Summary
Здесь мы представляем протокол для иммунофенотипической характеристики и цитокинов индуцированной дифференциации пуповинной крови, полученных CD34и гематопоиетических стволовых и клеток-прародителей к четырем миелоидным линиям. Применение этого протокола включает исследования влияния мутаций миелоидных заболеваний или небольших молекул на миелоидную дифференциацию клеток CD34.
Abstract
Ex vivo дифференциации человеческих гематопоитических стволовых клеток является широко используемой моделью для изучения гематопоезии. Описанный здесь протокол предназначен для цитокинов индуцированной дифференциации CD34и гематопоиетического стебля и клеток-прародителей к четырем клеткам миелоидной линии. Клетки CD34 изолируются от пуповинной крови человека и совместно культивируются с стромальными клетками MS-5 в присутствии цитокинов. Описана иммунофенотипическая характеристика стволовых и клеток-прародителей, а также дифференцированных клеток миелоидной линии. Используя этот протокол,клетки CD34 могут быть инкубированы с небольшими молекулами или трансумционированы с лентивирусами для выражения мутаций миелоидной болезни, чтобы исследовать их влияние на дифференциацию миелоидов.
Introduction
Нормальная дифференциация гематопоэтических стволовых клеток (ГСК) имеет решающее значение для поддержания физиологических уровней всех линий клеток крови. Во время дифференциации, в скоординированной реакции на внеклеточные сигналы, включая факторы роста и цитокины, HSCs сначала приводят к многопотентным клеткам-прародителям (MPP), которые имеют лимфо-миелоидный потенциал1,2,3 ,4 (Рисунок1). MPPs дают начало к общим меелоидным прародителям (CMPs) и общим протекторам лимфоида (CLPs) которые lineage-ограниченно. CLPs дифференцируются в лимфоидные линии, состоящие из B, T и естественных клеток-убийц. CMPs генерировать миелоидные линии через два более ограниченных популяций прародителей, мегакариоцитов эритроидных прародителей (MEPs), и гранулоцитмонов прародителей (GMPs). Депутаты Европарламента порождают мегакариоциты и эритроциты, в то время как ГМП порождают гранулоциты и моноциты. В дополнение к возникающим через CMPs, мегакариоциты, как сообщается, также возникают непосредственно из HSCs или ранних MPPs через неканонические пути5,6.
Гематопоитические стволовые и клетки-прародители (HSPCs) характеризуются поверхностным маркером CD34 и отсутствием родовых специфических маркеров (Lin-). Другие поверхностные маркеры, которые обычно используются для различения HSCs и миелоидных популяций прародителей включают CD38, CD45RA и CD1232 (Рисунок 1). HSCs и MPPs являются Лин-/CD34/CD38- и Лин-/CD34//CD38,соответственно. Популяции миелоидных прародителей отличаются наличием или отсутствием CD45RA и CD123. CMPs являются Лин-/CD34 /CD38/CD45RA-/CD123lo, GMPs являются Лин-/CD34//CD38 / CD45RA / CD123lo, и MEPs являются Лин-/CD34 /CD38/CD45RA-/CD123-.
Общая популяция клеток ствола и прародителей CD34 может быть получена из пуповинной крови человека (UCB), костного мозга и периферической крови. КлеткиCD34 составляют от 0,02% до 1,46% от общего числа моноядерных клеток (МНК) в UCB человека, в то время как их процент колеблется от 0,5% до 5,3% в костном мозге и значительно ниже на 0,01% в периферической крови7,8,9 . Пролиферативная способность и потенциал дифференциации UCB производных клеток CD34значительно выше, чем у костного мозга или периферических клеток крови1,10, тем самым предлагая явное преимущество для получения достаточноматериала для молекулярного анализа в сочетании с выполнением иммунофенотипической и морфологической характеристики клеток во время дифференциации.
