB. Tutti i costrutti MEIOB (A, C, E) sono stati espressi come proteine di fusione GST. (B) Colorazione blu Coomassie e analisi delle macchie occidentali delle proteine MEIOB purificate utilizzando il sistema GST-batteri. Le frecce rosse indicano le posizioni delle proteine MEIOB purificate. Le bande di circa 26 KDa corrispondono a glutathione. Per la macchia occidentale, l'anticorpo anti-GST è stato utilizzato con diluizione 1:6000. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : In vitro dei saggi delle interazioni MEIOB-ssDNA . (A) Test di resistenza del segnale di diverse concentrazioni di ssDNA con etichetta biotina a 36 nt. (B) Risultato del legame della proteina MEIOB ai substrati di DNA con etichetta fine biotina 5' (10% di gel nativo). (C) Scissione mediata da MEIOB di substrati di DNA con etichetta fine biotina 5' (20% gel nativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi in vitro delle interazioni MEIOB-ssRNA. (A) Risultato del legame della proteina MEIOB ai substrati di RNA con etichetta finale di biotina 5' (10% gel nativo). (B) Scissione mediata da MEIOB di substrati RNA con etichetta fine biotina 5' (20% gel nativo). (C) Grafico della percentuale di concentrazione di DNA/RNA rispetto a MEIOB-A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : proteina MOV10 purificata e rilassamento di dsRNA a coda 5' in vitro. (A) Colorazione blu Coomassie della proteina MOV10 purificata con il sistema FLAG-HEK293T. Le frecce rosse indicano le posizioni della proteina MOV10 purificata. Le bande sul gel Coomassie con un peso molecolare di circa 55 kDa corrispondono alla catena di immunoglobuline pesante (IgG) dall'anticorpo FLAG. (B) MOV10 si srotola d'idER a coda 5' con un tempo di crescita (10, 30, 60 min) a 37 gradi centigradi. SsRNA - 18 nt RNA a filamento singolo, dsRNA 54 nt a doppio filamento con una coda da 18 nt 5' (20% di gel nativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Alternativa metodi di usando la biotina cromogenico reagente s sul saggio MEIOB. Volume standard commerciale: istruito da kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente; 2x volume commerciale diluito: diluizione bidimensionale di ogni tampone in kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente, reagenti autoprodotti: vedi i dettagli al passo 3.7.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: I primer utilizzati per amplificare il gene frammenti di Meiob e Mov10. Le lettere in grassetto in primer in avanti e indietro sono siti di taglio BamHI e NotI; le lettere in grassetto corsivo in un primer inverso sono siti di taglio XhoI; le lettere in grassetto in casella indicano i nucleotidi corrispondenti alla mutazione punto R235A.
Tabella 2: Sequenze di substrati DNA/RNA utilizzate in questo lavoro.
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Discussion
Lo studio delle interazioni tra proteine e acidi nucleici è fondamentale per la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di diversi processi biologici. Ad esempio, MEIOB è una proteina specifica per i testicoli essenziale per la meiosi e la fertilità nei mammiferi25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB che si lega al DNA a filamento singolo e presenta da 3' a 5' attività esonuclease26, che si riferisce direttamente alla sua rilevanza fisiologica durante la ricombinazione meiotica. Come altro esempio, MOV10 è un elicasi di RNA con funzione onnipresente che può associarsi a strutture secondarie dell'RNA16. Di conseguenza, MOV10 mostra ampie proprietà di legame dell'RNA e 16 attività di rimozione duplex di RNA da 5' a 3'. Gli studi che riportano le suddette attività biochimiche di queste proteine si basavano sull'uso di isotopo 32P per etichettare gli acidi nucleici per i test in vitro. Nel presente studio, abbiamo stabilito protocolli per una serie di esperimenti in vitro etichettati con biotina delle funzioni MEIOB e MOV10. Questi protocolli iniziano con la preparazione di proteine attive e terminano con l'imaging di segnali di biotina.
