Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

In vitro biokemiske assays ved hjælp af biotin etiketter til at studere Protein-nukleinsyre interaktioner

doi: 10.3791/59830 Published: July 17, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er protokoller for in vitro biokemiske assays ved hjælp af biotin etiketter, der kan være almindeligt anvendelig til at studere Protein-nukleinsyre interaktioner.

Abstract

Protein-nukleinsyre interaktioner spiller vigtige roller i biologiske processer såsom transkription, rekombination, og RNA metabolisme. Eksperimentelle metoder til at studere Protein-nukleinsyre interaktioner kræver brug af fluorescerende Tags, radioaktive isotoper, eller andre etiketter til at opdage og analysere specifikke mål molekyler. Biotin, et ikke-radioaktivt nukleinsyre mærke, er almindeligt anvendt i elektroforetic Mobility Shift assays (EMSA), men har ikke været regelmæssigt ansat til at overvåge protein aktivitet under nukleinsyre processer. Denne protokol illustrerer nytten af biotin mærkning under in vitro enzymatiske reaktioner, viser, at dette mærke fungerer godt med en række forskellige biokemiske assays. Specifikt, i overensstemmelse med tidligere fund ved hjælp af radioisotop 32P-mærkede substrater, det bekræftes via biotin-mærket EMSA, at meiob (et protein specifikt involveret i den meiotiske rekombination) er et DNA-bindende protein, at MOV10 (en RNA helicase) løser biotin-mærkede RNA duplex strukturer, og at meiob spalter biotin-mærket enkeltstrenget DNA. Denne undersøgelse viser, at Biotin er i stand til at erstatte 32P i forskellige nukleinsyre-relaterede biokemiske assays in vitro.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protein-nukleinsyre interaktioner er involveret i mange essentielle cellulære processer såsom DNA reparation, replikation, transskription, RNA behandling, og oversættelse. Protein interaktioner med specifikke DNA-sekvenser inden for kromatin er nødvendige for den tætte kontrol af genekspression på transkriptional niveau1. Præcis posttranskriptional regulering af talrige kodning og Noncoding RNAs nødvendiggør omfattende og komplicerede interaktioner mellem ethvert protein og RNA2. Disse lag af genekspressions reguleringsmekanisme omfatter en kaskade af dynamiske intermolekylære hændelser, som koordineres af interaktioner mellem transskription/epigenetiske faktorer eller RNA-bindende proteiner med deres nukleinsyre-mål samt protein-protein interaktioner. For at dissekere om proteiner in vivo er direkte eller indirekte forbundet med nukleinsyrer, og hvordan sådanne sammenslutninger opstår og kulsyre, udføres in vitro biokemiske analyser for at undersøge den bindende affinitet eller enzymatiske aktivitet af proteiner af interesse på designede substrater af DNA og/eller RNA.

Mange teknikker er udviklet til at detektere og karakterisere nukleinsyre-protein komplekser, herunder elektroforetic Mobility Shift assay (EMSA), også kaldet gel retardering assay eller band Shift assay3,4,5 . EMSA er en alsidig og følsom biokemisk metode, der er almindeligt anvendt til at studere den direkte binding af proteiner med nukleinsyrer. EMSA er afhængig af gel-elektroforetisk skift i bands, som rutinemæssigt visualiseres ved hjælp af chemiluminescens til påvisning af biotin-etiketter6,7, fluorescens-etiketterne8,9eller ved autoradiography af radioaktive 32P etiketter10,11. Andre formål med biokemiske undersøgelser er identifikation og karakterisering af nukleinsyre-Processing aktivitet af proteiner, såsom nuklease-baserede reaktioner til vurdering af spaltning produkter fra nukleinsyre substrater12, 13 , 14 og DNA/RNA-struktur-afvikling af assays til evaluering af helicase-aktiviteter15,16,17.

I sådanne enzymatiske aktivitets analyser anvendes de radioaktive Tope-mærkede eller fluorophore-mærkede nukleinsyrer ofte som substrater på grund af deres høje følsomhed. Analyse af røntgenbilleder af enzymatiske reaktioner, der involverer 32P mærket aktive, er blevet fundet at være følsom og reproducerbar18. Men i et stigende antal laboratorier i verden er brugen af radioisotoper begrænset eller endog forbudt på grund af de sundhedsmæssige risici, der er forbundet med potentiel eksponering. Foruden biosikkerhedsmæssige betænkeligheder er andre ulemper det nødvendige udstyr til at udføre arbejde med radioisotoper, krævet radioaktiv licens, kort halveringstid på 32P (ca. 14 dage) og gradvis forringelse af sonde kvaliteten på grund af radiolyse. Der er således udviklet alternative ikke-isotopmetoder (dvs. mærkning af sonden med fluorophorer muliggør detektion ved fluorescerende billeddannelse19). Der er dog behov for et billedsystem med høj opløsning ved brug af fluorescently-mærkede proser. Biotin, en almindeligt anvendt etiket, binder let til biologiske makromolekyler såsom proteiner og nukleinsyrer. Biotin-streptavidin-systemet fungerer effektivt og forbedrer detekteringsfølsomheden uden at øge den ikke-specifikke baggrund20,21. Udover EMSA, biotin er meget udbredt til protein rensning og RNA pull-down, blandt andre22,23,24.