Ex vivo дифференциации пуповинной крови, полученных CD34и HSPCs является широко прикладной моделью для исследования нормальных механизмов гематопоезии и гематопоетических заболеваний. При культивировании с соответствующими цитокинами, UCB CD34и HSPCs могут быть индуцированы, чтобы дифференцировать вдоль миелоидных или лимфоидных линий11,12,13,14,15 , 16. Здесь мы описываем протоколы для изоляции и иммунофенотипической характеристики CD34и HSPCs от человека UCB, и для их дифференциации к клеткам линии миелоида. Эта культурная система основана на цитокино-индуцированной дифференциации HSPCs в присутствии стромальных клеток MS-5 для имитации микросреды в костном мозге. Условия культуры причиняют первоначальное расширение клеток CD34, последовано за их дифференциацией к клеткам которые выражают маркеры для 4 клеток линии миелоида, а именно granulocytes (CD66b), monocytes (CD14), megakaryocytes (CD41), и эритроцитов (CD235a). Применение протокола дифференциации клеток CD34включает исследования молекулярных механизмов, регулирующих гематопоис, а также исследования влияния связанных с миелоидными мутациями и малых молекул на самообновление и дифференциации HSPCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческая пуповинная кровь для экспериментов была пожертвована здоровыми людьми после информированного согласия на Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. Деидентифицированные единицы были получены в рамках соглашения о передаче материалов между MIHS и Университетом Аризоны.
1. Реагенты и буферы
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все реагенты и буферы в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности.
- Подготовка стерильного PBS-BSA-EDTA (PBE) буфер, добавив 7,2 мл стерильных 35% бычьего сыворотки альбумина (BSA; использовать стерильные ткани культуры класса 35% BSA) и 5 мл стерильных 0,5 М этилен диамин тетра уксусной кислоты (EDTA) до 487,8 мл стерильной Dulbecco's буфера солью (DPBS). Фильтр стерилизовать и де-газ буфера, оставив фильтр прилагается к вакууму в биологической безопасности шкаф, по крайней мере 2 ч. Aliquot де-газом буфера в меньших объемах (250 мл) и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Приготовьте 1x Хэнкс сбалансированный солевой раствор (1x HBSS). Разбавить 100 мл 10x HBSS запас в 900 мл стерильной дистиллированной воды, чтобы сделать 1 л 1x HBSS и настроить рН до 7,2. Фильтр стерилизовать 1x HBSS перед использованием.
- Приготовьте 2% раствор уксусной кислоты, добавив 2 мл ледниковой уксусной кислоты к 98 мл дистиллированной воды.
- Подготовка 20 нг /мл рекомбинантных человека фибронектин фрагмент решения в 1x PBS. Сделать 10 мл на 48-хорошую пластину.
- Подготовка 2% BSA. До 100 мл 1x PBS, добавить 2 грамма фракции BSA V. Фильтр стерилизовать перед использованием.
- Сделать полный Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM) путем добавления DMEM порошок, 3,7 г бикарбоната натрия, 100 мл сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 5 мл пенициллина-стрептомицина (PS) до 800 мл стерильной дистиллированной воды. Смешайте и составьте объем до 1 л, а фильтр стерилизовать перед использованием.
- Подготовка замораживания среды путем смешивания 90 мл FBS и 10 мл стерильного диметилсульфида (DMSO).
- Подготовьте среду стимуляции. Для сыворотки свободной среде, добавить L-глютамин до 2 мМ, и цитокины к окончательной концентрации 50 нг /мл для фактора стволовых клеток (SCF), тромбопоэтин (TPO), и FM-как тирозина киназы 3 лиганда (Flt3L), и 20 нг/мл для интерлейкина-3 (IL3) (см. для приготовления цитокинов фондовых растворов). Сделайте 5 мл на 48-хорошую пластину.
- Подготовка 1x миелоидной дифференциации среды. Для завершения DMEM добавьте цитокины к конечной концентрации 5 нг/мл для SCF, Flt3L и IL3, 50 нг/мл для ТПО и 4 единицы/мл для эритропоэтина (EPO). Сделайте 5 мл на 48-хорошую пластину.