In particolare, in linea con gli studi precedenti25,26, proteine MEIOB sono stati sovraespressi in batteri con e la purificazione ha prodotto una singola fascia con forte segnale di colorazione Coomassie dopo l'elettroforesi gel. Tuttavia, la purificazione della proteina MOV10 a lunghezza intera era più efficace quando sovraespressa come proteina FLAG-tag-fused nelle cellule HEK293T rispetto a una proteina GST-fused nei batteri (dati non mostrati). Per ottenere quantità sufficienti di proteine a una purezza adeguata per le reazioni successive, questi due sistemi di purificazione delle proteine devono essere confrontati per determinare il metodo più adatto per proteine con diverse dimensioni e/o proprietà. Gli acidi nucleici sono stati poi etichettati utilizzando la biotina invece di 32P come substrato e hanno ottenuto un segnale robusto quando si esamina l'affinità di legame dell'acido nucleico o le attività di elaborazione dell'acido nucleico di entrambe le proteine. Tuttavia, poiché le proteine purificate dai batteri sono spesso contaminate da RNase, è difficile escludere la possibilità che l'attività di scissione osservata durante la reazione in vitro possa in parte derivare dalla contaminazione di RNase. I saggi in vitro con mutanti MEIOB con ridotta attività catalitica (troncato e mutante a punti) hanno mostrato una sostanziale compromissione dell'elaborazione del substrato di RNA, ma la possibile contaminazione da RNase non può essere esclusa. I risultati ottenuti con ciascuno dei costrutti MEIOB che agiscono su ssDNA e MOV10 srotolamento dsRNA sono simili a quelli ottenuti nello studio precedente16,26. Tuttavia, MEIOB elabora il DNA per generare uno striscio, mentre una banda più discreta è vista con RNA secondo i risultati sperimentali (Figura 2C e Figura 3B). Forse, MEIOB ha capacità di legame differenziale al substrato di DNA e RNA (Figura 2B, Figura 3A,C), che porta alla differenza nei loro prodotti di scissione. Può anche essere possibile che MEIOB fenda DNA e RNA in modo distinto. Il ruolo esatto del MEIOB nella lavorazione dell'RNA rimane da studiare ulteriormente (ad esempio, utilizzando la proteina MEIOB fusa da tag FLAG espressa nelle cellule HEK293T).
Le sonde di acido nucleico etichettate con biotina sono vantaggiose rispetto a 32 sonde con etichetta P in quanto non richiedono una protezione specifica e lo smaltimento dei rifiuti. In secondo luogo, le sonde con etichetta biotina possono essere conservate stabilmente per almeno 1 anno a -20 gradi centigradi, mentre 32sonde con etichetta P durano solo 2 settimane. Pertanto, lo stesso lotto di acidi nucleici etichettati in biotina può essere utilizzato per un lungo periodo di tempo, mantenendo la riproducibilità degli esperimenti. Infine, l'autoradiografia rapida delle sonde radioattive può dipendere da strumenti costosi come lo schermo del fosforo. Al contrario, tutti i saggi con etichettatura biotina qui descritti possono essere eseguiti entro un giorno e non richiedono attrezzature speciali. Gli inconvenienti dell'etichettatura della biotina comprendono principalmente ulteriori passaggi sperimentali, tra cui il trasferimento di gel e la chemiluminescenza che sono necessari per rilevare i substrati con etichetta di biotina, ma possono inoltre richiedere ottimizzazione o risoluzione dei problemi. Un'altra debolezza generale è la sensibilità relativamente bassa dell'etichettatura biotina rispetto a quella dell'etichettatura radioisotopa. In questi saggi, tuttavia, è stata ottenuta un rilevamento ben visibile di concentrazione molto bassa di acidi nucleici (Figura 2A).
Inoltre, l'apparato di trasferimento del gel semi-secco è adatto per il trasferimento di gel più lunghi del normale alle membrane. Rispetto al trasferimento bagnato, il trasferimento semi-secco è più veloce soprattutto per gli acidi nucleici e produce un segnale di fondo basso. Inoltre, i costi della reazione cromogenica del sistema biotina-streptavidinsono sono stati ridotti diluindo i reagenti commerciali o facendo il nostro, entrambi i quali hanno ottenuto segnali simili. La sensibilità di rilevamento dei reagenti autoprodotti può non sembrare così elevata, anche se sufficiente nel presente punto (Figura 5C), ma può essere migliorata estendendo il tempo di blocco (dati non pubblicati). Inoltre, i segnali possono essere migliorati con una maggiore concentrazione della sonda dell'acido nucleico utilizzata per i saggi. Date le prove sperimentali di cui sopra, l'etichetta biotina può essere un sostituto vantaggioso per 32P in più analisi biochimiche in vitro.
Collettivamente, questo protocollo offre una piattaforma con etichettatura biotina per lo studio delle interazioni proteina-nucleiche dell'acido che si dimostra robusta, affidabile, efficiente e conveniente.
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Disclosures
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo P. Jeremy Wang (Università della Pennsylvania) per modifiche e discussioni utili. Ringraziamo anche Sigrid Eckardt per l'editing linguistico. È stato sostenuto dal Programma nazionale di Ricerca e Sviluppo della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) e dalla National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) e dal Programma Innovativo e Imprenditoriale della Provincia di Jiangsu. J. N. è stato supportato dal progetto di scienza e tecnologia medica di zhejiang (2019KY499). M. L. è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31771588) e del 1000 Youth Talent Plan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
References
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