Denne protokol anvender med succes biotin-mærkede nukleinsyrer som substrater for in vitro biokemiske analyser, der omfatter EMSA, foruden enzymatiske reaktioner, hvor biotin ikke er almindeligt anvendt. Meiob OB domænet er konstrueret og to mutanter (trunkering og punkt mutation) udtrykkes som GST fusion proteiner25,26,27, samt mus MOV10 rekombinant flag fusion protein16. Denne rapport fremhæver effektiviteten af denne kombinerede protokol for protein rensning og biotin-mærkede assays til diverse eksperimentelle formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. protein præparat

  1. MEIOB-og MOV10-udtryks konstruktioner
    1. Generer cDNA-udtryks konstruktioner kodning af mus MEIOB-A, C og E (figur 1A) og MOV10.
      1. Indstil polymerase-Kædereaktionen (PCR) for hvert fragment. 1 μL mus cDNA blandes (fra C57BL/6 muse testis), 1 μL dNTP, 2 μL 10 μM fremad primer, 2 μL 10 μM omvendt primer, 1 μL DNA-Polymerase, 25 μL 2x PCR-buffer og 18 μL dobbeltdestilleret H2o (DDH2o) i en endelig volumen på 50 μL.
        Bemærk: primere til forstærkning af Meiob -og Mov10 -genfragmenter er anført i tabel 1.
      2. Udfør PCR-reaktioner ved hjælp af følgende programmer: 95 °c i 5 min, 35 cyklusser af opvarmning ved 95 °c i 15 s, udglødning ved 64 °c for 15 s, udvidelse ved 72 °c for 20 s (2 min for forlængelse fuld længde MOV10) og endelig udvidelse ved 68 °c i 7 min.
        Bemærk: Brug primer pair MEIOB-E (F1) og MEIOB-E-mut (R1) og MEIOB-E-mut (F2) og MEIOB-E (R2) til at forstærke to segmenter, der indeholder den mutante sekvens i en overlappende sekvens i henholdsvis 3 ' og 5 ' enderne, for at generere en mutant PCR-skabelon.
    2. Analysér det forstærkede PCR-DNA ved gelelektroforese, skær båndet af den påkrævede størrelse fra gelen hurtigt under en UV-lampe, og Placer den i et centrifugeglas.
      Bemærk: de forventede produktstørrelser synlige på agrose gel for MEIOB-A er 536 BP, MEIOB-C er 296 BP, MEIOB-E er 312 BP og 229 BP, og MOV10 er 3015 BP.
    3. Du renser PCR-DNA med et gel-ekstraktions udstyr efter producentens protokol.
      1. Tilsæt en tilsvarende mængde opløsende buffer i centrifugeglasset fra trin 1.1.2 og Smelt gel i et 50-55 °C vandbad i 5-10 min, hvilket sikrer, at gel-stykkerne smelter helt. Centrifuge kort for at indsamle eventuelle dråber fra væggen af røret.
        Bemærk: massen/volumenkoncentrationen af gelen og opløsnings bufferen er 1 mg/μL.
      2. Adsorptions søjlen placeres i opsamlingsrøret, overføres opløsningen indeholdende det opløste gel fragment til adsorptions søjlen, og centrifugeres ved 12.000 x g i 2 min.
      3. Filtratet i bunden af opsamlings rørene kasseres. Tilsæt 600 μL af vaskebufferen til søjlen, centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min., og filtratet kasseres.
      4. Gentag trin 1.1.3.3 én gang.
      5. Placer kolonnen tilbage i opsamlingsrøret, og centrifuger ved 12.000 x g i 2 min. for at fjerne alle de resterende vaskebuffer.
      6. Adsorptions søjlen placeres i et 1,5 mL steriliseret centrifugeglas, der tilsættes 50 μL ddH2O til midten af adsorptions søjlen og centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min. mål DNA-koncentrationen af eluatet ved hjælp af Spektrofotometer.
    4. Begrænsning fordøjelse af plasmider
      1. Digest pGEX-4T-1 vektor med BamHI og NotI. For at gøre dette blandes 4 μg pGEX-4T-1 vektor, 5 μL 10x Digest buffer, 1 μL BamHI og 1 μL NotI og ddH2O til en endelig reaktions volumen på 50 μl. Inkuber ved 37 °C i 2 timer.
      2. Fordøje pRK5 vektor med BamHI og XhoI ved at blande 4 μg pRK5 vektor, 5 μL 10x Digest buffer, 1 μL BamHI og 1 μL XhoI og ddH2O til en endelig reaktions volumen på 50 μl. Inkuber ved 37 °C i 2 timer.
    5. Analysér vektor-DNA ved hjælp af gel-elektroforese, skær den ønskede størrelsesgruppe fra gelen hurtigt med en skalpel under en UV-lampe, og Placer den i et centrifugeglas.
    6. Rens vektor-DNA med et gel ekstraktions udstyr som 1.1.3 efter producentens instruktion.
      Bemærk: længden af lineariseret Plasmids: pGEX-4T-1, 4,4 KB; pRK5, 4,7 KB.
    7. Der blev oprettet en standard rekombinant ligations reaktion ved at kombinere 0,03 pmol af lineariseret vektor, 0,06 pmol af cDNA-fragment, 2 μL ubiquitinligase og 4 μL 5x-ligasebuffer og ddH2O i en endelig reaktions volumen på 10 μl.
      Bemærk: klon MEIOB-A, C og E i en pGEX-4T-1 vektor og MOV10 ind i en pRK5 vektor.
    8. Blandingen inkubates ved 37 °C i 30 minutter, hvorefter reaktionen straks afkøles i 5 minutter på is. Omdanne meiob rekombinant plasmider til BL21 bakterier og MOV10 rekombinant plasmider i DH5α bakterier.
      Bemærk: Bekræft alle rekombinante konstruktioner af sanger sekvensering.
    9. Forbered glycerol lagre af bakterielle kulturer, der indeholder verificeret rekombinant plasmider ved at tilføje et tilsvarende volumen på 50% glycerol til flydende kulturer, og opbevar ved-80 °C.