- Подготовка 2x миелоидной дифференциации среды. Для завершения DMEM добавьте цитокины к конечной концентрации 10 нг/мл для SCF, Flt3L и IL3, 100 нг/мл для ТПО и 8 единиц/мл для ЭПО. Сделайте 5 мл на 48-хорошую пластину.
- Подготовьте буфер цитометрии потока. К 1 l 1x PBS, добавьте 10 г фракции BSA V.
- Подготовка 1% параформальдегида в 1x PBS (см. Таблица материалов для деталей).
- Приготовьте поли-L-лизинный раствор, добавив 500 л 10 мг/мл поли-л-лизин до 49,5 мл 1x PBS.
2. Изоляция моноядерных клеток от крови пуповины
ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола, описанного ниже, были использованы объемы пуповинной крови от 90 до 100 мл. Изоляция клеток CD34должна осуществляться в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности.
- Спрей мешок, содержащий UCB с 70% этанола для стерилизации внешней поверхности, прежде чем ввести его в шкаф биологической безопасности. Перенесите UCB в стерильную пластиковую бутылку объемом 250 мл и разбавьте его 1:1, добавив равный объем комнатной температуры (RT) 1x HBSS.
- Утилизировать 15 мл среды фракционирования MNC (MFM; см. ТаблицаМатериалов) на трубку примерно в шесть стерильных конических труб 50 мл. Наклоните трубку с MFM, и аккуратно вылейте 30 мл разбавленного UCB на слой MFM, не нарушая его.
- Центрифуга труб на 400 х г в течение 30 минут на RT с медленным ускорением и без тормозов.
- После центрифугирования, аспирировать между 15-20 мл плазмы над слоем MNC. Аккуратно соберите МНК с помощью пипетки и перенесите на новую коническую трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: MNCs депозит в виде белого слоеного слоя на стыке плазмы и MFM, и красные кровяные тельца (RBCs) осадка в нижней части конической трубки. - Бассейн MNCs собраны из 2-3 труб вместе. Составьте объем каждой трубки до 50 мл с холодным буфером PBE.
- Centrifuge трубы на 300 х г в течение 10 минут при 4 кв с, с тормозом на низком уровне.
- Аспирировать супернатант и нажмите трубку осторожно, чтобы ослабить клетку гранулы.
- Повторно приостановить гранулированных клеток в 5 мл ледяного буфера PBE. Используйте те же 5 мл повторно подвешенных ячеек для сбора клеток из других труб. Объедините клетки от 3 до 4 трубок вместе в одной конической трубке 50 мл.
- Чтобы собрать все оставшиеся ячейки, промойте все трубки с 5 мл холодного буфера PBE и добавьте в коническую трубку 50 мл.
- Подсчитайте MNCs, разбавив 10 л клеточной суспензии в раствор 490 л уксусной кислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетическая кислота лисиц любого загрязнения РБК, чтобы легче подсчет АМС. - Составьте объем подвески ячейки до 50 мл с ледяным буфером PBE. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 10 минут при 4 кв с, с тормозом на низком уровне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подвеска MNC может быть обработана немедленно для изоляции клеток CD34или заморожена для более поздних применений. - Чтобы заморозить MNCs, удалить супернатант и повторно приостановить при плотности 2 х 107 ячеек / мл в замораживании среды на RT.
- Заморозить клетки при -80 градусов на ночь в контейнере для замораживания клеток, а затем передать их в жидкий азот.
3. Изоляция CD34- клетки от моноядерных клеток
- При использовании свежеизолированных МНК перейти непосредственно к шагу 3.3.
- При использовании замороженных МНК быстро разморозить замороженные клетки в водяной бане 37 градусов по Цельсию и переложить на коническую трубку 50 мл. Соберите все оставшиеся ячейки во флаконах с 1 мл ледяного буфера PBE и перенесите в коническую трубку 50 мл.
