Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .
Abstract
A diferenciação ex vivo de células-tronco hematopoiéticas humanas é um modelo amplamente utilizado para estudar a hematopoiese. O protocolo descrito aqui é para a diferenciação induzida citocinas de pilhas da haste e do progenitor de CD34+ hematopoietic às quatro pilhas myeloid da linhagem. As pilhas de CD34+ são isoladas do sangue humano do cabo de cordão umbilical e co-cultivadas com as pilhas STROMAL MS-5 na presença de cytokines. A caracterização de immunophenotypic das pilhas da haste e do progenitor, e as pilhas Myeloid diferenciadas da linhagem são descritas. Usando este protocolo, as pilhas de CD34+ podem ser incubadas com moléculas pequenas ou transadas com lentivirus para expressar mutações myeloid da doença para investigar seu impacto na diferenciação Myeloid.
Introduction
A diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é fundamental para a manutenção de níveis fisiológicos de todas as linhagens de células sanguíneas. Durante a diferenciação, em uma resposta coordenada às pistas extracelulares, incluindo fatores de crescimento e citocinas, as hscs primeiro dão origem a células de progenitoras multipotentes (MPP) que têm potencial lympho-mielóide1,2,3 ,4 (Figura 1). Os MPPs dão origem a progenitores mielóides comuns (CMPs) e progenitores linfoides comuns (CLPs) que são restritos à linhagem. Os CLPs diferenciam nas linhagens lymphoid compostas de B, T, e de pilhas naturais do assassino. Os CMPS geram as linhagens Myeloid através de duas populações mais restritas do progenitor, dos progenitores Erythroid do megacariócito (deputados), e dos progenitores do monocyte do granulocyte (GMPs). Os eurodeputados dão origem a megacariócitos e eritrócitos, enquanto os GMPs dão origem a granulócitos e monócitos. Além do que levanta-se com CMPS, os megacariócitos foram relatados para levantar-se também diretamente de hscs ou de Mpps adiantados através das vias não-canônicas5,6.
As células tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são caracterizadas pelo marcador de superfície CD34 e pela falta de marcadores específicos de linhagem (Lin-). Outros marcadores de superfície comumente empregados para distinguir HSCs e populações de progenitoras mielóides incluem CD38, CD45RA e CD1232 (Figura 1). HSCs e MPPs são Lin-/Cd34+/CD38- e Lin-/CD34+/CD38+, respectivamente. As populações de progenitoras comprometidas mielóides distinguem-se pela presença ou ausência de CD45RA e CD123. As CMPS são Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, os GMPs são Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, e os eurodeputados são Lin-/CD34+ /Cd38+/Cd45ra-/CD123-.
A população total de células CD34+ Stem e progenitoras pode ser obtida a partir do sangue do cordão umbilical humano (UCB), da medula óssea e do sangue periférico. As células CD34+ constituem 0, 2% a 1,46% das células mononucleares totais (MNCs) em UCB humano, enquanto a sua percentagem varia entre 0,5% e 5,3% na medula óssea e é muito mais baixa em ~ 0, 1% no sangue periférico7,8,9 . A capacidade proliferativa e o potencial de diferenciação das células CD34+ derivadas de UCB é significativamente maior do que a da medula óssea ou das células sanguíneas periféricas1,10, oferecendo assim uma vantagem distinta para obter material suficiente para análises moleculares em combinação com a realização de caracterização imunofenootípica e morfológica das células durante a diferenciação.