      Bemærk: for hvert efterfølgende eksperiment, stribe bakterier fra glycerol bestande på en frisk agar plade og bruge en enkelt koloni for ekspansion som beskrevet i trin 1,2.
  2. MEIOB proteinekstrakter fra bakterier
    1. Vælg en koloni af hver BL21 stamme transficeret med den tomme eller rekombinante pgex-4T-1 plasmid verificeret ved sekvensering og inokulere i 3 ml lb indeholder 100 μg/ml ampicillin. Vokse natten over ved 37 °C med omrystning ved 220 rpm.
    2. Inoculate 300 mL LB indeholdende 100 μg/mL ampicillin fra 3 mL overnight kultur (fra trin 1.2.1). Dyrke kulturer med omrystning ved 37 °C for 2 h indtil OD600 når 0,5-1,0.
    3. Inducerer protein ekspression ved at tilsætte isopropyl beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) til en endelig koncentration på 0,2 mM. Inkuber kulturerne i yderligere 3 timer med omrystning ved 180 rpm og 18 °C.
    4. Den bakterielle kultur centrifugeres ved 3.500 x g og 4 °c i 20 minutter.
    5. Resuspension af pellet i 20 mL iskoldt Dulbecco's fosfatbuffer i saltopløsning (DPBS). Sonikere den bakterielle suspension på is i 25 cyklusser i korte 10 s brister (udgangseffekt 20%) efterfulgt af 2-3 s hvilende på is.
    6. Der centrifugeres lysbilledet ved 12.000 x g og 4 °c i 15 min. Overfør hele supernatanten til et friskt rør.
    7. Forvask perler.
      1. Tilsæt 300 μL glutathion-sepharose perler til et frisk 15 mL rør og vask perlerne med 10 mL iskold PBS buffer.
      2. Centrifugeres ved 750 x g og 4 °c i 1 min for at pille perlerne og kassere Vaskeopløsningen.
    8. Tilsæt lysatet til de vaskede perler og Inkuber ved 4 °C i 2 timer. centrifuge ved 750 x g og 4 °c i 1 min til pellet perlerne. Skyl perlerne i 10 mL iskold PBS 8x.
    9. Elute perlerne med 1 mL af elueringsbufferen (10 mM glutathion i 50 mM Tris-HCl ved pH 8,0) 6x, inkuberet ved 4 °C i 10 minutter før hvert elueringstrin. Centrifugeres ved 750 x g og 4 °C i 1 min. for at pille perlerne. Saml og pulje de 6 fraktioner.
    10. De eluede proteiner overføres til et centrifugal filter og koncentreres ved centrifugering ved 7.500 x g for at opnå et endeligt volumen på 100-200 μl.
  3. MOV10 proteinekstrakter fra HEK293T celler
    1. Transitivt udtrykker de MOV10 proteiner i dyrkede HEK293T celler.
      1. Forbered MOV10-pRK5 plasmid ved en koncentration > 500 ng/μL.
      2. Seed HEK293T celler i 15 cm retter. Når celletætheden når ~ 70%-90%, skal cellekultur mediet udskiftes med frisk Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin.
      3. For en transfektering fortyndes 60 μg MOV10-pRK5 plasmid DNA i 3 ml af det reducerede serum medium, tilsæt derefter 120 μl af transfektering forstærker reagens, og bland godt.
      4. I et separat rør fortyndes 90 μl af transfektering reagens med 3 ml reduceret serum medium (uden penicillin-streptomycin) og blandes godt.
      5. Tilsæt det fortyndede DNA til hvert rør af fortyndet transfektering reagens. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
      6. Tilsæt transfektering blandingen til cellekulturen, og kultur cellerne for ~ 36-48 h.
    2. Efter 36-48 h, indsamle celler fra hver plade i en 50 mL rør. Centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °c. Hver pille vaskes med 10 mL iskold PBS, og cellerne opsamles ved centrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °c.
    3. Der opslæmmes pellet i 3 mL cellelyse buffer indeholdende komplet ehylendiametetraeddikesyre (EDTA)-fri proteasehæmmer cocktail. Inkuber i 30 min på is. Du centrifugeres lysbilledet ved 20.000 x g og 4 °c i 20 minutter.
    4. Tilsæt 100 μL anti-FLAG magnetiske perler pr. skål af celler i et 1,5 mL rør.
    5. Vask de magnetiske perler 2x med K150 buffer (50 mM HEPES ved pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. De magnetiske perler opslæmmes i 1 mL iskold K150 buffer.
      2. De magnetiske perler inkubates i 2 min ved 4 °C med blid rotation og pellet de magnetiske perler ved hjælp af en magnet. Fjern og kassér supernatanten.
    6. Tilsæt de magnetiske perler til celle lysatet supernatanten fra trin 1.3.3 og Inkuber ved 4 °C i 2 timer.
    7. Vask proteinbundne magnetiske perler 3x med K150 buffer, derefter 2x med K150 indeholdende 250 mM NaCl, derefter 3x med K150 buffer som 1.3.5.
    8. Resuspendere perlerne i 300 μL af FLAG elueringsbuffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl ved pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glycerol), tilsæt flag peptid til en endelig koncentration på 0,5 μg/μl, og Inkubér med perler på en rotator ved 4 °c i 1 time , så pellet de magnetiske perler ved hjælp af en magnet.
    9. Supernatanten opsamles, som indeholder de eluede MOV10 proteiner, bestemmer koncentrationen og opbevares ved-80 °C til fremtidig brug.

