Summary
Her præsenterer vi en protokol for immunophenotypic karakterisering og cytokin induceret differentiering af navlestrengsblod afledt CD34+ hæmatopoietisk stilk og stamceller til de fire myeloid lineages. Ansøgningerne i denne protokol omfatter undersøgelser af effekten af myeloid sygdoms mutationer eller små molekyler på myeloid differentiering af CD34+ celler.
Abstract
Ex vivo differentiering af humane hæmatopoietiske stamceller er en meget anvendt model til at studere hæmatopoiese. Den protokol, der er beskrevet her, er for cytokininduceret differentiering af CD34 + hæmatopoietisk stamcelle-og progenitorceller til de fire myeloid- Lineage celler. CD34+ celler isoleres fra humant navlestrengen blod og co-kultiveret med MS-5 stromale celler i nærværelse af cytokiner. Immunophenotypisk karakterisering af stammen og stamceller, og de differentierede myeloide Lineage celler beskrives. Ved hjælp af denne protokol kan CD34+ celler inkuberet med små molekyler eller transduceres med lentivira til at udtrykke myeloide sygdoms mutationer for at undersøge deres indvirkning på myeloid differentiering.
Introduction
Normal differentiering af hæmatopoietiske stamceller (HSCs) er afgørende for vedligeholdelse af fysiologiske niveauer af alle blodlegemer lineages. Under differentieringen, i en koordineret respons på ekstracellulære signaler, herunder vækstfaktorer og cytokiner, giver hscs først Multipotente stamceller (MPP), der har lympho-myeloid potentiel1,2,3 ,4 (figur 1). Mpp'er giver anledning til almindeligt myeloid progenitorer (CMPs) og fælles lymfoide progenitorer (Clp'er), som er begrænset til Lineage. Clps differentiere i de lymfoide nedstamningens består af B, T, og naturlige dræber celler. CMPs genererer myeloid nedstamningens gennem to mere begrænsede stamceller, megakaryocyte erytroide progenitorer (MEP'er) og granulocytmonocytter progenitorer (gmps). MEPerne giver anledning til megakaryocytter og erythrocytter, mens GMPs giver anledning til granulocytter og monocytter. Ud over at opstå gennem CMPs er megakaryocytter blevet rapporteret til også at opstå direkte fra hscs eller tidlige mpps via ikke-kanoniske veje5,6.
Hæmatopoietisk frempind og stamceller (Hspc'er) er karakteriseret ved overfladen markør CD34 og manglen på Lineage specifikke markører (Lin-). Andre overflade markører, der almindeligvis anvendes til at skelne mellem HSCs og myeloid stamcellepopulationer, omfatter CD38, CD45RA og CD1232 (figur 1). HSCs og MPPs er henholdsvis Lin-/Cd34+/CD38- og Lin-/cd34+/CD38+. Myeloid bekræftet stamceller populationer er kendetegnet ved tilstedeværelsen eller fravær af CD45RA og CD123. CMPs er Lin-/cd34+/CD38+/CD45RA-/cd123Lo, gmps er Lin-/cd34+/CD38+/CD45RA+/cd123Lo, og MEP'erne er Lin-/cd34+ /Cd38+/Cd45ra-/cd123-.
Den samlede population af CD34- og stamceller kan fås fra humant navlestrengsblod (UCB), knoglemarv og perifert blod. CD34+- celler udgør 0,02% til 1,46% af totale mononukleære celler (multinationale selskaber) i humant UCB, hvorimod deres andel varierer mellem 0,5% og 5,3% i knoglemarv og er meget lavere ved ~ 0,01% i perifert blod7,8,9 . Den proliferativ kapacitet og differentierings potentialet for UCB-afledte CD34+- celler er signifikant højere end for knoglemarv eller perifert blodlegemer1,10, hvilket giver en klar fordel for at opnå tilstrækkeligt materiale til molekylære analyser i kombination med immunophenotypiske og morfologiske karakterisering af cellerne under differentiering.
