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Bioengineering

पत्ता परावर्तकता और क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस विश्लेषण के एक साथ माप द्वारा फोटोसिंथेटिक व्यवहार का मूल्यांकन

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59838
Automatic Translation
1
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

Summary

हम उच्च पौधों में प्रकाश संश्लेषण प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक नए तकनीकी दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जिसमें क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता के साथ-साथ माप शामिल हैं, जिसमें पीएएम और एक वर्णक्रमीय रेडियोमीटर का उपयोग करके संकेतों का पता लगाने के लिए Arabidopsis में एक ही पत्ती क्षेत्र.

Abstract

क्लोरोफिल एक फ्लोरोसेंट विश्लेषण व्यापक रूप से बरकरार पौधों में प्रकाश संश्लेषण व्यवहार को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, और कुशलता से प्रकाश संश्लेषण को मापने कि कई मापदंडों के विकास में हुई है। पत्ता परावर्तक विश्लेषण पारिस्थितिकी और कृषि में कई वनस्पति सूचकांक प्रदान करता है, फोटोकेमिकल परावर्तक सूचकांक (पीआरआई) सहित, जिसे प्रकाश संश्लेषण के दौरान थर्मल ऊर्जा क्षय के सूचक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह के साथ संबंधित है गैर-फोटोकेमिकल शमन (एनपीक्यू)। तथापि, चूंकि एनपीक्यू एक समग्र पैरामीटर है, इसलिए PRI पैरामीटर की प्रकृति को समझने के लिए इसके सत्यापन की आवश्यकता होती है। PRI पैरामीटर के मूल्यांकन के लिए शारीरिक साक्ष्य प्राप्त करने के लिए, हम एक साथ एक साथ xanthophyll चक्र दोषपूर्ण उत्परिवर्ती (npQ1) और जंगली प्रकार Arabidopsis पौधों में क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता मापा. इसके अतिरिक्त, क्यूजेड पैरामीटर, जो संभावित रूप से जैन्थोफिल चक्र को दर्शाता है, प्रकाश को बंद करने के बाद एनपीक्यू की छूट गतिज की निगरानी करके क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट विश्लेषण के परिणामों से निकाला गया था। ये एक साथ माप एक पल्स-एम्पलेंडल ममॉडुलन (पीएएम) क्लोरोफिल फ्लोरोमीटर और एक वर्णक्रमीय रेडियोमीटर का उपयोग कर के लिए किया गया। दोनों उपकरणों से फाइबर जांच एक ही पत्ती की स्थिति से संकेतों का पता लगाने के लिए एक दूसरे के करीब तैनात थे. प्रकाश संश्लेषण को सक्रिय करने के लिए एक बाहरी प्रकाश स्रोत का उपयोग किया गया था, और मापने रोशनी और संतृप्त प्रकाश पीएएम साधन से प्रदान किए गए थे। इस प्रयोगात्मक प्रणाली ने हमें बरकरार संयंत्र में प्रकाश पर निर्भर PRI पर नजर रखने के लिए सक्षम है और पता चला कि PRI में प्रकाश पर निर्भर परिवर्तन जंगली प्रकार और npQ1 उत्परिवर्ती के बीच काफी अलग हैं. इसके अलावा, PRI ु के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध था, जिसका अर्थ है कि ु] जैन्थोफिल चक्र को दर्शाता है। एक साथ, इन माप का प्रदर्शन किया है कि पत्ती reflectance और क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट के एक साथ माप पैरामीटर मूल्यांकन के लिए एक वैध दृष्टिकोण है.

Introduction

पर्ण परावर्तन का प्रयोग वनस्पति सूचकांकों को दूरस्थ रूप से संवेदन देने के लिए किया जाता है जो पादपों में प्रकाश संश्लेषण या लक्षणों को प्रतिबिंबित करते हैं. सामान्यीकृत अंतर वनस्पति सूचकांक (एनडीवी), जो अवरक्त प्रतिबिंब संकेतों पर आधारित है, क्लोरोफिल से संबंधित गुणों का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से ज्ञात वनस्पति सूचकांकों में से एक है, और यह पारिस्थितिकी और कृषि विज्ञान में एक के रूप में प्रयोग किया जाता है पेड़ों या फसलों में पर्यावरण ीय प्रतिक्रियाओं का सूचक3| क्षेत्र अध्ययन में, हालांकि कई पैरामीटर (जैसे, क्लोरोफिल सूचकांक (सीआई), जल सूचकांक (WI), आदि) विकसित किया गया है और इस्तेमाल किया, क्या इन मापदंडों सीधे (या परोक्ष रूप से) का पता लगाने के कुछ विस्तृत सत्यापन म्यूटेंट का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है.