2. fremstilling af nukleinsyre

  1. Købe DNA og RNA-oligonukleotider (oligoer) med eller uden biotinetiketter fra en egnet kilde. Hvert oligo fortyndes i RNase-fri ddH2O til 20 μM og opbevares ved-80 °c til fremtidig brug.
    Bemærk: oligo-sekvenser af DNA/RNA-substrater, der anvendes i dette studie, er opført i tabel 2.
  2. Forbered følgende blanding til den dobbeltstrengede RNA (dsRNA) udglødning-reaktion for MOV10-helicase-aktivitetsanalyse: Bland 60 mm N-2-hydroxyethylpiperazin-n-Ethan-sulfonsyre (Hepes) ved pH 7,5, 6 mm KCl, 0,2 mm mgcl2 og RNase-fri DDH2 O i en endelig reaktions volumen på 20 μl.
  3. Anneal RNA oligonukleotider til dannelse af RNA duplex ved opvarmning af en blanding af biotin-mærket top strand (2 μM, endelig koncentration) og en 1,5-fold af sin ikke-mærkede komplementære bund streng i udglødning buffer (trin 2,2) ved 95 °c i 5 min, og derefter langsomt afkøles til rum temperatur (RT).

3. in vitro biokemiske assays

  1. EMSA og enzymatiske reaktioner
    1. For meiob EMSA-analysen blandes 50 mm Tris HCL ved pH 7,5, 2 mm mgcl2, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 2 mm ditiotreitol (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mm (eller andre relevante koncentrationer som vist i figur 2 og figur 3) meiob-protein og 10 nm med biotin-mærkede oligonukleotider og ddH2O i en endelig reaktions volumen på 20 μl. Inkuber ved RT i 30 min, og tilsæt 5x stop buffer (125 mM EDTA, 50% glycerol) for at stoppe reaktionen.
    2. Indstil MEIOB nucleaseaktivitets reaktioner som beskrevet i trin 3.1.1, men uden tilsætning af 10 mM EDTA.
    3. Til MOV10-analyse af helicase-aktiviteten Bland 50 mM Tris-HCl ved pH 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mm DTT, 2 U/ΜL rnasehæmmer, 10 nm biotin-mærket RNA-substrat, 2 mm adenosintrifosfat (ATP), 100 nm RNA-fælde og 20 ng af MOV10 protein og DDH < C6 > 2O i en endelig reaktions volumen på 20 μl. Reaktionsblandingen inkubates ved 37 °C i 10 min, 30 min og 60 min. Tilsæt 5x stop bufferen for at standse reaktionen.
      Bemærk: RNA Trap, en biotin-umærkede oligo med sekvens, komplementaritet til den mærkede oligo, som forhindrer usåret dsRNA fra udglødning igen.
  2. Polyacrylamid geler
    1. Gelpladerne vaskes (16 cm x 16 cm) og 1,5 mm kamme. Saml gelelektroforese enhederne.
    2. For at tilberede en 10% Native polyacrylamid gel blandes 14 mL ddH2O, 1,25 ml 10X Tris-BORSYRE-EDTA (TBE), 8,3 ml af 30% acrylamid, 1,25 ml 50% glycerol, 187,5 μl af 10% frisk tilberedt ammonium PERSULFAT (APS) og 12,5 μl tetramethylethylenediamin (TEMED).
    3. For at tilberede en 20% Native polyacrylamid gel blandes 5,5 mL ddH2O, 1,25 ml 10X TBE, 1,25 ml 50% glycerol, 16,7 ml af 30% acrylamid, 187,5 μl 10% APS og 12,5 ΜL af TEMED.
    4. Hæld acrylamid opløsningen straks på gelen og Indsæt kammen. Lad blandingen polymerisere i ca. 30 min.
  3. Gel, der løber
    1. Fjern kammen, fyld tankene med elektroforese-løbe bufferen (0,5 x TBE).
    2. Skyl prøve brøndene med 0,5 x TBE-buffer, og før derefter gelen på 100 V på is i 30 min. Udskift løbe bufferen med en frisk 0,5 x TBE.
    3. Læg 20-25 μL prøver i hver brønd.
    4. Brug en 10% Native acrylamid-gel til EMSA-analysen og en 20% Native acrylamid-gel til de enzymatiske analyser. Kør elektroforese på 100 V på isbadet, indtil bromphenolblåt blå markør er migreret til den nederste fjerdedel af gelen.
  4. Skil gelpladerne ad, trim gelen ved at fjerne læsse brønde og ubrugte baner. Læg gelen i 0,5 x TBE-buffer.
  5. Skær filter papiret og nylon membranen til gelens størrelse. Forvåd det rene filterpapir og nylon membranen.
  6. Saml stakken til overførsel.
    1. Anbring den præ-våde membran på det præ-våde filtrerpapir.
    2. Placer gelen på membranen.
    3. Dæk gelen med et andet lag præ-vådt filtrerpapir.