Ex vivo differentiering af navlestrengen blod afledt CD34+ hspc'er er en bredt anvendt model til undersøgelse af normal hæmatopoiese og hæmatopoietiske sygdomsmekanismer. Når det dyrkes med de relevante cytokiner, kan UCB CD34+ hspc'erne induceres for at skelne langs myeloid eller lymfoid nedstamningens11,12,13,14,15 , 16. her beskriver vi protokoller for isolation og immunophenotypic karakterisering af CD34+ hspc'erne fra Human UCB, og for deres differentiering til myeloid Lineage celler. Dette kultur system er baseret på cytokininduceret differentiering af Hspc'er i nærværelse af MS-5 stromale celler til at efterligne mikromiljøet i knoglemarven. Dyrkningsforholdene forårsager en indledende udvidelse af CD34+ cellerne efterfulgt af deres differentiering til celler, der udtrykker markører for de fire myeloide Lineage celler, nemlig granulocytter (CD66b), MONOCYTTER (CD14), megakaryocytter (CD41), og erythrocytter (CD235a). Anvendelser af CD34+ celle differentierings protokollen omfatter undersøgelser af molekylære mekanismer, der regulerer hæmatopoiesis, og undersøgelser af virkningen af myeloid sygdom associerede mutationer og små molekyler på selvfornyelse og differentiering af Hspc'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant navlestrengen blod til eksperimenter blev doneret af raske personer efter informeret samtykke til Maricopa integrerede sundhedssystemer (MIHS), Phoenix. De deidentificerede enheder blev opnået gennem en materiale overførselsaftale mellem MIHS og University of Arizona.
1. reagenser og buffere
Bemærk: Forbered alle reagenser og buffere under sterile forhold i et biologisk sikkerhedskabinet.
- Der forberedes steril PBS-BSA-EDTA (PBE) buffer ved tilsætning af 7,2 mL steril 35% bovint serumalbumin (BSA; brug steril vævskultur kvalitet 35% BSA) og 5 mL steril 0,5 M ethylendiamin Tetra eddikesyre (EDTA) til 487,8 mL steril Dulbecco's fosfat Buffered saltvand (DPBS). Filter Steriliser og de-gas bufferen ved at lade filteret fastgjort til vakuum i en biologisk sikkerhed kabinet i mindst 2 h. aliquot den de-gassede buffer i mindre volumener (250 mL) og opbevares ved 4 °C.
- Forbered 1x Hanks afbalanceret saltopløsning (1x HBSS). 100 mL 10x HBSS-materiel fortyndes i 900 mL sterilt destilleret vand for at gøre 1 L 1x HBSS og justere pH til 7,2. Filter Steriliser 1x HBSS før brug.
- Tilbered 2% eddikesyre ved tilsætning af 2 mL iseddike til 98 mL destilleret vand.
- Forbered 20 ng/ml rekombinant humant fibronektin fragment opløsning i 1x PBS. Lav 10 mL pr. 48-brønd plade.
- Forbered 2% BSA. Til 100 ml 1x PBS tilsættes 2 gram BSA fraktion V. filter sterilisere før brug.
- Fuldfør Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) ved at tilsætte DMEM-pulveret, 3,7 GM-natriumbicarbonat, 100 mL føtal kvægserum (FBS) og 5 mL penicillin-streptomycin (PS) til 800 mL sterilt destilleret vand. Bland og Skru op for lydstyrken til 1 L, og Filtrer sterilisering før brug.
- Forbered fryse middel ved at blande 90 mL FBS og 10 mL sterilt dimethylsulfoxid (DMSO).
- Forbered stimulation medium. Til serumfrit medium, der tilsættes L-glutamin til 2 mM og cytokiner til en endelig koncentration på 50 ng/mL for stamcellefaktor (SCF), trombopoietin (TPO) og FMS-lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt3L) og 20 ng/mL for interleukin-3 (IL3) (Se tabel over materialer til fremstilling af cytokinstam opløsninger). Lav 5 mL pr. 48-brønd plade.
- Forbered 1x myeloid differentierings medium. For at fuldføre DMEM tilsættes cytokiner til en endelig koncentration på 5 ng/mL for SCF, Flt3L og IL3, 50 ng/mL for TPO og 4 enheder/mL for erythropoietin (EPO). Lav 5 mL pr. 48-brønd plade.