क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट का पल्स-एम्प्लियम मॉडुलन (पीएएम) विश्लेषण प्रकाश संश् लेषी प्रतिक्रियाओं और फोटोसिस्टम II (पीएसII)4में शामिल प्रक्रियाओं को मापने के लिए एक प्रभावी तरीका है। क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट एक कैमरे के साथ पता लगाया जा सकता है और प्रकाश संश्लेषण म्यूटेंट5स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया. हालांकि, क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट के कैमरे का पता लगाने के लिए जटिल प्रोटोकॉल जैसे अंधेरे उपचार या प्रकाश संतृप्ति दालों की आवश्यकता होती है, जिन्हें क्षेत्र अध्ययनों में लागू करना मुश्किल होता है।

पत्ता अवशोषित सौर प्रकाश ऊर्जा मुख्य रूप से प्रकाश संश्लेषी प्रतिक्रियाओं द्वारा भस्म हो जाता है। इसके विपरीत, अतिरिक्त प्रकाश ऊर्जा के अवशोषण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, जो प्रकाश संश्लेषण अणुओं को नुकसान का कारण बनता है उत्पन्न कर सकते हैं. अतिरिक्त प्रकाश ऊर्जा गैर फोटोकेमिकल शमन (एनपीक्यू) तंत्र6के माध्यम से गर्मी के रूप में नष्ट किया जाना चाहिए। फोटोकेमिकल परावर्तकता सूचकांक (पीआरआई), जो पत्ती परावर्तकता पैरामीटरों में प्रकाश-निर्भर परिवर्तनों को दर्शाता है,531 और 570 एनएम (संदर्भ तरंगदैर्ध्य) 7,8पर संकीर्ण बैंड परावर्तकता से व्युत्पन्न है। यह क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट विश्लेषण9में एनपीक्यू के साथ सहसंबंधित होने की सूचना है। हालांकि, चूंकि NPQ एक समग्र पैरामीटर है जिसमें जैन्थोफिल चक्र, राज्य परंपरा, और photoinhibition शामिल है, इसलिए पंचायती राज पैरामीटर उपायों को समझने के लिए विस्तृत सत्यापन की आवश्यकता है। हमने जैन्थोफिल चक्र, एक थर्मल अपव्यय प्रणाली पर ध्यान केंद्रित किया है जिसमें जैन्थोफिल पिगमेंट (विओलाक्सैन्थिन से एंथेरेक्सान्थिन और ज़ेएक्सान्थिन) और एनपीक्यू का एक मुख्य घटक शामिल है क्योंकि पंचायती राज और इनके रूपांतरण के बीच सहसंबंध और रूपांतरण पिछले अध्ययनों में वर्णकों की सूचना दी गईहै 8.

कई प्रकाश संश्लेषण से संबंधित म्यूटेंट अलग किया गया है और Arabidopsis में पहचान की. npQ1 उत्परिवर्ती zeaxanthin जमा नहीं करता है क्योंकि यह violaxanthin de-epoxidase (VDE) में एक उत्परिवर्तन किया जाता है, जो violaxanthin के रूपांतरण zeaxanthin10को उत्प्रेरित करता है. यह स्थापित करने के लिए कि क्या PRI केवल जैन्थोफिल पिगमेंट्स में परिवर्तन का पता लगाता है, हम एक साथ NPQ1 और जंगली प्रकार में एक ही पत्ती क्षेत्र में PRI और क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट मापा और फिर निकालने के लिए अंधेरे छूट के अलग समय तराजू पर NPQ विच्छेदन जैन्थोफिल से संबंधित घटक11| ये एक साथ माप वनस्पति सूचकांक के काम के लिए एक मूल्यवान तकनीक प्रदान करते हैं. इसके अलावा, चूंकि पंचायती राज सकल प्राथमिक उत्पादकता (जीपीपी) से संबंधित है, इसलिए एक घटक को पंचायती राज को ठीक से असाइन करने की क्षमता में पारिस्थितिकी12में महत्वपूर्ण अनुप्रयोग हैं।

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Protocol

1. अरबिडोप्सिस पौधों की खेती

  1. एक माइक्रोट्यूब में बाँझ deionized पानी में Arabidopsis thaliana बीज भिगो दें, और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट।
  2. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मिट्टी की सतह पर आत्मसात, ठंडे उपचार वाले बीजों में से लगभग चार रखें। एक 16 ज प्रकाश (120 $मोल फोटॉनों उ-2 े))और 8 ज अंधेरे अवधि के साथ एक विकास कक्ष में लगाए गए बर्तन क्रमशः 22 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. अंकुरण के बाद अन्य अंकुरों को पतला करके प्रति बर्तन एक पौध ासाकीय बढाएँ. कम से कम पांच बर्तन तैयार करें. एक अतिरिक्त 4 सप्ताह के लिए विकास कक्ष में पौधों को इनक्यूबेट करें। प्रयोगों के लिए तीन पौधों का उपयोग किया जाता है।
  4. प्रकाश संश्लेषण माप के लिए सबसे कम उम्र, पूरी तरह से खोला परिपक्व पत्ती का प्रयोग करें.