    4. Fjern alle luftbobler ved at rulle en ren pipette fra centrum til kant.
  7. Prøverne overføres fra gelen til membranen i et semi-tørt elektroforetisk apparat ved 90 mA i 20 min.
  8. Stop overførslen, og tør derefter membranen på et nyt filtrerpapir i 1 min.
  9. Link prøverne ved at bestråling membranen ved 120 MJ/cm2 for 45-60 s i en UV-lys krydsbinderens udstyret med 254 nm pærer (AutoLink funktion). Luft tør membranen ved RT i 30 min.
  10. Påvisning af chemiluminescens
    1. Protokol 1: Brug et standard volumen af kommercielt kemiluminescerende nukleinsyre detektionssæt.
      1. Der tilsættes 20 mL blokerende buffer til membranen og Inkuber i 15-30 min med blid rystning på en rotator ved 20-25 rpm.
      2. Forbered konjugat/blokerende bufferopløsning ved tilsætning af 66,7 μL stabiliseret streptavidin-peberrod-peroxidase-konjugat til 20 mL blokerende buffer.
      3. Fjern forsigtigt blokerings bufferen, og Udskift den med konjugat/blokerende buffer. Inkubér i 15 min på en rotator ved 20-25 rpm.
      4. Vask membranen 4X med omrystning ved 40-45 rpm i 5 minutter hver.
      5. Tilsæt 30 mL substrat-ækvibrationbuffer til membranen. Inkuber membranen i 5 minutter med omrystning ved 20-25 rpm.
      6. Forbered substrat arbejdsopløsning ved at tilsætte 6 mL luminol/Enhancer-opløsning til 6 mL stabil peroxid opløsning. Undgå lys.
      7. Dække hele overfladen af membranen med substrat arbejdsopløsning og inkubere i 5 min.
      8. Scan membranen i et kemiluminescerende billedbehandlingssystem til 1-3 s.
    2. Protokol 2: Brug 2x fortyndet kommerciel kemiluminescens nukleinsyre detection kit og følg trinene 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. Protokol 3: Brug selv lavede reagenser6.
      1. Forbered blokerende buffer: mix 0,1 M Tris-HCl ved pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2og 3% kvægserum albumin fraktion V. AP 7,5 buffer: mix 0,1 m Tris-HCL ved pH 7,5, 0,1 m NaCl og 2 mm mgcl2. AP 9,5 buffer: mix 0,1 M Tris-HCl ved pH 9,5, 0,1 M NaCl og 50 mM MgCl2. TE buffer: Bland 10 mM Tris-HCl ved pH 8,0, 1 mM EDTA ved pH 8,0.
      2. Opsug membranen i blokerende buffer ved 30 °C i 1 time.
      3. Tilsæt 8,5 μL streptavidin alkalisk fosfatase til 10 mL AP 7,5 buffer. Ryst membranen forsigtigt i denne opløsning ved RT i 10 min. Derefter vaskes membranen 2x i 15 mL AP 7,5 buffer i 10 min.
      4. Membranen vaskes en gang mere i 20 mL AP 9,5 buffer i 10 min. Tilsæt 20 mL TE-buffer for at standse reaktionen.
      5. Tilsæt 7,5 mL udviklingsopløsning på membranen, og Scan membranen i et kemiluminescerende billedbehandlingssystem for 1-3 s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Proteinstrukturen i MEIOB og de udtryks konstruktioner, der anvendes i dette studie, er illustreret i figur 1A. OB folder i MEIOB er kompakte tønde-lignende strukturer, der kan genkende og interagere med enkelt-strandede nukleinsyre syrer. Et af OB-domænerne (AA 136-307, Construct A) binder enkeltstrenget DNA (ssDNA), det afkortede protein (AA 136-178 trunkationer, konstruere C) og den punkt mutant form (R235A mutation, konstruere E) af MEIOB har ikke DNA-bindende aktivitet26. GST-MEIOB-fusions proteinerne blev overudtrykt i BL21 bakterier med efterfølgende isolations trin, hvilket resulterede i rensede proteiner påvist ved Coomassie Blue-farvning og Western blot-analyse (figur 1B). Nukleinsyre substrater ved forskellige koncentrationer illustrerer biotinsignalets høje følsomhed med et detekterbart signal på 1 nM oligo efter en relativ kort eksponeringstid for 1-3 s (figur 2a). Den vilde type MEIOB-et protein, men ikke de mutante MEIOB-E og MEIOB-C proteiner, binder kraftigt til 36 NT biotin-mærkede ssDNA-substrater (samme længde og sekvens som tidligere anvendt26) (figur 2B) og kløver substrater til stiger (figur 2C).