- Forbered 2x myeloid differentierings medium. For at fuldføre DMEM tilsættes cytokiner til en endelig koncentration 10 ng/mL for SCF, Flt3L og IL3, 100 ng/mL for TPO og 8 enheder/mL for EPO. Lav 5 mL pr. 48-brønd plade.
- Forbered strømnings cytometri-buffer. Til 1 liter 1x PBS tilsættes 10 g BSA fraktion V.
- Forbered 1% PARAFORMALDEHYD i 1x PBS (Se tabel over materialer for detaljer).
- Forbered poly-L-lysin opløsning ved at tilføje 500 μL af 10 mg/mL poly-L-lysin til 49,5 mL 1x PBS.
2. isolering af Mononukleske celler fra navlestrengen blod
Bemærk: For den nedenfor beskrevne protokol blev der anvendt navlestrengsblod volumener på 90 til 100 mL. Isolationen af CD34+ celler skal udføres under sterile forhold i et biologisk sikkerhedskabinet.
- Spray posen indeholdende UCB med 70% ethanol for at sterilisere den ydre overflade, inden den indføres i det biologiske sikkerhedskabinet. UCB overføres til en steril 250 mL plastikflaske og fortyndes 1:1 ved at tilføje et tilsvarende volumen af rumtemperatur (RT) 1x HBSS.
- 15 mL MNC fraktionerings medium (MFM; Se tabel over materialer) pr. rør i ca. seks sterile 50 ml koniske rør. VIP røret med MFM, og hæld forsigtigt 30 mL fortyndet UCB på MFM-laget uden at forstyrre det.
- Centrifuger rørene ved 400 x g i 30 minutter ved rt med langsom acceleration og ingen bremse.
- Efter centrifugering aspirerer du mellem 15-20 mL af plasmaet over MNC-laget. Saml forsigtigt multinationale selskaber med en pipette og Overfør til et nyt 50 mL konisk rør.
Bemærk: Multinationale selskaber deponering som en hvid Buffy lag på grænsefladen af plasma og MFM, og de røde blodlegemer (RBCs) sediment i bunden af koniske rør. - Pool multinationale selskaber indsamlet fra 2-3 rør sammen. Volumen af hvert rør til 50 mL med kold PBE buffer.
- Rørene centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c, mens bremsen er lav.
- Aspirér supernatanten, og Tap forsigtigt på røret for at løsne celle pellet.
- Re-suspendere de pelleteret celler i 5 mL iskold PBE buffer. Brug de samme 5 mL re-suspenderede celler til at indsamle celler fra andre rør. Kombiner celler fra 3 til 4 rør sammen i 1 50 mL konisk rør.
- For at indsamle eventuelle resterende celler skal alle rørene vaskes med 5 mL kold PBE-buffer og tilsættes til 50 mL konisk slange.
- De multinationale selskaber tælles ved at fortynde 10 μL af cellesuspensionen til 490 μL eddikesyre opløsning.
Bemærk: Eddikesyre af kontaminerende RBC'er for at gøre det lettere at tælle multinationale selskaber. - Mængden af cellesuspensionen udgør 50 mL med iskold PBE-buffer. Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °c med lav bremse.
Bemærk: MNC suspension kan behandles straks for isolering af CD34+ celler eller frosset til senere anvendelser. - For at fryse multinationale selskaber, fjerne supernatanten og re-suspendere ved en densitet på 2 x 107 celler/ml i fryse middel på rt.
- Frys cellerne ved-80 °C natten over i en celle frysende beholder, og overfør dem derefter til flydende nitrogen.
3. isolering af CD34+ celler fra mononukleare celler
- Hvis du bruger nyisolerede multinationale selskaber, skal du gå direkte til trin 3,3.
- Hvis du bruger frosne multinationale selskaber, skal du hurtigt tø de frosne celler i et 37 °C vandbad og overføres til et 50 mL konisk rør. De resterende celler i hætteglassene opsamles med 1 mL iskold PBE-buffer og overføres til 50 mL konisk slange.