2. नमूना चरण, प्रकाश संश्लेषण उपकरणों, और प्रकाश स्रोत की स्थापना

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, एक कस्टम निर्मित नमूना चरण पत्तियों फिक्सिंग और पता लगाने की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्र 1)।

  1. कस्टम बनाया नमूना चरण पर एक 1 सेमी व्यास छेद के साथ एक 10 सेमी2 स्टील प्लेट संलग्न करें। इस थाली में छेद आकार विभिन्न पत्ती के नमूने या संयंत्र प्रजातियों को समायोजित करने के लिए बदला जा सकता है। मंच का पता लगाने की जांच फिक्सिंग और जांच और पत्ती के नमूने के बीच की दूरी को समायोजित करने के लिए एक समायोजक के लिए एक क्लिप है।
  2. क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता को मापने के लिए पतली फाइबर जांच तैयार करें। इन पतली फाइबर जांच बारीकी से तैनात किया जाएगा ताकि वे एक ही पत्ती की स्थिति से संकेतों को मापने.
    नोट: एक पीएएम क्लोरोफिल फ्लोरोमीटर और एक वर्णक्रमीय रेडियोमीटर क्रमशः क्लोरोफिल एक फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता के संकेत का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया। दोनों उपकरणों क्रमशः 1 मिमी और 2 मिमी के व्यास के साथ पतली फाइबर जांच का उपयोग करें।
  3. इन दोनों जांचों को कसकर एक साथ फिट करें और उन्हें प्लास्टिक टेप के साथ लपेट लें।
  4. एक समाक्षीय लेंस धारक का उपयोग कर नमूना चरण पर टेप जांच क्लिप (चित्र 1देखें), और उन्हें पत्ती की सतह के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिति.
    नोट: वर्णक्रमीय रेडियोमीटर में फाइबर ऑप्टिक केबल के दृश्य का क्षेत्र ] 25 डिग्री है। इस विधि में, फाइबर जांच युक्तियाँ और पत्ती की सतह के बीच की दूरी 1 सेमी से कम है। इसलिए, मापने पत्ती क्षेत्र लगभग फाइबर की है कि के रूप में ही है.
  5. हैलोजन प्रकाश स्रोत के लिए कांच के फाइबर से बना एक biforked प्रकाश गाइड संलग्न करें और लगभग 45 डिग्री के कोण पर दोनों दिशाओं से नमूना चरण विकिरण।
    नोट: एक हैलोजन लैंप, जो प्राकृतिक सूर्य के प्रकाश की तरंगदैर्घ्य वितरण के करीब है, प्रकाश संश्लेषण को प्रेरित करने के लिए actinic प्रकाश के रूप में प्रयोग किया जाता है। हैलोजन प्रकाश स्रोत एक निर्मित में ठंड फिल्टर है, जो अवरक्त के पास से लंबी तरंगदैर्ध्य को हटा के साथ अनुकूलित किया गया था, पत्ती की सतह के तापमान में वृद्धि को रोकने के लिए ($ 400 से 800 एनएम).
  6. प्रकाश स्रोत को समायोजित करें ताकि प्रकाश समान रूप से छाया कास्टिंग के बिना नमूना चरण illuminates।

3. पत्ती परावर्तकता और क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट के एक साथ माप की स्थापना

नोट: सभी चरणों actinic प्रकाश के अलावा अन्य प्रकाश का पता लगाने से बचने के लिए अंधेरे कमरे में प्रदर्शन कर रहे हैं. एक कमजोर हरे रंग की रोशनी (उदा., हरे-सेलोफेन्ड प्रकाश) को वास्तविक माप से पहले बंद कर दिया जाना चाहिए।