- Составьте объем подвески MNC до 50 мл с холодным буфером PBE и центрифугой при 600 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Удалите супернатант и нажмите трубку осторожно, чтобы ослабить клетку гранулы. Повторно приостановить MNCs до 1 х 108 ячеек в 300 Л ледяной буфер PBE.
- Добавьте 100 qL fcR блокирующий реагент от магнитно-активированной сортировки клетки (MACS) людский набор cd34 microbead на 1 x 108 MNCs и смешайте нежно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это блокирует неспецифические привязки к микробусы CD34. - Добавьте 100 л микробусов CD34 на 1 х 108 клеток. Смешайте осторожно и инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 30 минут в холодильнике. Не инкубировать на льду.
- В то время как клетки инкубируют, поместите колонку LS и предразделительный фильтр в магнитном поле сепаратора MACS. Уравновесите столбец с ледяным буфером PBE, добавив 2 мл непосредственно в столбец и 1 мл в фильтре предварительного разделения. Разрешить столбец, чтобы очистить в 15 мл конической трубки и отбросить поток через.
- Удалите MNCs от 4 C, добавьте ледяной буфер PBE, чтобы составить объем до 15 мл, и центрифуги клетки на 300 х г в течение 10 минут при 4 кв С, с тормозом на низком уровне.
- Призадыхать супернатант и повторно приостановить клетки в 1 мл ледяной буфер PBE.
- Добавьте суспензию ячейки к фильтру предварительного разделения, размещенному на столбце LS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр предварительного разделения удаляет все крупные агрегаты ячеек, которые могут блокировать столбец. - Промыть трубку с 3 мл ледяного буфера PBE и добавить его в предварительное разделение фильтра, размещенного на колонке LS. После этого отбросьте фильтр предварительного разделения.
- Вымойте столбец LS четыре раза, добавив 3 мл ледяного буфера PBE, что позволяет столбец стечь каждый раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки CD34 будут оставаться связанными с столбцом, а немаркированные ячейки будут проходить через столбец. - После окончательной стирки снимите столбец с магнитного поля сепаратора MACS и поместите ее в новую коническую трубку 15 мл, подальше от магнита.
- Добавьте 5 мл ледяного буфера PBE в столбец и изгонийте связанные клетки CD34, твердо нажав на поршень.
- Дополнительно пройдитеклетки CD34, изолированные от первой колонки по другой колонке LS, с фильтром предварительного разделения, как описано выше (шаги 3.10–3.13).
- Подсчитайте изолированные клетки CD34с трипан синим (10 л клеток и 10 зл трипан синий), чтобы определить общее количество живых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе изолированные клетки CD34могут быть заморожены для последующего использования или могут быть обработаны непосредственно для анализа HSPCs цитометрией потока (раздел 4) или для дифференциации на миелоидные клетки линии (раздел 5). - Centrifuge клеточной подвески на 600 х г в течение 5 мин на RT, с тормозом на низком уровне.
- Чтобы заморозить клетки CD34, аспирировать супернатант и повторно приостановить до 5 х 106 ячеек в 1 мл замораживания среды и заморозить, как описано выше (шаг 2.13). В противном случае перейдите в раздел 4 или 5.
4. Определение стволовых и прародителей населения поток цитометрии
- Чтобы определить фракции популяций стебля и прародителей в свежеисзолеях CD34и HSPCs, центрифуги их на 600 х г в течение 5 минут и повторно приостановить 1 х 106 клеток в 50 л потока цитометрии буфера.
- К 1 х 106 CD34 - клеткам, добавьте антитела (см. Таблица Материалов для разбавления) к маркерам линии (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 и CD235a - все fitC помечены), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) и 7- аминоактиномицин D (7-AAD; как живое/мертвое пятно) и составляет общий объем до 100 л. Инкубировать на льду в темноте в течение 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа может использоваться менее 1 х 106 CD34 ячеек. При окрашивании меньше клеток, общий объем и объем добавленных антител должны быть соответственно уменьшены. Для анализа цитометрии потока, неокрашенные и одиночные запятнанные MNCs должны быть использованы как управление для установки положительных и отрицательных стробов для каждого фторофра. - После инкубации промойте клетки 1 мл цитометрии цитометрии и центрифугу при 600 х г в течение 5 мин.