In vitro-analysen af MEIOB-proteiner med RNA-oligoer af samme sekvens som de ssDNA-substrater, der anvendes i figur 2B, C, illustrerer den bindende kapacitet og exonucleaseaktiviteten af meiob på 36 NT enkeltstrenget RNA (ssrna) (figur 3A, B ). Den bindende aktivitet af MEIOB med DNA og RNA blev yderligere kvantitativt analyseret (figur 3C). Desuden blev FLAG-mærkede MOV10 proteiner renset fra HEK293T celler (figur 4A). For at måle helicase aktiviteten af MOV10, blev et duplex RNA designet (samme længde, men forskellig sekvens end brugt tidligere16) forsynet med en 18 NT 5 ' overhæng (figur 4B). Når den biotin-mærkede RNA duplex blev inkuberet med MOV10 i nærværelse af ATP, et lavere bånd svarende til den frigivne enkelt-strandede biotin-mærket RNA dukkede op med stigende tid, reflekterende af MOV10's funktion som en RNA helicase. Endelig blev det forsøgt at optimere brugen af reagenser til kemiluminescens påvisning af biotin-etiketten for at reducere omkostningerne. Det blev konstateret, at en dobbelt fortynding af kemiluminescerende nukleinsyre detektionskit ikke påvirkede den kromogene følsomhed af biotin-streptavidin-systemet negativt, og ophidsende, virkede de selv skabte reagenser næsten lige godt (figur 5 ).

Figure 1
Figur 1 : Rensning af Meiob-proteiner. A) skematisk gengivelse af de meiob-konstruktioner, der blev anvendt i dette studie26. MEIOB indeholder et OB-domæne. Alle MEIOB-konstruktioner (A, C, E) blev udtrykt som GST-fusions proteiner. B) coomassie Blue-farvning og Western blot-analyse af meiob-proteinerne renset ved hjælp af GST-bakterie-systemet. De røde pile indikerer positionen af renset MEIOB proteiner. Bands på ca. 26 KDa svarer til glutathion. For Western blot blev anti-GST-antistoffer anvendt med 1:6000 fortynding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : In vitro-assays af MEIOB-ssDNA-interaktioner . (A) signal Styrkeprøvning af forskellige koncentrationer af 36 NT biotin-mærket ssdna. (B) EMSA resultat af meiob proteinbinding til biotin 5 ' end-mærkede DNA-substrater (10% Native gel). (C) meiob-medieret spaltning af biotin 5 ' end-mærkede DNA-substrater (20% Native gel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : In vitro-assays af MEIOB-ssRNA-interaktioner. (A) EMSA resultat af meiob proteinbinding til biotin 5 ' end-mærkede RNA-substrater (10% Native gel). B) meiob-medieret kavalergang af biotin 5 ' end-mærkede RNA-substrater (20% Native gel). (C) plot af procentdel af DNA/RNA-bundet versus Meiob-en koncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : RENSET MOV10 protein og dets afvikling af 5 ' tailed dsRNA in vitro. A) coomassie blå farvning af MOV10 protein renset ved hjælp af flag HEK293T systemet. De røde pile indikerer positionen af renset MOV10 protein. Bands på Coomassie gel med en molekylvægt på ca. 55 kDa svarer til den tunge immunglobulin kæde (IgG) fra flaget antistof. (B) MOV10 vikler 5 ' tailed dsRNA med stigende tid (10, 30, 60 min) ved 37 °c. ssRNA = 18 NT enkeltstrenget RNA, dsRNA = 54 NT dobbeltstrenget RNA med en 18 NT 5 ' hale (20% Native gel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Alternative metoderne af de brug af biotin kromogen reagens s på MEIOB-assay. Kommerciel standard volumen: instrueret af kemiluminescens nukleinsyre detection kit; 2x fortyndet kommerciel volumen: to-fold fortynding af hver buffer i kemiluminescent nukleinsyre detektionssæt, selv lavede reagenser: Se detaljer i trin 3.7.3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: primere anvendt til PCR forstærker genet fragmenter af Meiob og Mov10. De dristige bogstaver i fremadgående og omvendte primere er bamhi og noti skære anlæg; de kursiv fede bogstaver i en omvendt primer er XhoI-skære steder. de fede bogstaver i boksene angiver de nukleotider, der svarer til punkt mutationen R235A.