  1. पत्ती के नमूने और नमूना चरण पर जांच के बीच की दूरी को मापने.
    1. अंधेरे में नमूना चरण के पत्ती धारक पर एक परीक्षण पत्ता रखें। मंच पर स्टील की प्लेट के विरुद्ध पत्ती दबाएं (चित्र 1में काला वर्ग)।
    2. PAM चालू करें और एक मापने प्रकाश के साथ पत्ती का नमूना विकिरण. लामोफिल फ्लोरोसेंट तीव्रता के मूल्यों की पुष्टि पीएएम नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके की जाती है (सामग्री की तालिकादेखें )।
    3. समायोजक ले जाएँ ताकि फ्लोरोसेंट तीव्रता लगभग 100 के उपाय. जांच और पत्ती के बीच की दूरी को मापने। समायोजक को ठीक करें, और समायोजक पर दूरी का मान रिकॉर्ड करें.
    4. मापने के प्रकाश को बंद करें. टेस्ट पत्ती निकालें.
  2. actinic प्रकाश के विकिरण तीव्रता को मापने
    नोट: प्रकाश पर निर्भर प्रकाश संश्लेषी व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए, अलग तीव्रता के actinic प्रकाश पत्ती के नमूने विकिरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. जहां नमूना पत्ती रखा जाएगा स्थिति पर एक प्रकाश क्वांटम मीटर सेट करें।
    2. हैलोजन प्रकाश स्रोत से प्रकाश विकिरणित करें और तीव्रता को मापें।
    3. यह निर्धारित करें कि प्रकाश स्रोत डायल की कौन सी स्थिति30, 60, 120, 240 तथा480 र्मोल फोटॉनों उ-2 े की तीव्रता उत्पन्न करेगी।
      नोट: Arabidopsis पौधों के तहत बड़े हो रहे हैं 120 [मोल फोटॉनों m-2 s-1; इसलिए, actinic प्रकाश के विकिरण तीव्रता छोटे और बड़े तीव्रता की एक श्रृंखला प्रदान करने के लिए चुना जाता है.
    4. डायल पर प्रत्येक विकिरण तीव्रता चिह्नित करें.
  3. एक प्रतिबिंब मानक को मापने.
    नोट: प्रत्येक विकिरण तीव्रता पर पत्ती परावर्तकता अनुपात की गणना करने के लिए एक प्रतिबिंब मानक की आवश्यकता होती है।
    1. पत्ती के नमूने की स्थिति में परावर्तक मानक के रूप में एक सफेद प्लेट रखें।
    2. वर्णक्रमीय रेडियोमीटर चालू करें. परावर्तन संकेत वर्णक्रमीय रेडियोमीटर अभिनियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा दिखाया गया है। इस समय, कोई वर्णक्रमीय डेटा नहीं है क्योंकि कोई विकिरण प्रकाश नहीं है।
    3. हैलोजन लैंप को 480ख्2 े-1,इस परीक्षण में उच्चतम विकिरण तीव्रता के साथ विकिरणित करने के लिए चालू करें।
    4. संतृप्ति से बचने के लिए रेडियोमीटर का पता लगाने की ताकत समायोजित करें।
    5. 30, 60, 120, 240, और 480 ख्-2 एस-1के साथ रोशनी के अंतर्गत 1 एनएम अंतरालों पर 450-850 दउ के बीच रिकार्ड स्पेक्ट्रमी परावर्तक परावर्तक परावर्तकपरकता ।
      नोट: एक आधार भूतरेखा विद्युत संकेत (अंधेरे वर्तमान) सही है और हर वर्णक्रमीय माप पर घटाया.

4. पत्ती परावर्तकता और क्लोरोफिल एक फ्लोरोसेंट की एक साथ माप, और प्रकाश संश्लेषी मापदंडों की गणना