A diferenciação ex vivo do sangue do cordão umbilical CD34+ hspcs é um modelo amplamente aplicado para a investigação de hematopoiese normal e mecanismos de doença hematopoética. Quando cultivadas com as citocinas apropriadas, a UCB CD34+ hspcs pode ser induzida para diferenciar ao longo das linhagens mielóide ou linfoide11,12,13,14,15 , 16. aqui, nós descrevemos protocolos para a isolação e a caracterização immunophenotypic do CD34+ HSPCS do UCB humano, e para sua diferenciação às pilhas myeloid da linhagem. Este sistema da cultura é baseado na diferenciação cytokine-induzida dos HSPCs na presença de pilhas stromal MS-5 para imitar o microambiente na medula. As condições da cultura causam uma expansão inicial das pilhas de CD34+ , seguidas por sua diferenciação às pilhas que expressam marcadores para as quatro pilhas myeloid da linhagem, a saber os granululocytes (CD66b), os monócitos (CD14), os megacariócitos (CD41), e eritrócitos (CD235a). As aplicações do protocolo de diferenciação celular CD34+ incluem estudos sobre mecanismos moleculares que regulam a hematopoiese, e investigações sobre o impacto de mutações associadas à doença mielóide e pequenas moléculas na autorenovação e diferenciação de HSPCs.
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Protocol
O sangue do cordão umbilical humano para experimentação foi doado por indivíduos sadios após consentimento informado para a Maricopa sistemas integrados de saúde (MIHS), Phoenix. As unidades desidentificadas foram obtidas por meio de um acordo de transferência de material entre a MIHS e a Universidade do Arizona.
1. reagentes e amortecedores
Nota: Prepare todos os reagentes e tampões condições estéreis em um armário de segurança biológico.
- Prepare o tampão estéril de PBS-BSA-EDTA (PBE) adicionando 7,2 mL da albumina de soro bovina estéril de 35% (BSA; use a classe estéril 35% BSA da cultura do tecido) e 5 mL do ácido tetra acético da diamina do etileno de 0,5 M estéril (EDTA) a 487,8 mL do fosfato de Dulbecco estéril tamponado soro fisiológico (DPBS). O filtro esteriliza e de-gás o amortecedor deixando o filtro anexado ao vácuo em um armário de segurança biológico para pelo menos 2 h. aliquot o tampão de-gabastecido em volumes menores (250 mL) e armazene em 4 ° c.
- Prepare a solução de sal equilibrada de 1x Hanks (1x HBSS). Diluir 100 mL de estoque de 10x HBSS em 900 mL de água destilada estéril para fazer 1 L de 1x HBSS e ajustar o pH para 7,2. O filtro Esteriliza o 1x HBSS antes de usar.
- Prepare 2% de solução de ácido acético adicionando 2 mL de ácido acético glacial a 98 mL de água destilada.
- Prepare 20 ng/mL solução de fragmento de fibronectina humana recombinante em 1X PBS. Faça 10 mL por placa 48-well.
- Prepare 2% BSA. Para 100 mL 1X PBS, adicione 2 gramas de fração BSA V. filtro esterilizar antes de usar.
- Faça o meio modificado da águia de Dulbecco completo (DMEM) adicionando o pó de DMEM, o bicarbonato de sódio do GM 3,7, o soro fetal do bovino de 100 mL (FBS) e a penicilina-estreptomicina de 5 mL (picosegundo) a 800 mL da água destilada estéril. Misture e compo o volume a 1 L, e esterilize o filtro antes de usar-se.
- Prepare o meio de congelação misturando 90 mL de FBS e 10 mL de dimetil sulfóxido estéril (DMSO).
- Prepare o meio de estimulação. Ao meio livre do soro, adicione a L-glutamina a 2 milímetros, e as citocinas a uma concentração final de 50 ng/ml para o fator da pilha de haste (SCF), o thrombopoietin (TPO), e o ligante da tirosina quinase 3 de FMS-como (Flt3L), e 20 ng/ml para interleukin-3 ( para a preparação de soluções em estoque de citocinas). Faça 5 mL por placa 48-well.
- Prepare o meio de diferenciação mielóide 1x. Para completar DMEM, adicionar citocinas a uma concentração final de 5 ng/mL para SCF, Flt3L, e IL3, 50 ng/mL para TPO, e 4 unidades/mL para eritropoietina (EPO). Faça 5 mL por placa 48-well.