- Volumen af MNC suspension til 50 mL med kold PBE buffer og centrifugeres ved 600 x g i 5 min ved 4 °c.
- Fjern supernatanten, og Tap forsigtigt på røret for at løsne celle pellet. Re-suspendere multinationale selskaber til 1 x 108 celler i 300 μl ISKOLD PBE buffer.
- Tilsæt 100 μL FcR-blokerende reagens fra den magnetiske-aktiverede celle sortering (MACS) Human CD34 microbead kit pr. 1 x 108 multifiber og bland forsigtigt.
Bemærk: Dette blokerer uspecifik binding til CD34-mikroperlerne. - Tilsæt 100 μL af CD34-mikroperlerne pr. 1 x 108 celler. Bland forsigtigt og Inkuber ved 4 °C i 30 minutter i køleskab. Må ikke inkubere på is.
- Mens cellerne er inkuberet, placere en LS kolonne og præ-separation filter i MACS separator magnetfelt. Kolonnen skal være i ligevægt med iskold PBE-buffer ved at tilsætte 2 mL direkte i kolonne og 1 mL i præ-separations filteret. Lad kolonnen tømme i et 15 mL konisk rør og kassér strømmen igennem.
- Fjern multinationale selskaber fra 4 ° c, tilsæt iskold PBE buffer til at gøre op volumen til 15 mL, og centrifuge cellerne ved 300 x g i 10 min ved 4 °c, med bremsen på lav.
- Aspirér supernatanten og re-suspendere cellerne i 1 mL iskold PBE buffer.
- Føj cellesuspensionen til det præ-separations filter, som er placeret i kolonnen LS.
Bemærk: Filteret før separation fjerner alle store celle aggregater, der kan blokere kolonnen. - Skyl røret med 3 mL iskold PBE-buffer, og tilsæt det til præ-separations filter placeret på LS-søjlen. Efter dette, kassere præ-separation filter.
- Vask LS-kolonnen fire gange ved at tilføje 3 mL iskold PBE-buffer, så kolonnen kan dræne hver gang.
Bemærk: CD34+- cellerne vil fortsat være bundet til kolonnen, og de ikke-mærkede celler flyder gennem kolonnen. - Efter den sidste vask skal du fjerne kolonnen fra MACS separator magnetfelt og placere den i et nyt 15 mL konisk rør, væk fra magneten.
- Tilsæt 5 mL iskold PBE-buffer til kolonnen, og udpres de bundne CD34+- celler ved at skubbe stemplet fast.
- Eventuelt passere CD34+ celler isoleret fra den første kolonne over en anden ls kolonne med præ-separation filter som beskrevet ovenfor (trin 3.10 − 3.13).
- Tæl de isolerede CD34+ celler med trypan og et Blue (10 μl celler og 10 μl trypan og et blå) for at bestemme det samlede antal levende celler.
Bemærk: På dette stadium kan de isolerede CD34+- celler fryses til senere brug eller kan behandles direkte til analyse af Hspc'er ved flowcytometri (punkt 4) eller til differentiering af myeloide Lineage celler (punkt 5). - Centrifuger cellesuspensionen ved 600 x g i 5 minutter ved rt, med bremse på lav.
- For at fryse CD34+ cellerne skal du aspirere supernatanten og re-suspendere op til 5 x 106 celler i 1 ml fryse medium og fryse som beskrevet ovenfor (trin 2,13). Ellers skal du gå videre til afsnit 4 eller 5.
4. bestemmelse af Stam-og Progenitorpopulationer ved strømnings cytometri
- For at bestemme brøkdele af Stam-og progenitorpopulationer i de frisk isolerede CD34 + hspc'er centrifugeres de ved 600 x g i 5 minutter og gensuspenderer 1 x 106 celler i 50 μl flow cytometri- buffer.
- Til 1 x 106 CD34+ celler, tilsættes antistoffer (Se tabel over materialer til fortynding) til LINEAGE MARKØRER (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 og CD235a — alle FITC mærket), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) og 7- aminoactinomycin D (7-AAD; som en levende/dødt bejdsen) og udgør den totale volumen til 100 μL. Inkuber på is i mørket i 20 min.