  1. पत्ती के नमूने की स्थिति में एक संयंत्र सेट करें।
    1. विकास कक्ष के रूप में एक ही तापमान और आर्द्रता के साथ नियंत्रित अंधेरे कमरे में बड़े कक्ष से Arabidopsis संयंत्र स्थानांतरण.
    2. PSII प्रतिक्रिया केंद्र से इलेक्ट्रॉनों को नष्ट करने के लिए और गैर-फोटोकेमिकल शमन के आराम करने के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 1 एच के लिए संयंत्र इनक्यूबेट करें।
    3. नमूना चरण के अंतर्गत प्रयोगशाला जैक पर अंधेरे-अनुकूलित पूरे पौधे को रखें (चित्र 1)।
    4. पत्ती धारक को नमूना पत्ती को ठीक करें ताकि पत्ती की सतह का पता लगाने की जांच के लंबवत हो।
  2. PSII की अधिकतम क्वांटम उपज का मापन।
    1. PAM चालू करें और वक्र रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं. यह मान 0कहा जाता है।
    2. मापने प्रकाश चालू करें, और प्रतिक्रिया करने के लिए वक्र के लिए लगभग 30 s प्रतीक्षा करें। इस मान को F0कहा जाता है.
    3. PAM से 0ण्8 े के लिए 4000 ख्मोल फोटॉनों उ-2 े-1 की संतृप्त नाड़ी दे दी गई है।
    4. बढ़ी हुई फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ वक्र में कील का उच्चतम मान प्राप्त करें। इस मान को FMकहा जाता है।
    5. निम्न समीकरण का उपयोग करते हुए, अंधेरे में PSII की अधिकतम क्वांटम उपज की गणना करें (FV/FM)।
      FV/FM ] (FM - F0) / एफएम
  3. स्थिर अवस्था में प्रकाश संश्लेषण व्यवहार का मापन।
    1. हैलोजन लैंप को बाह्य प्रकाश स्रोत के रूप में चालू करें, जिस पर चम की रिकॉर्डिंग के बाद मापन प्रकाश होता है (4ण्2ण्4 देखें)। सबसे पहले, सबसे कमजोर प्रकाश के साथ पत्ती के नमूने को विकिरणित करें (30 $मोल फोटॉन उ-2 े)।
    2. पत्ती परावर्तकता की निगरानी करने के लिए एक ही समय में वर्णक्रमीय रेडियोमीटर चालू करें।
    3. प्रकाश संश् लेषी अभिक्रिया के प्रकाश स्थितियों में स्थिर अवस्था तक पहुँचने के लिए 20 मिनट या उससे अधिक समय तक प्रतीक्षा करें। स्थिर अवस्था की प्रतिदीप्ति की तीव्रता को फ्र कहा जाता है।
    4. actinic प्रकाश के साथ रोशनी के दौरान 1 मिनट के अंतराल पर एक संतृप्त पल्स की आपूर्ति. स्पंदित प्रकाश के अंतर्गत प्राप्त अधिकतम प्रतिदीप्ति मान को चम्कहते हैं।
    5. अभिक्रियाय प्रकाश को चालू करने के बाद 20 मिनट पर एफड़ के आंकड़ों को अभिलिखित की गई है।
    6. एक अंधेरे वर्तमान घटाव के साथ, एक अनुकूलित एकीकरण समय में 10 स्कैन औसत द्वारा पत्ती reflectance डेटा ले लो।
  4. स्थिर अवस्था में प्रकाश संश्लेषण मानकों की गणना।
    1. PSII फोटोकेमिस्ट्री (जेड पीएस आईआई) की क्वांटम पैदावार की गणना करें, जिसका अनुमान निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके, actinic light के अंतर्गत संतृप्त दालों के साथ विकिरण करके लगाया जा सकता है।
      ( चम) च े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े ेे े
    2. PSII अभिक्रिया केंद्र से रैखिक इलेक्ट्रॉन फ्लक्स (एलईएफ) का अनुमान लगाकर 4का अनुमान लगाया जिए।
      LEF - actinic प्रकाश की विकिरण तीव्रता - $PSII - 0.5 $ 0.84
    3. NPQ की गणना करें, जिसे निम्न समीकरण का उपयोग करके तापीय क्षय व्यक्त किया जा सकता है।
      एनपीक्यू ] (एफएम - एफएम]) /
      नोट: प्रकाश ऊर्जा मुख्य रूप से प्रकाश संश्लेषण प्रतिक्रियाओं द्वारा भस्म हो जाता है। तथापि, जब पौधे प्रकाश संश्लेषण द्वारा उपभोग की जाने वाली ऊर्जा की तुलना में अधिक प्रकाश ऊर्जा को अवशोषित करते हैं, तो अतिरिक्त ऊर्जा से बचने के लिए तापीय क्षय के लिए तंत्र प्रेरित होते हैं।
    4. एक ही प्रकाश की स्थिति के तहत रेडियोमीटर के साथ प्राप्त वर्णक्रमीय डेटा का उपयोग करते हुए, इस प्रकार के रूप में पत्ती परावर्तक अनुपात की गणना.
      परावर्तन अनुपात ] आरपत्ती /
    5. 531 एनएम और 570 एनएम से पंचायती राज की गणना निम्नानुसार करें। ये दो तरंगदैर्ध्य परावर्तकता अनुपात से निकाले जाते हैं।
      PRI ] (R531-R570) / (R531+R570)
      नोट: आर एक परावर्तकता है.
  5. गैर-फोटोकेमिकल शमन की छूट गतिज को मापने।
    1. एफ एस और पत्ती परावर्तकता प्राप्त करने के बाद actinic प्रकाश बंद कर दें।
    2. प्रकाश बंद करने के बाद 10 मिनट के लिए पीएएम द्वारा क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट की निगरानी करें।
    3. अंधेरे विश्राम के दौरान 1 मिनट के अंतराल पर एक संतृप्त नाड़ी प्रदान करें। अंधेरे के नीचे संतृप्ति स्पंद द्वारा प्रेरित अधिकतम प्रतिदीप्ति मान को चम्कहते हैं। एक परीक्षण में दसचम्म के दस को प्राप्त की गई है।
    4. actinic प्रकाश बंद करने के बाद 2 मिनट और 10 मिनट पर एफएमके डेटा को बचाओ।
    5. अगले विकिरण तीव्रता के लिए सेट पर actinic प्रकाश मुड़ें, 60 $ मोल फोटॉनों उ-2 s-1.
    6. 20 मिनट के लिए एक प्रकाश अनुकूलन और 1 मिनट के अंतराल पर स्पंदन संतृप्ति प्रकाश के साथ 10 मिनट के लिए एक अंधेरे छूट दोहराएँ. ऊपर वर्णित सभी डेटा रिकॉर्ड करें। 120, 240, और 480 मोल फोटॉनों उ-2 ेपर विकिरण का उपयोग करके सभी चरणों और मापों को दोहराएँ।
  6. छूट गतिज से गैर-फोटोकेमिकल शमन के मापदंडों की गणना।
    नोट: NPQ के प्रकाश पर निर्भर प्रेरण प्रकाश स्रोत13बंद करके आराम है. यह विश्राम timescales का समायोजन करके प्रत्येक NPQ समारोह भिन्न करना संभव है.
    1. क्यूई (ऊर्जा-निर्भर मज्जन) भिन्न का उपयोग करते हुए FM$ 2-मिनट काले अनुकूलन के बाद अनुमान लगाएँ।
      ुे ] (FM2m[]FM]) / FM]
      नोट: क्यूई अंश तेजी से 1-2 मिनट के भीतर उलट है। इस अंश में मुख्य रूप से PsbS प्रोटोनेशन और जैन्थोफिल रूपांतरण का हिस्सा शामिल है, जो थाइल्याक्ऑइड झिल्ली13के पार प्रकाश-प्रेरित $pH पर निर्भर करता है। दोनों ढाल के टूटने पर उत्क्रमणीय हैं।
    2. 10-मिनट के अंधेरे अनुकूलन के बाद एफएमका उपयोग करते हुए ु (zeaxanthin निर्भर शमन) भिन्न की गणना करें।
      ु] (FM10m[]FM]) / FM]
      नोट: actinic प्रकाश बंद करने के बाद लगभग 10 मिनट पर NPQ की एक छूट गतिज एक xanthophyll चक्र14को दर्शाता है. अधिकांश जैन्थोफिल रूपांतरण लगभग 10 मिनट (क्यूजेड) के लंबे समय के समय पर उलट जाता है क्योंकि रूपांतरण के लिए एक VDE (violaxanthin de-epoxidase) एंजाइमी प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है। थाइल्याकॉइड झिल्ली के पार $pH के टूटने से अंश भी शिथिल हो जाता है।
    3. ुI (फोटोनिहिकारी अवस्था) की गणना निम्नानुसार करें.
      ुI ] (FM-FM10m[) / FM]
      नोट: NPQ भिन्नों के बीच सबसे धीमी वसूली PSII (D1 कारोबार का संकेत) के photodamage माना जाता है. फोटोनिहिकारी राज्य (क्यूआई) का यह अंश, जो 10 मिनट15तक ठीक नहीं होता है।