- Prepare o meio de diferenciação mielóide 2x. Para completar o DMEM, adicione citocinas a uma concentração final de 10 ng/mL para SCF, Flt3L e IL3, 100 ng/mL para TPO e 8 unidades/mL para EPO. Faça 5 mL por placa 48-well.
- Prepare o tampão da citometria do fluxo. Para 1 L de 1X PBS, adicione 10 g de fração BSA V.
- Prepare 1% paraformaldeído em 1X PBS (ver tabela de materiais para mais detalhes).
- Prepare a solução de poli-L-lisina adicionando 500 μL de 10 mg/mL de poli-L-lisina a 49,5 mL de 1X PBS.
2. isolamento de células mononucleares do sangue do cordão umbilical
Nota: Para o protocolo descrito abaixo, foram utilizados volumes sanguíneos de cordão umbilical de 90 a 100 mL. O isolamento das células CD34+ deve ser realizado condições estéreis em um armário de segurança biológico.
- Pulverize o saco que contem UCB com o etanol 70% para esterilizar a superfície exterior antes de introduzi-la no armário de segurança biológico. Transfira o UCB para um frasco de plástico estéril de 250 mL e dilui-o 1:1 adicionando um volume igual de temperatura ambiente (RT) 1x HBSS.
- Dispensar 15 mL de meio de fraccionamento MNC (MFM; ver tabela de materiais) por tubo em cerca de seis tubos estéreis 50 ml cônicos. Incline o tubo com MFM e despeje suavemente 30 mL de UCB diluído na camada MFM sem perturbá-lo.
- Centrifugue os tubos a 400 x g durante 30 min em RT com aceleração lenta e sem travão.
- Após a centrifugação, aspirar entre 15-20 mL do plasma acima da camada de MNC. Recolha suavemente as MNCs com uma pipeta e transfira para um novo tubo cônico de 50 mL.
Nota: O depósito de MNCs como uma camada branca da Buffy na relação do plasma e do MFM, e os glóbulos vermelhos (RBCs) sedimento na parte inferior do tubo cônico. - Os MNCs da Associação coletaram de 2-3 tubos junto. Compo o volume de cada tubo a 50 mL com o amortecedor frio de PBE.
- Centrifugue os tubos a 300 x g durante 10 min a 4 ° c, com o travão em baixo.
- Aspirar o sobrenadante e bata o tubo suavemente para soltar o pellet celular.
- Resuspender as células peletizadas em 5 mL de tampão PBE gelado. Use as mesmas 5 mL de células resuspensas para coletar células de outros tubos. Combine células de 3 a 4 tubos em conjunto em 1 50 mL de tubo cônico.
- Para recolher todas as células restantes, lave todos os tubos com 5 mL de tampão PBE frio e adicione ao tubo cônico de 50 mL.
- Conte as MNCs diluindo 10 μL de suspensão celular em 490 μL de solução de ácido acético.
Nota: O ácido acético lise qualquer contaminando RBCs para permitir a contagem mais fácil de MNCs. - Compo o volume da suspensão da pilha a 50 mL com o amortecedor Ice-Cold de PBE. Centrifugue as pilhas em 300 x g por 10 minutos em 4 ° c, com freio em baixo.
Nota: A suspensão de MNC pode ser processada imediatamente para o isolamento de células CD34+ ou congelada para aplicações posteriores. - Para congelar as MNCs, retire o sobrenadante e Resuspenda a uma densidade de 2 x 107 células/ml em meio de congelação em RT.
- Congele as pilhas em-80 ° c durante a noite em um recipiente de congelação da pilha e transfira-os então ao nitrogênio líquido.
3. isolação de pilhas de CD34+ das pilhas mononuclear
- Se o uso de MNCs recém-isolados prosseguir diretamente para a etapa 3,3.
- Se estiver usando MNCs congelados, descongele rapidamente as células congeladas em um banho de água de 37 ° c e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Colete todas as células restantes nos frascos com 1 mL de tampão PBE gelado e transfira para o tubo cônico de 50 mL.
- Compõem o volume da suspensão MNC para 50 mL com tampão PBE frio e centrifugador a 600 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Retire o sobrenadante e bata o tubo suavemente para soltar o pellet celular. Re-suspender as MNCs para 1 x 108 células em 300 μL de Ice-Cold PBE buffer.
- Adicione 100 μL de reagente de bloqueio de FcR do jogo humano do microbead do CD34 da classificação de pilha (MACS) magnética-ativada por 1 x 108 MNCs e misture delicadamente.
Nota: Isto obstrui a ligação inespecíficos aos microbeads CD34. - Adicionar 100 μL de microesferas CD34 por 1 x 108 células. Misture suavemente e incubar a 4 ° c durante 30 min num frigorífico. Não incubar no gelo.
- Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna LS e filtro de pré-separação no campo magnético do separador MACS. Equilibrar a coluna com o tampão PBE gelado adicionando 2 mL directamente na coluna e 1 mL no filtro de pré-separação. Permita que a coluna esvazie em um tubo cônico de 15 mL e descarte o fluxo.
- Remova as MNCs de 4 ° c, adicione o amortecedor PBE Ice-Cold para compo o volume a 15 mL, e Centrifugue as pilhas em 300 x g por 10 minutos em 4 ° c, com o freio em baixo.
- Aspirar o sobrenadante e resuspender as células em 1 mL de tampão PBE gelado.
- Adicione a suspensão da célula ao filtro de pré-separação colocado na coluna LS.
Nota: O filtro de pré-separação remove quaisquer agregados de células grandes que podem bloquear a coluna. - Enxague o tubo com 3 mL de tampão PBE gelado e adicione-o ao filtro de pré-separação colocado na coluna LS. Depois disso, descarte o filtro de pré-separação.
- Lave a coluna LS quatro vezes adicionando 3 mL de tampão PBE gelado, permitindo que a coluna escorra cada vez.
Nota: As células CD34+ permanecerão vinculadas à coluna e as células sem rótulo fluirão pela coluna. - Após a lavagem final, retire a coluna do campo magnético do separador MACS e coloque-a num novo tubo cônico de 15 mL, longe do íman.
- Adicione 5 mL de tampão PBE gelado à coluna e expelir as células CD34+ ligadas empurrando firmemente o êmbolo.
- Opcionalmente, passe células CD34+ isoladas da primeira coluna sobre outra coluna ls com o filtro de pré-separação, conforme descrito acima (etapas 3.10 − 3.13).
- Conte as células CD34+ isoladas com azul de Tripan (10 μL de células e 10 μL de azul de Tripan) para determinar o número total de células ao vivo.
Nota: Nesta fase, as células CD34+ isoladas podem ser congeladas para uso posterior ou podem ser processadas diretamente para análise de HSPCs por citometria de fluxo (seção 4) ou para diferenciação em células de linhagem mielóide (seção 5). - Centrifugue a suspensão da pilha em 600 x g por 5 minutos em RT, com freio em baixo.
- Para congelar as células CD34+ , aspirar o sobrenadante e re-suspender até 5 x 106 células em 1 ml de congelamento médio e congelar como descrito acima (passo 2,13). Caso contrário, prossiga para a seção 4 ou 5.
4. determinação de populações de caule e progenitoras por citometria de fluxo
- Para determinar as frações das populações de tronco e progenitoras no recém-isolado CD34+ hspcs, centrifugue-os a 600 x g por 5 min e Resuspenda 1 x 106 células em 50 μL de tampão de citometria de fluxo.
- Para 1 x 106 células CD34+ , adicione anticorpos (ver tabela de materiais para diluições) a marcadores de linhagem (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 e CD235a — todos os FITC rotulados), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) e 7- aminoactinomicina D (7-AAD; como uma mancha viva/morta) e compõem o volume total para 100 μL. Incubar no gelo no escuro por 20 min.
Nota: Menos de 1 x 106 células CD34+ podem ser empregadas para análise. Se manchar menos células, o volume total e o volume de anticorpos adicionados devem ser reduzidos em conformidade. Para a análise de citometria de fluxo, as MNCs não manchadas e únicas devem ser usadas como controles para a fixação de portões positivos e negativos para cada fluoróforo. - Após a incubação, lave as células com 1 mL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 600 x g durante 5 min.
- Opcionalmente, fixar as células manchadas em 0,5 mL de 1% solução paraformaldeído por 10 min no escuro em RT.
- Centrifugar a 600 x g durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
- Lave as células fixas/manchadas com 1 mL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Aspirar o sobrenadante, re-suspender as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo, e analisar por um citometro de fluxo (tabela de materiais).
5. diferenciação mielóide da haste hematopoiética CD34+ e células progenitoras
Nota: Para diferenciar o CD34+ hspcs às pilhas myeloid da linhagem, são estimulados primeiramente em placas revestidas humanas de recombinação do fragmento do fibronectina e semeadas então em uma camada de pilhas STROMAL MS-5 no meio myeloid da diferenciação. A diferenciação pode ser monitorada a cada semana durante 3 semanas com base na expressão de marcadores de superfície celular específicos para as quatro linhagens mielóides. Durante a estimulação e a diferenciação, todas as incubações são executadas em 37 ° c e em 5% CO2 em uma câmara humidificada. Todas as etapas devem ser executadas em um armário de segurança biológico.
- Cubra os poços de uma placa 48-well estéril não revestida adicionando 200 μL/poço da solução humana de recombinação do fibronectina em 1X PBS para 2 h em RT.
- Após 2 h, Retire cuidadosamente a solução de fibronectina humana recombinante e elimine-a.
- Bloqueie os poços com 200 μL/poço de 2% de BSA por 30 min em RT.
- Aspirar a solução de BSA e lave os poços duas vezes com 500 μL de 1X PBS estéril.
Nota: As placas revestidas do fragmento de fibronectin podem ser armazenadas em 4 ° c por até 2 semanas. - Para estimular o CD34+ hspcs, re-suspender as células recém-isoladas (a partir do passo 3,17) em uma densidade de 1 x 105 células/200 μl ou 5 x 105 células/ml de meio de estimulação quente 1x.
- Se estiver usando células CD34+ congeladas, descongele e transfira rapidamente as células para um tubo cônico de 15 ml contendo DMEM completo quente. Centrifugue a 600 x g durante 5 min e Resuspenda as células conforme descrito no passo 5,5.
- Placa 200 μL da suspensão de células CD34+ por poço do fragmento de fibronectina revestido placa de 48 poços e incubar para 48 h.
- No dia seguinte, sementes 15.000 MS-5 células estromais em 200 μL de DMEM completo por poço de uma cultura de tecido 48 bem tratada e incubar a 37 ° c por 24 h.
- Após 48 h da estimulação, colete as pilhas de CD34+ pela pipetagem delicada. Lave os poços com 500 μL de DMEM quente e piscina com a suspensão celular.
- Conte as células com azul de Tripan. Centrifugue a suspensão a 600 x g durante 5 min e Resuspenda a uma densidade de 5.000 células/200 μL de meio de diferenciação mielóide 1x.
- Da placa da cultura do tecido 48-well semeado com as pilhas stromal MS-5, Aspire delicadamente o meio sem perturbar as pilhas. Camada 200 μL (5.000 células) da suspensão de células CD34+ por poço da placa e incubar a 37 ° c.
Nota: A cultura das células MS-5 pode ser mantida em DMEM completo. No dia em que as células CD34+ são semeadas, as células MS-5 devem estar em uma camada uniforme (80-90% de confluência). Recomenda-se que as pilhas MS-5 estejam chapeadas pelo menos 24 horas antes da semeadura das pilhas de CD34+ . Se as pilhas MS-5 devem ser chapeadas 48 h ou 72 h antes de semear as pilhas CD34+ , a densidade da pilha deve ser ajustada conformemente. Recomenda-se também que os poços periféricos da placa 48-well sejam deixados em branco ou preenchidos com 200 μL de água estéril para evitar efeitos de aresta. - Realize uma mudança meio-média a cada 3 − 4 dias, removendo suavemente 100 μL do meio da parte superior de cada poço e substituindo-o por 100 μL de meio de diferenciação mielóide 2x por poço.
- No 21º dia, colher as células para análise da expressão do marcador da linhagem mielóide por citometria de fluxo. Sem perturbar a camada MS-5, pipete suavemente o meio e transfira as células para um tubo de 5 mL.
Nota: Para a análise de coloração e citometria de fluxo, as células de 1-2 poços são suficientes. A diferenciação também pode ser monitorada nos dias 1, 7 e 14. Se executar imunofenotipagem em dias múltiplos, os números dos poços necessários para a análise devem ser calculados conformemente. - Mancha 5 x 105 células com anticorpos para CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (percp-Cy 5.5), e CD235A (APC) em um volume total de 50 ΜL. Incubar no gelo no escuro por 20 min. inclua MNCs manchados e únicos manchado como controles para ajustar portas positivas e negativas para cada fluoróforo, e 7-AAD como uma mancha viva/inoperante para eliminar pilhas inoperantes da análise.
- Lave e fixe (opcional) as células manchadas como descrito acima (etapas 4.3-4.6).
- Re-suspender as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo e analisar por um citometro de fluxo.
6. avaliação da morfologia celular
- Limpe as lâminas do microscópio pulverizando o etanol e limpando até Squeaky.
- Mergulhe os slides limpos em solução de poli-L-lisina por 5 min em RT e seque por 1 h em RT.
- Ressuscitem os HSPCs da etapa 3,14 e células diferenciadas do passo 5,13 em 10 μL de tampão de citometria de fluxo.
- Transfira a suspensão da célula para as lâminas revestidas e deixe-as secar ao ar.
Nota: Os slides do dia 1 e do dia 21 podem ser armazenados em RT e manchados simultaneamente. - Despeje 0,5 mL da mancha Wright-Giemsa no slide e deixe ficar por 3 min em RT.
- Adicione o volume igual de água deionizada e deixe-se levantar para 10 minutos adicionais em RT.
- Lave a lâmina em água desionizada.
- Visualize células manchadas em uma ampliação de 60x ou 100x por um microscópio.
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Representative Results
A aplicação dos protocolos acima rende 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs e 1 (± 0,3) x 106 células CD34+ de uma unidade de sangue do cabo de ~ 100 ml. A percentagem de células CD34+ totais varia entre 80-90% (Figura 2A, B). A análise imunofenotípica pelo esquema descrito por Manz et al.5 demonstra que as células CD34+ tipicamente consistem em ~ 20% hscs e ~ 72% Mpps que são Lin-/Cd34+/Cd38- e Lin-/CD34+ /Cd38+, respectivamente (Figura 1 e Figura 2A). Na população MPP, as percentagens de CMPs (Lin-/Cd34+/Cd38+/CD123lo/Cd45ra-), GMPs (Lin-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA+), e eurodeputados (Lin-/Cd34+/Cd38+/Cd123-/CD45RA-) são aproximadamente 25%, 15% e 56%, respetivamente (Figura 1 e Figura 2b).
Durante a incubação dos HSPCs isolados em condições de diferenciação mielóide, há perda progressiva do marcador CD34. Immunophenotyping mostra que a porcentagem de pilhas de CD34+ reduz de ~ 90% no isolamento (Figura 2a) a~ 23% no dia 21 (Figura 3B). A análise do CD34- Population demonstra um aumento concomitante na porcentagem das pilhas que expressam marcadores Myeloid maduros da linhagem. Há um aumento no percentual de células expressando marcadores para monócitos (CD34-/Cd14+/cd66b-) de uma média de 1,7% para 12%, para granulócitos (CD34-/CD14-/cd66b+) de 1,3% para 5,3%, para megacariócitos (CD34-/CD41+/cd235a-) de 1,8% a 8%, e para pilhas Erythroid (CD34-/CD41-/cd235a+) de 0,7% a 11% (Figura 3C). A examinação de pilhas manchadas de Wright-Giemsa demonstra que as características morfológicas das pilhas no dia 1 e no dia 21 são distintas. As células indiferenciadas têm grandes núcleos redondos, e muito pouco citoplasma. Por outro lado, células de culturas diferenciadas exibem características de células de linhagem, incluindo monócitos maduros, granulócitos e eritroblastos (Figura 4). Assim, as condições da cultura descritas neste protocolo promovem a diferenciação de pilhas de UCB CD34+ às pilhas myeloid da linhagem.
Figura 1 : Esquema de diferenciação hematopoiética. A pilha de haste hematopoietic pluripotente (HSC) diferencia-se no progenitor multipotente (MPP), que dá a ascensão ao progenitor Myeloid comum (CMP) e às pilhas lymphoid comuns do progenitor (CLP). Os CMPS geram dois outros progenitores Myeloid, os progenitores do monocyte do granulocyte (GMPs) e os progenitores do eritrócitos do megacariócito (deputados). Os granulocytes e os monócitos surgem de GMPs, e os eritrócitos e megacariócitos surgem dos eurodeputados. CLPs dar origem a assassino natural, B, e células T. Os marcadores de superfície celular utilizados para caracterizar as populações celulares neste protocolo são indicados. Este número foi modificado de Bapat et al.11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Análise Immunophenotypic das pilhas hematopoietic da haste e do progenitor. (A) as células foram bloqueadas para a frente e dispersão lateral para selecionar uma única população de células. As pilhas positivas mortas e da linhagem foram eliminadas manchando com 7-AAD e anticorpos a CD3, a CD7, a CD10, a CD11b, a CD19, e a CD235a (todo o FITC manchado). As células Lin-/Live foram analisadas com anticorpos para CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD123 (APC) e CD45RA (PE-Cy7). Os progenitores foram distinguidos das pilhas de CD34+/Cd38+ . CMPs são CD123lo/CD45RA-, GMPs são CD123lo/CD45RA+ e os deputados são CD123-/CD45RA-. Os gráficos de dispersão representativos de um experimento são mostrados. B) são representadas percentagens de HSPCs totais (células CD34+ totais), CMPS, GMPs e eurodeputados no sangue do cordão umbilical. Os dados apresentados são médias com erro padrão de pelo menos três experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de Immunophenotypic de pilhas myeloid da linhagem. As únicas células foram fechadas com base na dispersão de frente e de lado. CD34- Cells foi selecionado manchando com o anticorpo a CD34 (APC-Cy7). Linhagens mielóidesna população CD34 foram analisadas com anticorpos para CD14 (PE), CD66B (PE-Cy7), CD41 (percp-Cy 5.5) e CD235A (APC) no dia 1 (a) e dia 21 (B). Os monócitos são CD14+/cd66b-, os granulócitos são CD14-/cd66b+, os megacariócitos são CD41+/cd235a- e as células eritroides são CD41-/cd235a+. Os gráficos de dispersão representativos de um experimento são mostrados. Frações de monócitos, granulócitos, megacariócitos e células eritroidesna população CD34 no dia 1 e dia 21 são representadas (C). Os dados apresentados são médias com erro padrão de pelo menos três experimentos independentes. Este número foi modificado de Bapat et al.11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Imagens representativas de HSPCs e células diferenciadas. CD34+ hspcs (a) e as pilhas das culturas Myeloid no dia 21 (B) foram manchadas com a mancha de Wright-Giemsa. As células correspondentes aos granulócitos (setas pretas), monócitos (setas azuis) e células eritroides (setas vermelhas) são mostradas. As barras de escala representam 10 mm. Este número foi modificado de Bapat et al.11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui é apropriado para a diferenciação ex vivo de UCB derivado CD34+ hspcs às quatro linhagens Myeloid. A incubação inicial com uma mistura de citocina consistindo de SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula as células CD34+ . Subseqüentemente, a diferenciação é conseguida com um cocktail de SCF, de IL3, de Flt3L, de EPO, e de TPO. Nesta mistura, o SCF, o IL3, e o Flt3L são importantes para a sobrevivência e a proliferação de CD34+ hscs. ePO e TPO promovem a diferenciação para eritrócitos e megacariócitos, respectivamente, e IL3 promove a diferenciação de granulocyte-monócitos precoces precursores e células maduras13,17,18. Uma advertência a este método é a variação observada nas porcentagens de células diferenciadas. Isto poderia ser por causa das diferenças nas capacidades do CD34+ hspcs isolados dos doadores diferentes para dar a ascensão às pilhas da linhagem.
A camada de MS-5 pilhas é crítica para a diferenciação eficiente do CD34+ hspcs. Em nossa experiência, as pilhas MS-5 precisam de ser chapeadas pelo menos 24 horas antes da semeadura das pilhas de CD34+ . É importante manter a confluência das células MS-5 em 80-90%. As pilhas de MS-5 do overconfluent tendem a destacar, e uma mais baixa confluência causa a diferenciação reduzida. Durante a incubação, as células CD34+ expandem-se por ~ 50 vezes. Eles se tornam confluentes no dia 14 e precisam ser colhidas e divididas em poços adicionais contendo células MS-5 em uma nova placa.
A frequência das alterações na mídia também é fundamental para a diferenciação eficiente e deve ser realizada a cada 3-4 dias para manter as concentrações ideais de citocinas. Menos mudanças de mídia e concentrações menores de citocinas, ambas causam uma redução na proliferação e diferenciação de CD34+ hspcs. Esta exigência para grandes quantidades de citocinas pode significativamente aumentar custos e assim, é uma limitação deste protocolo. Outra limitação para experimentos em grande escala é o número de células CD34+ obtidas de uma unidade de sangue do cordão umbilical. Tipicamente, uma unidade nova de UCB de ~ 100 mL rende aproximadamente 1 milhão pilhas de CD34+ . O armazenamento da unidade além de 24 horas reduz significativamente o rendimento. Uma perda mais adicional de pureza das pilhas CD34+ pode ocorrer durante as etapas da lavagem da coluna que são importantes para remover todas as pilhas contaminando sem rótulo. Se a coluna obstrui durante as etapas da lavagem, recomenda-se que as pilhas acopladas da coluna obstruída estejam eluídas e recarregadas em uma coluna nova a fim começ uma população pura de células CD34+ .
Na literatura, foram relatadas diferentes combinações de citocinas que promovem diferenciação para linhagens megacariocíticas, eritroides ou granulo-monócitos19,20,21,22 . Uma vantagem deste protocolo é que permite a diferenciação ao longo de todas as quatro populações Myeloid, a saber monocytes, granulocytes, megakaryocytes, e erythrocytes. Assim, pode ser empregado para estudar a diferenciação Myeloid normal e para investigar o impacto da doença Myeloid (síndromes myelodysplastic, leucemia Myeloid aguda, neoplasma Myeloproliferative, e outro) mutações de ponto associadas e translocações cromossomáticos no phenotype molecular e celular durante a proliferação e a diferenciação de pilhas de CD34+ 11,12,23,24,25. Este protocolo também pode ser empregado para examinar o impacto de citocinas pró-inflamatórias e antiinflamatórios, e de potenciais fármacos terapêuticos na diferenciação mielóide26,27,28.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero, e Gabriella Ruiz de Maricopa sistemas integrados de saúde para as unidades de sangue de cabo de-identificado e doado, Mrinalini Kala para assistência com citometria de fluxo, e bandidos gays e Christopher seet para aconselhamento sobre diferenciação mielóide ex vivo. Este trabalho foi apoiado por fundos para S.S. dos institutos nacionais de saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e da sociedade americana de câncer (a pesquisa institucional Grant 74-001-34-IRG). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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