Bemærk: Der kan anvendes færre end 1 x 106 CD34+ celler til analyse. Ved farvning af færre celler bør det samlede volumen og mængden af tilsat antistoffer reduceres tilsvarende. Til analyse af strømnings cytometri bør ufarvede og enkeltfarvede multinationale selskaber anvendes som kontrol for indstilling af positive og negative porte for hver fluorophore. - Efter inkubation vaskes cellerne med 1 mL flow cytometri buffer og centrifugeres ved 600 x g i 5 min.
- Alternativt kan du rette de farvede celler i 0,5 mL 1% PARAFORMALDEHYD opløsning i 10 minutter i mørket ved RT.
- Centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter og Aspirér supernatanten.
- De faste/farvede celler vaskes med 1 mL flow cytometri buffer og centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Aspirér supernatanten, re-suspendere cellerne i 500 μl flow flowcytometri buffer, og analysere ved et flow flowcytometer (tabel over materialer).
5. myeloid differentiering af CD34 + hæmatopoietisk stamcelle- og progenitorceller
Bemærk: For at differentiere CD34+ hspc'erne til myeloid Lineage celler, de er først stimuleret i rekombinant humane fibronektin fragment belagte plader og derefter seedet på et lag af MS-5 stromale celler i myeloid differentiering medium. Differentieringen kan overvåges hver uge i 3 uger baseret på ekspression af celleoverflade markører, der er specifikke for de fire myeloid-lineager. Under stimulation og differentiering udføres alle inkubationer ved 37 °C og 5% CO2 i et befuret kammer. Alle trin skal udføres i et biologisk sikkerhedskabinet.
- Coat brøndene af en steril ubelagt 48-brønd plade ved at tilføje 200 μl/godt af rekombinant Human fibronektin opløsning i 1x PBS for 2 h på rt.
- Efter 2 h, Fjern forsigtigt den Rekombinante humane fibronektin opløsning og kassér.
- Bloker brøndene med 200 μL/brønd på 2% BSA i 30 min ved RT.
- Du aspirerer BSA-opløsningen og vasker brøndene to gange med 500 μL steril 1x PBS.
Bemærk: Fibronectin fragment belagte plader kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger. - For at stimulere CD34+ hspcs, re-suspendere de frisk isolerede celler (fra trin 3,17) med en densitet på 1 x 105 celler/200 μl eller 5 x 105 celler/ml varm 1x stimulation medium.
- Hvis du bruger frosne CD34+ celler, skal du hurtigt tø og overføre cellerne til et 15 ml konisk rør, der indeholder varm komplet DMEM. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 minutter, og cellerne gensuspenderes som beskrevet i trin 5,5.
- Plade 200 μl af CD34+ cellesuspensionen pr. brønd af fibronektin fragment belagt 48-brønd plade og Inkuber for 48 h.
- Den næste dag, frø 15.000 MS-5 stromale celler i 200 μL af komplet DMEM per brønd af en 48-brønd vævskultur behandlet plade og inkubere ved 37 °C for 24 h.
- Efter 48 h stimulation, indsamle CD34+ celler ved blid pipettering. Vask brøndene med 500 μL varm DMEM og pool med cellesuspensionen.
- Tæl cellerne med trypan og et Blue. Opslæmning af suspensionen ved 600 x g i 5 min. og re-suspension ved en densitet på 5.000 celler/200 μl 1x myeloid differentierings medium.
- Fra 48-brønd vævskultur pladen seedet med MS-5 stromale celler, forsigtigt aspirere mediet uden at forstyrre cellerne. Lag 200 μL (5.000 celler) af CD34+ cellesuspensionen pr. brønd af pladen og Inkuber ved 37 °c.