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Representative Results

चित्र 1 क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता को एक साथ मापने के लिए स्थापित प्रायोगिक का एक योजनाबद्ध आरेख प्रस्तुत करता है। PAM और वर्णक्रमीय विकिरणमापी के फाइबर जांच कस्टम बनाया नमूना चरण पर पत्ती धारक पर पत्ती की सतह के लिए सीधा सेट किया गया था, और एक हैलोजन दीपक किसी भी कास्टिंग के बिना दोनों बाएँ और दाएँ दिशाओं से actinic प्रकाश विकिरण के लिए इस्तेमाल किया गया था छाया. पीएएम और पत्ती परावर्तक संकेतों का अलग सिस्टम के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पाया गया। इस प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग अरबिडोप्सिस जंगली-प्रकार (कोल) और नप1 उत्परिवर्ती (कम ज़ेक्सैन्थिन) पौधों की तुलना करने के लिए किया गया था (चित्र 2)। पत्ती परावर्तकता से परिकलित [PRI को पी ए एम (चित्र 2क)द्वारा अनुमानित PSII से प्रकाश पर निर्भर रैखिक इलेक्ट्रॉन प्रवाह के विरुद्ध प्लॉट किया गया था। PRI के बारे में बताया जाता है कि यह न केवल जैन्थोफिल बल्कि कैरोटीनोइड्स16से भी प्रभावित हुआ है . PRI को निम्नतम प्रकाश तीव्रता ($PRI) पर न्यूनतम प्रकाश तीव्रता ($PRI) पर प्रत्येक प्रकाश तीव्रता शून्य से PRI होने के कारण सुधार किया गया था ताकि केवल प्रकाश पर निर्भर PRI परिवर्तन11का निरीक्षण किया जा सके। परिणामों से पता चला है कि [PRI नकारात्मक जंगली प्रकार के पौधों में LEF के साथ सहसंबद्ध था, लेकिन npQ1में नहीं. हमने एनपीक्यू के अंधेरे विश्राम गतिविज्ञान से जैन्थोफिल चक्र का प्रतिनिधित्व करने वाले क्ुको को भी विच्छेदित किया है और इसे चित्र 2खमें ख्प् में तगित किया है। परिणाम दर्शाते हैं कि ु] दृढ़ता से [PRI (त2 ] -0.87, च-मूल्य और 0.001) के साथ सहसंबद्ध है, जिसका अर्थ है कि PRI जैन्थोफिल चक्र को दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1: क्लोरोफिल एक फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता के एक साथ माप के लिए प्रयोगात्मक प्रणाली का योजनाबद्ध आरेख। प्रोटोकॉल अनुभाग में विवरण वर्णित हैं. एक संयंत्र पॉट एक प्रयोगशाला जैक (ठोस डबल सिर तीर) द्वारा तैनात किया गया था. प्रकाश संश्लेषण (थिन ठोस तीर) को सक्रिय करने के लिए विभिन्न प्रकाश तीव्रताको विकिरण ित करने के लिए हैलोजन लैंप का उपयोग किया जाता था। क्लोरोफिल एक फ्लोरोसेंट संकेतों पल्स आयाम मॉडुलन (पीएएम) की एक प्रणाली का उपयोग कर का पता लगाया गया था; लाल रेखा पीएएम क्लोरोफिल फ्लोरोमीटर से फाइबर जांच इंगित करता है। पत्ती परावर्तकता प्रकाश रोशनी के तहत एक वर्णक्रमीय रेडियोमीटर द्वारा पाया गया था; नीली रेखा वर्णक्रमीय रेडियोमीटर से फाइबर जांच इंगित करता है। मापने प्रकाश (डॉटेड तीर) और लघु संतृप्त प्रकाश (थिक ठोस तीर) भी पीएएम क्लोरोफिल फ्लोरोमीटर द्वारा प्रदान की गई थी। संतृप्त रोशनी 20 मिनट और 10 मिनट के लिए अंधेरे छूट के लिए प्रकाश अनुकूलन के दौरान 1 मिनट के अंतराल के साथ स्पंदित थे. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: जंगली प्रकार कोलंबिया (काले वर्गों) में प्रकाश संश्लेषण मानकों में परिवर्तन, और npQ1 उत्परिवर्ती (लाल वर्गों) Arabidopsis पौधों. [PRI (प्रत्येक विकिरण तीव्रता पर PRI ऋण शून्य 30 डिग्री मोल फोटॉनों उ-1 ) के विरुद्ध प्लॉट किया गया था (क) रैखिक इलेक्ट्रॉन फ्लक्स की दर (एलईएफ ), और (ठ) ु ] 10 मिनट के लिए अंधेरे छूट के बाद। actinic प्रकाश की विकिरण तीव्रता 30, 60, 120, 240, और 480 [मोल फोटॉनों m-2 s-1था. डेटा बिंदु और त्रुटि पट्टियाँ n$ 3 के लिए SD का प्रतिनिधित्व करती हैं. B में पंक्ति सभी डेटा बिंदुओं के लिए लागू होता है एक प्रतिगमन वक्र है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने यह दिखाने के लिए अतिरिक्त साक्ष्य प्राप्त किए कि PRI एक साथ क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता को मापने के द्वारा जैन्थोफिल पिगमेंट का प्रतिनिधित्व करता है।

एक हैलोजन प्रकाश, जिसमें सूर्य के प्रकाश के समान तरंगदैर्घ्य होती है, प्रकाश संश्लेषण को सक्रिय करने के लिए एक अभिक्रियाप्रकाश स्रोत के रूप में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। हम शुरू में पत्ती की सतह के थर्मल नुकसान से बचने के लिए एक सफेद एलईडी प्रकाश स्रोत का इस्तेमाल किया, लेकिन यह धीमी गति से अंधेरे छूट गतिज और असाधारण उच्च क्यूआई (photoinhibitory शमन) का उत्पादन किया, संभवतः photodamaging PSII द्वारा. इसलिए हम गर्मी उत्पादन को कम करने के लिए एक निर्मित ठंड फिल्टर के साथ हैलोजन दीपक अनुकूलित. इस प्रकाश स्रोत अंधेरे वसूली या क्यूआई में किसी भी असामान्यताओं का कारण नहीं था.

हमारी विधि में सबसे महत्वपूर्ण चर पत्ती के बीच स्थितिपरक संबंध है, प्रकाश स्रोत, और पता लगाने की जांच. हम सीधे ऊपर से पत्ती के लिए विकिरण प्रकाश के साथ विभिन्न विकर्ण कोणों से क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता को मापने का परीक्षण किया है। हालांकि, पता लगाने के संकेतों की तीव्रता कोण के आधार पर भिन्न. इस परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, जांच पत्ती के नमूने के ऊपर खड़ी तय की गई थी (चित्र 1)। प्रकाश स्रोत द्विशाखित रेशों का उपयोग करके वितरित किया गया था जो पत्तियों की सतह को बाएँ और दाएँ दोनों ओर से विकिरणित करता था ताकि एक समान विकिरणी प्रकाश उत्पन्न किया जा सके (चित्र 1)।

पत्ती परावर्तकता के अध्ययन मुख्य रूप से पारिस्थितिकी में उपयोग किया गया है क्षेत्र सेटिंग्स में विभिन्न संयंत्र वनस्पति सूचकांक, जैसे पौधों की प्रजातियों, पोषण की स्थिति, या मौसमी परिवर्तन के बीच अंतर निर्धारित करने के लिए. हालांकि, कुछ अध्ययनों का परीक्षण किया है और इस तरह के Arabidopsis और तंबाकू, जिनके उत्परिवर्ती आनुवंशिक जानकारी और omics विश्लेषण डेटा का खजाना हो सकता है के रूप में मॉडल पौधों में इन वनस्पति सूचकांक सत्यापित. इन पौधों के लिए वनस्पति सूचकांकों का सत्यापन और विकास करने से नवीन वनस्पति सूचकांकों में प्रतिनिधित्व किए गए नवीन प्रकाश संश्लेषण पैरामीटरों की पहचान हो सकती है, जो पारिस्थितिकी के अनुशासन में योगदान देंगे।

इस अध्ययन में जिंकोफिल चक्र व्यवहार को सत्यापित करने के लिए एनपीक्यू के अंधेरे विश्राम गतिजों पर ध्यान केंद्रित किया गया। नए प्रकाश संश्लेषण से संबंधित पैरामीटर वर्तमान में क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट विश्लेषण के लिए विकास के अधीन हैं (उदाहरण के लिए, प्लास्टोक्विनोन पूल (क्यूएल) के रेडॉक्स राज्य का अनुमान या पीएसआई के चारों ओर चक्रीय इलेक्ट्रॉन प्रवाह की गतिविधि17,18 ). संबंधित Arabidopsis म्यूटेंट में क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट और पत्ती परावर्तकता का एक साथ माप प्रकाश संश्लेषण के आणविक तंत्र में अनुसंधान अग्रिम और क्षेत्र के अध्ययन में इस ज्ञान का उपयोग करने में मदद करेगा। हाल ही में किए गए एक अध्ययन में बताया गया है कि पौधों में क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट को पत्तियों वर्णक्रमीय परावर्तक ताक से दूर से महसूस किया जा सकता है। पैरामीटर सौर प्रेरित क्लोरोफिल फ्लोरोसेंट (एसआईएफ) एक Fraunhofer लाइन का उपयोग मापा जाता है, अंधेरे लाइनों ऑक्सीजन द्वारा अवशोषित, सौर प्रकाश के तहत 12,19. यदि वर्तमान में विकसित वनस्पति सूचकांक इन तकनीकों का उपयोग कर पुन: असाइन किए गए थे, तो संतृप्त दालों या अंधेरे अनुकूलन जैसे विशेष उपचारों का उपयोग किए बिना पौधों में प्रकाश संश्लेषी प्रतिक्रियाओं का दूरस्थ रूप से आकलन करना संभव होगा।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम चर्चा उत्तेजक, एक काम अंतरिक्ष के साथ सहायता, और प्रयोगों के लिए उपकरणों के लिए डॉ Kouki Hikosaka (Tohoku विश्वविद्यालय) के आभारी हैं। काम KAKENHI [अनुदान संख्या 18K05592, 18J40098] और Naito फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Halogen light source OptoSigma SHLA-150
Light quantum meter LI-COR LI-1000
PAM chlorophyll fluorometer Walz JUNIOR-PAM
PAM controliing software Walz WinControl-3.27
Reflectance standard Labsphere, Inc. SRT-99-050
Spectral radiometer ADS Inc. Field Spec3
Spectral radiometer controlling software ADS Inc. RS3

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 150 संयंत्र शरीर क्रिया विज्ञान प्रकाश संश्लेषण प्रकाश रासायनिक परावर्तक सूचकांक (पीआरआई) क्लोरोफिल एक फ्लोरोसेंट विश्लेषण पत्ती परावर्तकता गैर-फोटोकेमिकल शमन (एनपीक्यू)
पत्ता परावर्तकता और क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस विश्लेषण के एक साथ माप द्वारा फोटोसिंथेटिक व्यवहार का मूल्यांकन
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Kohzuma, K. Evaluation of… More

Kohzuma, K. Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses. J. Vis. Exp. (150), e59838, doi:10.3791/59838 (2019).

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