Table 2
Tabel 2: sekvenser af DNA/RNA-substrater, der anvendes i dette arbejde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Undersøgelse af protein-nukleinsyre interaktioner er afgørende for vores forståelse af molekylære mekanismer underliggende forskellige biologiske processer. For eksempel er meiob et testis-specifikt protein, der er essentielt for meiose og fertilitet hos pattedyr25,26,27. MEIOB indeholder et OB-domæne, der binder sig til enkeltstrenget DNA og udviser 3 ' til 5 ' exonucleaseaktivitet26, som direkte relaterer til dets fysiologiske relevans under meiotisk rekombination. Som et andet eksempel, MOV10 er en RNA helicase med allestedsnærværende funktion, der kan associere med RNA sekundære strukturer16. Derfor viser MOV10 brede RNA-bindingsegenskaber og 5 ' til 3 ' RNA-dupleks-afspolings aktivitet16. De undersøgelser, som rapporterer de ovennævnte biokemiske aktiviteter for disse proteiner, var baseret på brugen af 32P-isotop til mærkning af nukleinsyrer til in vitro-assays. I denne undersøgelse har vi etableret protokoller for en række biotin-mærkede in vitro eksperimenter af meiob og MOV10 funktion. Disse protokoller begynder med forberedelsen af aktive proteiner og sluttede med billeddannelse af biotin signaler.

Specifikt, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser25,26, meiob proteiner blev overudtrykt i bakterier med og rensning gav et enkelt bånd med stærke coomassie farvnings signal efter gel elektroforese. Oprensning af MOV10 protein i fuld længde var imidlertid mere effektiv, når den blev overudtrykt som FLAG-tag-smeltet protein i HEK293T celler end som et GST-smeltet protein i bakterier (data ikke vist). For at opnå tilstrækkelige mængder protein med tilstrækkelig renhed til efterfølgende reaktioner, skal disse to systemer til protein rensning sammenlignes for at bestemme den mest velegnede metode til proteiner med forskellige størrelser og/eller egenskaber. Nukleinsyrer blev derefter mærket ved hjælp af biotin i stedet for 32P som substrat og opnåede robust signal ved undersøgelse af nukleinsyre bindende affinitet eller nukleinsyre-forarbejdningsaktiviteter af begge proteiner. Men da proteiner, der er renset fra bakterier, ofte er forurenet med RNase, er det vanskeligt at udelukke muligheden for, at den spaltet aktivitet, som ses under in vitro-reaktionen, delvis kan skyldes kontaminerende RNase. In vitro-assays med MEIOB-mutanter med reduceret katalytisk aktivitet (trunkeret og punkt mutant) udviste betydelig svækkelse af RNA-substrat forarbejdningen, men eventuel Rnasekontaminering kan ikke udelukkes. De opnåede resultater med hver af meiob-konstruktioner, der handler på ssdna og MOV10-afvikling af dsRNA, svarer til dem, som blev opnået i tidligere studie16,26. MEIOB behandler imidlertid DNA for at generere en smear, mens et mere diskret bånd ses med RNA i henhold til de eksperimentelle resultater (figur 2C og figur 3B). MEIOB har muligvis differentialbindings evne til DNA og RNA-substrat (figur 2B, figur 3A, C), hvilket fører til forskellen i deres spaltende produkter. Det kan også være muligt, at MEIOB renser DNA og RNA på en tydelig måde. MEIOB ' nøjagtige rolle i RNA-behandling er fortsat at blive undersøgt yderligere (f. eks. ved hjælp af FLAG-tag-smeltet MEIOB-protein udtrykt i HEK293T-celler).

Biotin-mærkede nukleinsyre sonder er fordelagtige over 32P-mærkede sonder, idet de ikke kræver særlig beskyttelse og bortskaffelse af affald. For det andet kan biotin-mærkede sonder være stabilt bevaret i mindst 1 år ved-20 °c, hvorimod 32P-mærkede sonder kun varer i 2 uger. Derfor kan det samme parti af biotin-mærkede nukleinsyre anvendes over en lang periode, opretholde reproducerbarhed af eksperimenter. Endelig, hurtig autoradiography af radioaktive sonder kan afhænge af dyre instrumenter såsom fosfor skærm. I modsætning hertil kan alle biotin-mærkede assays, der er beskrevet her, udføres inden for en dag og kræver ikke særligt udstyr. Ulemperne ved biotin mærkning omfatter hovedsageligt yderligere eksperimentelle trin, herunder gel overførsel og chemiluminescens, der er nødvendige for at opdage biotin-mærkede substrater, men kan desuden kræve optimering eller fejlfinding. En anden generel svaghed er den relativt lave følsomhed af biotin-mærkning sammenlignet med radioisotope-mærkning. I disse assays blev der ikke desto mindre opnået en velsynlig påvisning af meget lav koncentration af nukleinsyrer (figur 2A).