Bemærk: Kultur af MS-5-celler kan opretholdes i komplet DMEM. På den dag, hvor CD34+ cellerne er seedet, skal MS-5-cellerne være i et ensartet lag (80-90% sammenløbet). Det anbefales, at MS-5-cellerne er belagt mindst 24 timer før såning af CD34+ cellerne. Hvis MS-5-celler skal være belagt 48 h eller 72 h før SÅNING af CD34+ celler, bør celletætheden justeres i overensstemmelse hermed. Det anbefales også, at de perifere brønde af 48-brønd pladen skal stå tomt eller fyldes med 200 μL sterilt vand for at undgå kanteffekter. - Udfør halv-medium Skift hver 3 − 4 dage ved forsigtigt at fjerne 100 μL af mediet fra toppen af hver brønd og erstatte det med 100 μL 2x myeloid differentierings medium per brønd.
- På dag 21, høst cellerne til analyse af myeloid Lineage markør udtryk ved flow cytometry. Uden at forstyrre MS-5-laget, pipetten forsigtigt mediet og Overfør cellerne til et 5 mL rør.
Bemærk: For farvning og flow cytometri analyse, celler fra 1-2 brønde er tilstrækkelige. Differentieringen kan også overvåges på dag 1, 7 og 14. Hvis der udføres immunophenotyping på flere dage, bør antallet af brønde til analyse beregnes i overensstemmelse hermed. - Plet 5 x 105 celler med antistoffer mod CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (percp-CY 5.5) og CD235A (APC) i et samlet volumen på 50 ΜL. Inkuber på is i mørket i 20 min. Medtag ufarvede og enkeltfarvede multinationale selskaber som kontrol for indstilling positive og negative porte for hver fluorophore, og 7-AAD som en levende/død plet for at eliminere døde celler fra analysen.
- Vask og Fix (valgfrit) de farvede celler som beskrevet ovenfor (trin 4.3-4.6).
- Re-suspendere cellerne i 500 μL flow cytometri buffer og analysere ved et flow cytometer.
6. vurdering af cellulær morfologi
- Rengør mikroskop slides ved at sprøjte ethanol og aftørring indtil knirkende.
- Nedsænk rene lysbilleder i Poly-L-lysin opløsning i 5 minutter ved RT og tør i 1 time ved RT.
- Resuspension af Hspc'erne fra trin 3,14 og differentierede celler fra trin 5,13 i 10 μL flow cytometri buffer.
- Overfør cellesuspensionen til de coatede slides og lad dem lufttørre.
Bemærk: Slides fra dag 1 og dag 21 kan lagres på RT og farves samtidigt. - Hæld 0,5 mL af Wright-Giemsa plet på sliden og lad stå i 3 min ved RT.
- Tilsæt lige volumen af deioniseret vand og lad stå for yderligere 10 min på RT.
- Vask sliden i deioniseret vand.
- Visualisere farvede celler ved en forstørrelse på 60x eller 100x af et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelsen af ovenstående protokoller giver 5,6 (± 0,5) x 108 multinationale selskaber og 1 (± 0,3) x 106 CD34+ celler fra en ledning blod enhed på ~ 100 ml. Procentdelen af total CD34+ celler svinger mellem 80-90% (figur 2A, B). Immunophenotypisk analyse af ordningen beskrevet af Manz et al.5 viser, at CD34+ cellerne typisk består af ~ 20% hscs og ~ 72% mpps, der er Lin-/Cd34+/Cd38- og Lin-/cd34+ Henholdsvis/Cd38+(figur 1 og figur 2A). I MPP-populationen er procentdelene af CMPs (Lin-/Cd34+/Cd38+/cd123Lo/Cd45ra-), gmps (Lin-/Cd34+/CD38+/cd123Lo/CD45RA+) og MEP'er (Lin-/Cd34+/Cd38+/Cd123-/CD45RA-) er henholdsvis ca. 25%, 15% og 56% (figur 1 og figur 2b).
Under inkubation af de isolerede Hspc'er i myeloide differentierings betingelser, er der progressivt tab af CD34 markør. Immunophenotyping viser, at procentdelen afCD34 + celler reducerer fra ~ 90% ved isolation (figur 2A) til ~ 23% på dag 21 (figur 3B). Analyse af CD34- populationen viser en samtidig stigning i procentdelen af celler, der udtrykker modne myeloid Lineage markører. Der er en stigning i procentdelen af celler, som udtrykker markører for monocytter (CD34-/CD14+/cd66b-) fra et gennemsnit på 1,7% til 12%, for granulocytter (CD34-/CD14-/cd66b+) fra 1,3% til 5,3%, for megakaryocytter (CD34-/cd41+/cd235a-) fra 1,8% til 8%, og for erythroide celler (CD34-/cd41-/cd235a+) fra 0,7% til 11% (figur 3C). Undersøgelse af Wright-Giemsa farvede celler viser, at cellernes morfologiske egenskaber på dag 1 og dag 21 er forskellige. De udifferentierede celler har store runde kerner, og meget lidt cytoplasma. På den anden side udviser celler fra differentierede kulturer karakteristika for Lineage celler, herunder modne monocytter, granulocytter og erythroblaster (figur 4). Således, de dyrkningsbetingelser, der er beskrevet i denne protokol fremme differentiering af UCB CD34+ celler til myeloid Lineage celler.
Figur 1 : Hæmatopoietisk differentiering skematisk. Den pluripotente hæmatopoietiske stamcelle (HSC) differentieres i den Multipotente progenitorceller (MPP), som giver anledning til den fælles myeloid progenitorceller (CMP) og de fælles lymfoide progenitorceller (CLP). CMPs genererer to andre myeloide progenitorer, granulocytmonocytter (GMPs) og megakaryocyte erythrocyt-progenitorer (MEP'er). Granulocytter og monocytter opstår fra GMPs, og erythrocytter og megakaryocytter opstår fra MEP'er. CLPs giver anledning til naturlige Killer, B, og T-celler. De celleoverflade markører, der bruges til at karakterisere cellepopulationer i denne protokol, er angivet. Dette tal er blevet modificeret fra Bapat et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Immunophenotypisk analyse af det hæmatopoietiske Stam-og progenitorceller. (A) celler blev gated på fremad og side scatter for at vælge en enkelt cellepopulation. Døde og Lineage positive celler blev elimineret ved farvning med 7-AAD og antistoffer mod CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 og CD235a (alle FITC plettet). Lin-/Live-cellerne blev analyseret med antistoffer mod CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD123 (APC) og CD45RA (PE-Cy7). Progenitorerne blev adskilt fra cellerne CD34+/Cd38+ . CMPs er CD123Lo/CD45RA-, gmps er CD123Lo/Cd45ra+ og MEP'er er CD123-/CD45RA-. Repræsentative scatter plot fra et eksperiment vises. B) procentdelen af samlede Hspc'er (total CD34+ celler), CMPs, Gmps og MEP'er i navlestrengsblod er repræsenteret. De præsenterede data er gennemsnit med standardfejl fra mindst tre uafhængige eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunophenotypisk analyse af myeloide Lineage celler. Enkeltceller blev gated baseret på fremad og side scatter. CD34- celler blev udvalgt ved farvning med antistof til CD34 (APC-Cy7). Myeloide nedstamningens i CD34- populationen blev analyseret med antistoffer mod CD14 (PE), CD66b (PE-Cy7), CD41 (percp-CY 5.5) og CD235a (APC) på dag 1 (A) og dag 21 (B). Monocytter er CD14+/cd66b-, GRANULOCYTTER er CD14-/cd66b+, megakaryocytter er CD41+/CD235A- og erythroide celler er CD41-/cd235a+. Repræsentative scatter plot fra et eksperiment vises. Fraktioner af monocytter, granulocytter, megakaryocytter og erythroide celler i CD34- populationen på dag 1 og dag 21 er repræsenteret (C). De præsenterede data er gennemsnit med standardfejl fra mindst tre uafhængige eksperimenter. Dette tal er blevet modificeret fra Bapat et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative billeder af Hspc'er og differentierede celler. CD34+ hspc'er (A) og celler fra myeloide kulturer på dag 21 (B) blev plettet med Wright-Giemsa-pletten. Celler svarende til granulocytter (sorte pile), monocytter (blå pile) og erythroide celler (røde pile) vises. Skala stænger repræsenterer 10 mm. Dette tal er blevet modificeret fra Bapat et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne protokol er egnet til ex vivo-differentiering af UCB-afledte CD34 + hspc'er til de fire myeloid- lineager. Indledende inkubation med en cytokinblanding bestående af SCF, TPO, Flt3L og IL3 stimulerer CD34+ cellerne. Efterfølgende opnås differentiering med en cocktail af SCF, IL3, Flt3L, EPO og TPO. I denne blanding er SCF, IL3 og Flt3L vigtige for overlevelse og spredning af CD34+ hscs. EPO og TPO fremme differentiering mod erythrocytter og megakaryocytter, henholdsvis, og IL3 fremmer differentiering af tidlige granulocyt-monocyte prækursorer og modne celler13,17,18. En advarsel til denne metode er den observerede variation i procentdelen af differentierede celler. Dette kan skyldes forskelle i kapaciteten af de CD34+ hspc'er, der er isoleret fra forskellige donorer for at give anledning til Lineage cellerne.
Laget af MS-5-celler er afgørende for effektiv differentiering af CD34+ hspc'erne. I vores erfaring, MS-5 celler skal være belagt mindst 24 timer før såning af CD34+ celler. Det er vigtigt at opretholde sammenløbet af MS-5 celler på 80-90%. Over konflydende MS-5-celler har tendens til at løsne, og lavere konfluency medfører reduceret differentiering. Under inkubationen udvider CD34+ cellerne med ~ 50-fold. De bliver flydende ved dag 14 og skal høstes og opdeles i yderligere brønde, der indeholder MS-5-celler på en ny plade.
Hyppigheden af medieændringer er også afgørende for effektiv differentiering og skal udføres hver 3-4 dage for at opretholde optimale cytokinkoncentrationer. Færre ændringer i medierne og lavere cytokinkoncentrationer, begge forårsage en reduktion i spredning og differentiering af CD34+ hspc'er. Dette krav om store mængder af cytokiner kan øge omkostningerne betydeligt, og dermed er en begrænsning af denne protokol. En anden begrænsning for stor skala eksperimenter er antallet af CD34+ celler opnået fra en enhed af navlestrengsblod. Typisk, en frisk UCB enhed af ~ 100 mL udbytter omkring 1.000.000 CD34+ celler. Opbevaring af enheden ud over 24 timer reducerer udbyttet betydeligt. Yderligere tab af renhed af CD34+ celler kan forekomme under de kolonne vaske trin, der er vigtige for at fjerne alle ikke-mærkede kontaminerende celler. Hvis kolonnen træsko under vaske trinene, anbefales det, at de bundne celler fra den tilstoppede kolonne eluppes og genindlæses på en ny kolonne for at få en ren population af CD34+ celler.
I litteraturen er der rapporteret om forskellige cytokinkombinationer, som fremmer differentiering i forhold til enten megakaryocytisk, erythroid eller granulo-monocyt nedstamningens19,20,21,22 . En fordel ved denne protokol er, at det giver mulighed for differentiering langs alle fire myeloid populationer, nemlig monocytter, granulocytter, megakaryocytter, og erythrocytter. Således kan det være ansat til at studere normal myeloid differentiering og til at undersøge virkningen af myeloid sygdom (myelodysplastiske syndromer, akut myeloid leukæmi, myeloproliferative neoplasmer, og andre) associerede punktmutationer og kromosomale omplaceringer på molekylær og cellulær fænotype under spredning og differentiering af CD34+ celler11,12,23,24,25. Denne protokol kan også anvendes til at undersøge virkningen af anti-og pro-inflammatoriske cytokiner, og af potentielle terapeutiske lægemidler på myeloid differentiering26,27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Wendy Barrett, Rachel Caballero, og Gabriella Ruiz af Maricopa integrerede sundhedssystemer for de identificerede og donerede navlestrengsblod enheder, Mrinalini Kala for assistance med flow cytometry, og homoseksuelle skurke og Christopher seet for rådgivning om ex vivo myeloid differentiering. Dette arbejde blev støttet af midler til S.S. fra National Institutes of Health (R21CA170786 and R01GM127464) og American Cancer Society (den institutionelle forskningsbevilling 74-001-34-IRG). Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