- Дополнительно, исправить окрашенных клеток в 0,5 мл 1% параформальдегида раствор в течение 10 минут в темноте на RT.
- Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин и аспирируй супернатант.
- Вымойте фиксированные / окрашенные клетки с 1 мл потока цитометрии буфера и центрифуги на 600 х г в течение 5 минут при 4 c.
- Приспособите супернатант, повторно приостановить клетки в 500 л цитометрии буфера потока, и анализировать с помощью цитометра потока (Таблица материалов).
5. Миелоидная дифференциация CD34- гематопоитических стволовых и прародителей клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы дифференцировать CD34и HSPCs к клеткам миелоидной линии, они сначала стимулируются в рекомбинантных человека фибронектин фрагмент покрытые пластины, а затем семенами на слое MS-5 стромальных клеток в миелоидной дифференциации среды. Дифференциация может контролироваться каждую неделю в течение 3 недель на основе выражения маркеров поверхности клеток, характерных для четырех миелоидных линий. Во время стимуляции и дифференциации все инкубации выполняются при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в увлажненной камере. Все шаги должны выполняться в кабинете биологической безопасности.
- Пальто скважины стерильной непокрытой пластины 48-наилучшим образом, добавив 200 л/колодец рекомбинантного раствора фибронектина человека в 1x PBS для 2 ч на RT.
- Через 2 ч осторожно удалите рекомбинантный раствор фибронектина и отбросьте.
- Блокируйте скважины 200 л/колой 2% BSA в течение 30 мин на РТ.
- Аспирируй раствор BSA и дважды промойте скважины 500 л стерильных 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фибронектин фрагмент покрытием пластины могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель. - Чтобы стимулировать CD34и HSPCs, повторно приостановить свежеизолированных клеток (от шага 3.17) при плотности 1 х 105 клеток / 200 Л или 5 х 105 клеток /мл теплой 1x стимуляции среды.
- При использовании замороженных клеток CD34и быстро оттаиваете и перенесите клетки в коническую трубку 15 мл, содержащую теплый полный DMEM. Центрифуга на 600 х г в течение 5 мин и повторно приостановить клетки, как описано в шаге 5.5.
- Плита 200 л суспензии клетки CD34на скважину фибронектина, покрытая 48-ну й пластиной, и инкубирует сярвые 48 ч.
- На следующий день, семена 15000 MS-5 стромальных клеток в 200 Л полного DMEM на хорошо 48-хорошо культуры ткани обработаны пластины и инкубировать при 37 КС в течение 24 ч.
- После 48 ч стимуляции, собирать CD34и клетки нежным пипеттингом. Вымойте скважины с 500 л теплого DMEM и бассейн с клеточной подвеской.
- Подсчитайте клетки с трипан синим. Центрифуги подвески на 600 х г в течение 5 мин и повторно приостановить при плотности 5000 клеток / 200 Л 1x миелоидной дифференциации среды.
- Из 48-хорошо ткани культуры пластины семенами MS-5 стромальных клеток, мягко аспирируем среду, не нарушая клетки. Слой 200 л (5000 клеток) суспензии клетки CD34и на скважину пластины и инкубировать при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура ячеек МС-5 может поддерживаться в полном DMEM. В день посева клеток CD34и MS-5 клетки MS-5 должны быть в едином слое (80-90% слияния). Рекомендуется, чтобы клетки MS-5 покрывались по крайней мере за 24 часа до посева клеток CD34. Если клетки MS-5 должны быть покрыты 48 ч или 72 ч до посева клетки CD34, плотность клеток должны быть скорректированы соответствующим образом. Рекомендуется также, чтобы периферийные скважины 48-колодца пластины были оставлены пустыми или заполнены 200 л стерильной воды, чтобы избежать краевого эффекта. - Выполняйте полу-среднее изменение каждые 3–4 дня, аккуратно удаляя 100 л среды из верхней части каждой скважины и заменяя ее 100 злитровых 2-х миелоидной дифференциации в скважину.
- На 21 день, урожай клетки для анализа миелоидной линии маркера выражения потокциометрии. Не нарушая слой MS-5, аккуратно пипетка среднего и передачи клеток в трубку 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа цитометрии окрашивания и потока достаточно клеток из 1-2 скважин. Дифференциация также может контролироваться в дни 1, 7 и 14. При выполнении иммунофенотипирования в течение нескольких дней, количество скважин, необходимых для анализа должны быть рассчитаны соответствующим образом. - Пятно 5 х 105 клеток с антителами к CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5) и CD235a (APC) в общем объеме 50 ЗЛ. Инкубировать на льду в темноте в течение 20 минут. положительные и отрицательные ворота для каждого фторофора, и 7-AAD как живое/ мертвое пятно для устранения мертвых клеток из анализа.
- Вымойте и исправьте (необязательно) окрашенные клетки, как описано выше (шаги 4.3-4.6).
- Повторно приостановить клетки в 500 л цитометрии буфера потока и анализировать с помощью цитометра потока.
6. Оценка клеточной морфологии
- Чистый микроскоп скользит, распыляя этанол и вытирая до скрипучих.
- Погрузите чистые горки в поли-L-лизин в раствор в течение 5 мин на RT и высушите в течение 1 ч на РТ.
- Отстранить HSPCs от шага 3.14 и дифференцированных ячеек от шага 5.13 в 10 qL буфера цитометрии потока.
- Перенесите подвеску клетки на покрытые горки и оставьте их на воздушно-сухой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды с первого дня и 21 дня можно хранить на RT и запятнать одновременно. - Налейте 0,5 мл пятна Райт-Гимса на слайде и пусть стоять в течение 3 минут на RT.
- Добавьте равный объем деионированной воды и дайте постоять дополнительно 10 минут на RT.
- Вымойте горку в деионизированной воде.
- Визуализируйте окрашенные клетки при увеличении 60x или 100x микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Применение вышеуказанных протоколов дает 5,6 (0,5) х 108 МНК и 1 (0,3) х 106 CD34- клетки из пуповинной крови в единицу пуповинной крови в 100 мл. Процент от общего количества клеток CD34 колеблется между 80-90% (рисунок2A,B). Иммунофенотипический анализ по схеме, описанной Manz et al. 5, показывает, что клетки CD34, как правило, состоят из 20% HSCs и 72% MPPs, которые являются Лин-/CD34 /CD38- и Lin- /CD34 /CD38,соответственно(Рисунок 1 и Рисунок 2A). В популяции MPP, проценты CMPs (Lin-/CD34 /CD38/CD123lo/CD45RA-), GMPs (Lin-/CD34//CD38/CD123lo/CD45RA , и депутаты Европарламента (Lin-/CD34/CD38/CD123-/CD45RA- )составляют примерно 25%, 15% и 56%, соответственно (рисунок 1 и рисунок 2B).
Во время инкубации изолированных HSPCs в условиях миелоидной дифференциации происходит прогрессирующая потеря маркера CD34. Иммунофенотипирование показывает, что процент клеток CD34уменьшается с 90% при изоляции (рисунок2А)до 23% на 21-й день (рисунок3В). Анализ CD34- популяция демонстрирует сопутствующий рост доли клеток, выражающих зрелые маркеры миелоидной линии. Увеличивается процент клеток, выражающих маркеры для моноцитов (CD34-/CD14,/CD66b-) в среднем на 1,7% до 12%, для гранулоцитов (CD34-/CD14-/CD66b)с 1,3% до 5,3% для мегакариоциты (CD34-/CD41/CD235a- )от 1,8% до 8%, а для эритроидных клеток (CD34-/CD41-/CD235a)от 0,7% до 11% (рисунок3C). Изучение окрашенных клеток Райта-Гимсы показывает, что морфологические характеристики клеток на 1 и 21 день различны. Недифференцированные клетки имеют большие круглые ядра, и очень мало цитоплазмы. С другой стороны, клетки дифференцированных культур обладают характеристиками линейных клеток, включая зрелые моноциты, гранулоциты и эритропласты(рисунок 4). Таким образом, культурные условия, описанные в этом протоколе, способствуют дифференциации клеток UCB CD34и клеток миелоидной линии.
Рисунок 1 : Схема гематопойетической дифференциации. Плюрипотентная гематопоатическая стволовая клетка (HSC) дифференцируется в многопотентный прародитель (MPP), который рождает общий миелоидный прародитель (CMP) и общие клетки лимфоидного прародителя (CLP). CMPs генерировать два других миелоидных прародителей, гранулоцитов моноцитов прародителей (GMPs) и мегакариоцитов эритроцитов прародителей (MEPs). Гранулоциты и моноциты возникают из ГМП, а эритроциты и мегакариоциты возникают у евродепутатов. CLPs приводят к естественному убийце, B и Т-клеткам. В этом протоколе указаны маркеры поверхности клеток, используемые для характеристики популяций клеток. Эта цифра была изменена из Бапат и др.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Иммунофенотипический анализ гематопоиетического стебля и клеток-прародителей. (A) Клетки были закрыты на вперед и бока рассеяния, чтобы выбрать одну ячейку населения. Мертвые и линии положительных клеток были устранены путем окрашивания с 7-AAD и антитела к CD3, CD7, CD10, CD19, CD19, и CD235a (все FITC окрашенных). Lin-/живые клетки были проанализированы с антителами к CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD123 (APC), и CD45RA (PE-Cy7). Прародители были отличить отклеток CD34и/CD38. CMPs являются CD123lo/CD45RA-, GMPs являются CD123lo/CD45RAи MEPs являются CD123-/CD45RA-. Показаны сюжеты разброса представителей из эксперимента. (B) Проценты от общего числа HSPCs (всего CD34- клетки), CMPs, GMPs, и MEPs в пуповинной крови представлены. Представленные данные представляют средние значения со стандартной ошибкой по крайней мере по трем независимым экспериментам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Иммунофенотипический анализ клеток миелоидной линии. Одиночные клетки были закрыты на основе переднего и бокового рассеяния. CD34- клетки были выбраны путем окрашивания антителами к CD34 (APC-Cy7). Миелоидные линии в CD34- популяция были проанализированы с антителами к CD14 (PE), CD66b (PE-Cy7), CD41 (PerCP-Cy5.5), и CD235a (APC) на день 1 (A) и день 21 (B). Моноциты являются CD14и/CD66b-, гранулоциты CD14-/CD66b, мегакариоциты являются CD41/CD235a- и эритроидные клетки CD41-/CD235a. Показаны сюжеты разброса представителей из эксперимента. Фракции моноцитов, гранулоцитов, мегакариоцитов и эритроидных клеток в CD34- популяция на 1 и 21 день представлены (C ). Представленные данные представляют средние значения со стандартной ошибкой по крайней мере по трем независимым экспериментам. Эта цифра была изменена из Бапат и др.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Репрезентативные изображения HSPCs и дифференцированных ячеек. CD34и HSPCs (A) и клетки из миелоидных культур в день 21 (B) были окрашены пятном Райт-Гимса. Показаны клетки, соответствующие гранулоцитам (черные стрелки), моноцитам (синим стрелкам) и эритроидным клеткам (красным стрелкам). Шкала баров составляет 10 мм. Эта цифра была изменена из Бапат и др.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь протокол подходит для дифференциации ex vivo uCB, полученных CD34и HSPCs к четырем миелоидным линиям. Первоначальная инкубация с цитокиновым миксом, состоящим из SCF, TPO, Flt3L и IL3, стимулирует клетки CD34. Впоследствии дифференциация достигается с помощью коктейля SCF, IL3, Flt3L, EPO и TPO. В этом миксе, SCF, IL3, и Flt3L важны для выживания и распространения CD34и HSCs. EPO и TPO способствуют дифференциации к эритроцитов и мегакариоцитов, соответственно, и IL3 способствует дифференциации раннего гранулоцитов-моноцитов прекурсоры и зрелые клетки13,17,18. Одним из предостережений к этому методу является наблюдаемое изменение в процентах дифференцированных клеток. Это может быть связано с различиями в емкости CD34и HSPCs, изолированных от различных доноров, чтобы привести к линии клеток.
Слой ячеек MS-5 имеет решающее значение для эффективной дифференциации CD34и HSPCs. По нашему опыту, ms-5 клетки должны быть покрыты по крайней мере 24 часов до посева клеток CD34. Важно поддерживать слияние клеток МС-5 на уровне 80-90%. Пересотые клетки MS-5 имеют тенденцию к съежению, а снижение выпуклости приводит к снижению дифференциации. Во время инкубации, клетки CD34 расширяются в 50 раз. Они становятся сопливыми к 14-му дню и должны быть собраны и разделены на дополнительные колодцы, содержащие клетки МС-5 на новой пластине.
Частота изменений в средствах массовой информации также имеет решающее значение для эффективной дифференциации и должна выполняться каждые 3-4 дня для поддержания оптимальной концентрации цитокинов. Меньшее количество изменений в средствах массовой информации и снижение концентрации цитокинов, как вызвать снижение пролиферации и дифференциации CD34и HSPCs. Это требование для большого количества цитокинов может значительно увеличить расходы и, таким образом, является ограничением этого протокола. Еще одним ограничением для крупномасштабных экспериментов является количество клеток CD34, полученных из единицы пуповинной крови. Как правило, свежий блок UCB в 100 мл дает около одного миллиона клеток CD34. Хранение устройства за 24 часа значительно снижает урожайность. Дальнейшая потеря чистоты клеток CD34может произойти во время шагов мытья колонны, которые важны для удаления любых немаркированных загрязняющих клеток. Если столбец забивает во время стирки, рекомендуется, чтобы связанные ячейки из засоренной колонки были eluted и перезагружены на новую колонку, чтобы получить чистую популяцию клеток CD34.
В литературе, различные комбинации цитокинов были зарегистрированы, которые способствуют дифференциации в отношении мегакариоцитарных, эритроидных, или грануло-моноцитных линий19,20,21,22 . Преимуществом этого протокола является то, что он позволяет дифференциру по всем четырем миелоидным популяциям, а именно моноцитам, гранулоцитам, мегакариоцитам и эритроцитам. Таким образом, он может быть использован для изучения нормальной дифференциации миелоидов и для исследования воздействия миелоидных заболеваний (миелодиспластические синдромы, острый миелоидный лейкоз, миелопролиферативные неоплазмы и другие) связанные точечные мутации и хромосомные транслокации на молекулярно-клеточном фенотипе при пролиферации и дифференциации КЛЕТОк CD3411,12,23,24,25. Этот протокол также может быть использован для изучения воздействия анти- и провоспалительных цитокинов, а также потенциальных терапевтических препаратов на дифференциацию миелоидов26,27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Венди Барретт, Рейчел Кабальеро, и Габриэлла Руис Марикопа интегрированных систем здравоохранения для де-идентифицированных и сданных пуповинной крови единиц, Mrinalini Кала за помощь с потоком цитометрии, и Гей Крукс и Кристофер Seet для советы по ex vivo миелоидной дифференциации. Эта работа была поддержана средствами для S.S. из Национальных институтов здравоохранения (R21CA170786 и R01GM127464) и Американского онкологического общества (Институциональные исследования Грант 74-001-34-IRG). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