Desuden er semi-Dry gel overførings apparater egnet til at overføre længere end normale geler til membraner. Sammenlignet med våd overførsel, semi-Dry overførsel er hurtigere især for nukleinsyre syrer, og giver et lavt baggrunds signal. Desuden blev omkostningerne ved den kromogene reaktion i biotin-streptavidin-systemet skåret ned ved enten at fortynde de kommercielle reagenser eller at lave vores egne, som begge opnåede lignende signaler. Detekterings følsomheden af de selv lavede reagenser kan ikke synes at høj, omend tilstrækkelig heri (figur 5C), men det kan forbedres ved at forlænge blokerende tid (ikke-offentliggjorte data). Også, signalerne kan forbedres med en øget koncentration af nukleinsyre sonde, der anvendes til assays. I betragtning af ovenstående eksperimentelle dokumentation kan biotin etiketten være en fordelagtig erstatning for 32P i flere in vitro biokemiske assays.

Kollektivt, denne protokol tilbyder en biotin-mærket platform for studiet af protein-nukleinsyre interaktioner, der viser sig at være robust, pålidelig, effektiv og overkommelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der erklæres ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker P. Jeremy Wang (University of Pennsylvania) for nyttige redigeringer og diskussioner. Vi takker også Sigrid Eckardt for sprog redigering. K. Z. blev støttet af National Key R & D program i Kina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) og National Natural Science Foundation i Kina (31771653). L. Y. blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81471502, 31871503) og innovativt og iværksætter program af Jiangsu-provinsen. J. N. blev støttet af Zhejiang Medical Science and Technology Project (2019KY499). M. L. blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31771588) og 1000 Youth talent plan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Germany 5242R
Chemiluminescent Imaging System Tanon, China 5200
Digital sonifer Branson, USA BBV12081048A 450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotter Hoefer, USA TE77XP
Tube Revolver  Crystal, USA 3406051
UV-light cross-linker UVP, USA CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter  Milipore, USA UFC801096 4 ml/10 K
Nylon membrane Thermo Scientific, USA TG263940A
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430167 100 mm 
TC-treated Culture Dish Corning, USA 430597 150 mm 
Microtubes tubes AXYGEN, USA MCT-150-C 1.5 mL 
Tubes Corning, USA 430791 15 mL
Reagents 
Ampicillin SunShine Bio, China 8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beads Sigma, USA M8823
ATP Thermo Scientific, USA 591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit Beyotime, China C3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent  Sigma, USA 107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit  Vazyme, China C112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit Thermo Scientific, USA T1269950
dNTP Sigma-Aldrich, USA DNTP100-1KT
DMEM Gibco, USA 10569044
DPBS buffer Gibco, USA 14190-136
EDTA Invitrogen, USA AM9260G 0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktail Roche, USA 04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit  Vazyme, China  
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit Vazyme, China DC301-01
FBS Gibco, USA 10437028
FLAG peptide Sigma, USA F4799
Glycerol Sigma, USA SHBK3676
GST Bulk Kit GE Healthcare, USA 27-4570-01
HEPES buffer Sigma, USA SLBZ2837 1 M 
IPTG Thermo Scientific, USA 34060
KoAc Sangon Biotech, China 127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent Thermo Scientific, USA L3000001
MgCl2 Invitrogen, USA AM9530G 1 M
NaCl Invitrogen, USA AM9759
 
5 M 
NP-40 Amresco, USA M158-500ML
Opti-MEM medium Gibco, USA 31985062
PBS Gibco, USA 10010023 PH 7.4
RNase Inhibitor Promega, USA N251B
Streptavidin alkaline phosphatase Promega, USA V5591
TBE Invitrogen, USA 15581044
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15567027 1 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer  Invitrogen, USA 15568025 1 M, PH 8.0
Tween-20 Sangon Biotech, China A600560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145, (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56, (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43, (8), 52 (2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43, (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60, (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35, (21), 143 (2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35, (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555, (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157, (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29, (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54, (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292, (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318, (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57, (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103, (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8, (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277, (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6, (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373, (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9, (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788 (2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96, (5), 1096-1104 (2017).
In vitro biokemiske assays ved hjælp af biotin etiketter til at studere Protein-nukleinsyre interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).More

Yu, L., He, W., Xie, J., Guo, R., Ni, J., Zhang, X., Xu, Q., Wang, C., Yue, Q., Li, F., Luo, M., Sun, B., Ye, L., Zheng, K. In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions. J. Vis. Exp. (149), e59830, doi:10.3791/59830 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter